IBS (CEA-CNRS-UJF)

HPBP,

un marqueur potentiel du risque vasculaire ?

Rappels sur le transport des lipides et

les maladies cardio-vasculaires

Les lipoprotéines

Plusieurs catégories

-chylomicrons

-VLDL

(Very Low Density Lipoprotein)

-LDL

(Low Density Lipoprotein)

-HDL

(High Density Lipoprotein)

alias "bon cholesterol"

intestin

foie

acides grascholestérol

chylomicronTGCE

TGCE

CE

cellule adipeuseou muscle

triglycérides

Cholestérol

triglycérides

Cellulecholestérol

acide gras

cholestérol

acide gras

cholestérol

HDL

TG

CE

VLDL

LDL

Cycle des lipides

L’athérosclérose

1ere cause de mortalité dans les pays à mode de vie occidentale

C’est un dépôt de cholestérol

et de phosphate de calcium qui bouche les artères

Provoque l’infarctus et la thrombose

Le processus est encore mal connu mais implique les LDL oxydées qui sont captées par des macrophages

Découverte de la Human Phosphate Binding Protein (HPBP)

Structure de HPBP

R.Morales et al., Structure (2006)

Essais de cristallisation de HPON1 à partir de lots HPON1 "purs" 

Plasmas fournis par le CTS

Structure de HPON chimérique

Harel et al., Nat. Struct Biol (2004)

HPBP est copurifiée avec la paraoxonase (HPON1)

la paraoxonase (38-45 KDa) :- apoprotéine associée aux HDL- protéine hydrophobe - glycosylée- activité arylesterase et phosphotriesterase- hydrolyse les agents neurotoxiques (soman, sarin ..)- la paraoxonase a un rôle antiathérogénique (Souris knock-out)

Rôles physiologiques ?:Activité thiolactone : dégrade l’homocystèineProtège les LDL de l’oxydation…

HPBP est associée avec HPON1 et elles ont la même masse moléculaire

Gel bidimensionnel

Seules des conditions drastiques ont permis de séparer HPBP et HPON1

On parvient à les séparer sur hydroxyapatite

F. Renault et al., J Chrom B (2006)

45kDa

39kDa

HPON1

HPBP

Éch

ange

ur

d’an

ion

hydr

oxya

patit

e

39kDa

45kDa

Immunoprécipitation

phosphate

2 ponts disulfures

Structure SIRAS à 1.9 ÅDérivé coloré fournit par ML. Chesne-Seck

HPBP est similaire aux "Phosphate Solute Binding Proteins" associées aux transporteurs ABC   

Boucle 1

Boucle 2

Boucle 3

Boucle 4

HPBP

E. coli PstS protein

M. tuberculosis PstS1

IonsPeptides

…

Binding protein

HPBP est la première "binding protein" détectée chez un eucaryote

Schéma d’un transporteur ABC

HPBP fixe le phosphate

Avec 13 liaisons hydrogènes- affinité submicromolaire (32P)- Spécificité entre phosphate et le sulfate (105)

HPBP est le premier transporteur de phosphate caractérisé dans le plasma

La paraoxonase “pure” est un mulltimèreJosse et al., JBC (2002)

L’oligomérisation du complexe paraoxonase-HPBP dépend de la concentration de phosphate et de calcium

Cela confirme que HPBP est liée au mécanisme phosphocalcique

Poster M. Elias

Localisation physiologique de HPBP

sur la plupart des lipoprotéines

Dans les cellules de foie et d’intestin

HPBP PON

Région hydrophobe

HPBP est une apolipoprotéine hydrophobe

HPBP et génome

HPBP n’a jamais été caractérisée ni prédite par les banques de données génomiques

Initialement HPBP (378 aa) a été séquencée par cristallographie (10% d’ambigüité)

Puis vérifiée par spectrométrie de masse MS/MS (A. Van Dorsselaer).

La complémentarité des deux techniques ont permis de séquencer complètement la protéine sans ambigüité.

Séquençage de HPBP

Attribution à partir de densité

MALDI-MS spectrum of trypsin digest of HPBP

Ambiguities of the crystallographic sequencingAmbiguities of the crystallographic sequencing

Isosteric amino acids

Difficult to discriminate C, N, and O at 1.9Å Discrimination using chemical neighborhood

Very difficult: attribution not reliable : 50%

Possible: attribution reliable: more than 70%

Residues with similar electronic density shapes

Human DING proteinsN-terminus: D I N G G G A T L P Q…

Protein Origin Function

Synovial stimulatoryprotein

Fibroblasts T lymphocyte proliferationEtiology of rheumatoid arthritis?

Hirudin binding protein(leech thrombin inhibitor)

Fibroblasts Cell proliferation

Genistein binding protein(soybean isoflavone with oestrogen activity)

Carcinoma cell culturemedium

Cell proliferation?Apoptosis?

Proteolysis inducing factorreceptor

Muscles and liver(tumors)

Activation of phospholipase A2 : proteasome activation (cachexia)

Crystal (Ca oxalate)adhesion inhibitor (CAI)

Kidney epithelial cells Inhibition of kidney stoneadhesion to epithelial cells

Phosphate binding protein (HPBP)

Plasma (HDL) Involved in phosphocalcicmechanism ?

Les protéines DING sont absentes des banques donnéesElles sont principalement caractérisée que par leurs extrémités N-term

HPBP est la première DING séquencée complètement

Il y au moins 3 protéines humaines absentes du génome séquencé

Autres DING protéines

Protein Origin Functions

Cotinine receptor(nicotine derivative)

Rat: neurones Cotinine receptor

Lipid-free polysaccharide-binding protein

Turkey: “air sac fluid”

Pathogen adhesion to epithelial cells:trigger of defense reactions?

Hepatitis Virus bindingprotein

Woodchuck plasma

?

Macrophage C3R ligand Candida albicansAspergillus nidulans

C3R ligand :« hijacking » of complement system

Germin-Like Protein(GLP) binding protein

Tobacco ?

DING protein Hypericum perforatum(St.John’s wort)

?Inhibits HIV transcription andreplication

Les protéines DING semblent ubiquitaires chez les eucaryotes

Il existe des fragments de gènes de DING

eucaryotes

procaryotes

Absence systématique de HPBP des banques de données nucléotidiques.

Autre mystère : La très grande conservation des séquences partielles nucléotidiques entre des espèces très différentes.

97% d’identité (sur 628 pb)

Les protéines DING sont liées à plusieurs pathologies

Références

Rôles possibles de la HPBPLe phosphate est une molécule très importante impliquée dans de

nombreux mécanismes biologiques.

•HPBP est principalement liée aux lipoprotéine

•HPBP fixe le phosphate

•HPBP est associée à HPON1. modulée par l’environnement phosphocalcique

•HPBP est similaire à la CAIInhibe la formation des calculs rénaux

HPBP peut être impliquée dans les maladies

liées à la phosphatémie telle que l’athérosclérose

Mapping des anticorps polyclonaux

Mapping des anticorps monoclonaux

Très utile pour dévelloper un ELISA "type sandwich"

Etude des cohortes

HPBP et HPON1 un bio-épurateur

Essentielle à la stabilité et la fonctionnalité du complexe paraoxonase-HPBP

Un enjeu pour la prophylaxie et le traitement des intoxications par les agents neurotoxiques.

Paraoxonase : bio-épurateur catalytique.

(responsable de la résistance des mammifères face aux insecticides)

La butyrylcholinesterase : épurateur stoechiométrique.

Production U.S. Army (1 million de dose (200mg) par an) remplacera en 2007 la pyridostigmine.

Production par chèvres transgéniques (Nexia).

Co-exprimer HPON1 avec HPBP

L’étude de cette nouvelle protéine :

• soulève des questions au niveau génétique

• de plus, elle pourrait avoir un intérêt au niveau médical (Maladies cardiovasculaires, arthrite, cancer, HIV).

L’opportunité de travailler avec une protéine inconnue ouvre un large champs d’investigation, autorisant tous

les espoirs.

Conclusions

Remerciements

LCCP,IBS, Grenoble: R. Morales, P. Carpentier, J. Dupuis, C. Contreras,J.C. Fontecilla

IBMP, Strasbourg: F. Bernier

LCM, IBS, Grenoble: M.L. Chesne, R. Kahn, J. Vicat

CRSSA Grenoble: D. Rochu, F. Renaud, P. Masson

LBA, Nancy: M. Nicodeme

LSMBO, Strasbourg: H. dimer, C. Schaefer, A. Van Dorsselaer

FIP, LCM3B

Et bien d’autres ….