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N° d’ordre : 04-ISAL-0076 année 2004
THESE Présentée
DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR
Formation doctorale: Biochimie
Ecole doctorale interdisciplinaire sciences-santé
Par
Hiba KOMATI
IMPLICATION DE LA PHOSPHOLIPASE D ET DE SON PRODUIT, L’ACIDE
PHOSPHATIDIQUE, DANS LA DIFFERENCIATION MYOGENIQUE
Soutenance le 03 décembre 2004
Jury de thèse : Mme le Dr. M.BRETON-DOUILLON (Rapporteur)
Mme Le Dr. B.GENY (Rapporteur)
M. le Pr. M.LAGARDE (Président)
M. le Dr. F.NARO
M. le Dr. G.NEMOZ (Directeur de thèse)
Mme le Dr. A.F.PRIGENT
Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Physiopathologie des Lipides et Membranes de l’INSA (INSERM UMR585)
2
Novembre 2003
INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Directeur : STORCK A.
Professeurs :
AMGHAR Y. LIRIS
AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE
BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS
BABOUX J.C. GEMPPM***
BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE
BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS
BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE
BASKURT A. LIRIS
BASTIDE J.P. LAEPSI****
BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS
BENADDA B. LAEPSI****
BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS
BLANCHARD J.M. LAEPSI****
BOISSE P. LAMCOS
BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE
BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES
BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain
BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain
BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE
BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES
BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment
BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE
BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE
BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES
BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION
BUFFIERE J-Y. GEMPPM***
BUREAU J.C. CEGELY*
CAMPAGNE J-P. PRISMA
CAVAILLE J.Y. GEMPPM***
CHAMPAGNE J-Y. LMFA
CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications
CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine
COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS
COURBON GEMPPM
COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures
DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique
DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL
DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE
DUBUY-MASSARD N. ESCHIL
DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES
DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE
3
EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION
ESNOUF C. GEMPPM***
EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE
FANTOZZI G. GEMPPM***
FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS
FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS
FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES
FAZEKAS A. GEMPPM
FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES
FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS
FLEURY E. CITI
FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS
FOUGERES R. GEMPPM***
FOUQUET F. GEMPPM***
FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES
GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES
GERMAIN P. LAEPSI****
GIMENEZ G. CREATIS**
GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM***
GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE
GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE
GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS**
GOUJON L. GEMPPM***
GOURDON R. LAEPSI****.
GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE
GUENIN G. GEMPPM***
GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE
GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE
GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS
GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE
GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE
HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON
JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES
JAYET Y. GEMPPM***
JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION
Novembre 2003
JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures
JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique
KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION
LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE
LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES
LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique
LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique
LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique
LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE
LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE
LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION
LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE
4
LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS
MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE
MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE
MERLE P. GEMPPM***
MERLIN J. GEMPPM***
MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE
MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE
MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine
MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES
MOSZKOWICZ P. LAEPSI****
NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS
NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI****
NELIAS D. LAMCOS
NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
NORMAND B. GEMPPM
NORTIER P. DREP
ODET C. CREATIS**
OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI****
PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE
PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES
PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE
PECORARO S. GEMPPM
PELLETIER J.M. GEMPPM***
PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux
PERRIAT P. GEMPPM***
PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE
PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE
PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION
PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE
POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE
PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE
PROST R. CREATIS**
RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux
REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
RETIF J-M. CEGELY*
REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures
RICHARD C. LGEF
RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES
RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES
ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES
ROUBY D. GEMPPM***
ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat
RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION
SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux
SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES
SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE
SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE
THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE
THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon
UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES
5
VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS
VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI
VIGIER G. GEMPPM***
VINCENT A. GEMPPM***
VRAY D. CREATIS**
VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE
Directeurs de recherche C.N.R.S. :
BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS
CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE
COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE
ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON
FRANCIOSI P. GEMPPM***
MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE
POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE
ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES
SEGUELA A. GEMPPM***
VERGNE P. LaMcos
Directeurs de recherche I.N.R.A. :
FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS
GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS
RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS
Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. :
KOBAYASHI T. PLM
PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE
MAGNIN I. (Mme) CREATIS**
* CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON
** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL
***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX
****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS
6
SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
CHIMIE DE LYON M. Denis SINOU
Université Claude Bernard Lyon 1
Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS
5622
Bât 308
2ème étage
43 bd du 11 novembre 1918
69622 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.44.81.83
E2MC
ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS
M. Alain BONNAFOUS
Université Lyon 2
14 avenue Berthelot
MRASH
Laboratoire d’Economie des Transports
69363 LYON Cedex 07
Tél : 04.78.69.72.76
E.E.A.
ELECTRONIQUE,
ELECTROTECHNIQUE,
AUTOMATIQUE
M. Daniel BARBIER
INSA DE LYON
Laboratoire Physique de la Matière
Bâtiment Blaise Pascal
69621 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.64.43
E2M2
EVOLUTION, ECOSYSTEME,
MICROBIOLOGIE, MODELISATION
http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2
M. Jean-Pierre FLANDROIS
UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive
Equipe Dynamique des Populations
Bactériennes
Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de
Bactériologie BP 1269600 OULLINS
Tél : 04.78.86.31.50
EDIIS
INFORMATIQUE ET INFORMATION
POUR LA SOCIETE
http://www.insa-lyon.fr/ediis
M. Lionel BRUNIE
INSA DE LYON
EDIIS
Bâtiment Blaise Pascal
7
69621 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.60.55
EDISS
INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-
SANTE
http://www.ibcp.fr/ediss
M. Alain Jean COZZONE
IBCP (UCBL1)
7 passage du Vercors
69367 LYON Cedex 07
Tél : 04.72.72.26.75
MATERIAUX DE LYON
http://www.ec-lyon.fr/sites/edml
M. Jacques JOSEPH
Ecole Centrale de Lyon
Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des
Matériaux et des Surfaces
36 Avenue Guy de Collongue BP 163
69131 ECULLY Cedex
Tél : 04.72.18.62.51
Math IF
MATHEMATIQUES ET
INFORMATIQUE FONDAMENTALE
http://www.ens-lyon.fr/MathIS
M. Franck WAGNER
Université Claude Bernard Lyon1
Institut Girard Desargues
UMR 5028 MATHEMATIQUES
Bâtiment Doyen Jean Braconnier
Bureau 101 Bis, 1er étage
69622 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.27.86
MEGA
MECANIQUE, ENERGETIQUE,
GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE
http://www.lmfa.ec-
lyon.fr/autres/MEGA/index.html
M. François SIDOROFF
Ecole Centrale de Lyon
Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes
Bât G8
36 avenue Guy de Collongue
BP 163
69131 ECULLY Cedex
Tél :04.72.18.62.14
8
A mon futur proche époux dont l’amour me comble, à toi Mohamad.
Pour ton amour, ta tendresse, ta confiance en moi, ta compréhension, ta patience,
ton amitié et ton soutien de tous les jours pendant toute cette épreuve et tout le
reste…..
A mes parents que je ne pourrai jamais assez remercier de tout ce qu’ils
ont fait pour moi.
Tout l’amour et le bonheur que vous me donnez m’ont portée pendant ces longues
années d’études. J’ai vraiment une chance fabuleuse d’avoir des parents comme
vous et une famille formidable. Je vous dédie cette thèse, qui n’aurait jamais pu
aboutir sans votre soutien et votre confiance constants et sans bornes. Merci pour
tout.
9
Remerciements
Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé au sein du laboratoire de
« Physiopathologie des Lipides et Membranes », INSERM/INSA-Lyon UMR 585.
« L’Homme est un Homme avec l’autre » selon Nietzsche. Au cours de cette longue traversée
incertaine qu’est la thèse, j’ai appris au contact des uns, partagé des moments intenses avec
d’autres. En espérant n’oublier personne, je tiens à remercier tous ceux qui de près ou de loin
m’ont entouré durant ces 3 années de thèse.
Je tiens à remercier M. le Professeur Michel Lagarde pour la confiance qu’il m’a témoignée
en m’accueillant au sein du laboratoire de Physiopathologie des Lipides et Membranes. Je le
remercie aussi pour l’intérêt qu’il a porté à mon travail, pour ses suggestions et critiques
scientifiques durant les réunions d’équipe et pour son acceptation de présider le jury de ma
thèse.
Je suis très reconnaissante envers Mme le Docteur Annie-France Prigent de m’avoir
acceptée dans son équipe de recherche. Sa gentillesse, sa générosité et sa disponibilité m’ont
toujours beaucoup touchée. Je la remercie sincèrement pour ses conseils et discussions
scientifiques qui m’ont toujours été profitables et pour avoir accepté de participer au jury de
ma thèse.
Un remerciement chaleureux à M. le Docteur Georges Nemoz sans qui ce travail n’aurait pu
aboutir. Merci d’avoir guidé mes premiers coups de pinceaux sur la toile de la recherche tout
en m'accordant liberté et autonomie. Ses précieux conseils, sa gentillesse, ses qualités
humaines, son enthousiasme inaltérable, sa rigueur scientifique et sa passion pour la recherche
m’ont beaucoup appris et aidé tout au long de ce travail. Nos nombreuses discussions
resteront des souvenirs marquants. Je tiens à lui exprimer ma vive reconnaissance et mon
profond respect.
Je tiens à remercier Mme le Docteur Blandine Gény et Mme le Docteur Monique Breton-
Douillon de me faire l’honneur d’avoir accepté d’être rapporteurs de cette thèse, me
permettant ainsi de bénéficier de leur expertise. Je les remercie pour le temps qu’elles ont
10
consacré pour juger ce travail et je tiens à leur exprimer ma respectueuse considération et ma
sincère gratitude.
Un grand merci évidemment à «nos amis italiens» du département d’Histologie et
d’Embryologie Médicale à l’université de Rome «La Sapienza» et plus particulièrement le
Docteur Fabio Naro avec qui nous avons établi une collaboration étroite et enrichissante qui
s’est transformée en une réelle amitié. Il a rendu ce travail plus motivant par son
enthousiasme, son optimisme et ses compétences. Je lui suis reconnaissante pour les
nombreuses discussions scientifiques très intéressantes que nous avons pu avoir. Grâce à son
amitié et sa générosité, j’ai eu l’opportunité de visiter une des plus belles et historiques villes
du monde, Rome. Pour cela comme pour tout le reste, je l’en remercie sincèrement. Un merci
aussi au Docteur Vania De Arcangelis pour sa gentillesse et son aide pleinement appréciée.
Je lui adresse tous mes remerciements pour sa complaisance et son aimabilité.
Mener à bien une thèse est un travail passionnant qui ne saurait être possible sans la
compagnie et l’appui des amis. Merci donc à Saïda, Amal, Nada, Nader, Imad et Jahjah
qui sont tout simplement ma petite famille et avec qui j’ai partagé tant de moments de joie et
parfois de tristesse. Ces années d’études parfois longues et difficiles ont été facilitées par leur
présence. Je suis heureuse de les avoir traversées avec eux. Je garderai de cette période de
beaux souvenirs, une belle solidarité et une profonde amitié. Amal et Saïda, cette année n’a
pas été la plus facile, on s’est soutenues mutuellement et ça m’a beaucoup aidée. Merci
d’avoir supporté mes moments de stress et d’angoisse. Saida, ma petite sœur, je n’oublierai
jamais ton soutien solide et ton aide précieuse aux moments clés. C’est vraiment agréable et
important d’avoir des amies sur qui on peut compter pour vous remonter le moral. Je vous
remercie pour ces moments partagés où les tourments du thésard s’effaçaient, pour nos
manips en parallèle faites dans la bonne humeur, pour votre soutien sans faille et pour votre
amitié. Les drôles de dames commencent à ne plus être très nombreuses au labo, et vous êtes
parmi les prochaines sur la liste, courage et bonne chance. Nada et Nader, que dire… il
faudrait bien plus d’une page pour exprimer tout ce que j’éprouve comme sentiments et
reconnaissance envers vous deux. Merci pour votre précieux soutien, vos encouragements
dans les moments difficiles et votre amitié fidèle sans lesquels je n’aurai pu y arriver. C’est
l’occasion pour moi de vous témoigner ma profonde amitié. L’aventure continue… à bientôt,
à Montréal.
11
J’aurai sans nul doute un souvenir très ému de l’ambiance du laboratoire. Je tiens à remercier
tout particulièrement :
Bader, pour les fous rires qu’on a eus grâce à toi et à ta bonne humeur permanente. J’aurais
aimé plus te connaître encore et je te remercie d’être toujours là prêt à nous rendre service. Un
conseil, n’embête pas trop saïda quand je ne serai plus là☺.
Caroline, pour tes encouragements, pour la recherche des références sur EndNote (c’était
vraiment sympa) et pour les moments partagés dans le bureau durant cette dernière année.
Elodie, Karen et Nelly, mes collègues de fin de rédaction de thèse, pour vos marques de
sympathie, vos encouragements et votre gentillesse. C’est la dernière ligne droite, bonne
chance et bon courage.
Anisio, pour ta gentillesse et ta sincérité, j’ai bien apprécié nos discussions variées durant les
petites pauses café. Bonne chance pour la suite.
Sandrine, pour ton aide précieuse à la fin de ma thèse concernant toutes les formalités
administratives de dépôt de thèse.
Patrick, pour ta gentillesse, ta disponibilité et ton aide en informatique.
Madeleine Dubois, pour ta bonne humeur, tes qualités humaines remarquables, ton grand
coeur et ton écoute toujours attentive face à mes problèmes. Un grand merci à toi.
Laurence et Véronique, pour votre gentillesse et votre aide administrative précieuse.
Delphine, pour ton dynamisme et ta sympathie. L’ambiance du laboratoire n’est pas la même
sans toi.
Salim, pour ta gentillesse, ta bonne humeur et ta disponibilité.
Mes amis libanais, Nansy, Loubna, Radwan, Salam, Tamara, Wassim.....
Ahmad, pour ton soutien dans les moments difficiles et pour les nombreux matchs de tennis
qui m’ont aidée à diminuer le stress important de la thèse. J’aurais quand même voulu gagner
un dernier match avant mon départ☺
Enfin je remercie l’ensemble des personnes qui travaillent ou qui ont travaillé dans l’Unité
INSERM 585 et dans l’équipe Merck pour leur disponibilité et leur gentillesse. Je prends
soin de ne pas les nommer ce qui est un moyen, certes commode, de n’oublier personne.
12
RESUME
Lors de la myogénèse, les myoblastes précurseurs sortent du cycle cellulaire, fusionnent, et expriment
l'appareil contractile myocytaire. Des données préliminaires suggéraient l'implication de la
phospholipase D (PLD) dans la différenciation de myoblastes L6 en culture, induite par l'arginine-
vasopressine (AVP). En réponse aux agonistes, la PLD hydrolyse la phosphatidylcholine des
membranes cellulaires, donnant naissance à l'acide phosphatidique (PA), messager impliqué dans
diverses fonctions. Nous avons cherché à définir le rôle de cette voie dans la différenciation des
myoblastes L6. Nous avons caractérisé le système de la PLD dans ce modèle, et observé que son
activation par l'AVP dépend de la médiation de la protéine G monomérique RhoA, dont l'implication
dans la formation des fibres de stress et la myogénèse est reconnue. Les myoblastes expriment les
deux isoformes connues de PLD, PLD1 et PLD2, et leur expression est différentiellement régulée au
cours de la différenciation. L'inhibition pharmacologique de la production de PA bloque la
différenciation. Inversement, la surexpression de l'isoforme PLD1, mais pas celle de l'isoforme PLD2,
stimule la différenciation. Nous en déduisons que la PLD, et spécifiquement l'isoforme PLD1, est
nécessaire à la myogénèse, conclusion confirmée par l'observation que l'ester de phorbol TPA est
capable d'induire une activation soutenue de PLD et une différenciation myogénique complète. En
réponse aux agents myogéniques AVP et TPA, nous avons observé la formation rapide de fibres de
stress d'actine, et montré que cette formation est PLD-dépendante. Nous avons observé par
immunofluorescence une translocation de PLD1 du Golgi vers les fibres de stress. A l'aide d'une sonde
fluorescente sélective du PA, nous avons pu observer pour la première fois que ce messager est
accumulé au niveau des fibres de stress naissantes. Ces résultats démontrent que PLD1 et PA sont
directement impliqués dans le remodelage du cytosquelette lors de la stimulation myogénique. Un lien
entre la production de PA par la PLD et la production de PIP2 par la PI4P-5-kinase étant reconnu,
nous avons recherché et mis en évidence une synthèse PLD-dépendante de PIP2 lors de la stimulation
myogénique. De plus, nous avons montré par immunofluorescence que le PIP2 est accumulé, comme
le PA, au niveau des fibres de stress. Il apparaît donc que la PLD est impliquée dans les
réarrangements de l'actine via la production de PIP2, dont le rôle dans la réorganisation du
cytosquelette est prouvé. Il est admis que les réarrangements du cytosquelette jouent un rôle
primordial dans la myogénèse. Nos résultats permettent de proposer l'hypothèse que PLD1 intervient
dans ce processus en provoquant la formation PA- et PIP2-dépendante de fibres d'actine. Nous
poursuivons ce travail en essayant de montrer que ces remaniements s'accompagnent d'une activation
actine-dépendante de l'expression des gènes spécifiques du muscle, impliquant le facteur de
transcription SRF "serum response factor".
13
AVANT-PROPOS
Publications scientifiques :
- Fabio Naro, Vania De Arcangelis, Claudio Sette, Caterina Ambrosio, Hiba Komati, Mario
Molinaro, Sergio Adamo, Georges Nemoz. A bimodal modulation of the cAMP pathway is
involved in the control of myogenic differentiation in L6 cells.
J Biol Chem. 2003 Dec 5; 278(49): 49308-15.
- Hiba Komati, Alessandra Minasi, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie-France Prigent,
Sergio Adamo, Georges Nemoz. Phorbol ester-induced differentiation of L6 myogenic cells
involves phospholipase D activation.
FEBS Letters. 2004 Oct 5; 577(3): 409-414.
- Hiba Komati, Fabio Naro, Saïda Mebarek, Vania De Arcangelis, Sergio Adamo, Michel
Lagarde, Annie-France Prigent, Georges Nemoz. Phospholipase D is involved in myogenic
differentiation through remodeling of actin cytoskeleton (sous presse, Molecular Biology of
the Cell).
- Birbes, H., Komati, H., Lagarde, M., Nemoz, G., and Prigent, A.F. Involvement of
Phospholipase D in TNFα-induced apoptosis (à soumettre).
- Saïda Mebarek, Hiba Komati, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie-France Prigent, Georges
Nemoz. Ceramides are implicated in the control of myogenic differentiation in L6 cells via
modulation of Phospholipase D expression (en preparation).
Communications orales:
- Hiba Komati, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges Nemoz.
Implication of phospholipase D in the myogenic differentiation of L6 myoblasts. Congrès du
GERLI, Paris, France, 2-5 septembre, 2003
14
Communications affichées:
- Saïda Mebarek, Hiba Komati, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges
Nemoz. Rôle de la phospholipase D dans le contrôle de la perméabilité endothéliale. XXI ème
Congrès "Biologie et pathologie du coeur et des vaisseaux" la Baule, France, 22-23 Avril,
2004.
- Birbes, H., Komati, H., Lagarde, M., Nemoz, G., and Prigent, A.F. Involvement of
Phospholipase D in TNFα-induced apoptosis. XXI ème Congrès "Biologie et pathologie du
coeur et des vaisseaux" la Baule, France, 22-23 Avril, 2004.
- Hiba Komati, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges Nemoz.
Implication of phospholipase D in the myogenic differentiation of l6 myoblasts. Congrès du
GERLI, Paris, France, 2-5 septembre, 2003.
- H. Birbes, H. Komati, G. Nemoz, M. Lagarde, A.F. Prigent. Involvement of Phospholipase
D in TNFα-induced apoptosis. Congrès du GERLI, Paris, France, 2-5 septembre, 2003.
- Hiba Komati, Fabio Naro, Saïda Mebarek, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges
Nemoz. Rôle de la phospholipase D et de son produit, l’acide phosphatidique, dans la
différenciation du muscle squelettique. 14ème rencontre régionale Rhône-Alpes, Saint-Étienne,
France, 21 octobre, 2003.
- Hiba Komati, Fabio Naro, Saïda Mebarek, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges
Nemoz. Rôle de la phospholipase D et de son produit, l’acide phosphatidique, dans la
différenciation du muscle squelettique. Meeting of “Institut Multidisciplinaire Biologie des
Lipides”, Villeurbanne, France, September 25, 2002.
- Hiba Komati, Fabio Naro, Michel Lagarde, Annie France Prigent, Georges Nemoz.
Implication of phospholipase D in the myogenic differentiation of L6 myoblasts. Pris du
meilleur poster de la 7ème journée de l’ EDISS (Ecole Doctorale Interdisciplinaire Science et
Santé), villeurbanne, France, 16 avril, 2003.
15
- Birbes, H., Komati, H., Lagarde, M., Nemoz, G., and Prigent, A.F. Involvement of
Phospholipase D in TNFα-induced apoptosis. XX ème Congrès GRRC, Grenoble, France, 15-
16 avril, 2003.
16
TABLES DES MATIERES
TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX .............................................................................. 21
ABREVIATIONS .................................................................................................................... 24
I Introduction ...................................................................................................................... 26
II Rappels bibliographiques ................................................................................................. 29
II.1 Les phospholipases D............................................................................................... 29
II.1.1 Caractéristiques enzymatiques des phospholipases D ..................................... 29
II.1.1.1 La transphosphatidylation ............................................................................ 29
II.1.1.2 Mesure de l’activité enzymatique ................................................................ 31
II.1.1.2.1 Mesure du produit hydrosoluble............................................................ 31
II.1.1.2.2 Mesure du produit lipidique .................................................................. 31
II.1.1.3 Purification ................................................................................................... 32
II.1.2 Clonage et caractérisation des PLD ................................................................. 33
II.1.3 Structure primaire des phospholipases D ......................................................... 35
II.1.3.1 Domaines HKD et mécanismes catalytiques ............................................... 35
II.1.3.2 Les régions conservées I et III...................................................................... 37
II.1.3.3 Les domaines PH et PX................................................................................ 38
II.1.3.4 La boucle centrale de PLD1 ......................................................................... 39
II.1.3.5 Le domaine de liaison au PIP2 ou «motif polybasique».............................. 39
II.1.3.6 Les séquences amino- et carboxy-terminales............................................... 39
II.1.4 Régulation des PLD ......................................................................................... 40
II.1.4.1 Régulation par le PIP2.................................................................................. 40
II.1.4.1.1 Rôles physiologiques de PIP2 ............................................................... 40
II.1.4.1.2 PIP2 et cytosquelette d’actine................................................................ 42
II.1.4.1.3 PIP2 et PLD........................................................................................... 42
II.1.4.2 Régulation par les petites protéines G.......................................................... 43
II.1.4.2.1 Régulation par les protéines Rho........................................................... 43
II.1.4.2.1.1 Les protéines de la famille Rho ...................................................... 43
II.1.4.2.1.2 Rôles physiologiques de Rho ......................................................... 45
II.1.4.2.1.3 Les effecteurs de Rho ..................................................................... 46
II.1.4.2.1.4 Rho et PLD ..................................................................................... 47
17
II.1.4.2.2 Régulation par les protéines ARF.......................................................... 48
II.1.4.2.2.1 Les protéines G de la famille ARF ................................................. 48
II.1.4.2.2.2 ARF et PLD.................................................................................... 49
II.1.4.3 Régulation par les protéines kinases C......................................................... 49
II.1.4.3.1.1 PKC et PLD.................................................................................... 50
II.1.4.3.1.2 Mécanismes d’activation de la PLD par les PKC........................... 50
II.1.4.4 Régulation par les tyrosines kinases............................................................. 51
II.1.4.5 Régulation par les ions calcium ................................................................... 52
II.1.4.6 Régulation par des facteurs inhibiteurs ........................................................ 52
II.1.5 Localisation des PLD ....................................................................................... 53
II.1.5.1 Localisation tissulaire................................................................................... 53
II.1.5.2 Localisation subcellulaire............................................................................. 53
II.1.6 Rôles physiologiques de la PLD et de son produit, l’acide phosphatidique .... 55
II.1.6.1 Rôle de la PLD dans le trafic vésiculaire, l’exocytose et la sécrétion ......... 57
II.1.6.1.1 La PLD est impliquée dans la formation ARF-dépendante des vésicules
coatées 57
II.1.6.1.2 PLD et sécrétion .................................................................................... 57
II.1.6.1.3 Rôle fusogène du PA ............................................................................. 58
II.1.6.2 Rôle de la PLD dans le réarrangement du cytosquelette.............................. 60
II.1.6.2.1 La PLD et le cytosquelette d’actine....................................................... 60
II.1.6.2.2 Implication des petites protéines G dans les effets de PLD sur le
cytosquelette............................................................................................................. 61
II.1.6.3 Rôle de la PLD dans la différenciation cellulaire ........................................ 61
II.1.6.4 Cibles intracellulaires de l’acide phosphatidique......................................... 62
II.1.6.4.1 Raf-1 kinase........................................................................................... 63
II.1.6.4.2 PI(4)P 5-kinase ...................................................................................... 64
II.2 La myogénèse du muscle squelettique ..................................................................... 66
II.2.1 La myogénèse durant le développement embryonnaire................................... 66
II.2.2 La myogénèse in vitro: les lignées cellulaires myogéniques ........................... 68
II.2.3 Facteurs régulateurs de la myogénèse.............................................................. 69
II.2.3.1 Les protéines à domaine bHLH.................................................................... 69
II.2.3.2 Les protéines de la famille MADS-box........................................................ 72
II.2.3.2.1 Le Facteur de Réponse au Sérum (SRF) ............................................... 72
II.2.3.2.2 SRF et différenciation musculaire squelettique..................................... 72
18
II.2.3.2.3 La famille des Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2)............................. 73
II.2.3.2.4 MEF2 et différenciation musculaire squelettique.................................. 74
II.2.4 Effecteurs de la différenciation myogénique ................................................... 76
II.2.4.1 Inhibiteurs..................................................................................................... 76
II.2.4.1.1 Le facteur de croissance TGF-β............................................................. 76
II.2.4.1.2 Le facteur de croissance FGF ................................................................ 76
II.2.4.2 Inducteurs ..................................................................................................... 77
II.2.4.2.1 Les facteurs IGFs................................................................................... 77
II.2.4.2.2 L’hormone AVP .................................................................................... 77
II.2.5 Myofribrillogénèse ........................................................................................... 79
II.2.5.1 Protéines spécifiques du muscle................................................................... 79
II.2.5.2 Les myofibrilles............................................................................................ 80
II.2.5.3 Modèle de myofibrillogénèse....................................................................... 82
III Materiels et methodes................................................................................................... 84
III.1 Réactifs..................................................................................................................... 84
III.2 Méthodes .................................................................................................................. 85
III.2.1 Culture et traitements des cellules.................................................................... 85
III.2.1.1 Culture des cellules L6C5 ........................................................................ 85
III.2.1.2 Traitement des cellules L6C5................................................................... 85
III.2.1.3 Evaluation de la différenciation ............................................................... 86
III.2.2 Dosage de l’activité créatine kinase ................................................................. 86
III.2.3 Transfections transitoires ................................................................................. 87
III.2.4 Immunofluorescence ........................................................................................ 87
III.2.4.1 Immunofluorescence de la myogénine..................................................... 87
III.2.4.2 Immunofluorescence de la myosine......................................................... 88
III.2.4.3 Immunofluorescence des PLD ................................................................. 88
III.2.4.4 Immunofluorescence du PIP2 .................................................................. 88
III.2.4.5 Marquage de l’actine. ............................................................................... 88
III.2.5 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) ............................... 89
III.2.6 Préparation des échantillons pour électrophorèse en conditions dénaturantes
(SDS-PAGE) .................................................................................................................... 89
III.2.6.1 RhoA ........................................................................................................ 89
III.2.6.2 PLD1 et PLD2.......................................................................................... 89
III.2.6.3 Myogénine................................................................................................ 90
19
III.2.6.4 Les différentes isoformes de PKC............................................................ 90
III.2.7 Electrophorèse en SDS-PAGE et "Western-blotting"...................................... 90
III.2.7.1 Conditions spécifiques à chaque protéine détectée .................................. 91
III.2.8 Mesure de l’activité PLD dans les cellules L6................................................. 92
III.2.9 Traitement par l’exoenzyme C3 avec la méthode de « Scrape loading » ........ 93
III.2.10 Dosage du PIP2 néosynthétisé ..................................................................... 93
III.2.11 Préparation des ARN.................................................................................... 94
III.2.12 RT-PCR........................................................................................................ 94
III.2.12.1 Trancription inverse (RT)......................................................................... 94
III.2.12.2 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ............................................ 95
III.2.12.3 Electrophorèse sur gel d'agarose des ADN .............................................. 95
III.2.13 Construction des plasmides pEGFP-hPLD1, pEGFP-hPLD2 et pEGFP-
PABD 96
III.2.13.1 Amplification des séquences d'ADN codantes pour hPLD1, hPLD2 et
domaine de fixation de PA........................................................................................... 96
III.2.13.2 Insertion des séquences amplifiées dans pEGFP-C1 ............................... 97
III.2.13.3 Transformation des bactéries ................................................................... 97
III.2.13.3.1 Compétence des bactéries .................................................................. 97
III.2.13.3.2 Transformation des bactéries compétentes ........................................ 98
III.2.14 Mutagénèse dirigée ...................................................................................... 98
IV Resultats ..................................................................................................................... 100
IV.1 Activation de la PLD par les inducteurs myogéniques .......................................... 100
IV.1.1 Activation de la PLD par l’AVP via ARF, PKC et Rho ................................ 100
IV.1.2 Activation de la PLD par le TPA via PKC..................................................... 104
IV.1.2.1 Le TPA, à une faible concentration, induit la différenciation myogénique
104
IV.1.2.2 La régulation de l’activité PLD par le TPA est dose-dépendante .......... 106
IV.2 L’activité PLD est nécessaire à la différenciation myogénique............................. 110
IV.3 La PLD1 est impliquée positivement dans la différenciation myogénique ........... 116
IV.4 La PLD1 est sélectivement down-régulée au cours de la différenciation .............. 118
IV.4.1 Au niveau des ARNm .................................................................................... 118
IV.4.2 Au niveau des protéines ................................................................................. 119
IV.4.3 Au niveau de l’activité ................................................................................... 121
20
IV.5 La stimulation myogénique déclenche la formation PLD-dépendante des « stress
fiber like structures» (SFLS) .............................................................................................. 123
IV.5.1 La formation des SFLS est induite par l’AVP et le TPA dans les cellules L6
123
IV.5.2 La formation de SFLS par l’AVP et le TPA est PLD-dépendante................. 123
IV.5.3 La PLD1 est impliquée positivement dans la formation des SFLS................ 127
IV.6 La PLD1 et le PA participent directement à la formation des SFLS ..................... 128
IV.6.1 La PLD1, et non la PLD2, transloque vers les SFLS lors de la stimulation
myogénique .................................................................................................................... 128
IV.6.2 RhoA est partiellement relocalisée au niveau des SFLS................................ 131
IV.6.3 Le PA est sélectivement accumulé au niveau des SFLS lors de la réponse
myogénique .................................................................................................................... 132
IV.6.3.1 Cinétique de marquage des fibres d’actine par le PA ............................ 134
IV.6.3.2 Spécificité de la sonde pour le PA ......................................................... 134
IV.7 La PLD et le PA interviennent dans la formation des SFLS en induisant la synthèse
localisée de PIP2 ................................................................................................................ 137
V Discussion, conclusion et perspectives .......................................................................... 140
VI references ................................................................................................................... 148
21
TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1 : Schéma de réaction de la phospholipase D.............................................................. 30
Figure 2 : Représentation schématique des 2 isoformes de PLD (PLD1 et PLD2). ................ 34
Figure 3 : Domaines I-IV conservés chez les PLD de différentes espèces (d'après Cockcroft et
al., 2001)........................................................................................................................... 35
Figure 4 : Modèle de mécanisme catalytique des PLD............................................................ 36
Figure 5 : Structure tridimentionnelle de la protéine Nuc dimérisée. ...................................... 37
Figure 6: Production de PIP2 au niveau de plusieurs sites cellulaires. .................................... 41
Figure 7 : Implication des protéines G de la famille Rho dans le réarrangement du
cytosquelette..................................................................................................................... 45
Figure 8 : Modèle hypothétique résumant le rôle de la PLD1 ARF6-dépendante dans
l’exocytose. ...................................................................................................................... 59
Figure 9 : Représentation schématique de Raf1 contenant le domaine de fixation de PA (Rizzo
et al., 2002)....................................................................................................................... 64
Figure 10 : Représentation schématique de coupes transversales.d’un embryon de poulet. ... 67
Figure 11 : Définition des rôles des facteurs de transcription MRF durant l’embryogénèse.
(Sabourin et al., 2000). ..................................................................................................... 70
Figure 12 : Inter-régulations entre les facteurs myogéniques au cours de l’embryogénèse
(Kitzmann, 1999). ............................................................................................................ 71
Figure 13 : Structure du muscle squelettique. .......................................................................... 80
Figure 14 : Disposition des molécules de titine dans le sarcomère.......................................... 81
Figure 15 : Modèle de myofibrillogénèse proposé par Dabiri et al. (1997)............................. 82
Figure 16: Principe de la méthode mutagénèse dirigée avec le kit QuickChange Stratagene. 99
Figure 17 : Effet de la bréfeldine A et de la « down-régulation » des PKC sur l'activation de la
PLD par AVP. ................................................................................................................ 101
Figure 18 : Effet de l’AVP sur la translocation de la protéine RhoA vers la fraction insoluble.
........................................................................................................................................ 102
Figure 19 : Effet de l’exoenzyme C3 sur l’activation de la PLD par l’AVP. ........................ 103
Figure 20 : Effet de deux doses différentes de TPA sur l’expression de la myogénine......... 105
Figure 21 : Effet de deux doses différentes de TPA sur l’accumulation nucléaire de la
myogénine. ..................................................................................................................... 106
22
Figure 22 : Cinétique d’activation de la PLD par 1 et 100 nM TPA. .................................... 107
Figure 23 : Effet sur l’activité PLD du retraitement des cellules par le TPA après un
traitement prolongé. ....................................................................................................... 108
Figure 24 : Effet d’un traitement prolongé par 1 ou 100 nM de TPA sur « la down-
régulation » des PKCs. ................................................................................................... 109
Figure 25 Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’expression de la myogénine
induite par AVP.............................................................................................................. 111
Figure 26 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’accumulation nucléaire de la
myogénine induite par AVP........................................................................................... 113
Figure 27 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’accumulation nucléaire de la
myogénine induite par 1 nM de TPA. ............................................................................ 114
Figure 28 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur la formation des myotubes induite
par AVP.......................................................................................................................... 115
Figure 29 : Effet de la surexpression de deux isoformes de PLD (PLD1b et PLD2) sur
l’accumulation nucléaire de la myogénine..................................................................... 117
Figure 30 : Recherche de l’expression des PLD par RT-PCR au cours de la différenciation
myogénique induite par AVP......................................................................................... 119
Figure 31 : Recherche de l’expression des PLD par Western-Blotting dans les cellules L6 non
différenciées ou différenciées en myotubes. .................................................................. 120
Figure 32 : Activité de la créatine kinase dans les cellules L6 différenciées, ou non, en
myotubes. ....................................................................................................................... 121
Figure 33 : Mesure de l’activité PLD dans les cellules non différenciées ou différenciées en
myotubes. ....................................................................................................................... 122
Figure 34 : Effet de l’AVP (10-7M) et du TPA (1 nM) sur la formation des SFLS.............. 124
Figure 35: Effet du propranolol, de l’exoenzyme C3, de 0,5% butanol-1 et de 0,5% butanol-2
sur la formation des SFLS.............................................................................................. 125
Figure 36: Effet de l’AVP, du propranolol, du butanol-1 et du butanol-2 sur le pourcentage
des cellules présentant des SFLS. .................................................................................. 126
Figure 37: Effet de la surexpression de la PLD1b sur le pourcentage des cellules présentant
des SFLS. ....................................................................................................................... 127
Figure 38: Localisation de la PLD1 endogène dans les cellules L6 par immunofluorescence.
........................................................................................................................................ 128
Figure 39: Effet de l’AVP sur la localisation de la PLD1 endogène dans les cellules L6. .... 129
Figure 40: Effet de l’AVP sur la localisation de la PLD2 endogène dans les cellules L6. .... 130
23
Figure 41: Effet de l’AVP sur la localisation de Rho endogène dans les cellules L6............ 131
Figure 42: Marquage du PA à l’aide d’une sonde fluorescente spécifique............................ 132
Figure 43: Effet de l’AVP et du TPA sur la localisation du PA dans les cellules L6. ........... 133
Figure 44: Cinétique de marquage de SFLS par la sonde de PA. .......................................... 135
Figure 45: Contrôle de la spécificité de la sonde de PA. ....................................................... 136
Figure 46: Effet de l’inhibition de la production de PA sur la néosynthèse de PIP2 induite par
AVP................................................................................................................................ 138
Figure 47 : Effet de l’AVP sur la localisation du PIP2 dans les cellules L6.......................... 139
Figure 48 : Séquences de signalisation déclenchées par la stimulation myogénique. ........... 144
Figure 49 : Topographie des évènements impliquant la PLD lors de l’initiation de la
myogénèse. ..................................................................................................................... 147
Tableau 1 Les familles des petites protéines G (Takai et al., 2001) ........................................ 44
Tableau 2 Activation de la PLD dans divers types cellulaires par différents agonistes (Rizzo et
al., 2002)........................................................................................................................... 56
24
ABREVIATIONS
ADP : adénosine diphosphate
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
AMPc : adénosine monophosphate 3’, 5’ cyclique
ARF : facteur d'ADP-ribosylation
ARN : acide ribonucléique
AVP : arginine8-vasopressine
bHLH: “basic helix-loop-helix”: hélice-boucle-hélice basique
BHT : butyl-hydroxy-toluène
BET : bromure d’éthidium
BFA : bréfeldine A
BSA : albumine sérique bovine
CCM : chromatographie sur couche mince
CK: créatine kinase
DAG : diacylglycérol
DAPI : 4’,6’-diamidino-2-phénylindole
ECL : « enhanced chemiluminescence » : chimioluminescence amplifiée
EDTA : acide éthylènediamine tétraacétique
EGF : facteur épidermal de croissance
EGTA : acide éthylèneglycol tétraacétique
FGF: facteur de croissance des fibroblastes
GDP : guanosine diphosphate
GFP : protéine fluorescente verte
GTP : guanosine triphosphate
GTPγS : guanosine 5'-O-3-thiotriphosphate
HA: hémaglutinine
HEPES : acide N-(2-hydroxyéthylpipérazine)N’-(2-éthanesulfonique).
HPLC : chromatographie liquide haute performance
IGF : facteur de croissance « insulin like »
LPA : acide lysophosphatidique
25
MAP Kinase: Mitogen Activated Protein Kinase
MEF2 : “myocyte enhancer factor 2”: facteur stimulateur des myocytes
MRF : myogenic regulator factor
MADS: MCM1-Agamous-Deficiens-SRF
PA : acide phosphatidique
PABD : domaine de fixation de PA
PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide
PBS : tampon phosphate salin
PBu : phosphatidylbutanol
PC : phosphatidylcholine
PCR : réaction en chaîne de la polymérase
PDE : phosphodiestérase
PE : phosphatidyléthanolamine
PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PKC : protéine kinase C
PL : phospholipide
PLA2 : phospholipase A2
PLC: phospholipase C
PLD : phospholipase D
PMSF : fluorure de phenylmethylsulfonyle
PS: phosphatidylsérine
SDS : dodécylsulfate de sodium
SFLS : stress fiber like structures
Si RNA : petits ARNs interférants
SRF : facteur de réponse au sérum
SVF : sérum de veau foetal
TBS-T : tampon tris salin + tween
TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(dimethylamino)ethane
TGF-β: transforming growth factor β
TGN : “Trans Golgi Network”: réseau trans-golgien
TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-accétate
Tween : monolaurate de polyéthylène-sorbitane
26
I INTRODUCTION
La phospholipase D, ou PLD, hydrolyse la liaison phosphodiester distale des
phosphatidylcholines des membranes cellulaires, libérant de la choline et de l'acide
phosphatidique (PA), en réponse à des stimuli extracellulaires. Chez les mammifères, deux
gènes distincts, PLD1 et PLD2, ne présentant que 50% d'homologie de séquence ont été
décrits (Frohman et al., 1999), chaque gène donnant naissance à plusieurs variants d'épissage
(Hammond et al., 1997; Katayama et al., 1998; Steed et al., 1998). Ces deux isoformes de
PLD nécessitent du phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) comme cofacteur pour leur
activité mais sont régulées différemment. La PLD1 caractérisée par une activité basale faible
est activée synergiquement par les petites protéines G des familles Rho et ARF, et par les
PKC conventionnelles. La PLD2 au contraire a une activité basale élevée, et sa sensibilité à
des protéines activatrices est moins bien documentée (Exton, 2002). Les fonctions cellulaires
où une implication de la PLD a été démontrée sont multiples. On peut citer le trafic
vésiculaire, la réorganisation agoniste-dépendante du cytosquelette (Kam and Exton, 2001),
l'explosion respiratoire chez les neutrophiles, la prolifération et la survie cellulaires
(McDermott et al., 2004). Diverses cibles intracellulaires du PA ont été identifiées, ce qui
permet de considérer ce phospholipide comme un second messager majeur. On peut citer
divers constituants de la cascade des MAPkinases, notamment Raf-1 (Andresen et al., 2002),
des protéines impliquées dans le trafic vésiculaire (Ktistakis et al., 2003), l'AMPc-
phosphodiestérase PDE4D3 (Grange et al., 2000), etc. De manière très importante pour notre
projet, le PA a aussi été proposé comme un régulateur de la synthèse de PIP2, par sa capacité
à stimuler certaines PI4P-5-kinases (Anderson et al., 1999).
Au cours du processus myogénique, les myoblastes, cellules précurseurs, cessent de
proliférer et fusionnent pour se différencier en myotubes polynucléés, exprimant les protéines
spécifiques du tissu musculaire, notamment les constituants du système contractile. La
myogénèse intervient au cours de la vie embryonnaire, mais aussi lors de la réparation des
blessures du tissu musculaire déjà constitué, et dans la régénération du muscle dystrophique,
chez les patients atteints de myopathies (Perry and Rudnick, 2000). La myogénèse peut être
perturbée dans diverses situations pathologiques, telles que l'exposition à certains toxiques
environnementaux (Coletti et al., 2001). La compréhension des mécanismes qui la sous-
27
tendent présente donc un intérêt majeur en physiopathologie. Une équipe italienne avec
laquelle nous entretenons une collaboration suivie (Pr. S. Adamo, université de Rome-La
Sapienza) avait montré que l'hormone neuro-hypophysaire arg8-vasopressine (AVP) est un
puissant inducteur de la différenciation, chez diverses lignées myogéniques, et chez des
myoblastes en culture primaire, en l'absence de facteurs sériques (Nervi et al., 1995). En
outre, cette équipe avait montré que l'AVP induit, dans la lignée myoblastique de rat L6,
l'activation des voies de la phospholipase C (PLC) et de la phospholipase D (PLD). La
réponse myogénique pouvant intervenir pour des concentrations nanomolaires d'AVP,
auxquelles seule la PLD, et non la PLC, est activée, l'implication de la voie PLD paraissait
prépondérante dans ce système (Naro et al., 1997). Notre équipe a montré, en collaboration
avec le laboratoire italien, le rôle crucial joué par les AMPc-phosphodiestérases (PDE4) dans
le processus myogénique: l’AVP induit une stimulation prolongée de l’activité PDE4, et par
ailleurs, l’inhibition de ces enzymes par des composés sélectifs bloque puissamment la
différenciation. L’inactivation de la voie de l’AMPc consécutive à l’activation des PDE4 est
indispensable au déroulement de la myogénèse (Naro et al. 1999). La régulation des PDE4
sous l’effet de l’AVP semble être un processus complexe: deux phases de stimulation sont
apparentes (un premier maximum est atteint à 2 min, puis un plateau est atteint en 15 min,
après quoi l’activité se maintient élevée plus de 48h). Plusieurs mécanismes d’activation de
PDE sont donc probablement en jeu. L’isoforme PDE4D3, majoritaire dans les L6, étant
sélectivement activable par la fixation du second messager PA en système acellulaire, et une
accumulation rapide de PA résultant de l’activation de la PLD en réponse à L’AVP, il est
permis de penser que le PA accumulé provoque directement la phase rapide de stimulation de
la PDE.
Une autre intervention possible de la PLD dans la signalisation de l’AVP se situe au niveau de
la production de prostaglandines : nous avons récemment montré (Naro et al., 2003) que
l’AVP induit chez les L6 une synthèse et une sécrétion rapides de prostaglandines,
responsables d’une activation transitoire de la voie de l’AMPc au tout début de la stimulation.
Cette activation exerce un effet positif sur la différenciation. La PLD pourrait être impliquée
dans cette production de prostaglandines, puisqu’elle intervient dans l’activation de la cascade
des MAP kinases, le PA étant nécessaire au recrutement membranaire et à l’activation de la
kinase Raf-1, effecteur en amont de cette cascade ( Rizzo et al., 1999). Les MAP kinases sont
capables à la fois d’activer la libération d’acide arachidonique par la phospholipase A2, et de
stimuler son métabolisme en prostaglandines, via une augmentation de l’expression de la
prostaglandine H synthase 2 (Daniel et al, 1999).
28
C'est pourquoi, l’objectif principal de cette étude a été de déterminer le rôle de la PLD
dans la différenciation myogénique des myoblastes L6. Afin d'évaluer le rôle joué par la voie
de signalisation de la PLD lors de la myogénèse, nous avons entrepris de caractériser ce
système enzymatique et ses régulations dans les myoblastes L6 en différenciation. Nous nous
sommes ensuite attaché à démontrer que la PLD est nécessaire à la réponse myogénique. Nos
observations allant clairement dans ce sens, nous avons alors entrepris de préciser les
mécanismes impliquant la PLD.
Grâce à des techniques d’imagerie cellulaire, nous avons pu observer que le
cytosquelette joue un rôle central dans les effets de la PLD sur la différenciation myogénique.
Nous avons donc été amené à proposer un modèle intégrant la phospholipase D, ses
régulateurs et ses effecteurs, les remaniements du cytosquelette, et l’acquisition du phénotype
myocytaire. Ce modèle est basé sur l’hypothèse que le remaniement PLD-dépendant de
l’actine intervient à la fois dans la mise en place des myofibibrilles, et dans l’expression des
gènes spécifiques du muscle.
La première partie de ce mémoire est consacrée aux Rappels Bibliographiques et
comporte deux chapitres. Le premier chapitre fait état des connaissances actuelles sur les PLD
de mammifères, leur régulation et leurs fonctions physiologiques. Dans le second, nous
rapportons les données concernant la myogénèse, les facteurs de transcriptions musculaires et
la myofibrillogénèse. Le reste de ce mémoire concerne notre travail personnel et s'articule
autour de trois parties distinctes. La première partie traite les méthodes d'étude utilisées. La
deuxième partie est consacrée aux résultats expérimentaux. Ce mémoire se termine par une
discussion et une conclusion générale, et par l’exposé des perspectives qui découlent de notre
travail.
29
II RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
II.1 Les phospholipases D
La phospholipase D (PLD) est une phosphodiestérase qui catalyse la réaction
d’hydrolyse de la liaison phosphodiester distale d’un phospholipide pour libérer d’une part sa
tête polaire, et d’autre part l’acide phosphatidique (PA), un lipide considéré comme un second
messager (English, 1996). Les PLD intracellulaires de mammifères hydrolysent
majoritairement la phosphatidylcholine (PC), un des principaux phospholipides des
membranes. L’activité PLD a été identifiée la première fois dans les feuilles de chou en 1947
(Hanahan and Chaikoff, 1947). Depuis, il a été montré que la PLD est très répandue dans tout
le règne végétal. Pendant plusieurs années, cette enzyme a été considérée comme absente du
monde animal, mais aujourd’hui elle apparaît ubiquitaire. Elle a été retrouvée dans les
organismes procaryotes, la levure, et chez les mammifères où la reconnaissance de
l’importance de son rôle en fait une enzyme particulièrement intéressante.
La première activité PLD décrite chez les mammifères a été découverte en 1973 dans
des extraits membranaires de cerveau de rat (Saito and Kanfer, 1973; Saito and Kanfer 1975).
Ce n’est que dans les années 1980 que cette activité a été impliquée dans la transduction du
signal via des récepteurs membranaires (Billah et al., 1989). Depuis lors, les travaux portant
sur l’identification, la purification, l’isolement de la (ou des) PLD et la détermination de leurs
mécanismes d’action se sont succédés. Ainsi, on distingue des formes de PLD nécessitant ou
non du phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2), sensibles ou non à l’oléate. Ces travaux
ont conduit à penser que la PLD pouvait intervenir dans différents processus physiologiques.
II.1.1 Caractéristiques enzymatiques des phospholipases D
II.1.1.1 La transphosphatidylation
La PLD dans les conditions physiologiques (en milieu aqueux) hydrolyse les
phospholipides pour former d’une part un produit soluble, la choline, dans le cas où le
substrat est la phosphatidylcholine et d’autre part un médiateur phospholipidique, l’acide
phosphatidique. En présence d’alcools primaires, la PLD catalyse une réaction de
transphosphatidylation. Dans ce cas, l’alcool primaire sert d’accepteur pour le groupe
30
phosphatidyl, au détriment de l’eau (Dawson and Hemington, 1967). L’alcool primaire est un
excellent accepteur nucléophile, montrant 1000 fois plus d’affinité que l’eau (Yang et al.,
1967; Frohman et al., 1999). En présence de faibles concentrations d’alcool primaire, on
observe donc une formation préférentielle de phosphatidylalcool aux dépens du PA (Figure
1). Le phosphatidylalcool est un métabolite stable et représente un marqueur d’activation de la
PLD fiable et spécifique (Morris et al., 1997). En ce qui concerne la réaction de
transphosphatidylation, il est bien établi que la PLD ne peut utiliser que des alcools primaires
à chaîne courte. Il a été montré que la PLD de membranes de cerveau de rat utilise de manière
plus efficace le butanol-1 par rapport au propanol et à l’éthanol (Möhn et al., 1992). Par
contre, les alcools secondaires ne sont pas utilisables par les PLD animales et végétales
(Danin et al., 1993).
Figure 1 : Schéma de réaction de la phospholipase D.
1: En présence d'un milieu aqueux, la PLD forme à partir de la PC du PA et de la choline. 2: En
présence d'un alcool primaire (butanol-1) la PLD forme à partir de la PC du phosphatidylalcool, ici
du phosphatidylbutanol.
31
II.1.1.2 Mesure de l’activité enzymatique
Plusieurs méthodes ont été décrites pour mesurer l’activité enzymatique de la
phospholipase D en système acellulaire et sur cellules intactes. Elles peuvent être distinguées
en fonction de la méthodologie utilisée pour isoler et quantifier le produit de catalyse: produit
hydrosoluble (la tête polaire) ou le produit lipidique (PA, phosphatidylalcool).
II.1.1.2.1 Mesure du produit hydrosoluble
L’activité PLD peut être mesurée par dosage de la choline libérée lors de l’activation
de l’enzyme. Cette méthode consiste à marquer la tête polaire de la PC avec de la choline
tritiée. L’action d’une PLD spécifique de la PC libère, dans le milieu réactionnel, la choline
radioactive qui peut être dosée. Toutefois la choline libérée dans des cellules intactes est
rapidement phosphorylée en phosphocholine qui peut provenir aussi d’une activité PLC
(Besterman et al., 1986; Purkiss et al., 1991). En effet l’activation d’une PLC spécifique de la
PC conduit à la formation de phosphocholine d’une part et de diglycéride d’autre part. La
phosphocholine peut aussi être transformée en choline sous l’action d’une phosphatase.
Ce type de mesure n’est possible que sur des cellules perméabilisées, des membranes ou des
vésicules artificielles dans lesquelles la choline libérée dans le milieu réactionnel n’est plus
accessible aux kinases intracellulaires. La phase aqueuse contenant la choline marquée peut
être séparée de la phase lipidique selon la méthode de Bligh et Dyer (Bligh and Dyer, 1959).
La choline radioactive est alors quantifiée grâce à sa radioactivité, proportionnelle à l'activité
PLD. Il est également possible de quantifier la choline par mesure de chimiluminescence
(Pedruzzi et al., 1998).
II.1.1.2.2 Mesure du produit lipidique
Dans ce cas, la radioactivité est incorporée au groupement phosphatidyl du substrat.
Plusieurs acides gras ont été employés pour marquer la partie lipidique de la PC (oléique,
myristique, arachidonique, palmitique). L'activité PLD est déterminée par la mesure de la
radioactivité liée à l'acide phosphatidique (PA) libéré après activation de la PLD. Toutefois,
cette technique de mesure de l'activité PLD présente certaines limitations. Dans la cellule, le
PA peut être rapidement converti en diacylglycérol (DAG) par une phosphatidate
phosphohydrolase, ou transformé en un acide lysophosphatidique (LPA) par une
phospholipase A2 (PLA2). Le PA peut également être utilisé pour la synthèse de
phosphatidylglycérol et de phosphatidylinositol. De plus il peut provenir d'une
32
phosphorylation du DAG par une DAG-kinase ou résulter de la voie de biosynthèse des
phospholipides. Sa mesure ne reflète donc pas toujours de façon certaine une activité PLD.
Afin de remédier à cela il est possible d'utiliser la propriété de transphosphatidylation de la
PLD. C'est une méthode de mesure sensible et hautement spécifique de l'activité enzymatique
de la PLD (Morris et al., 1997). En présence d'un alcool primaire à chaîne courte (éthanol,
propanol-1, butanol-1), comme décrit précédemment, la PLD catalyse une réaction de
transfert du groupe phosphatidyl sur l'alcool pour produire de la choline et un
phosphatidylalcool au dépens du PA. L'emploi d'un alcool (à des concentrations de 0,2 à 2%)
empêche toute confusion avec le PA issu du DAG, et le phosphatidylalcool formé reflète
spécifiquement une activité PLD (Randall et al., 1990; Cook and Wakelam, 1992).
Pour mesurer l'activité de transphosphatidylation on peut utiliser un alcool primaire marqué
au tritium (Randall et al., 1990) ou une PC marquée sur le groupe phosphatidyl avec des
acides gras insaturés comme le [3H]-oléate, le [3H]-arachidonate,… ou saturés tels que le
[3H]-palmitate, le [3H]-myristate,… qui s'incorporent majoritairement dans le pool des PC
(Huang and Cabot, 1990). Le [3H]-alkyl-2-lyso-PC, appelé aussi lyso-PAF, permet également
de marquer sélectivement le pool de PC et de mesurer de façon spécifique l'acitivité PC-PLD.
Les phosphatidylalcools sont extraits dans la phase organique et séparés des autres
phospholipides par chromatographie sur couche mince ou par HPLC.
II.1.1.3 Purification
Plusieurs tentatives de purification de la PLD à homogénéité ont échoué,
principalement à cause d’une perte de l’activité enzymatique au cours des différentes étapes
de la purification. Cependant, ces études ont permis de mettre en évidence l’existence de
plusieurs isoformes différentes de PLD ayant des mécanismes de régulation distincts. Kanfer
et ses collègues ont partiellement solubilisé une PLD de 200 KDa à partir des membranes de
cerveau de rat. Son activité est optimale à PH 6, stimulée par l’oléate de sodium et faiblement
activée par le calcium et le magnésium à des concentrations comprises entre 1 et 10 mM.
Cependant, le calcium utilisé à des concentrations physiologiques (0,1-1 µM), n’a pas d’effet
sur l’activité (Saito and Kanfer, 1975; Taki and Kanfer 1979; Kanfer 1980; Chalifour and
Kanfer 1982; Kobayashi and Kanfer 1987; Chalifa et al., 1990). Une activité PLD
partiellement purifiée à partir des membranes de cellules HL-60 est stimulable par PIP2 et la
petite protéine G ARF (ADP Ribosylation Factor), mais pas par l’oléate de sodium (Brown et
al., 1993). Ensuite, Massenburg et al. ont rapporté la présence de deux activités PC-PLD dans
le cerveau de rat: une PLD activable par ARF qui requiert du PIP2, et l’autre activable par
33
l’oléate de sodium non stimulée en présence de PIP2 (Massenburg et al., 1994). Ce n’est
qu’en 1994 qu’Okamura et Yamashita ont pu purifier une PLD à homogénéité, à partir de
microsomes de poumon de porc. La PLD isolée présente des propriétés très proches de celle
de la PLD de cerveau de rat. Elle a une masse moléculaire apparente de 190 KDa et son pH
optimal est de 6,6. Elle est stimulée par 1 mM de calcium et 2 mM de magnésium. Cette
activité PLD est stimulée par l’acide oléique et ne requiert pas de PIP2, ni de petite protéine
G. Une autre PLD de 95 KDa, partiellement purifiée à partir de cerveau de porc, est activable
par PIP2, ARF, et Rho. (Brown et al., 1995).
II.1.2 Clonage et caractérisation des PLD
Les PLD de plusieurs espèces procaryotes et eucaryotes ont été clonées. Le premier
gène humain codant une isoforme dénommée PLD1 a pu être isolé à partir d’une banque
d’ADN complémentaire de cellules HeLa, par homologie de séquence avec celui de la levure
(Hammond et al., 1995). L’alignement de cinq séquences de PLD représentatives de chaque
règne (vertébrés, invertébrés, champignons, végétaux et bactéries) révèle la présence de
caractéristiques communes. La comparaison du gène hPLD1 avec ses homologues clonés
dans d’autres espèces, montre qu’il fait partie d’une famille de gènes hautement conservés
chez les eucaryotes (Liscovitch et al., 2000). Tous les gènes eucaryotes de PLD clonés à ce
jour possèdent un centre catalytique très conservé, entouré de régions N-terminales et C-
terminales de séquence plus variable. Le gène de la hPLD1 code une protéine de 1072 acides
aminés correspondant à une masse moléculaire de 120 KDa. Cette protéine présente une
activité PLD PC-spécifique (hydrolyse et transphosphatidylation). La PLD1, caractérisée par
une activité basale faible, est activée par trois classes d’effecteurs: les protéines G de la
famille ARF, les protéines G de la famille Rho et plusieurs membres de la famille des
protéines kinases C (PKC). Elle nécessite la présence de PIP2 et elle est inhibée par l’oléate
(Hammond et al., 1995). La PLD1 présente deux variants, PLD1a et PLD1b, produits par
épissage alternatif. PLD1b comporte une délétion de 38 acides aminés (résidus 585 à 624) par
rapport à PLD1a (Hammond et al., 1997; Katayama et al., 1998). Ces deux variants
d’épissage présentent la même structure et les mêmes caractéristiques d’activité et de
sensibilité aux effecteurs.
Après le clonage de PLD1 d'autres séquences homologues ont été identifiées chez les
mammifères (Ribbes et al., 1996). La séquence complète d'une nouvelle PLD appelée PLD2 a
été décrite (Colley et al., 1997b; Kodaki and Yamashita, 1997). C'est une protéine de 932
34
acides aminés, d'une masse moléculaire de 100 kDa environ, et présentant 50 à 53%
d'homologie de séquence avec PLD1. PLD2 est délétée d'une boucle centrale de 116 acides
aminés présente dans PLD1 juste en aval de la triade catalytique HKD du motif I (hPLD1a
∆505-620) (Figure 2). De plus PLD1 et PLD2 diffèrent également dans leurs parties C-
terminale et N-terminale. Trois variants d'épissage de la PLD2 humaine ont été décrits à ce
jour. Le variant le plus long est hPLD2a. Il existe un variant plus court de 11 acides aminés
(hPLD2a ∆810-820) dénommé hPLD2b et un variant tronqué ne conservant que les 335
premiers acides aminés de la séquence (hPLD2a ∆336-932), nommé hPLD2c (Steed et al.,
1998). Même si la PLD2 a pour substrat majeur la phosphatidylcholine et si elle nécessite du
PIP2 comme la PLD1, elle est régulée différemment. La PLD2 a une activité basale élevée
qui est peu ou pas stimulée par les protéines activatrices de PLD1 (Colley et al., 1997a;
Kodaki and Yamashita, 1997; Lopez et al., 1998).
Figure 2 : Représentation schématique des 2 isoformes de PLD (PLD1 et PLD2).
Les rectangles représentent les séquences très conservées dans les PLD de mammifères (CRI, HKD,
CRIII et domaines PH et PX) ou la région unique de la PLD1 (boucle ou « loop »).
Certains travaux ont décrit une activation de PLD2 par PKC mais d'une amplitude plus faible
que celle de PLD1 (Han et al., 2002; Chen and Exton, 2004). Le groupe de Colley et Frohman
a montré que les PLD2 humaines et murines ne sont pas activables par les petites protéines G
de la famille Rho ni par la PKCα. La sensibilité de la PLD2 à ARF est variable dans
différentes espèces. En effet, alors qu’ ARF n’a aucun effet sur la PLD2 murine in vitro
(Jenco et al., 1998), il a été montré que la PLD2 humaine est activée par cette protéine mais à
35
un degré moindre que la PLD1 (1,5 fois pour la PLD2 contre 50 à 100 fois pour la PLD1)
(Lopez et al., 1998).
II.1.3 Structure primaire des phospholipases D
II.1.3.1 Motifs HKD et mécanismes catalytiques
La séquence peptidique de la PLD montre quatre domaines fortement conservés entre
les diverses isoformes et entre espèces (Figure 3) (nommés CRI à CRIV) pouvant être soit des
sites catalytiques soit des motifs de liaison à des cofacteurs ou des activateurs de la PLD.
Deux domaines particuliers (II et IV) ont été nommés «HKD» parce qu’ils contiennent
chacun un motif chargé invariable «HxKxxxxD/E» (Hammond et al., 1995). Ces motifs sont
caractérisés par la présence de résidus conservés (histidine, lysine et acide aspartique) qui sont
indispensables à la catalyse in vitro et pour le fonctionnement de la PLD in vivo (Sung et al.,
1997). De plus, il a été montré dans les cellules Cos7 que la délétion de l’un de ces motifs
provoque la perte de l’activité catalytique de l’enzyme. Cette activité peut être restaurée par la
cotransfection de ce mutant de délétion avec le domaine manquant de l’enzyme. Ceci
s’explique par le fait que les deux parties N et C-terminales peuvent s’associer physiquement
lorsqu’elles sont exprimées dans les cellules Cos7 (Xie et al., 2000).
Figure 3 : Domaines I-IV conservés chez les PLD de différentes espèces (d'après Cockcroft et al., 2001).
36
Toutes ces observations ont permis d’établir un modèle de catalyse théorique qui met en jeu
un intermédiaire phosphatidyl-enzyme selon un mécanisme ping-pong (Figure 4) (Sung et al.,
1997).
Figure 4 : Modèle de mécanisme catalytique des PLD.
Au commencement du cycle (bas de la figure au centre), l’histidine du motif HKD amino-terminal est
protonnée alors que celle du carboxy-terminal ne l'est pas. La première moitié de la réaction conduit
à la formation d'un intermédiaire PA-PLD et la choline est ensuite libérée. La seconde moitié de la
réaction conduit à la rupture de la liaison entre l'enzyme et le PA ou le Phosphatidylalcool,
respectivement, selon la nature de l’accepteur nucléophile H2O ou alcool primaire (McDermott et al.,
2004).
Les PLD de mammifères n’ont pas encore pu être cristallisées. Cependant, la structure
cristalline des PLD bactériennes a pu être étudiée par la méthode de dispersion anormale
multi-longueur d'ondes (MAD). Ainsi, le modèle structural déterminé pour NUC (Leiros et
37
al., 2000; Stuckey et Dixon, 1999) (Figure 5) issue de Salmonella typhimurium, a confirmé la
nécessité d'une dimérisation de deux monomères comportant chacun une triade catalytique
HKD pour obtenir un site actif. Il est à noter que le résidu aspartate très conservé du motif
HKD ne participe pas à la catalyse puisqu’il est situé loin du site actif de l’enzyme.
Figure 5 : Structure tridimensionnelle de la protéine Nuc dimérisée.
Forme catalytique de NUC obtenue à l'aide du programme MOLSCRIPT (Stukey et Dixon, 1999). Les
deux monomères sont représentés respectivement en jaune et bleu. Les flèches représentent des
feuillets β et les hélices sont des hélices α. Les résidus conservés sont représentés en couleur et
reportés au bas de la structure.
II.1.3.2 Les régions conservées I et III
Des mutations effectuées dans le domaine CRI de la PLD1 ont montré que certains des
acides aminés sont indispensables au fonctionnement de l’enzyme (Sung et al., 1999b).
Cependant la délétion de cette région n’affecte ni l’activité enzymatique ni la dépendance de
cette enzyme envers le PIP2.
Le motif «IYIENQFF» dans le domaine CRIII est important pour l’activité catalytique
puisque les mutations de la tyrosine en sérine, cystéine ou isoleucine, diminuent l’activation
38
de l’enzyme. De plus, le domaine CRIII est enrichi en résidus aromatiques, comme le
domaine de liaison à la choline présent dans le récepteur à l’acétylcholine (Harel et al., 1993;
Gilson et al., 1994). Ainsi le domaine CRIII pourrait faciliter la catalyse ou plus
vraisemblablement limiter la spécificité de la PLD aux phospholipides qui portent un
groupement polaire de type choline (Frohman et al., 1999). Cette région code également une
séquence consensus de liaison à la cavéoline, ØxØxxxxØ, où Ø est un acide aminé
aromatique (Okamato et al., 1998).
II.1.3.3 Les domaines PH et PX
Il existe dans la région N-terminale des PLD adjacente au CRI une séquence
significativement semblable à la séquence consensus des domaines PH, ou domaines
d’homologie à la pleckstrine (Steed et al., 1998). Les domaines PH permettent généralement
une interaction spécifique des protéines avec les inositides diphosphorylés possédant leurs
phosphates en position vicinale, comme le PIP2 (Hodgkin et al., 2000). Cependant, l’analyse
de mutants de délétion de la partie N-terminale de PLD1 et PLD2 contenant le domaine PH a
révélé qu’il n’est ni nécessaire à l’activité enzymatique, ni à la dépendance envers le PIP2
(Sung et al., 1999a; Sung et al., 1999b; Hoër et al., 2000), ce qui implique la présence d’un
autre domaine de liaison au PIP2 responsable de l’activation de l’enzyme par ce
phosphoinositide (Sciorra et al., 1999). Le domaine PH des PLD semble jouer un rôle dans la
localisation subcellulaire de la protéine. La délétion de ce domaine supprime l’association de
la PLD avec la membrane (Sciorra et al., 2002).
Les PLD possèdent dans leur partie N-terminale un domaine ressemblant de façon
significative à un domaine PX, ou domaine d’homologie à PHOX (Ponting and Kerr, 1996;
Liscovitch et al., 2000). Les domaines PX ont été décrits comme impliqués dans une grande
variété d’interactions protéine-protéine incluant la liaison à des kinases ou des domaines SH3.
Il a été récemment montré que ces domaines peuvent fixer PI3P, PI(3,4)P2, PI(4,5)P2,
PI(3,5)P2, PI(3,4,5)P3 (Xu et al., 2001). Des mutations ponctuelles de la PLD1 ont suggéré
que le domaine PX n’est pas essentiel pour la catalyse in vitro. Cependant, les PLD1 mutées
dans le domaine PX présentent une activité basale plus élevée in vivo, qui peut être stimulée
par le PMA mais moins que celle de la PLD1 sauvage (Sung et al., 1999b). Très récemment,
on a montré que le domaine PX de PLD1 peut lier le PI5P et cibler la protéine vers les
vésicules d’endocytose (Du et al., 2003). Les domaines PX qui possèdent un acide aminé
basique en position centrale (Lysine ou Arginine en position 58) lient plus particulièrement le
PI3P (Ellson et al., 2002). Les PLD possèdent une lysine à cette position. Comme la PLD1
39
intacte peut fixer le PI3P mais que cela n’est pas dû au domaine PH (Hodgkin et al., 2000), le
domaine PX pourrait être responsable de la liaison de ce lipide.
II.1.3.4 La boucle centrale de PLD1
La PLD1 possède une région de 100 à 150 acides aminés au centre de la protéine (aa
505-620), absente de la PLD2 ou des PLD des organismes inférieurs (Hammond et al., 1995;
Colley et al., 1997a). Cette région appelée «boucle» aurait une activité régulatrice négative:
d’une part, la délétion de la région «boucle» ou de la partie N-terminale de la PLD1 provoque
une augmentation de l’activité basale de l’enzyme et ceci suggère que ces deux régions sont
des domaines de régulation négative qui permettent de maintenir l’activité PLD1 basale à un
niveau faible. D’autre part, l’activité basale de la PLD2, qui ne possède pas de séquence
boucle, est très élevée. Cette boucle au centre de PLD1 serait donc impliquée dans un
mécanisme d’autoinhibition, levée par les activateurs de l’enzyme.
II.1.3.5 Le domaine de liaison au PIP2 ou «motif polybasique»
Les activités PLD1 et PLD2 sont fortement dépendantes du PIP2. Un domaine de
liaison au PIP2 situé entre les deux domaines HKD a été identifié. L’association de ce
domaine avec le PIP2 est nécessaire à l’activité enzymatique des PLD de levure et de
mammifères, ce qui suggère que ce domaine est responsable de la dépendance des PLD
envers le PIP2 (Sciorra et al., 1999). Ce domaine contient un motif riche en acides aminés
aromatiques et basiques (motif polybasique).
II.1.3.6 Les séquences amino- et carboxy-terminales
Les séquences amino-terminales des PLD de nombreuses espèces, de la levure à
l’homme, sont relativement peu conservées et semblent tolérer des modifications comme la
fusion à d’autres protéines telles que la protéine fluorescente verte (GFP). Ces modifications
n’influent pas sur l’activité PLD (Hammond et al., 1995; Sung et al., 1997). Dans cette partie
N-terminale de la PLD1 se trouve une zone qui serait impliquée dans la régulation par la PKC
(Xie et al., 1998; Sung et al., 1999b). En effet, des mutants de PLD1 délétés de leur partie N-
terminale perdent leur sensibilité aux esters de phorbol, puissants activateurs des PKCs. Par
contre la partie N-terminale de PLD2 semble nécessaire à son activité basale. La délétion des
308 premiers acides aminés de cette région conduit à une enzyme de faible activité basale qui,
de façon surprenante, devient sensible à l'activation par ARF.
40
La séquence C-terminale est plutôt conservée et l'activité enzymatique semble très
sensible aux modifications de cette région (Sung et al., 1999a et 1999b). L’analyse de
différentes protéines chimères de la PLD1 et de la PLD2, suggère que le domaine
interagissant avec ARF se trouve dans l’extrémité C-terminale des PLD. La séquence C-
terminale de PLD1 est indispensable pour l’interaction avec Rho (discuté plus en détail dans
la partie «Régulation»).
II.1.4 Régulation des PLD
II.1.4.1 Régulation par le PIP2
II.1.4.1.1 Rôles physiologiques de PIP2
Le phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (PIP2) est connu comme précurseur de
seconds messagers dans plusieurs voies de signalisation. Ainsi l’hydrolyse de PIP2 par la
phospholipase C libère de l’inositol-trisphosphate (IP3), responsable de la mobilisation du
calcium des compartiments intracellulaires, et du diacylglycérol (DAG), un activateur des
PKC. Le PIP2 est aussi par lui-même un second messager impliqué dans plusieurs fonctions
cellulaires incluant le trafic vésiculaire, l’exocytose, la formation des adhésions focales et la
régulation du cytosquelette d’actine (Hinchliffe et al., 1998) (Figure 6).
La production de PIP2 est assurée par les phosphatidylinositol phosphate kinases (PIP
kinases). Ces dernières sont divisées en trois sous-familles: les types I, II et III. Les PIP
kinases de types I et II comportent chacune trois isoformes α, β et γ (Ishihara et al., 1996;
1998; Itoh et al., 2000; Loijens and Anderson; 1996). Les PIP kinases de type I sont des
PI(4)P 5-kinases qui produisent le PI(4,5)P2 à partir de PI(4)P, alors que les PIP kinases de
type II sont des PI(5)P 4-kinases qui utilisent le PI(5)P comme substrat pour former le
PI(4,5)P2 (Rameh et al., 1997). Les PIP kinases de type III sont des PI(3)P 5-kinases qui
produisent le PI(3,5)P2 en utilisant le PI(3)P comme substrat (Gary et al., 1998; Sbrissa et al.,
1999). Les PIP kinases de type I ont été localisées dans la membrane plasmique, les «ruffles»
(ou fronces membranaires), le Golgi, le noyau et les adhésions focales (Boronenkov et al.,
1998; Godi et al., 1999; Di Paolo et al., 2002; Ling et al., 2002). Elles jouent un rôle dans la
sécrétion, l’endocytose et le réarrangement du cytosquelette d’actine, (Hay et al., 1995;
Shibasaki et al., 1997; Di Paolo et al., 2002). Les PIP kinases de type II ont été retrouvées
dans le cytosol, le réticulum endoplasmique et le noyau. Contrairement aux PIP kinases de
type I, elles ne régulent pas la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les PIP kinases de
41
types I et II ont des localisations subcellulaires différentes et ciblent ainsi la production de
PIP2 au niveau des sites subcellulaires spécifiques riches en protéines effectrices du PIP2.
(Doughman et al., 2003).
Figure 6: Production de PIP2 au niveau de plusieurs sites cellulaires.
Divers processus cellulaires comme l’endocytose, l’exocytose, la réorganisation du cytosquelette
d’actine (lamellipodes, adhésions focales et fibres de stress) et autres nécessitent une synthèse locale
du PIP2 (Doughman et al., 2003).
Le PIP2 est capable de lier les protéines ayant des domaines PH (Harlan et al., 1994). Les
domaines PH sont retrouvés dans de nombreuses protéines intervenant dans la signalisation
cellulaire dont les PLCγ et PLCδ, certaines PKC, Ras-GAP, Db1 (facteur d’échange des
protéines Rho) et dans des protéines appartenant au cytosquelette dont la fodrine, l’α-actinine.
Cependant, l’affinité du domaine PH pour le PIP2 est très variable en fonction des protéines
considérées (Boivin and Lecomte, 1997). Il est à noter que le domaine PH de PLCδ (PH-
PLCδ) fusionné à la GFP a servi comme sonde spécifique de PIP2 et a permis d’étudier sa
42
localisation dans les cellules vivantes (Balla et al, 2000). Il existe aussi des anticorps
spécifiques de PIP2 qui permettent son immunolocalisation. Il a ainsi été déterminé que la
synthèse et la dégradation du PIP2 sont régulées de manière spatio-temporelle lors des
différents processus cellulaires impliquant ce phospholipide.
II.1.4.1.2 PIP2 et cytosquelette d’actine
Le PIP2 est connu pour interagir avec au moins 30 protéines liant l’actine, régulant
ainsi la polymérisation de l’actine et la formation des ruffles ou des fibres de stress. Par
exemple le PIP2 peut interagir avec la profiline, protéine de sequestration des monomères
d’actine G, la gelsoline, une protéine de «capping» et de sectionnement des filaments
d’actine, l’actinine-α, une protéine d’empaquetage, et la taline une protéine d’adhésion focale
(Janmey et al., 1999). Une surexpression de la PIP kinase Iα dans les cellules COS-7 induit
une polymérisation massive d’actine (Shibasaki et al., 1997). Gilmore et Burridge (1996) ont
montré que l’injection des anticorps anti-PIP2 dans les fibroblastes inhibe la formation des
fibres de stress et des adhésions focales induite par l’acide lysophosphatidique (LPA) via la
protéine Rho. La surexpression de la synaptojanine, une PIP2-5 phosphatase, diminue le
nombre des fibres de stress dans les cellules COS-7 (Sakisaka et al., 1997). Inversement, dans
les cellules CV1, la surexpression de la PIP kinase Iβ augmente le nombre de fibres de stress
de manière Rho dépendante (Yamanoto et al., 2001).
II.1.4.1.3 PIP2 et PLD
Les premières constatations de l’importance de PIP2 comme cofacteur dans
l’activation de la PLD ont été réalisées sur des vésicules artificielles de PE/PC, contenant ou
pas ce phosphoinositide. Dans les cellules U937, l’utilisation d’anticorps qui bloquent la
PI(4)P 5-kinase, et par conséquent la synthèse de PIP2, inhibe complètement l’activité PLD
stimulable par le GTPγS (Pertile et al., 1995). L’utilisation de la néomycine, un antibiotique
capable de fixer le PIP2 avec une grande affinité, provoque une inhibition de l’activité PLD
dans les cellules neuronales, les cellules HL60 et les neutrophiles (Liscovitch et al., 1991;
Geny and Cockcroft, 1992; Ohguchi et al., 1996). Les deux isoformes PLD1 et PLD2
requièrent du PIP2 pour leur activation (Colley et al., 1997a; Hammond et al., 1997). Il est
possible que le PIP2 interagisse avec les PLD sur le motif polybasique entre les deux
domaines HKD (Sciorra et al., 1999) mais pas sur le domaine PH qui n’est pas impliqué dans
l’activation des PLD par le PIP2 (Hoër et al., 2000). Les PLD1 et PLD2 pourraient interagir
43
directement avec la PI(4)P 5-kinase α. De plus la PLD2 est capable de recruter cette kinase à
la membrane (Divecha et al., 2000). Le PIP2 est nécessaire à l’effet stimulant de la PKC et
des petites protéines G ARF et RhoA sur la PLD recombinante, la PLD des membranes de
cerveau de rat ou de porc, et de cellules HL-60 (Massenburg et al., 1994; Brown et al., 1995 ;
Kuribara et al., 1995 ; Ohguchi et al., 1996 ; Hammond et al., 1997).
II.1.4.2 Régulation par les petites protéines G
Les GTPases monomériques forment une super-famille de 150 membres environ, dont
les masses moléculaires varient de 20 à 30 KDa. Ces protéines possèdent un motif consensus
de liaison au GTP. Elles sont classées, en fonction de leurs homologies de séquence en 5
familles: Ras, Rho, Rab, ARF et Ran. (Tableau 1). La phospholipase D est activée par les
petites protéines G Rho et ARF.
II.1.4.2.1 Régulation par les protéines Rho
II.1.4.2.1.1 Les protéines de la famille Rho
Les protéines Rho les mieux connues sont RhoA, Rac1 et Cdc42. Les protéines Rho
existent sous deux formes distinctes, l’une active se liant au GTP et l’autre inactive se liant au
GDP. Dans le cytosol, les protéines Rho sont liées par leurs extrémités C-terminale aux
inhibiteurs de dissociation de GDP (GDIs) qui les maintiennent sous forme inactive. Lors de
l’activation, les protéines Rho sont transloquées aux membranes où les facteurs d’échange
GEF (guanine nucleotide exchange factor) favorisent la dissociation du GDP et la liaison du
GTP. Les protéines Rho peuvent alors activer leurs protéines effectrices. Il existe aussi des
protéines activatrices de l’activité GTPase (GAP) qui favorisent le retour des protéines Rho à
leur état inactif. Les protéines de la famille Rho sont activées et transloquées du cytosol vers
la membrane après fixation de nombreux agonistes dont le LPA, l’endothéline-1, la trombine
et l’insuline sur leurs récepteurs. Le mécanisme par lequel ces agonistes activent les protéines
Rho n’est pas bien compris, mais plusieurs expériences laissent penser que des PKC, des
tyrosines kinases, des PI-3 kinases et surtout les sous-unités α et βγ de protéines G
hétérotrimériques pourraient être impliquées (Exton, 1999). En particulier, la sous-unité α des
protéines G hétérotrimériques G13 est capable d’activer directement un facteur d’échange de
Rho, P115-RhoGEF (Hart et al., 1998; Kozasa et al., 1998). Plusieurs autres études ont
montré que les protéines Gαq/11, Gα12 ou Gα13 peuvent activer les protéines Rho (Seasholtz et
al., 1999). L’activation de Gq peut résulter en l’activation de PKC, et il semble que les PKC
44
pourraient phosphoryler Gα12 et Gα13 suggérant ainsi une voie de régulation des protéines Rho
par Gαq (Kozasa and Gilman, 1996; Offermanns et al., 1996).
Ras
Family
Rho
Family
Rab
Family
Sar1/Arf
Family
Ran
Family
Mammal Ha-Ras
Ki-Ras
N-Ras
R-Ras
M-Ras
RalA
RalB
Rap1A
Rap1B
Rap2A
Rap2B
Tc21
Rit
Rin
Rad
Kir/Gem
Rheb
ΚB-
Ras1
ΚB-
Ras2
RhoA
RhoB
RhoC
RhoD
RhoE/
Rnd3/
Rho8
RhoG
RhoH/
TTF
Rac1
Rac2
Rac3
Cdc42
Rnd1/
Rho6
Rnd2/
Rho7
Tcl0
Rab1A
Rab1B
Rab2
Rab3A
Rab3B
Rab3C
Rab3D
Rab4
Rab5A
Rab5B
Rab5C
Rab6
Rab7
Rab8
Rab9
Rab10
Rab11A
Rab11B
Rab12
Rab13
Rab14
Rab15
Rab16
Rab17
Rab18
Rab19
Rab20
Rab21
Rab22
Rab23
Rab24
Rab25
Rab26
Rab27A
Rab27B
Rab28
Rab29
Rab30
Rab31
Rab32
Rab33A
Rab33B
Arf1
Arf2
Arf3
Arf4
Arf5
Arf6
Sar1a
Sar1b
Arl1
Arl2
Arl3
Arl4
Arl5
Arl6
Arl7
Ard1
Ran
Yeast Ras1
Ras2
Rsr1
Yct7
Rho1
Rho2
Rho3
Rho4
Cdc42
Yns0
Ypt1
Sec4
Ypt31/
Ypt8
Ypt32/
Ypt9
Ypt51/
Vps21
Ypt52
Ypt53
Ypt6
Ypt7
Ypt10
Ypt11
Arf1
Arf2
Arf3
Sar1
Arl1
Arl2
Cin4
Gsp1
Gsp2
Tableau 1 Les familles des petites protéines G (Takai et al., 2001)
45
II.1.4.2.1.2 Rôles physiologiques de Rho
Les protéines Rho contrôlent une multitude de processus biologiques incluant la
prolifération, la régulation de la transcription génique (Hill et al., 1995; Fukuhara et al.,
1999), la différenciation myogénique (Carnac et al., 1998; Takano et al., 1998; Wei et al.,
1998) et surtout le réarrangement du cytosquelette (Van Aelst and D’Souza-Schorey, 1997).
RhoA, Rac et Cdc42 sont les trois GTPases monomériques modulatrices du cytosquelette
d’actine. Cdc42 est responsable de la formation des filopodes, protrusions ou extensions
cytoplasmiques à l’avant de la cellule (Kozma et al., 1995; Nobes and Hall, 1995). Rac1 est
responsable de la formation des lamellipodes et des «ruffles», par son action au niveau du
réseau d’actine corticale (Ridley et al., 1992). RhoA est impliquée dans la formation des
adhésions focales et des fibres de stress, faisceaux de filaments d’actine qui traversent la
cellule de part en part (Nobes and Hall, 1995; Mackay and Hall, 1998) (Figure 7).
Figure 7 : Implication des protéines G de la famille Rho dans le réarrangement du cytosquelette.
Les protéines RhoA, Rac et Cdc42 sont respectivement impliquées dans la formation des fibres de
stress, des lamellipodes et "ruffles", et des filopodes. Les différents agonistes agissant en amont des
protéines G dans les fibroblastes Swiss 3T3 sont indiqués (Takai et al., 2001).
46
Une toxine bactérienne, l’exoenzyme C3 de Clostridium botulinum, qui inactive Rho par une
ADP-ribosylation, a été utilisée pour montrer les différentes fonctions de Rho. Ainsi
l’utilisation de cette toxine a suggéré le rôle de Rho dans le remaniement du cytosquelette
d’actine (Chardin et al., 1989; Paterson et al., 1990). L’implication de Rho dans la formation
des fibres de stress et des adhésions focales a été montrée dans les fibroblastes soit par
surexpression de mutants dominants négatifs ou des RhoGDIs (Ridley and Hall, 1992; Miura
et al., 1993; Ridley and Hall, 1994), soit par microinjection d’un mutant constitutivement actif
de Rho, RhoV14 (Ridley and Hall,1992). Plusieurs études ont montré que les protéines Gα12
et Gα13 contrôlent la formation des fibres de stress Rho-dépendante (Buhl et al., 1995; Hooley
et al., 1996). Ainsi une microinjection des formes actives de Gα12 et Gα13 dans les cellules
Swiss 3T3 peut induire la formation Rho-dépendante des fibres de stress et des adhésions
focales (Gohla et al., 1998). Dans les fibroblastes, la formation des fibres des stress induite
par le LPA est médiée par Gα13 alors que celle induite par la thrombine et l’arginine-
vasopressine (AVP) est médiée par Gα12 (Gohla et al., 1999).
II.1.4.2.1.3 Les effecteurs de Rho
Le mécanisme moléculaire par lequel Rho induit le réarrangement du cytosquelette
d’actine n’est pas complètement connu. Plusieurs effecteurs de Rho ont été identifiés chez les
mammifères dont la Rho kinase (ROCK), Citron, Rhophilin, Rhotekin, P140mDia,
phospholipase D (Madaule et al., 1995; Reid et al., 1996; Watanabe et al., 1996; Bishop and
Hall, 2000). ROCK, une sérine/thréonine kinase, est un des effecteurs de Rho fortement
impliqué dans la formation des fibres de stress. Des mutants constitutivement actifs de ROCK
peuvent stimuler l’assemblage des fibres de stress (Aspenström P, 1999) alors que des
inhibiteurs de cette kinase empêchent la formation de ces fibres (Uehata et al., 1997). ROCK
induit la phosphorylation et donc active la chaîne légère de la myosine ou MLC «myosin light
chain» en inhibant la MLC-phosphatase (Kimura et al., 1996). ROCK peut aussi jouer le rôle
de MLC kinase et phosphoryle directement la MLC (Amano et al., 1996). ROCK peut ainsi
provoquer la formation des fibres de stress et/ou leur contractilité en activant la myosine. Elle
est capable aussi d’activer la LIM kinase, une protéine qui phosphoryle et inactive la cofiline.
Cette dernière est une protéine fixatrice de l’actine et dépolymérise les filaments d’actine
(Maekawa et al., 1999). La surexpression de LIM kinase induit la formation des fibres de
stress d’actine de manière ROCK-dépendante, en inhibant la dépolymérisation des filaments
d’actine. Quel que soit le mode d’action de ROCK, l’épaisseur, le nombre et la distribution
des fibres de stress induites par des mutants constitutivement actifs de ROCK sont clairement
47
différents de ceux induits par l’activation de Rho (Sahai et al., 1998; Watanabe et al., 1999),
indiquant ainsi l’implication d’autres effecteurs de Rho. La protéine P140 mDia, qui interagit
avec la profiline (protéine fixant les monomères de l’actine G), coopère avec ROCK pour
former les fibres de stress (Watanabe et al., 1999). De plus, l’activation de PI(4)P 5-kinase par
Rho a été aussi rapportée in vitro (Toker, 1998). D’autres études ont montré que Rho et Rac
stimulent la synthèse de PIP2 (Chong et al., 1994; Hartwig et al., 1995), lui-même impliqué
dans la formation des fibres de stress par sa liaison à des protéines fixatrices de l’actine. Le
mécanisme exact par lequel Rho active la PI(4)P 5-kinase n’est pas encore bien connu. Cela
pourrait être par interaction directe, mais aussi via l’activation de la phospholipase D et la
formation d’acide phosphatidique, un activateur de PI(4)P 5-kinase.
II.1.4.2.1.4 Rho et PLD
En 1991, Olson et al. ont été les premiers à mettre en évidence une régulation de la
PLD par les protéines de la famille Rho. Ces auteurs ont montré que l’effet activateur du
GTPγS sur la PLD dans des membranes de neutrophiles est supprimé par RhoGDI, inhibiteur
spécifique de la dissociation du GDP des protéines Rho. Il a ensuite été montré, dans des
études utilisant des membranes d’hépatocytes de rat, de cellules HL-60 ou bien de
neutrophiles, que RhoA était la protéine de la famille Rho la plus efficace sur la PLD
(Malcolm et al., 1994; Siddiqi et al., 1995; Kwak et al., 1995). De plus RhoA stimule aussi la
PLD dans des fractions d’autres cellules ou dans des préparations d’enzyme partiellement
purifiées (Provost et al., 1996; Balboa and Insel, 1995; Singer et al., 1995; Shimooku et al.,
1996). D’autres protéines de la famille de Rho peuvent activer la PLD1 recombinante: il
s’agit de Rac1 et Cdc42. Le rôle des protéines Rho en tant que régulatrices de la PLD a été
confirmé par l’utilisation de toxines comme l’exoenzyme C3 de C.botulinum qui inactive
spécifiquement RhoA, RhoB et RhoC en les ADP ribosylant en Asn41 (Sekine et al., 1989),
et les toxines de C.difficile et de C. sordelli qui inactivent plusieurs protéines de la famille
Rho en les glucosylant. L’utilisation de ces toxines a permis de montrer l’implication de Rho
dans la stimulation de la PLD par divers agonistes tels que le LPA, les esters de phorbol,
l’endothéline-1 et le PDGF dans les fibroblastes (Malcolm et al., 1996; Hess et al., 1997).
L’activation de la PLD par les agonistes est associée à la translocation de Rho vers les
membranes. Les toxines inhibent l’activité PLD en empêchant la translocation de Rho, soit en
le maintenant sous forme liée à RhoGDI (toxine C3), soit en bloquant la petite protéine G
sous une forme inactive liée au GDP. L’action de Rho sur la PLD est synergique avec celle
48
d’autres facteurs cytosoliques tels que les PKCα et ARF (Exton et al., 1997). Bien que
l’activation de la PLD par des protéines de la famille Rho soit bien établie, le mécanisme par
lequel ces protéines influencent la PLD restait controversé jusqu’aux expériences qui ont
montré que Rho interagit directement avec le domaine CRIV de PLD1 (Sung et al., 1997). Le
domaine d’interaction de la PLD1 avec RhoA se situe du côté C-terminal de la protéine au
niveau de la séquence des acides aminés 873-1024, particulièrement riche en résidus basiques
(Cai et Exton, 2001). Aucune activation directe de la PLD2 par Rho n’a pu être observée
(Sung et al., 1999a). Il est aussi possible que Rho active la PLD indirectement via l’activation
de ROCK, puisque l’inhibition de l’activité de la Rho kinase par des agents pharmacologiques
ou par expression de mutants catalytiquement inactifs bloque l’activation de la PLD via le
récepteur m3 de l’acétylcholine (Schmidt et al., 1999b). Cependant, le mécanisme par lequel
ROCK peut activer la PLD n’est pas encore connu. Une autre possibilité d’activation indirecte
de la PLD passe par l’effet de RhoA sur la PI(4)P 5-kinase qui régule la synthèse de PIP2
(Chong et al., 1994; Ren et al., 1996).
II.1.4.2.2 Régulation par les protéines ARF
II.1.4.2.2.1 Les protéines G de la famille ARF
Les petites protéines G ARF peuvent être groupées, selon leur structure, en trois
classes: la classe I incluant ARF1, ARF2, ARF3; la classe II incluant ARF4, ARF5 et la
classe III incluant ARF6 (Moss and Vaughan, 1998; Chavrier and Goud, 1999). Les protéines
ARF sont impliquées dans différentes fonctions cellulaires incluant le trafic vésiculaire (Moss
et al., 1998; Roth et al., 1999), et la sécrétion (D’Souza-Schorey et al., 1995; Radhakrishna
and Donaldson, 1997; D’Souza-Schorey et al., 1998; Zhang et al., 1998; Altschuler et al.,
1999). Ceci concerne principalement ARF6, qui est aussi impliquée dans la formation des
«ruffles» induites par Rac1 (Radhakrishna et al., 1999). Comme les protéines Rho, les
protéines ARF sont activées par les facteurs d’échange GEFs et inhibées par les GAPs, mais
elles ne dépendent pas des GDIs. Le lien entre les protéines G couplées à des récepteurs à sept
passages transmembranaires, les récepteurs à activité tyrosine kinase et l’activation des
protéines ARF n’est pas bien connu. L’implication des facteurs d’échange est tentante: l’un
des candidats est ARNO «ARF Nucleotide site Opener», qui dépend du PIP2 pour son
association à la membrane et sa capacité à activer les protéines ARF (Paris et al., 1997).
49
II.1.4.2.2.2 ARF et PLD
Des études utilisant le GTPγS, un analogue de GTP non hydrolysable qui maintient les
protéines G sous forme active, sur des cellules HL60 perméabilisées, ont permis de montrer
que l’activation de la PLD par le GTPγS requiert des facteurs cytosoliques (Anthes et al.,
1991). La purification de ces facteurs a permis d’identifier les protéines ARF comme facteurs
activateurs de la PLD (Brown et al., 1993; Cockcroft et al., 1994). L’activité de la PLD est
stimulée par ARF1, ARF3, ARF 5 et ARF6, c’est à dire toutes les classes des protéines ARF
(Brown et al., 1995; Caumont et al., 1998). La bréfeldine A est une toxine fongique inhibitrice
de l’échange GDP/GTP au niveau des protéines ARF, qui empêche donc son activation
(Donaldson et al., 1992; Helms and Rothman, 1992). Utilisée à de fortes concentrations, elle
détruit l’appareil de Golgi. L’inhibition par la bréfeldine A de l’activation de la PLD par de
nombreux agonistes incluant l’insuline (Shome et al., 1995; Shome et al., 1997), le PDGF,
l’angiotensine II, l’endothéline-1 (Shome et al., 2000) et les agonistes des recepteurs
muscariniques M3 (Rümenapp et al., 1995) démontre qu’in vivo, les protéines ARF doivent
être impliquées dans leur effet activateur. La stimulation de la PLD par des agonistes coïncide
avec une translocation des protéines ARF à la membrane (Hammond et al. 1997). Le domaine
N-terminal de ARF semble être impliqué dans l’activation de la PLD1. La myristylation de
ARF qui permet son association avec la membrane plasmique, augmente considérablement
l’activation de la PLD1 (Cockcroft et al., 1994; Brown and Sternweis, 1995). Les deux
variants d’épissage de hPLD1 et de rPLD1 sont activables par ARF (Hammond et al., 1995;
Hammond et al., 1997; Park et al., 1997; Min et al., 1998). La hPLD2 semble être activable
par ARF mais à un moindre degré (Lopez et al., 1998). L'activation de la PLD par ARF a été
détectée dans de nombreux compartiments subcellulaires: la membrane plasmique (Provost et
al., 1996; Whatmore et al., 1996), le noyau (Banno et al., 1997), l’appareil de Golgi
(Whatmore et al., 1996; Morgan et al., 1997), et le cytosol (Siddiqi et al., 1995). Dans le
Golgi, l'activité PLD sensible aux ARF apparaît comme impliquée dans le trafic vésiculaire.
II.1.4.3 Régulation par les protéines kinases C
Les protéines kinases C sont des sérine/thréonine kinases et peuvent être divisées en
trois sous-familles: Les PKC conventionnelles (PKCα, βI, βII et γ) activables par le calcium,
le DAG et la phosphatidylsérine (PS), les PKC nouvelles (PKCδ, ε, η, θ) activables par le
DAG et la PS mais indépendantes du calcium et les PKC atypiques (PKCζ, λ, et ι) activables
seulement par la PS. Les différentes isoformes de PKC ont des distributions tissulaires et
50
subcellulaires différentes, suggérant des fonctions physiologiques diverses (Hug and Sarre,
1993) incluant la différenciation.
II.1.4.3.1.1 PKC et PLD
L’activation de la PLD par les PKC a été démontrée dans de nombreux types
cellulaires en utilisant des esters de phorbol PMA (ou TPA). Ces esters de phorbol peuvent
activer les PKC conventionnelles et nouvelles selon un mécanisme similaire à l’activation par
le DAG. Cependant, la translocation des PKC à la membrane provoque aussi leur dégradation
par des protéases. Par conséquent, un traitement prolongé par le PMA provoque une
élimination complète de l’activité enzymatique, appelée rétrocontrôle négatif. Le traitement
prolongé par le PMA supprime la capacité de divers agonistes à stimuler la PLD dans
plusieurs types cellulaires (Exton, 1997). Cependant, dans certains cas, le rétrocontrôle
négatif des PKC ne provoque qu’une inhibition partielle de la stimulation de la PLD, ou n’a
pas d’effet, ce qui implique une activité PLD indépendante des PKC. D’autre part,
l’utilisation des inhibiteurs de PKC sélectifs comme la chélérythrine et le Ro-31-8220, ou
moins sélectifs comme la staurosporine et la sphingosine, bloque partiellement ou totalement
l’activation de la PLD par certains agonistes (Bosch et al., 1999; Khan and Hichami, 1999;
Slaaby et al., 2000). La surexpression de la PKCα ou β dans des fibroblastes augmente
l’activité PLD basale et stimulée par l’endothéline, la thrombine, et le PDGF (Pai et al., 1991;
Pachter et al., 1992; Eldar et al., 1993). La déplétion de la PKCα par transfection des ADNc
antisens dans les cellules MDCK, diminue l’activation de la PLD par les agonistes
purinergiques (Balboa et al., 1994).
II.1.4.3.1.2 Mécanismes d’activation de la PLD par les PKC
Tous ces résultats indiquent que les PKC jouent un rôle important dans la régulation
de l’activité PLD. Cependant, une question très débattue concerne le mécanisme d’activation
de PLD par les PKC: est-ce par une interaction protéine-protéine, ou est-ce par un mécanisme
dépendant de l’activité kinasique des PKC? Plusieurs travaux ont montré que l’activation de
la PLD par les PKC se fait en absence d’ATP. La PKCα est capable de reconstituer l’activité
PLD, en absence d’ATP, dans des cellules perméabilisées et déplétées de leur cytosol (Singer
et al., 1995). De plus, des expériences d’immunoprécipitation ont permis de montrer que le
traitement de fibroblastes NIH 3T3 par le PMA induit l’association de la PLD1 avec la PKCα
(Lee et al., 1997b). De même, des études récentes ont confirmé que l’activation de la PLD1
51
par le PMA se fait par une interaction de la PKCα avec la PLD1 plutôt que par un mécanisme
de phosphorylation (Hu and Exton, 2003). Enfin, il a été montré que le domaine régulateur de
la PKC est capable à lui seul de stimuler la PLD (Singer et al., 1996). Cette activation de la
PLD1 par une PKC est synergique avec celle induite par les protéines ARF et Rho (Singer et
al., 1996), et par le PIP2 (Ohguchi et al., 1996). Des expériences de mutagénèse dirigée ont
montré que la PLD1 interagit directement avec la PKCα via son domaine N-terminal (Xie et
al., 1998) mais indépendamment des domaines PH et PX (Sung et al., 1999b). Tous ces
résultats suggèrent que la PKCα module l’activité PLD par interaction directe. D’autres
études ont montré que la PKC phosphoryle la PLD1 in vivo (Kim et al., 2000). De plus,
l’activation de la PLD par les esters de phorbol est fortement diminuée par les inhibiteurs de
PKC, compétiteurs du site actif (Davis et al., 1989). Certains sites de phosphorylation ont été
identifiés dans la séquence de PLD1, dont le résidu Thr 137, qui apparaît important dans la
régulation de PLD1 par la PKC (Kim et al., 1999). La PLD2 a été initialement décrite comme
insensible aux PKC (Colley et al., 1997b). Néanmoins, des travaux récents ont montré une
activation de PLD2 par les esters de phorbol dans des cellules Sf9 co-exprimant la PKCα et la
PLD2 (Siddiqi et al., 2000). Dans des cellules PC12, la surexpression d'un mutant de PKCδ
dépourvu d'activité kinasique supprime l'activation et la phosphorylation de PLD2 par les
esters de phorbol. De plus l'inhibition spécifique de cette isoforme de PKC par la rottlerine,
abolit complètement l'activation par les esters de phorbol. Dans ce cas, l'activation de PLD2
par PKCδ se fait via une phosphorylation directe (Han et al., 2002).Très récemment, des
expériences ont pu montrer que La PKCα interagit in vivo avec la PLD2 et l’active suite à une
stimulation par le PMA. Cette activation de la PLD2 par la PKCα est accompagnée d’une
phosphorylation qui contribue à désactiver l’enzyme. Dans ce cas, l’activation de PLD2 par
PKCα se fait par une interaction protéine-protéine (Chen and Exton, 2004).
II.1.4.4 Régulation par les tyrosines kinases
Dans plusieurs types cellulaires, la PLD est activée après stimulation des cellules par
différents facteurs de croissance comme l’EGF et le PDGF qui possèdent des récepteurs à
activité tyrosine kinase intrinsèque (Cockroft et al., 1997). D’autres voies d’activation de PLD
mettent en jeu des tyrosines kinases cytosoliques. La tyrosine kinase v-src est capable
d’activer la PLD via l’oncogène p21 ras (Jiang et al., 1994).
52
II.1.4.5 Régulation par les ions calcium
L’implication du Ca2+ dans l’activation de la PLD a pu être montrée grâce à
l’utilisation d’ionophores de Ca2+, comme l’ionomycine et l’A23187, qui permettent
l’augmentation de la concentration du calcium intracellulaire, ou à celle de chélateurs de Ca2+
comme l’EGTA (chélateur du calcium extracellulaire) et le BAPTA (chélateur du calcium
intracellulaire). L’ionomycine et l’A23187 stimulent la PLD dans plusieurs types cellulaires
(Billah et al., 1989; Reihold et al., 1990; Liahi et al., 1992). Les chélateurs de calcium (EGTA
ou BAPTA) inhibent l’activation de la PLD par différents agonistes, dans plusieurs types
cellulaires (Pai et al., 1988; Kessels et al., 1991, Garcia et al., 1992). Ces études suggèrent que
la PLD peut être activée soit par la libération de Ca2+ du réticulum endoplasmique, soit par un
apport de Ca2+ extracellulaire, soit par les deux mécanismes, selon le type cellulaire
considéré. Cependant, dans certains systèmes cellulaires comme les fibroblastes stimulés par
l’EGF, le calcium n’est pas necessaire à l’activation de la PLD (Cook and wakelam, 1992).
Donc, il pourrait exister des PLD calcium dépendante ou indépendante. Cette activation de la
PLD par le calcium pourrait être directe, mais plus probablement indirecte par l’intermédiaire
d’autres protéines comme la calmoduline qui interagirait avec ARF pour activer la PLD
(Takahashi et al., 1996), les isoformes de PKC dépendantes du calcium ou les tyrosines
kinases (Earp et al., 1995; Yu et al., 1996; Ito et al., 1997).
II.1.4.6 Régulation par des facteurs inhibiteurs
Plusieurs protéines semblent avoir un rôle inhibiteur sur l’activité PLD mais leur rôle
physiologique en tant qu’inhibiteurs de PLD n’est pas encore clair. La fodrine, une protéine
du cytosquelette inhibe spécifiquement la PLD activée par ARF dans les cellules HL60
perméabilisées (Lukowski et al., 1996) en diminuant le taux de PIP et PIP2 membranaires
(Lukowski et al., 1998). La synaptojanine, une PIP2 5-phosphatase inhibe l’activité PLD en
diminuant la quantité de son cofacteur PIP2 (Chung et al., 1997). La protéine d’assemblage de
la clathrine spécifique des synapses, l’AP3, inhibe la PLD1 par interaction directe (Lee et al.,
1997a). Les amphiphysines I et II ont également été décrites comme inhibitrices des PLD
(Lee et al., 2000). La gelsoline, protéine fixatrice de l’actine, inhibe l’activation de la PLD par
la bradykinine dans les fibroblastes NIH 3T3 (Banno et al., 1999). Au contraire, Steed et al.
(1996) ont montré in vitro que la gelsoline interagit avec -et active - la PLD en absence de
nucléosides triphosphates. Les synucléines α et β inhibent de façon sélective la PLD2 (Jenco
et al., 1998). Dans le muscle cardiaque, l’α-actinine interagit avec la PLD2 en l’inhibant de
manière réversible et dépendante de ARF (Park et al., 2000). Il a également été montré que la
53
β-actine régule négativement la PLD1 et la PLD2 par interaction directe (Lee et al., 2001).
Des facteurs non protéiques pourraient réguler physiologiquement la PLD. Ainsi plusieurs
études ont montré l’inhibition de l’activité PLD par les céramides (Gomez-Munoz et al.,
1995; Venable et al., 1996; Abousalham et al., 1997).
II.1.5 Localisation des PLD
II.1.5.1 Localisation tissulaire
La distribution tissulaire des différentes isoformes de PLD est très variable. Les
isoformes issues du gène PLD1 ont une expression restreinte à certains tissus comme la
moelle épinière, le cerveau, le cœur, le placenta, la rate et le pancréas. Leur expression est
particulièrement faible dans les poumons, le thymus, la trachée, les ganglions lymphatiques et
les leucocytes (Steed et al., 1998). Les transcrits de PLD1 ne sont pas détectables dans le
muscle adulte de rat (Katayama et al., 1998). La PLD1b semble majoritairement exprimée et
le niveau relatif de la PLD1a varie selon les tissus (Steed et al., 1998; Katayama et al., 1998;
Millar et al., 1999). L’expression de PLD2 semble beaucoup moins restreinte. La hPLD2 est
fortement exprimée dans le placenta, le thymus, la prostate, les ovaires, la thyroide, la trachée
et la moelle épinière. Les mPLD2 et rPLD2 ont une répartition tissulaire semblable à celle de
la hPLD2, à l’exception du thymus et de la rate où cette enzyme est beaucoup plus abondante
chez l’homme que chez les rongeurs (Colley et al., 1997b; Kodaki and Yamashita, 1997). La
PLD2a est l’isoforme la plus abondante dans la plupart des tissus examinés (cerveau,
placenta, muscle, etc.).
II.1.5.2 Localisation subcellulaire
Les études de fractionnement subcellulaire démontrent la présence d’une activité PLD
dans différents compartiments cellulaires incluant la membrane plasmique (Whatmore et al.,
1996), l’enveloppe nucléaire (Balboa and Insel, 1995), le réticulum endoplasmique, l’appareil
de Golgi et les vésicules de transport et de sécrétion (Decker et al., 1996; Czarny et al., 1999).
La distribution de l’activité PLD stimulée par RhoA et ARF a été étudiée in vitro lors de
fractionnements subcellulaires de foie de rat (Provost et al., 1996). Cette étude montre que
l’activité PLD1 la plus importante est au niveau de la membrane plasmique, bien qu’une
activité significative soit également retrouvée au niveau du noyau et de l’appareil de Golgi.
Une autre étude montre que l’activité PLD stimulée par ARF est plus forte dans les
membranes du Golgi que dans les membranes du réticulum endoplasmique ou que dans la
54
membrane plasmique (Ktistakis et al., 1995). Cependant, la PLD1 surexprimée ne semble pas
colocaliser avec des marqueurs de Golgi, mais plutôt avec des marqueurs du réticulum, des
granules sécrétoires des lysosomes ou des endosomes tardifs (Colley et al., 1997a; Brown et
al., 1998, Toda et al., 1999). Par contre, Freyberg et al. (2001) ont montré que la PLD1
endogène est localisée au niveau de l’appareil de Golgi et du noyau en utilisant des anticorps
spécifiques. Ces auteurs suggèrent que la surexpression de la PLD1 peut causer une
localisation artefactuelle de l’enzyme, hors de l’appareil de Golgi, dans une classe hétérogène
de structures vésiculaires. Dans les cellules basophiles leucémiques de rat RBL-2H3
transfectées avec la PLD1b fusionnée à la GFP ou étiquetée par l’hémaglutinine (HA), la
PLD1b a été trouvée au niveau des granules de sécrétion et sous l’effet d’une activation
cellulaire, elle est transloquée à la membrane plasmique (Brown et al., 1998; Powner et al.,
2002). A l’inverse, dans les cellules chromaffines, la PLD1 est constitutivement retrouvée à la
membrane plasmique. Cependant, elle n’est active que lorsque la cellule est stimulée et que
ARF6 est transloquée des granules chromaffines vers la membrane plasmique (Caumont et
al., 1998). D’autre part, il a été montré que la PLD pouvait être activée par RhoA, ARF et
différents agonistes au niveau des noyaux dans plusieurs types cellulaires (Balboa et al., 1995;
Balboa and Insel, 1995; Baldassare et al., 1997). La PLD2 recombinante est localisée à la
membrane plasmique dans les cellules au repos et elle est redistribuée vers les compartiments
vésiculaires sous-membranaires lorsque les cellules sont stimulées (Colley et al., 1997b). La
PLD2 est associée aux microdomaines détergents-insolubles de la membrane plasmique (ou
rafts), qui sont associés ou non, selon le type cellulaire, aux caveolae (Czarny et al., 2000; Xu
et al., 2000). Une localisation de la PLD1 au niveau des microdomaines a été aussi rapportée
(Kim et al, 2000; Meacci et al., 2000; Xu et al., 2000; Diaz et al., 2002). Une activité «PLD-
like» a été détectée dans les mitochondries de cellules de mammifères. Elle hydrolyse
préférentiellement la phosphatidyléthanolamine (PE) en présence du calcium et ne catalyse
pas la réaction de transphosphatidylation (Madesh and Balasubramanian, 1997; Madesh et al.,
1997). De manière tout à fait intéressante puisqu’elle suggère un rôle physiologique de la
PLD, une association de la PLD1 avec le cytosquelette a aussi été rapportée. Dans les cellules
U937, la PLD1, activée par RhoA et ARF, peut s’associer avec une fraction insoluble à
l’octylglucoside qui correspondrait au cytosquelette puisqu’elle contient l’actine F, l’α-
actinine, la vinculine, la taline et la paxilline (Iyer and Kusner, 1999). Dans les cellules HL60,
la PLD1 est également retrouvée dans les fractions du cytosquelette insolubles au Triton X-
100 (Hodgkin et al., 1999). La PLD2 peut interagir directement avec l’α-actinine (Park et al.,
2000) et la β-actine (Lee et al., 2001). Plusieurs autres études ont montré que les PLD1 (Lee
55
et al., 2001; Powner et al., 2002) et PLD2 recombinantes (O’luanaigh et al., 2002; Honda et
al., 1999) colocalisent avec l’actine F corticale près de la membrane plasmique dans les
cellules PC12, les cellules COS-7, les cellules RBL-2H3. Ces diverses observations suggèrent
une implication de la PLD dans les processus de remaniement du cytosquelette.
II.1.6 Rôles physiologiques de la PLD et de son produit, l’acide
phosphatidique
De nombreux agonistes sont capables de stimuler la PLD: hormones,
neurotransmetteurs, facteurs de croissance, cytokines, antigènes et molécules d’adhésion
cellulaire (Exton, 1999; Rizzo et al., 2002) (Tableau 2). La mise en évidence d’une activation
de la PLD, après stimulation des cellules via des récepteurs membranaires, a permis
d’impliquer la PLD dans la transduction des signaux intracellulaires et de montrer que cette
enzyme était susceptible de jouer divers rôles physiologiques. On peut citer le trafic
vésiculaire (Ktistakis et al., 1996), l’exocytose et la sécrétion (Caumont et al., 1998; Vitale et
al., 2002; Gasman et al.,2003), la réorganisation agoniste-dépendante du cytosquelette (Cross
et al., 1996; Kam and Exton, 2001), la différenciation, la prolifération et la survie cellulaires
(Boarder MR, 1994; McDermott et al, 2004). L’action de la PLD sur son substrat majeur la
PC, aboutit à la production de PA et de choline. La choline est une molécule largement
répandue dans divers tissus, mais n’a pas, par elle-même, un rôle de second messager. Le PA
est considéré comme un second messager intracellulaire et peut être métabolisé en deux autres
seconds messagers: le DAG sous l’action d’une phosphatidate-phosphohydrolase (Jamal et
al., 1991) et le LPA sous l’action d’une PLA2 (Thomson and Clark, 1995). Le PA peut aussi
provenir de la phosphorylation du DAG par une DAG-kinase. Grâce à la propriété de
transphosphatidylation de la PLD, l’emploi d'un alcool primaire pour bloquer une réponse
physiologique donnée permet de montrer sans ambiguïté l’implication de la PLD, le
phosphatidylalcool formé reflétant spécifiquement une activité PLD (Cook and Wakelam,
1992). L’utilisation d’un alcool primaire peut toutefois présenter un inconvénient: l’alcool
pourrait par lui-même avoir un effet sur les processus de transduction cellulaire. Ainsi
l’utilisation en parallèle d’un alcool secondaire, qui n’est pas un substrat de la PLD, est
nécessaire comme contrôle pour évaluer d’éventuels effets aspécifiques.
56
Tableau 2 Activation de la PLD dans divers types cellulaires par différents agonistes (Rizzo et al., 2002).
Agonists Cell types
Agents acting via tyrosine kinase
receptors
EGF
b-FGF
Erythropoietin
HGF
Insulin
G-CSF, GM-CSF
NGF
PDGF
Prolactin
Agonists that act via G-protein-
linked receptors
Acetylcholine, carbachol
Angiotensin II
ATP, adenosine
Bradykinin
Endothelin
Epinephrine, norepinephrine
Glutamate
IL-8, f MLP
LPA
Vasopressin
Miscellaneous agents
Ca2+ ionophores
Phorbol esters
Fibroblasts (Rat 1, Rat 2, Swiss 3T3, 3Y1), epidermal (A431, HEL-37)
Fibroblasts (Rat-1, NIH 3T3), endothelium, osteoblast primary cultures, L6 myoblasts,
pancreatic acinar cells
Hematopoietic stem cell lines
Hepatocyte primary cultures
Fibroblasts (HIRcB), primary adipocytes, myoblasts and myotubes (L6)
Neutrophils
Pheochromocytoma (PC12)
Fibroblasts (Rat 1, Rat 6, 3T3-L1 pre-adipocytes, HIRcB, Swiss 3T3, 3T3-F44A, BHK),
vascular smooth muscle cells (A10)
Astrocytes
Secretory cells (submandibular acinar cells, adrenal glomerulosa cells), neuroblastoma
(SH-SY5Y), pheochromocytoma (PC-12), astrocytes, cardiac myocytes
Vascular smooth muscle cells (A10, primary cultures), hepatocyte primary cultures,
adrenal glomerulosa cells, cardiac fibroblasts, renal mesangial cells
Ovarian carcinoma (EFO-21, EFO-27), macrophages (primary), astrocytes,
pheochromocytoma (PC12), hepatocytes (primary), endothelial cells (primary culture)
Pheochromocytoma (PC12), vascular smooth muscle cells, C2C12 myotubes, fibroblasts
(NIH 3T3), adenocarcinoma (A549), primary keratinocytes
Osteoblasts (MC3T3-E1,UMR-106), vascular smooth muscle cells (A-10, primary
cultures), myometrium, astrocytes, fibroblasts (primary cultures, Rat1)
Kidney (MDCK), primary hepatocytes, neurons, astroglia, primary vascular smooth
muscle cells, ischemic heart
Astrocytes, hippocampus, cerebral cortex
Neutrophils, monocytes
Fibroblasts (Rat 1, NIH 3T3, embryonic primary cultures), primary astrocytes, PC3
prostate cancer cells
Primary hepatocyes, Leydig cells, vascular smooth muscle (primary cultures, A7r5, A10),
myoblasts (L6)
Cerebral cortex, hippocampus, neutrophils, hepatocytes
(primary), kidney (MDCK)
Fibroblasts (primary, NIH 3T3, Swiss 3T3, Rat 1, Rat 2, HIRcB), monocytes,
lymphocytes, neutrophils, vascular smooth muscle (primary, A10, A7r5), epidermal
(A431), kidney (MDCK),
pheochromocytoma (PC12), cerebral cortex, myoblasts (L6), pancreatic islets,
myometrium, osteoblasts
57
II.1.6.1 Rôle de la PLD dans le trafic vésiculaire, l’exocytose et la sécrétion
II.1.6.1.1 La PLD est impliquée dans la formation ARF-dépendante des
vésicules coatées
Les diverses formes d'ARF sont impliquées dans de nombreuses voies de transport
vésiculaire, couvrant virtuellement toutes les routes cellulaires depuis la membrane nucléaire
jusqu’à la membrane plasmique (Vidal and Stah1, 1993; Boman et al., 1995; Lenhard et al.,
1994). ARF contrôle l'assemblage de divers types de complexes protéiques, ou manteaux,
impliqués dans la formation des vésicules de transport, incluant notamment, au niveau du
Golgi, le complexe COPI qui comprend six polypeptides collectivement nommés
"coatomère". L’identification d’ARF comme un activateur de la PLD (Brown et al., 1993) a
attiré l’attention de la communauté scientifique sur le rôle que peut jouer cette enzyme
comme médiateur du trafic vésiculaire, en liaison avec le recrutement des complexes
protéiques constituant le manteau des vésicules (Singer et al., 1997). L’activité PLD stimulée
par ARF a été retrouvée dans les membranes du Golgi des cellules CHO (Ktistakis et al.,
1995). L' inhibition de la production du PA par la PLD par adjonction d'éthanol empêche le
recrutement des protéines COPI et la formation de vésicules coatées à partir de ces
membranes (Ktistakis et al., 1996). Le transport de glycoprotéines virales du réticulum
endoplasmique vers le Golgi est aussi inhibé par l'éthanol (Bi et al., 1997). Les effets de
l’éthanol peuvent être réversés par l'apport de PA exogène. De plus, l’ajout de PLD
bactérienne aux membranes du Golgi induit la fixation du coatomère et la formation des
vésicules en absence d’ARF, et des vésicules artificielles contenant du PA lient mieux les
protéines du manteau que des vésicules contrôles (Ktistakis et al., 1996). Ces diverses
observations ont suggéré que l'activation de la PLD est un mécanisme important par lequel
ARF intervient dans le recrutement des protéines du manteau et la formation des vésicules
coatées, et donc dans le transport vésiculaire.
II.1.6.1.2 PLD et sécrétion
La PLD semble également impliquée dans la formation des vésicules sécrétoires issues du
réseau trans-golgien (TGN). Ainsi, La hPLD1 purifiée provoque le bourgeonnement des
vésicules issues du TGN alors qu’un mutant inactif de la PLD ou que l’ajout d’un alcool
primaire l’empêchent (Chen et al., 1997). L’inhibition de la synthèse du PA en présence d’un
alcool primaire bloque la sécrétion dans divers types cellulaires stimulés par des agonistes,
dont les mastocytes, les plaquettes et les cellules HL60 différenciées (Benistant and Rubin,
58
1990; Stutchfield and Cockcroft, 1993; Way et al., 2000). De plus, l’addition de PA exogène
ou la génération de ce lipide par une PLD exogène d’origine bactérienne, stimulent les
fonctions sécrétoires dans différents types cellulaires, comme la sécrétion d’aldostérone par
les cellules glomérulaires surrénales (Bollag et al., 1990) et la sécrétion d’insuline par les îlots
du pancréas (Metz and Dunlop, 1990). Dans les cellules épithéliales bronchiques humaines, la
PLD1 et la PLD2 participent à la sécrétion de l’IL-8 induite par la sphingosine-1-phosphate
(Wang et al., 2002). Dans les cellules chromaffines, la PLD1 est constitutivement retrouvée à
la membrane plasmique. Cependant, elle n’est active que lorsque la cellule est stimulée, et
que ARF6 est transloqué des granules de sécrétion vers la membrane plasmique. Dans ces
cellules, l’activation de la PLD via le calcium est corrélée avec la sécrétion, qui est atténuée
par l’inhibition de la production du PA par la PLD (Caumont et al., 1998). Dans une autre
étude, les auteurs montrent que c’est la PLD1b activée par ARF6 qui est impliquée dans la
sécrétion des cellules neuroendocrines (Vitale et al., 2001). Le facteur d’échange ARNO
semble aussi impliqué dans la régulation PLD-dépendante de la sécrétion. Ce facteur, qui
possède à son extrémité N-terminale un domaine PH responsable de son association PIP2-
dépendante à la membrane, active ARF en favorisant l'échange GDP/GTP (Paris et al., 1997).
Des anticorps anti-ARNO empêchent la sécrétion médiée par l’activation ARF-dépendante de
la PLD dans les cellules chromaffines (Caumont et al., 2000). ARNO est également
nécessaire à l’activation de la PLD1 par ARF6 au niveau de la membrane plasmique et à
l'induction de l’exocytose dans les cellules neuroendocrines PC12 (Vitale et al., 2002). Un
modèle résumant la régulation de l’exocytose par la PLD1 activée par ARF6 a été proposé par
Gasman et al. (2003) (Figure 8).
II.1.6.1.3 Rôle fusogène du PA
Dans les neurones, la PLD1 est spécifiquement impliquée dans le contrôle du statut
fusogénique des sites présynaptiques d’exocytose de l’acétylcholine (Humeau et al., 2001).
De plus, dans les mastocytes, la PLD2 et peut-être la PLD1, sont impliquées dans la fusion
calcium dépendante des granules sécrétoires avec la membrane plasmique (Choi et al., 2002).
Dans un certain nombre de réactions de fusion, incluant la fusion virale et l’exocytose, la
fusion membranaire pourrait être, de manière réversible, inhibée par des lipides qui induisent
des courbures positives de la membrane et stimulée par des lipides qui provoquent des
courbures négatives. Le PA est un phospholipide anionique, induisant une instabilité de la
bicouche lipidique, et possédant des propriétés fusogènes. Sa molécule ayant une forme en
cône, il pourrait être responsable d’une courbure négative importante de la membrane,
59
provoquant une hémifusion et la formation du pore de fusion exocytotique (Gasman et al.,
2003). L'observation que la formation de PA par un mécanisme indépendant de la PLD,
catalysée par l'endophiline, une lyso-PA acyltransférase, a un rôle central dans l'endocytose
des vésicules synaptiques, apporte confirmation à l'hypothèse du rôle fusogène du PA
(Schmidt et al., 1999a).
Figure 8 : Modèle hypothétique résumant le rôle de la PLD1 ARF6-dépendante dans l’exocytose.
Dans les cellules chromaffines et PC12, ARF6 est associé à la membrane des granules de sécrétion
sous sa forme inactive liée au GDP.La PLD1 est constitutivement présente dans la membrane
plasmique. Cependant, elle n’est active que lorsque la cellule est stimulée, et que ARF6 est transloqué,
suite à une augmentation du taux de calcium cytosolique, des granules de sécrétion vers la membrane
plasmique où il interagit avec son facteur d’échange « ARNO ». La PLD1 activée par ARF6 produit
localement du PA qui pourrait être responsable d’une courbure négative importante de la membrane,
provoquant une hémifusion et la formation du pore de fusion exocytotique. Les cellules PC12
surexprimant ARF6, ARNO et PLD1 stimulées ou pas (resting), sont représentées (Gasman et al.,
2003).
60
II.1.6.2 Rôle de la PLD dans le réarrangement du cytosquelette
II.1.6.1.3 La PLD et le cytosquelette d’actine
Une des fonctions proposées pour les PLD de mammifères est de médier le
remaniement du cytosquelette induit par différents agonistes. Plusieurs équipes ont pu établir
un lien entre l’acide phosphatidique et la polymérisation de l’actine, dans différents types
cellulaires dont les fibroblastes Rat-1, Swiss 3T3 et IIC9 (Ridley et al., 1992; Ven der Bend,
1992; Ha and Exton, 1993; Ha et al., 1994), les cellules endothéliales de l’aorte de porc
(PAEC) (Cross et al., 1996), les neutrophiles (Siddiqui and English, 1997) et les monocytes
(Zhou et al., 1995). De plus, dans ces différentes études, les effets observés apparaissent très
spécifiques du PA. Ha et Exton (1993) ont en effet montré que la stimulation des fibroblastes
IIC9 par l’α-thrombine provoque une réorganisation du cytosquelette d’actine avec apparition
de fibres de stress et allongement des cellules. Sur ces mêmes cellules, l’ajout de PA exogène
ou d’une PLD bactérienne, produit les mêmes effets. Les auteurs ont également constaté une
hausse de DAG intracellulaire, mais ni le traitement des cellules par de la PLC exogène, ni
par le PMA, qui induisent pourtant une translocation de la PKC, n’ont d’effet sur la
polymérisation de l’actine. De plus, un inhibiteur de PKC, H7, ne bloque pas la
polymérisation de l’actine induite par l’α-thrombine. Un rôle éventuel du DAG ou de
l’activation d’une PKC a donc été exclu. Dans une seconde étude, Ha et al. (1994) ont
examiné l’hypothèse d’une désacylation par une PLA2 du PA exogène en LPA, ce dernier
composé pouvant être responsable de l’induction de la polymérisation de l’actine. Ils ont
constaté que le LPA induit une augmentation dose-dépendante de la quantité des filaments
d’actine intracellulaire, avec une efficacité légèrement supérieure à celle obtenue avec le PA.
Le LPA induit une augmentation de la polymérisation de l’actine rapide et soutenue, mais il
provoque également une hausse très rapide des taux de PA endogènes, par une activation de la
PLD. Comme la toxine pertussique inhibe cette production de PA, les auteurs concluent que
le LPA active la PLD via une protéine G sensible à la toxine, et que le PA formé est
responsable de l’induction de la polymérisation de l’actine observée. Il a été aussi montré que
la sphingosine-1-phosphate (S1P) induit la formation des fibres de stress dans les cellules
épithéliales humaines et que la PLD serait un des composants de la voie de signalisation en
aval du récepteur de la S1P (Porcelli et al., 2002). Une étude d’Amsterdam et al. (1994)
fournit un exemple physiologique de régulation exercée par le PA sur le remaniement du
cytosquelette, qui concerne le processus de différenciation des cellules de la granulosa. La
GnRH exerce un effet anti-différenciateur sur ces cellules, alors que la FSH induit leur
61
différenciation, qui se caractérise par la rupture de l’association des fibres d’actine permettant
un arrondissement des cellules. De façon opposée, la GnRH provoque une activation de la
PLD, une accumulation de PA, et une polymérisation de l’actine empêchant la rupture des
fibres, ce qui explique son effet inhibiteur. Les différents agents qui induisent des hausses de
PA endogène, le propranolol ou le TPA, reproduisent cet effet inhibiteur de la différenciation.
II.1.6.1.4 Implication des petites protéines G dans les effets de PLD sur le
cytosquelette
Il est bien établi que les protéines G de la famille Rho sont responsables de la
formation des fibres de stress après activation des fibroblastes 3T3 (Ridley, 1999). Dans les
PAEC, le LPA induit la formation des fibres de stress de manière PLD-dépendante, mimée
par l’addition de PA exogène (Cross et al., 1996). Les auteurs suggèrent que la protéine Rho
serait impliquée dans la voie de signalisation, en aval du récepteur du LPA, car l’inhibition de
Rho par l’exoenzyme C3 de C. botulinum empêche la formation des fibres de stress, qu’elle
soit induite par le LPA ou par le PA (Cross et al., 1996). La transfection stable de fibroblastes
Rat-2 par une forme dominante négative de PLD1 inhibe la formation des fibres de stress
induite par le LPA (Kam and Exton, 2001). Le LPA active aussi Rho et la Rho-Kinase, mais
ces réponses ne sont pas affectées par la baisse d’activité PLD1. Ces résultats suggèrent que la
PLD agit sur la formation des fibres de stress en aval de Rho, mais indépendamment de la
Rho-Kinase. D’autre part, dans les cellules basophiles leucémiques de rat RBL-2H3
transfectées avec la PLD1b étiquetée par l’hémaglutinine (HA), la PLD1b a été trouvée au
niveau des granules de sécrétion. Sous l’effet d’une activation cellulaire par l’antigène, elle
est transloquée à la membrane plasmique où elle colocalise avec ses activateurs Rac1, ARF6,
et PKCα dans des structures membranaires riches en actine, les lamellipodes et les «ruffles»
(Powner et al., 2002). Au contraire, O’Luanaigh et al. (2002) ont observé une localisation de
la GFP-PLD2, mais pas de la GFP-PLD1, au niveau des «ruffles» membranaires après
stimulation des cellules par l’antigène. La PLD2 semble ainsi plus impliquée dans le
réarrangement de l’actine corticale. Par exemple, la surexpression de PLD2 provoque
l’apparition de filopodes dans les cellules fibroblastiques (Colley et al., 1997b).
II.1.6.2 Rôle de la PLD dans la différenciation cellulaire
La différenciation de divers types cellulaires est accompagnée d’une augmentation de
l’activité et/ou de l’expression des PLD suggérant l’implication de cette enzyme dans le
processus de différenciation. Par exemple, dans les cellules myéloïdes humaines de la lignée
62
HL60, l’activité de la PLD stimulée par le PMA augmente au cours de la différenciation en
granulocytes induite par l’acide rétinoïque ou le dibutyryl-AMPc (Ohguchi et al., 1997;
Nakashima et al., 1998; El Marjou et al., 2000). L’activation de la PLD par le GTPγS est
également plus importante, ce qui suggère que les facteurs activateurs de la PLD ou que la
PLD elle-même puissent être régulés à la hausse durant la différenciation. Effectivement, au
cours de la différenciation de ces cellules, l’expression des isoformes α et β des PKC est
augmentée (Nakashima et al., 1996). De même, les protéines G activatrices de la PLD, ARF,
Cdc42, et RhoA, sont plus exprimées dans les cellules différenciées (Ohguchi et al., 1997).
L’augmentation de l’activité PLD observée au cours du processus de différenciation serait
donc due à l’augmentation du niveau d’expression de ses régulateurs. Cependant, une
augmentation de l’expression des ARN messagers des PLD1 et PLD2 a également été
observée dans les cellules différenciées (Nakashima et al., 1998, El Marjou et al., 2000). Des
résultats similaires ont été obtenus dans les cellules HT-29, les kératinocytes, les cellules
gliales C6 et les cellules PC12: la différenciation est accompagnée d’une augmentation de
l’activité et/ou de l’expression des PLD (Madesh et al., 1998; Hayakawa et al., 1999; Jung et
al., 1999; Nakashima and Nozawa, 1999; Min et al., 2001). De même, l’hormone neuro-
hypophysaire arg8-vasopressine (AVP), un puissant inducteur de la différenciation
myogénique (Nervi et al., 1995), déclenche précocement l’activation des voies de la PIP2-
PLC et de la PLD dans les myoblastes. De manière intéressante, la réponse myogénique peut
intervenir pour des concentrations nanomolaires d’AVP, auxquelles seule la PLD, et non la
PLC, est activée, ce qui suggère l’implication prépondérante de la voie PLD, et donc de son
produit le PA, dans ce processus (Naro et al., 1997).
II.1.6.3 Cibles intracellulaires de l’acide phosphatidique
Diverses cibles intracellulaires du PA ont été identifiées, ce qui permet de l’impliquer
dans un grand nombre de fonctions cellulaires. On peut citer divers constituants de la cascade
des MAPKinases, notamment Raf-1 (Ghosh et al., 1996; Andresen et al., 2002), des protéines
impliquées dans le trafic vésiculaire comme le « coatomère », les protéines ARF, le facteur
NSF (N-éthylmaléimide sensitive factor) et la kinésine (Manifava et al., 2001; Ktistakis et al.,
2003), l’AMPc-phosphodiestérase PDE4D3 (Grange et al., 2000), la protéine mTOR
(mammalian target of rapamycin) (Fang et al., 2001), la tyrosine phosphatase 1 (SHP1)
(Frank et al., 1999) et la PI(4)P 5-kinase (Moritz et al., 1992; Jenkins et al., 1994; Jones et al.,
2000; Ktistakis et al., 2003).
63
II.1.6.3.1 Raf-1 kinase
Raf-1 est une sérine/thréonine kinase impliquée dans l’activation de la cascade des
MAP kinases lors de l’activation mitogénique. La cascade des MAP kinases (MAPK) est une
voie de signalisation de première importance dans la régulation de la mitose induite par des
signaux extracellulaires. L'un des points cruciaux de cette régulation est le recrutement de la
protéine Raf-1 au niveau de la membrane où elle est activée par les petites protéines G Ras ou
d'autres kinases. Le recrutement de Raf-1 au niveau de la membrane a été pendant longtemps
décrit comme la fonction principale de Ras. Mais des modifications de Raf-1 augmentant son
association à la membrane n'induisent qu'une faible activation indépendante de Ras (Leevers
et al., 1994; Stokoe et al, 1994), et une activation directe de Raf-1 par Ras n'a pas pu être
démontrée initialement in vitro (Hall, 1994). D'autres travaux plus récents ont montré que
lorsque la protéine Raf-1 était rendue constitutivement membranaire par une farnésylation,
son activation par Ras-GTP était accrue et que cette activation était directe (Mineo et al.,
1997). Toutefois la liaison de Raf-1 à la membrane n'est pas suffisante pour son activation
complète.
Récemment, il a été montré que Raf-1 pouvait interagir directement avec les lipides
membranaires et en particulier le PA (Ghosh et al., 1996). L’interaction se fait au niveau d’un
site distinct de celui de la PS antérieurement caractérisé. En effet, c’est dans une région riche
en cystéines au niveau de l’extrémité N-terminale de Raf-1 que se fixe la PS (Ghosh et al.,
1994), alors que le PA se lie avec une forte affinité dans une région d’environ 35 acides
aminés de la partie C-terminale de la kinase. Des travaux de délétion d'une partie de la
séquence du côté C-terminal de la protéine Raf-1 ont montré que le site d'interaction avec le
PA se trouve entre les acides aminés 390 et 426 (Ghosh et al., 1996) (Figure 9). De plus,
l'inhibition de la production de PA par l’éthanol diminue fortement la translocation de Raf-1
aux membranes induite par le PMA dans les cellules MDCK. La fixation de Raf-1 sur le PA
membranaire provoquerait donc son recrutement à la membrane plasmique, et permettrait
ainsi son activation par des facteurs membranaires (dont Ras) (Ghosh et al., 1996). Ce résultat
a par la suite été confirmé et approfondi par le travail de Rizzo et al. (1999). Ces auteurs ont
pu déduire que l’insuline stimule la production de PA dans les fibroblastes via une PLD2 de
manière ARF-dépendante, et que le PA produit est nécessaire à la translocation de Raf-1 aux
membranes. Le groupe de Rizzo a notamment montré qu'après liaison de Raf-1 au PA, Ras et
Raf-1 transitoirement associées à la membrane plasmique sont transloquées conjointement
64
avec le récepteur de l’insuline dans le compartiment endosomal riche en cholestérol et PA,
contenant MEK et MAPK, et que la régulation de la cascade se fait dans le compartiment
endosomal. De plus, lorsque Raf-1 est mutée sur son domaine de liaison au PA, elle agit
comme un dominant négatif et inhibe la voie des MAPK dans les cellules HIRcB (Rizzo et
al., 2000). Ces données suggèrent donc bien un rôle crucial du PA dans le recrutement de Raf-
1 et la régulation de la cascade des MAP Kinases.
Figure 9 : Représentation schématique de Raf1 contenant le domaine de fixation de PA (Rizzo et al., 2002).
II.1.6.3.2 PI(4)P 5-kinase
Dans les membranes des cellules HL-60, où l’activation de la PLD est ARF-
dépendante, la synthèse de PIP2 est augmentée après activation de la PLD par ARF et
formation de PA (Fensome et al., 1996). Par ailleurs, Arneson et al. (1999) ont montré que
l’inhibition de la production de PA par les alcools primaires bloque la synthèse de PIP2 dans
les membranes lysosomales, suggérant que la production de PIP2 peut être contrôlée par le
PA. La Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PI(4)P 5-kinase) responsable de la
synthèse du PIP2 a été décrite comme une cible du PA (Jones et al., 2000). Moritz et al.
(1992) ont montré que la PI(4)P 5-kinase purifiée à partir de membranes de cerveau de bœuf
est spécifiquement stimulée par le PA. Cet effet activateur est obtenu aussi bien avec du PA
exogène qu’avec du PA endogène produit de la PLD. Une autre équipe a montré que le PA
peut stimuler la PI(4)P 5-kinase (PIP kinase de type I), mais pas la PI(5)P 4-kinase (PIP
kinase de type II) (Jenkins et al., 1994). La PI(4)P 5-kinase peut être stimulée aussi par ARF,
65
notamment ARF6 (Honda et al., 1999; Jones et al., 1999). Des expériences de
chromatographie d’affinité réalisées à l'aide de PA greffé sur une résine (Lim et al., 2002), ont
permis de mettre en évidence plusieurs protéines cibles du PA dans le cytosol préparé à partir
de cerveau de mouton. Une interaction directe et spécifique du PA avec la PI(4)P 5-kinase
mais pas avec la PI(5)P 4-kinase a ainsi pu être démontrée (Ktistakis et al., 2003).
L'augmentation de la concentration intracellulaire de PIP2, qui résulte de l'activation de la
PI(4)P 5-kinase par le PA, augmente à son tour l'activité PLD, générant ainsi une boucle de
rétro-contrôle positif. Ce dispositif d’amplification permettant une accumulation localisée
massive de PA et PIP2, pourrait jouer un rôle physiologique important. Ainsi, par exemple, le
PA et le PIP2, accumulés localement au niveau de l’actine corticale pourraient être
responsables de la formation des «ruffles» induits par la stimulation antigénique des cellules
RBL (O’Luanaigh et al., 2002).
66
II.2 La myogénèse du muscle squelettique
Le développement du muscle squelettique lors de l’embryogénèse est un processus
complexe qui consiste en une séquence d’événements cellulaires incluant la détermination des
cellules souches du mésoderme somitique ou paraxial en cellules de la lignée musculaire
squelettique, la prolifération des myoblastes précurseurs, leur sortie du cycle cellulaire et leur
fusion en myotubes polynucléés exprimant des protéines spécifiques du muscle squelettique
différencié, notamment le système contractile. La myogénèse intervient aussi dans le muscle
adulte, lors de la régénération musculaire faisant suite à une lésion traumatique ou
pathologique, à partir d’un pool de cellules précurseurs appelées cellules satellites.
II.2.1 La myogénèse durant le développement embryonnaire
La musculature squelettique dérive du mésoderme somitique ou paraxial de l’embryon
(Chevalier et al., 1977; Currie and Ingham, 1998). Ainsi, le long de chaque côté du tube
neural en formation, des structures sphériques appelées somites s’organisent régulièrement de
l’avant vers l’arrière à partir du mésoderme paraxial (Meier et al., 1979). Les somites sont des
organes embryonnaires transitoires. En effet, peu de temps après leur formation, les cellules
de chaque somite se compartimentent en deux parties: ventrale et dorsale. La partie ventrale
donne de son côté le sclérotome, qui donne naissance aux vertèbres et aux côtes (Kalcheim et
al., 1999). La partie dorsale qui reste épithéliale est dénommée dermamyotome, du fait qu’elle
abrite les précurseurs de la lignée dermique et de la lignée myogénique. Cette partie des
somites semble être composée de précurseurs de deux lignées myogéniques (Ordhal and Le
Douarin, 1992): les somites de la partie dorsale sont divisés en 2 moitiés, latérale et médiane,
qui contiennent des cellules précurseurs qui évoluent selon leur position dans cet épithélium.
Dans la partie médiane, les cellules restent dans le territoire somitique et donnent le myotome
qui sera à l’origine de la musculature axiale. Dans la moitié latérale, les précurseurs sont
destinés à quitter le territoire des somites et migrent vers leur localisation finale où ils forment
la musculature des membres et de l’abdomen (Christ and Ordhal, 1995; Brand-Saberi and
Christ, 1999) (Figure 10). Ces cellules expriment le gène Pax3 avant, pendant et après cette
migration, et l’expression de ce gène semble nécessaire à cette migration (Christ and Ordhal,
1995). Pour donner naissance au tissu musculaire adulte, les cellules des somites subissent un
67
processus de détermination qui fait évoluer ces cellules précurseurs en cellules fusiformes,
dénommées myoblastes présomptifs ou prémyoblastes.
Figure 10 : Représentation schématique de coupes transversales.d’un embryon de poulet.
Dans un premier temps, les cellules mésodermiques se condensent près du complexe "tube
neural/notochorde" afin de former les somites. Ensuite, les somites donnent naissance à deux types de
tissus différents : le dermamyotome et le sclérotome. Enfin, trois territoires différents se différencient :
les précurseurs des cellules destinées à la musculature des membres et de l’abdomen (cellules
migratrices), les précurseurs des cellules destinées à la musculature axiale (myotome), et le
sclérotome donnant naissance aux côtes et aux vertèbres.
Ces cellules migrent vers leur localisation finale où elles forment, après la différenciation, les
fibres musculaires adultes (Olson, 1992). Pour cela, ces cellules localisées prolifèrent,
expriment différents gènes régulateurs spécifiques du muscle et deviennent des myoblastes
(Sabourin and Rudnicki, 2000). Les myoblastes subissent ainsi plusieurs cycles de division
avant de sortir du cycle et de s’engager dans la différenciation myogénique: ils fusionnent
alors, donnant naissance à des myotubes polynucléés (Cossu et al., 1996), exprimant diverses
protéines spécifiques du muscle comme l’actine-α sarcomérique, les chaînes lourdes et légères
de la myosine sarcomérique, la tropomyosine, la troponine, la créatine kinase musculaire et
les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine.
68
II.2.2 La myogénèse in vitro: les lignées cellulaires myogéniques
Au cours des années, il a été développé divers systèmes permettant d’observer la
myogénèse in vitro: soit des cultures primaires de cellules musculaires squelettiques
provenant essentiellement de muscles pectoraux d’embryon de poulet et de caille (de 10-14
jours) et de muscles des membres postérieurs de rat et souris nouveau-nés (jusqu’à 3 jours),
soit des cultures de lignées cellulaires myogéniques stabilisées. Ces systèmes de culture
cellulaire reproduisent diverses phases de la myogénèse, parmi lesquelles la détermination, la
prolifération, la différenciation, et constituent donc des modèles optimaux d’étude de la
myogénèse. En particulier, il a été possible de définir les conditions optimales pour induire
des myoblastes non encore spécialisés du point de vue morphologique, à se différencier en
myotubes multinucléés capables de se contracter sur la boîte de culture, et ainsi d’ analyser les
modifications qui interviennent dans la différenciation myogénique. Dans les années 60, un
progrès important a été accompli dans l’étude de la différenciation cellulaire in vitro, par la
réalisation de cultures clonales de cellules embryonnaires non spécialisées. Le développement
des cultures clonales a rendu possible l’étude des conditions déterminant soit la prolifération,
soit la différenciation des cellules myogéniques. L’identification des facteurs qui jouent un
rôle important pour ces fonctions a permis d’accroître les connaissances du processus
myogénique in vitro et in vivo. L’étude des mécanismes qui régulent le processus myogénique
chez les mammifères est effectuée dans une large mesure sur des lignées cellulaires
immortalisées, essentiellement d’origine murine, les plus utilisées étant les lignées C2C12 et
L6.
La lignée C2C12 est un sub-clone qui dérive de la lignée originelle C2 isolée par culture
primaire de myoblastes obtenus de muscles de la patte postérieure de souris (Yaffe, 1968).
Parmi les cellules adhérentes obtenues, le clone C2C12 spontanément immortalisé a été
selectionné. La lignée C2C12 est caractérisée par sa capacité à se différencier rapidement et à
former de grands myotubes contractiles sous l’effet d’une diminution du pourcentage du
serum dans le milieu de culture.
La lignée L6 dérive de myoblastes obtenus de la patte postérieure de rat nouveau-né,
stabilisés par traitement avec un carcinogène chimique (Yaffe, 1977). Lors des premiers
passages, l'adhésion des myoblastes transformés nécessitait un prétraitement du support par le
collagène, et par la suite les sous-lignées obtenues par clonage ont perdu cette exigence. Le
sous clonage et la caractérisation de la lignée L6 ont été rapportés par Teti et al. (1993). Les
cellules du clone C5 (L6C5) constituent un bon modèle pour l’étude de la myogénèse
69
puisqu’elles ont une forte capacité de différenciation dans des milieux de cultures contenant
1% de serum, ou des milieux dépourvus de serum additionnés de différents inducteurs
myogéniques (Nervi et al., 1995; Minotti et al., 1998). Ces cellules fusionnent en formant des
fibres musculaires striées, même si lors de la multiplication des passages en culture la
tendance à la fusion diminue et rend nécessaire le reclonage périodique de la lignée.
II.2.3 Facteurs régulateurs de la myogénèse
II.2.3.1 Les protéines à domaine bHLH
Des études portant sur la transcription dans le muscle squelettique ont abouti à
l’isolement et la caractérisation fonctionnelle du facteur MyoD (Davis et al., 1987). D’autres
travaux ont ensuite permis le clonage de plusieurs facteurs homologues: Myf5 (Braun et al.,
1989), myogénine (Edmondson and Olson, 1989; Wright et al., 1989) et MRF4 (Rhodes and
Konieczny, 1989). Ces quatre facteurs régulateurs de la myogénèse (MRFs), de la famille
MyoD, sont des facteurs de transcription spécifiques du muscle squelettique. Ils appartiennent
à la superfamille des facteurs de transcription de type basique hélice-boucle-hélice (bHLH).
La région basique est responsable de leur fixation à l’ADN. Cette fixation se produit via la
séquence consensus (CANNTG), appelée boîte E (E-box), qui est présente dans les
promoteurs de plusieurs gènes spécifiques du muscle squelettique (Lassar et al., 1989; Olson
and Klein, 1994; Sabourin and Rudnicki, 2000). Le domaine HLH leur permet de
s’hétérodimériser avec d’autres facteurs ubiquitaires à domaine HLH (Protéines E12, E47 ou
Id) lesquelles favorisent (E12 et E47) ou inhibent (Id) la liaison des facteurs myogéniques à
l’ADN (Murre et al., 1989; Blackwell and Weintraub; 1990). Les protéines de la famille Id ne
possèdent pas de région basique, ce qui rend le complexe MRF/Id inactif et incapable de se
lier à la boîte E. Les MRFs ont la capacité de convertir des cellules non musculaires en
cellules musculaires squelettiques soit in vitro (Choi et al., 1990; Weintraub et al., 1991) soit
in vivo (Miner et al, 1992, Santerre et al., 1993), ce qui suggère qu’ils jouent un rôle
important dans la détermination et la différenciation des précurseurs myogéniques. Plusieurs
études effectuées sur la souris suggèrent que la détermination et/ou la survie des précurseurs
myogéniques requièrent soit MyoD, soit Myf5. L’inactivation du gène MyoD, réalisée par
Rudnicki et al. (1992), n’a tout d’abord pas apporté d’indices précis sur la fonction de la
protéine MyoD. En effet, la souris MyoD-/- présente une myogénèse embryonnaire normale.
L’animal adulte est viable et fertile, et, à l’exception du fort taux d’ARNm de Myf5 post-
natal, présente un phénotype musculaire apparemment normal. De même, la souris Myf5-/-
70
semble avoir un phénotype musculaire normal mais elle subit une mortalité périnatale suite à
une sévère défaillance du développement des côtes (Braun et al., 1992). Cependant, les souris
«doubles KO» (knock out) pour MyoD et Myf5 montrent une absence complète des
myoblastes et des myofibres. Les fonctions de MyoD et Myf5 semblent donc redondantes
(Rudnicki et al., 1993) et chacun des gènes possède des propriétés d’autoactivation
importantes (Weintraub, 1993). Les souris inactivées pour la myogénine meurent à la
naissance à cause d’une sévère déficience en fibres musculaires différenciées, bien qu’elles
présentent un nombre normal de myoblastes déterminés (Hasty et al., 1993; Nabeshima et al.,
1993). MRF4 est le facteur myogénique majoritairement exprimé dans la fibre mature adulte.
Il est de ce fait impliqué dans la différenciation terminale (Zhang et al., 1995). Tous ces
résultats suggèrent un modèle selon lequel MyoD et Myf5 seraient responsables de la
détermination des précurseurs myogéniques, alors que la myogénine et MRF4 seraient
importants pour la différenciation et le maintien du phénotype différencié (Rudnicki and
Jaenish, 1995) (Figure 11).
Figure 11 : Définition des rôles des facteurs de transcription MRF durant l’embryogénèse. (Sabourin et al., 2000).
Des expériences de mutation chez la souris (Rudnicki et al., 1993) suggèrent que MyoD et
Myf5 sont à partir d’un certain seuil de concentration, les signaux primitifs permettant de
surmonter les messages répresseurs et d’activer en aval le gène de la myogénine. Ce facteur
Myf5 MyoD
myogenin MRF4
71
de transcription caractéristique de la différenciation des cellules myogéniques stimule à son
tour l’expression des gènes spécifiques du muscle squelettique (Weintraub, 1993; Lassar et
al., 1994). Les inter-régulations entre les MRFs ont été étudiées au cours du développement
embryonnaire et bien que les conclusions restent floues, il est toutefois possible d’établir un
schéma global (Figure 12). Les relations entre MyoD et Myf5 présentent un intérêt particulier.
En effet, en absence de Myf5, au cours de l’embryogenèse, le niveau d ’expression de MyoD
est plus faible que la normale (Braun et al., 1992). Au contraire, les souris MyoD-/- présentent
une augmentation du niveau d’expression de Myf5. Ces observations suggèrent que MyoD et
Myf5 peuvent avoir des rôles redondants ou compensatoires in vivo, et ont amené S.M.
Hughes en 1992 à proposer que Myf5 et MyoD forment, au cours du développement, une
boucle de régulation dans laquelle Myf5 serait un activateur du gène MyoD, tandis que MyoD
réprimerait le gène Myf5.
Figure 12 : Inter-régulations entre les facteurs myogéniques au cours de l’embryogénèse (Kitzmann, 1999).
72
II.2.3.2 Les protéines de la famille MADS-box
La famille des protéines à domaine MADS-box regroupe divers facteurs de
transcription. Elle est définie sur la base d’une similitude de séquences primaires chez des
protéines issues d’organismes eucaryotes, dont la levure, les insectes et des mammifères
(Shore and Sharrocks, 1995). Le motif conservé est appelé boîte MADS (MCM1-Agamous-
Deficiens-SRF). Il est composé de 56 acides aminés, dont 9 sont strictement conservés chez
tous les membres de la famille, et se compose de deux régions fonctionnelles: l’extrémité N-
terminale constitue le déterminant majeur de spécificité de liaison à l’ADN, chacun des
membres possédant sa propre spécificité, tandis que l’extrémité C-terminale est nécessaire à la
dimérisation. Ainsi, la formation d’homo ou d’hétérodimères entre les différentes protéines de
la famille crée toute une combinaison de spécificités de liaison.
II.2.3.2.1 Le Facteur de Réponse au Sérum (SRF)
Le Facteur de Réponse au Sérum (SRF) est l’un des membres les plus étudiés de la
famille MADS-box. D’une masse moléculaire de 67 KDa, ce facteur de transcription se fixe
en homodimère sur une séquence de dix nucléotides CC(AT)6GG appelée boîte CArG. Les
fonctions de la protéine sont multiples puisqu’il existe une trentaine de sites CArGs
fonctionnels dans des promoteurs de différents gènes (Chai and Tarnawski, 2002), dont le
gène c-fos (Treisman, 1986), les gènes d’α-actines squelettique (Muscat et al., 1992) ou
cardiaque (Miwa and Kedes, 1987). Son inactivation génique n’apporte que peu d’indices
quant à ses différentes fonctions: en effet, les embryons SRF-/- se développent normalement
jusqu’à E6.5 puis meurent in utero lors de la gastrulation, essentiellement par absence de
formation du mésoderme (Arsenian et al., 1998). Ainsi, des études fonctionnelles menées sur
la protéine ont été en grande partie réalisées ex vivo dans des lignées cellulaires. Elles ont
permis de distinguer deux fonctions principales de la protéine SRF: l’induction de gènes
impliqués dans la prolifération et le cycle cellulaire (Chai and Tarnawski, 2002; Miano,
2003), ainsi que la régulation des processus de différenciation, notamment dans le tissu
musculaire squelettique.
II.2.3.2.2 SRF et différenciation musculaire squelettique
La protéine SRF est exprimée de façon constitutive au niveau messager et protéine
dans les cellules musculaires en culture, son niveau d’expression, de même que sa localisation
73
nucléaire ne variant pas selon le stade prolifératif ou différencié de la cellule (Vandromme et
al., 1992). Cette étude de Vandromme et al. démontre que l’inactivation de la protéine SRF,
par microinjection d’anticorps anti-SRF, inhibe la différenciation de la lignée musculaire C2
en empêchant la transition myoblaste-myotube. Cela s’accompagne de l’inhibition de
l’expression de la Troponine T, marqueur tardif de la différenciation, mais également de la
myogénine, témoignant ainsi d’un rôle précoce de la protéine SRF dans le programme de
différenciation myogénique (Gauthier-Rouvière et al., 1996; Soulez et al., 1996). Il est par
ailleurs important de noter que, alors que le gène de la Troponine T est effectivement une
cible directe de la protéine SRF (Wang et al., 1994), aucune séquence CArG fonctionnelle n’a
été identifiée dans les séquences régulatrices du gène de la myogénine. Son inhibition par
extinction de la protéine SRF témoigne alors d’un rôle général de cette dernière dans le
processus de différenciation, et non d’une régulation directe du gène. Afin de préciser le rôle
fonctionnel ainsi que la régulation de la protéine SRF dans le muscle squelettique, plusieurs
promoteurs de gènes spécifiques du tissu musculaire comme l’α-actine squelettique, ont été
analysés (Minty and Kedes, 1986; Lee et al., 1991). La protéine SRF sous forme de dimère
n’a pas ou peu d’activité (Treisman et al., 1992). Elle doit, pour être activée, être
phosphorylée et/ou s’associer à des cofacteurs, et assurer ainsi une sorte d’ancrage pour la
formation de complexes multiprotéiques sur les régions régulatrices de ses gènes cibles. Outre
de nombreux gènes impliqués dans l’organisation du cytosquelette au cours de la
différenciation, les gènes de la famille bHLH, et notamment MyoD, représentent des cibles
potentielles importantes de la protéine SRF. L’implication de SRF dans la régulation du gène
MyoD a été suggérée en 1996 par deux études de Gauthier-Rouvière et al., puis Soulez et al..
Ces travaux démontrent successivement que l’inactivation de la protéine SRF par
microinjection d’anticorps bloquants dans des myoblastes prolifératifs, ou par utilisation de
lignées C2 SRF anti-sens, se traduit par une perte d’expression de la protéine MyoD. Des
travaux ultérieurs de Carnac et al. (1998) et Wei et al (1998) confirment cette régulation de
MyoD dépendante de SRF: l’inactivation de la petite protéine G RhoA, régulateur positif du
facteur SRF, entraîne une perte d’expression de la protéine MyoD, sans toutefois altérer
l’expression du facteur bHLH Myf5.
II.2.3.2.3 La famille des Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2)
En 1989, MEF2 (Myocyte Enhancer Factor-2) est initialement décrit comme un
facteur nucléaire présent dans les cellules musculaires différenciées, mais absent des cellules
en prolifération, ainsi que des cellules non musculaires. Cette protéine, par sa liaison à une
74
séquence consensus riche en A/T (CTA(A/T)4TAG) dans les promoteurs de gènes
musculaires, est alors décrite comme nécessaire à l’expression de la Créatine Kinase
Musculaire (MCK), ainsi que de la chaîne légère de la myosine de rat (Gossett et al., 1989).
Depuis, une famille de protéines MEF2 a été caractérisée après clonage de leur ADNc. Chez
les vertébrés, elle se compose de quatre gènes mef2 appelés mef2a, b, c et d, localisés sur des
chromosomes différents (Pollock et Treisman, 1991; McDermott et al, 1993; Morisaki et al.,
1997). Au cours du développement, les quatre gènes sont transcrits dès le 14ème jour de
gestation. L’expression de mef2c reste restreinte au muscle squelettique, au cerveau et à la
rate. Les trois autres gènes mef2a, b et d sont quant à eux transcrits de façon ubiquitaire. Cette
observation est pourtant en désaccord avec la restriction tissulaire de l'activité des facteurs
MEF2 correspondants, retrouvée uniquement dans les tissus musculaires squelettique,
cardiaque et lisse ainsi que dans le système nerveux. De plus, l'emploi d'anticorps dirigés
contre une région commune aux protéines MEF2A, B et D a permis de montrer qu’elles ne
sont exprimées qu’au niveau des tissus où leur activité est décelée, suggérant l’existence de
mécanismes post-transcriptionnels contrôlant la biosynthèse tissulaire de ces facteurs (Yu et
al., 1992).
Chaque isoforme possède, outre un domaine MADS-box, un domaine MEF2 constitué de 29
acides aminés. Celui-ci représente une extension de la boîte MADS constituant une région qui
assure essentiellement la liaison de la protéine à l’ADN, mais aussi son interaction avec des
partenaires. Les membres de la famille MEF2 peuvent s’homo et s’hétérodimériser. Le site de
liaison MEF2 présent dans de nombreux promoteurs peut aussi lier des facteurs autres que
ceux de la famille MEF2, créant ainsi des mécanismes de compétition qui participent à la
régulation de certains gènes. Ainsi, l’enhancer du gène de la MCK possède un site MEF2
essentiel à son activité dans les cellules musculaires squelettiques et cardiaques. Bien que la
liaison de MEF2 soit nécessaire à l’expression (Cserjesi et al., 1994), ce site peut aussi être lié
par d’autres protéines. D’autres exemples similaires de compétition ont été mis en évidence
sur le promoteur de la chaîne légère de la myosine (Zhu et al., 1993), et très récemment sur les
promoteurs de la desmine, de la myoglobine ainsi que de la chaîne lourde de la myosine
(βMHC) (Karasseva et al., 2003).
II.2.3.2.4 MEF2 et différenciation musculaire squelettique
L’analyse du profil d’expression du produit des quatre gènes mef2a, b, c et d dans le
muscle squelettique démontre une accumulation séquentielle. MEF2B et MEF2D sont
exprimés dès le stade myoblaste, bien que ce dernier n’acquière une activité transcriptionnelle
75
que lors de la sortie du cycle cellulaire (Breitbart et al., 1993; Molkentin et al., 1996). La
protéine MEF2A s’accumule dès l’entrée en différenciation des cellules, tandis que MEF2C
n’est induite que plus tardivement au cours de la différenciation, la protéine n’étant détectée
qu’au stade des myotubes plurinucléés (Martin et al., 1993; McDermott et al., 1993).
Il existe une régulation bidirectionnelle entre les MRFs et les MEF2. En effet, une activité
MEF2 est induite dans des cellules non musculaires transfectées par la myogénine (Cserjesi
and Olson, 1991; Cserjesi et al., 1994) ou MyoD (Yu et al., 1992), ce qui suggère que les
MRFs peuvent activer MEF2. Pourtant, Kaushal et al. (1994) démontrent que l’apport
exogène de la protéine MEF2A est capable de convertir des fibroblastes en myotubes
plurinucléés. D’après cette étude, l’efficacité de conversion observée avec MEF2A est
similaire à celle induite par MyoD. Comme précisé dans sa description de 1989, le facteur
MEF2 s’avère être un transactivateur puissant des gènes impliqués dans la régulation de la
myogénèse, démontrant ainsi un rôle central de ce facteur dans l’architecture musculaire. Dès
1992, plusieurs études successives démontrent l’existence, dans le promoteur de la
myogénine, d’un site MEF2 fonctionnel nécessaire à l’expression du gène dans des lignées
cellulaires (Edmondson et al., 1992; Buchberger et al., 1994), mais aussi in vivo, au cours du
développement des bourgeons des membres et de la formation des somites (Cheng et al.,
1993; Yee and Rigby, 1993). En 1995, deux études de Naidu et Black révèlent l’existence,
dans le promoteur du gène MRF4, d’un site MEF2 nécessaire à la régulation positive du gène,
sa mutation entraînant une forte réduction d’activité du promoteur lors de la différenciation
des cellules C2 ainsi que des myoblastes primaires de poulet (Black et al., 1995; Naidu et al.,
1995). Outre un site MEF2, le promoteur de MRF4 contient aussi une boîte E fonctionnelle
(Kaushal et al., 1994; Naidu et al., 1995). Des études de cotransfection démontrent
l’activation synergique du promoteur de MRF4 en présence des deux facteurs MEF2 et
myogénine. Pourtant, tandis qu’une double mutation de leurs sites fixateurs entraîne une perte
totale d’activité, toute simple mutation de l’une ou l’autre des boîtes E ou MEF2 n’altère pas
la synergie entre les deux facteurs. Ce résultat démontre l’existence d’une coopération de ces
deux facteurs sur l’un ou l’autre des deux sites et suggère leur interaction. Deux études de
Ridgeway et al. (2000) et Rogerson et al. (2002) par criblage des domaines de transactivation
de chaque MRF, définissent la myogénine et non MyoD comme le candidat idéal pour la
régulation du gène MEF2C.
76
II.2.4 Effecteurs de la différenciation myogénique
Le passage de la prolifération à la différenciation terminale des cellules myogéniques
est influencé par l’environnement extracellulaire, et, dans le cas des cellules en culture, par la
présence d’hormones et facteurs de croissance. Dans les cultures de myoblastes squelettiques,
le sérum et les facteurs de croissance exogènes induisent un mécanisme répresseur qui
empêche l’initiation du processus de différenciation, tant que leur concentration n’est pas
réduite sous une valeur-seuil. A la suite de la suppression des facteurs de croissance, le
programme de différenciation est activé, et s’accompagne de la formation des myotubes
polynucléés, de la détermination irréversible des myoblastes au stade post-mitotique, de
l’activation transcriptionnelle des gènes spécifiques du muscle qui deviennent réfractaires à la
répression exercée par les facteurs de croissance.
Les facteurs de croissance et hormones connus pour avoir des effets sur la
différenciation des cellules du muscle squelettique appartiennent à trois familles différentes
(Florini et al., 1991). La famille des facteurs-transformants-β (TGF-β) et celle du FGF
montrent un effet inhibiteur sur la différenciation, alors que la famille des facteurs «insulin-
like» (IGFs) favorise soit la prolifération, soit la différenciation des cellules musculaires.
II.2.4.1 Inhibiteurs
II.2.4.1.1 Le facteur de croissance TGF-β
Le TGF-β a été initialement caractérisé comme un inducteur du phénotype transformé
dans les cellules fibroblastiques. Par la suite, cependant, on a observé qu’il peut influencer la
prolifération et la différenciation de types cellulaires d’origine mésenchymateuse (Ignotz and
Massague, 1985). Le traitement de lignées cellulaires de muscle squelettique (L6A1, L6E9,
C2 et BC3H1), et de cellules musculaires primaires (rat, caille) par TGF-β inhibe, de manière
dose-dépendante, l’expression de tous les marqueurs principaux de la différenciation
myogénique (augmentation de l’activité créatine kinase; expression de la myosine, des
récepteurs de l’acétylcholine, et autres gènes spécifiques du muscle), et, en parallèle, stimule
la prolifération de ces cellules. L’inhibition de la différenciation induite par le TGF-β peut-
être reversée par l’élimination du facteur du milieu, suggérant que celui-ci induit un sinal
transitoire chez les myoblastes (Florini et al., 1991).
II.2.4.1.2 Le facteur de croissance FGF
77
Le FGF est un mitogène pour les cellules des tissus dérivés du mésoderme et du
neuroectoderme, mais surtout c’est un puissant inhibiteur du processus myogénique, du moins
in vitro. Il inhibe l’activation des gènes spécifiques du muscle en régulant négativement les
protéines myogéniques bHLH. Il a été démontré que le FGF induit la phosphorylation de la
thréonine 114 située dans le domaine basique de la myogénine, lui faisant perdre ainsi la
capacité de se lier à l’ADN (Olson, 1993). La présence de ce site de phosphorylation dans
toutes les protéines myogénique bHLH fait penser que les signaux induits par le FGF utilisent
la phosphorylation comme étape finale commune pour inhiber de manière coordonnée les
activités des MRFs.
II.2.4.2 Inducteurs
II.2.4.2.1 Les facteurs IGFs
Les IGFs appartiennent à une famille de petits peptides caractérisés par une structure
très proche de celle de la pro-insuline humaine. Les plus importants sont IGF I et II et
l’insuline. Les trois sont synthétisés en quantité notable par les cellules musculaires en
culture, alors qu’in vivo IGF I et II sont produits principalement par le foie (Florini et al.,
1991). Des premières études ont montré que l’insuline stimule la différenciation des cellules
musculaires d’embryon de poulet à des concentrations de l’ordre du µM. Ensuite, il a été
montré que les taux physiologiques d’IGFs stimulent la différenciation au niveau
morphologique (fusion) et au niveau biochimique (activité CK) (Florini et al., 1991), soit sur
des lignées (myoblastes de rat L6), soit sur des cellules primaires d’embryon de poulet ou des
cellules satellites de rat (Ewton et al., 1994). Des études impliquent aussi les IGFs dans les
phénomènes de régénération du muscle squelettique in vivo (Musaro et al., 1999). La liaison
de l’IGF-I sur son récepteur tyrosine-kinase conduit à la stimulation des MAP-kinases et de
PI3K : ceci démontre que l’effet différenciateur est précédé par une phase proliférative
(Coolican et al., 1997). En effet, si le signal des IGFs est inhibé, les cellules maintiennent un
taux élevé de protéines Id, et il n’y a pas d’augmentation de la protéine p21-ras essentielle
pour l’arrêt du cycle cellulaire et pour procéder à la différenciation.
II.2.4.2.2 L’hormone AVP
La vasopressine (AVP) est une hormone nonapeptidique, produite par l’hypothalamus
et secrétée par la neurohypophyse dans le courant sanguin, par lequel elle atteint ses tissus-
cibles. Sa fonction d’antidiurétique est bien connue, ainsi que son effet vasoconstricteur. Elle
est aussi capable d’agir sur les cellules hépatiques en stimulant la glycogénolyse, et d’agir
78
comme neurotransmetteur dans le système sympathique (Hanley et al., 1984). La réponse
cellulaire est médiée par deux types de récepteurs, V1 et V2, appartenant à la famille des
récepteurs à sept domaines transmembranaires qui activent diverses voies de signalisation.
Les récepteurs V1, localisés sur les hépatocytes, les cellules musculaires lisses des vaisseaux,
et sur les cellules neuronales, agissent en activant diverses phospholipases (PLA, PLD, PLC),
qui produisent des seconds messagers capables de moduler divers types de canaux calciques
(Michell et al., 1979). Localisés dans les canaux collecteurs des tubules rénaux, les récepteurs
de type V2 sont responsables de l’action anti-diurétique de l’AVP, via l’activation d’une
adénylate cyclase qui conduit à la production d’AMPc comme second messager. Les deux
types de récepteurs peuvent être exprimés simultanément dans le même tissu, si l’on
considère les diverses fonctions régulées par l’AVP (Valloton, 1991). Le calcium libéré, à la
suite de l’activation du récepteur V1, induit la translocation de la forme cytosolique inactive
de la PKC sur la face interne de la membrane plasmique, où elle est activée par les DAG
libérés par la PLC, et où elle peut agir sur les substrats importants pour divers processus
cellulaires.
L’action de l’AVP sur le tissu musculaire squelettique n’est pas encore bien clarifiée,
même si les études antérieures, menées soit in vitro, soit in vivo, ont suggéré son implication
dans le métabolisme glucidique. En outre, il a été mis en évidence le présence de récepteurs
V1 dans la lignée myogénique de rat L6 (Wakelam, 1987), et la réponse à l’AVP a été
caractérisée, au niveau de la transduction du signal, dans diverses lignées myogéniques (L6,
L5, RD), une lignée de cellules satellites de souris (C2C12), et des cultures primaires de
poulet (Teti et al., 1993). La stimulation par l’AVP, à des concentrations comprises entre 10-9
et 10-6 M, induit, de manière dose-dépendante, la production d’inositol-phosphates en
quelques secondes, et est suivie d’un pic transitoire de calcium libéré à partir du réticulum
endoplasmique. Les signaux induits par l’AVP dans les lignées étudiées sont hétérogènes et
indépendants du stade de différenciation des cultures, mais corrélés à leur potentiel
myogénique (Teti et al., 1993).
En ce qui concerne le rôle de l’AVP dans l’induction de la différenciation des cellules
musculaires squelettiques, il a été démontré que les myoblastes L6C5 cultivés dans un milieu
contenant 5% de SVF en présence d’AVP ont une augmentation du pourcentage de fusion,
après 3-4 jours de traitement, et forment des myotubes plus grands qu’en l’absence
d’hormone. De plus, l’AVP est capable d’induire la différenciation des myoblastes en
l’absence d’autres facteurs en milieu contrôlé, et agit en synergie avec l’IGF-I pour augmenter
l’expression du phénotype différencié (Minotti et al., 1998). Le mécanisme de transduction du
79
signal AVP-dépendant co-implique les phospholipases C et D (Naro et al., 1997) et est corrélé
d’abord avec une augmentation rapide de l’expression du co-régulateur myogénique des
MRFs, MEF2, nécessaire pour l’activation transcriptionnelle de la myogénine (Scicchitano et
al., 2002), suivie d’une augmentation de l’expression des MRFs myogénine et Myf5 (Nervi et
al., 1995), et ensuite, des marqueurs terminaux comme la myosine et les diverses formes de
récepteurs de l’acétylcholine.
Tous les résultats impliquant l’AVP dans l’induction de la différenciation ayant été
obtenus en culture, le rôle physiologique de l’AVP dans la myogénèse in vivo reste à
démontrer. Il a été constaté qu'il existe de fortes concentrations d’AVP dans le muscle fœtal
humain, et que celles-ci ne décroissent qu' après la naissance (Smith et al., 1992).
II.2.5 Myofribrillogénèse
II.2.5.1 Protéines spécifiques du muscle
Depuis plusieurs décennies, de nombreuses études ont clairement montré que les
myoblastes postmitotiques mononucléés sont capables de synthétiser et d’accumuler des
protéines spécifiques du muscle dont l’actine-α sarcomérique, les chaînes lourdes et légères
de la myosine, la tropomyosine, la troponine et la créatine kinase. La plupart de ces protéines
sont codées par des familles multigéniques et sont présentes sous différentes isoformes
exprimées à différentes périodes du développement (Buckingham, 1985; Stromer, 1992;
Bandman, 1992; Schiaffino and Reggiani, 1994). L’expression de l’actine sarcomérique a fait
l’objet de données contradictoires, peut-être dues à des sensibilités différentes des méthodes
de détection de la protéine ou du transcrit. On connaît au moins six gènes codant pour
différentes isoformes d’actine chez les vertébrés (Vandekerckhove and Weber, 1978), à savoir
les deux isoformes non musculaires β et γ, et 4 isoformes exprimées différentiellement dans
les muscles: la forme α-squelettique, la forme α-cardiaque, la forme α-vasculaire et la forme
α-entérique. Les myoblastes en prolifération expriment dans leur cytoplasme les isoformes
ubiquitaires β et γ, alors que, quand le programme de différenciation se poursuit, l’expression
de ces deux isoformes est réduite tandis que l’expression de l’isoforme α-squelettique est
activée. Bien que des études effectuées sur des myoblastes de poulet aient suggéré que la
synthèse de l’actine-α sarcomérique ainsi que l’accumulation des ARNm codant pour cette
protéine n’interviennent qu’après la fusion (Lawrence et al., 1989), des travaux postérieurs
ont montré que les myoblastes pré-fusionnels des myotomes d’embryon de rat et de souris
expriment l’actine α sarcomérique (Babai et al., 1990), de même que les myoblastes de
80
muscles embryonnaires de poulet en culture primaire, quelques heures après la sortie du cycle
cellulaire (Lin et al., 1994). Dès le moment où le cycle cellulaire cesse, les cellules
postmitotiques d’allure fusiforme et allongée commencent à exprimer des protéines
myofrillaires et à réorganiser leur cytosquelette.
II.2.5.2 Les myofibrilles
Les cellules du muscle squelettique sont peut-être celles dont la structure atteint le plus
haut niveau d’organisation dans l’organisme. Une coupe transversale dans une fibre
musculaire (Figure 13) montre qu’elle est semblable à un cable formé de centaines de
filaments cylindriques plus minces, les myofibrilles. Celles-ci sont séparées les unes des
autres par un cytoplasme contenant un système complexe de membranes intracellulaires, ainsi
qu’un ensemble servant à la production d’énergie qui consiste en mitochondries, gouttelettes
lipidiques et granules de glycogène.
Figure 13 : Structure du muscle squelettique.
Schéma représentant les niveaux d’organisation du muscle squelettique depuis l’ensemble du muscle
dans l’organisme jusqu’au sarcomère individuel. Le premier encadré montre une micrographie
81
optique d’une fibre multinucléée. Le second encadré montre une micrographie électronique d’un
sarcomère individuel dont les bandes ont été marquées par des lettres.
Chaque myofibrille se compose de filaments fins d’actine-α et de filaments épais de myosine
organisés spatialement par un éventail de filaments intermédiaires et de protéines de liaison
de l’actine, de façon à constituer une succession d’unités contractiles, les sarcomères,
délimitées par les stries Z (Figure 14). Les stries Z sont formées par l'organisation de
filaments d'alpha-actinine qui servent à relier les extrémités des filaments fins de chaque
sarcomère entre elles et avec les extrémités des filaments fins du sarcomère adjacent. Chaque
sarcomère s’étend d’une strie Z à la suivante et contient plusieurs bandes sombres et claires.
Ainsi les bandes sombres A sont caractérisées par la présence des filaments épais de myosine
qui s’arrêtent au niveau des bandes I. Les filaments fins d’actine parcourent tout le sarcomère
à l’exception de la zone H. Au milieu de celle-ci, les filaments de myosine s’unissent pour
former la strie M. A partir de la strie M, de longs filaments de titine liés fermement aux
filaments épais s’étendent le long des bandes A et I jusqu’aux stries Z. La titine est un
filament protéique qui, dans chaque demi-sarcomère, relie chaque filament épais à la strie Z.
Une autre protéine, la nébuline, part des stries Z et s’associe étroitement avec les filaments
fins d’actine. La nébuline pourrait servir comme support à l’assemblage des filaments
d’actine.
Figure 14 : Disposition des molécules de titine dans le sarcomère.
Ces énormes molécules élastiques s’étendent de la strieZ à la bande M au centre du sarcomère. Trois
à six molécules de titine sont associées à chaque moitié d’un filament de myosine. Les molécules de
82
nébuline sont associées aux filaments minces et sont supposées réguler la longueur (c.à.d le nombre
de monomères d’actine). (Keller, 1995).
II.2.5.3 Modèle de myofibrillogénèse
Un des grands défis de la recherche concernant la compréhension de la physiologie et
la biologie du muscle, est d’identifier la séquence des événements à l’origine de l’assemblage
des filaments contractiles et de la strie Z dans le sarcomère. Dans la mesure où la cellule
musculaire présente une organisation exceptionnelle, les mécanismes régissant la mise en
place des structures myofibrillaires doivent vraisemblablement être très restrictifs et d'une
grande complexité. Plusieurs études ont suggéré que les filaments d’actine organisés en SFLS
(stress fiber like structures) semblent jouer un rôle important dans la myofibrillogénèse des
Figure 15 : Modèle de myofibrillogénèse proposé par Dabiri et al. (1997).
83
cardiomyocytes en culture (Dlugosz et al., 1984; Handel et al., 1991; Lu et al., 1992; Rhee et
al., 1994). Un traitement des cardiomyocytes par la cytochalasine D qui détruit les filaments
d’actine des SFLS, arrête la myofrillogénèse de novo (Auerbach et al., 1997). De plus,
plusieurs études effectuées sur des cardiomyocytes (Rhee et al., 1994; Dabiri et al., 1997;
Sanger et al., 2000; Sanger and Sanger, 2001), des cellules précardiaques embryonnaires (Du
et al., 2003) ou des myoblastes squelettiques de souris (Sanger et al., 2002) ont pu suggérer un
modèle de formation des myofibrilles qui consiste en trois étapes: les prémyofibrilles ou
SFLS (stress fiber like structures) servent d’échafaudage pour la formation des myofibrilles
naissantes qui vont, à leur tour, former les myofibrilles matures (Figure 15). Les
prémyofibrilles sont composées de minisarcomères contenant l’actine α et l’α-actinine
spécifiques du muscle ainsi que la Myosine II non musculaire (Rhee et al., 1994). L’α-
actinine se concentre dans des structures appelées corps Z (Z-bodies). Les corps Z délimitent
les minisarcomères rappelant les stries Z dans les sarcomères. Les filaments d’actine sont
attachés à ces corps Z et aux filaments de myosine II non musculaire organisés en mini-
bandes A. Ensuite, les prémyofibrilles s’alignent les unes à côté des autres pour former les
myofibrilles naissantes par recrutement de la titine et des filaments de myosine II musculaire.
La formation des myofibrilles naissantes est une étape transitoire entre les prémyofibrilles et
les myofibrilles matures. Ces dernières se forment après l’élimination des filaments de
myosine non musculaire, l’alignement des filaments de myosine musculaire dans des bandes
A, et la fusion des corps Z en bandes Z (Dabiri et al., 1997; Sanger et al., 2002; Du et al.,
2003). Malgré toutes les études effectuées, les mécanismes de régulation de l'assemblage des
différentes protéines dans ces structures restent mal connus.
84
III MATERIELS ET METHODES
III.1 Réactifs
L'acide L-α-dipalmityl [glycérol-14C(U)] phosphatidique (144mCi/mmol) et l’acide [9,10-3H(N)] palmitique (57,00 Ci/mmol), proviennent de PERKIN ELMER Life Sciences.
L’orthophosphate [33P] (2500 Ci/mmol) provient de AMERCHAM BIOSCIENCES
L'acide phosphatidique (1-arachidonoyl, 2-stéaroyl) et le phosphatidylbutanol proviennent de
TEBU.
L'anticorps monoclonal anti- PIP2 provient de Assay Designs, EUROMEDEX.
L'anticorps polyclonal anti-RhoA provient de SANTA-CRUZ BIOTECHNOLOGY.
L'anticorps monoclonal F5D anti-myogénine provient de DEVELOPMENTAL STUDIES
HYBRIDOMA BANK, UNIVERSITY OF IOWA.
L'anticorps monoclonal anti-tubuline-α provient de SIGMA.
Les anticorps polyclonaux anti-PLD1 et anti-PLD2 ont été gracieusement fournis par le Dr.
Sylvain Bourgoin (Université de Laval, Québec, Canada).
Les anticorps monoclonaux anti-PKCα, β1, γ et ι proviennent de TRANSDUCTION
LABORATORIES.
L'anticorps monoclonal anti 58k (marqueur de Golgi) provient de SIGMA.
L'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la peroxydase de raifort et le kit ECL
proviennent de AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH.
L’anticorps secondaire anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase de raifort provient de
BIORAD.
La phalloïdine couplée à la rhodamine, le DAPI, l’anticorps secondaire Alexa Fluor-488 anti-
lapin proviennent de MOLECULAR PROBES.
Les vecteurs pCDNA3-hPLD1 et pCDNA3-hPLD2 sont un don du Dr. Michel Record
(INSERM U326, Toulouse), le vecteur pcDNA3-HA1-cRaf1 est un don du Dr. A. Eychene
(CNRS U146, Orsay) et le vecteur pEGFP-C1 provient de CLONTECH.
Le kit « QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis kit » provient de STRATAGENE.
Le kit « Rapid DNA Ligation Kit », le FuGENE 6, la Taq polymerase et la sérumalbumine
bovine proviennent de ROCHE APPLIED SCIENCE.
La transcriptase inverse M-MLV vient de PROMEGA.
85
Le cocktail d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail), l’arginine-vasopressine (AVP), le
milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) enrichi en glucose (4500 mg/L), le Tri
Reagent et la bréfeldine A proviennent de SIGMA.
L’exoenzyme C3 de Clostridum botulinum est un don du Dr. P.Boquet (INSERM U452,
Nice).
Le sérum de veau fœtal, le PBS stérile, la penicilline, la streptomycine et la L-glutamine
proviennent de GIBCO.
III.2 Méthodes
III.2.1 Culture et traitements des cellules
Les cellules sont cultivées sous une atmosphère humide à 37°C avec 5% de CO2 et
95% d’air dans un incubateur Stéricult.
III.2.1.1 Culture des cellules L6C5
Les cellules utilisées sont des cellules myogéniques de rat L6C5 (type L6, clone C5)
possédant une capacité de différenciation significative. Elles sont ensemencées à raison de
10000 cellules / cm2. Elles forment un tapis cellulaire monocouche qui devient jointif à
confluence. Ces cellules sont mises en culture dans un milieu nutritif liquide DMEM de base
riche en glucose (4500mg/L) supplémenté avec 200 mM de L-Glutamine, 20 mM de tampon
HEPES, 100µg/ml de streptomycine plus 100U/ml de pénicilline, ce qui donne un milieu
incomplet, auquel on ajoute 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté (S.V.F.) afin
d’obtenir un milieu complet.
Les cellules sont passées tous les 3-4 jours. Pour ce faire, le milieu est aspiré, les cellules sont
lavées avec du tampon PBS (sans Ca++, sans Mg++), puis 2 ml de trypsine/EDTA sont
déposés sur les cellules pendant 1 minute puis aspirés. Les cellules sont incubées ainsi
pendant 5 minutes à 37°C. Les cellules décollées sont resuspendues dans 10 ml de milieu
complet, et ré-ensemencées.
III.2.1.2 Traitement des cellules L6C5
Vingt-quatre heures après ensemencement des cellules et avant tout traitement, ces
dernières sont lavées deux fois avec du PBS à 37°C, puis elles sont mises en présence d’un
milieu DMEM dépourvu de SVF mais contenant de la BSA à 1% ce qui permet de rendre les
cellules quiescentes par arrêt de la prolifération cellulaire. Les cellules sont ensuite traitées
86
par les effecteurs à la concentration voulue et laissées en culture le temps nécessaire comme
cité dans chaque expérience. A noter que l’addition de bréfeldine A ou de butanol-1 et
butanol-2 dans le milieu précède de 10 min le traitement par l’AVP ou le TPA. Dans le cas
précis des alcools, le milieu est changé tous les jours pour éviter leur évaporation.
III.2.1.3 Evaluation de la différenciation
Les cellules L6C5 peuvent être différenciées soit après leur traitement par l’AVP à 10-
7 M dans un milieu DMEM dépourvu de SVF et contenant 1% BSA pendant plusieurs jours,
soit en les cultivant plusieurs jours dans un milieu DMEM contenant 1% de SVF. La
différenciation myogénique peut être évaluée sur des critères précoces comme l’expression et
l’accumulation nucléaire de la myogénine, facteur de transcription spécifique du muscle, 24h
après l’induction de la différenciation. Son expression est déterminée par des expériences de
western-blotting et son accumulation nucléaire est détectée par immunofluorescence (voir
protocole ci-dessous). La différenciation terminale des cellules L6 peut être évaluée sur des
critères tardifs comme la mesure de l’activité créatine kinase ou l’expression de la myosine
sarcomérique détectée par immunofluorescence dans les myotubes plurinucléés formés après
6-8 jours de l’induction myogénique (voir protocole ci-dessous).
III.2.2 Dosage de l’activité créatine kinase
Ce dosage est effectué d’après les conditions de réactions optimales déterminées par
Scasz et al., 1976. Huit jours après la mise en culture des cellules soit dans le milieu contenant
10% ou 1% SVF, soit dans un milieu dépourvu de SVF et supplémenté par 1% BSA, en
présence ou non d’AVP, les cellules sont lavées au PBS, puis décollées par incubation dans
du PBS contenant 1 mM d’EDTA pendant 15 minutes à 37°C, et récupérées grâce à une
centrifugation de 10 minutes à 2500g. Les culots sont repris par 300 µl de tampon Tris-HCl
20 mM, PH 6,7, EDTA 1mM, puis soniqués 5 secondes à 4°C afin d’obtenir une suspension
homogène, puis centrifugés 15 minutes à 14000g. Les surnageants sont récupérés et utilisés
pour le dosage qui se fait sur une micro-plaque de 96 puits. Ce dernier se fait sur 50 µl
d’échantillon par puits en présence de 100 µl de milieu réactionnel (CK 47-10 Sigma)
contenant 30 mM de créatine phosphate, 2 mM de NAD, 20 mM de N-acétyl-L-cystéine,
3000U/L d’hexokinase de levure, 2000U/L de glucose-6-phosphate déshydrogénase, 10 mM
d’ions magnésium, 20 mM de D-glucose, 10 µM d’ADP et 2 mM d’EDTA.
87
On suit la formation de NADH, pour cela la quantification se fait pendant 15 minutes à 30°C
par mesure de la vitesse de variation de l’absorption à 340 nm qui est proportionnelle à
l’activité créatine kinase. L’ appareil utilisé est un lecteur de plaque Powerwave-X (BIO-TEK
INSTRUMENTS).
III.2.3 Transfections transitoires
La méthode de transfection utilisée est basée sur la formation d’un complexe entre
l'ADN plasmidique et des liposomes cationiques, permettant l'entrée du plasmide à l'intérieur
de la cellule. Le réactif utilisé pour cette méthode est le FuGENE™ 6 (ROCHE Molecular
Biochemicals). 6 µl de réactif FuGENE 6 sont dilués dans 100µl de milieu incomplet (sans
SVF) et laissés à température ambiante 5 min. Le FuGENE dilué est ensuite ajouté sur 2 µg
de plasmide (pour pCDNA3) ou sur 3 µg de plasmide (pour pEGFP) placés au fond d'un tube
eppendorf. L’ensemble FuGENE/ADN est incubé 15 minutes à température ambiante en
tapotant de temps à autre. Ensuite le mélange de 100 µl Fugène/ADN est déposé sur 200 000
cellules en suspension dans 1 ml de milieu complet (10% de SVF). Les cellules sont ensuite
ensemencées dans des boîtes de culture de 35 mm et laissées 18h à 37°C. Pour les expériences
dans lesquelles on doit évaluer l’accumulation nucléaire de la myogénine par
immunofluorescence, le milieu des cellules transfectées est remplacé par du milieu sans
sérum additionné de 1% de BSA et les cellules sont cultivées pendant encore 24 h en présence
ou en absence de 10-7M AVP. Pour les expériences dans lesquelles on doit marquer l’actine
par une toxine fluorescente, le milieu des cellules transfectées est remplacé par du milieu sans
sérum additionné de 1% de BSA pendant 3h et les cellules sont ensuite traitées par l’AVP
pendant 10 min.
III.2.4 Immunofluorescence
III.2.4.1 Immunofluorescence de la myogénine
Vingt-quatres heures après culture des cellules dans 1% de BSA en présence ou en
absence des agonistes appropriés, les cellules sont lavées dans du PBS et fixées par 3,7% de
formaldéhyde pendant 10 min à 4°C. Les cellules sont ensuite perméabilisées avec 0,1% de
Triton-X100 pendant 15 min à 4°C et incubées avec 1% BSA pendant 20 min à température
ambiante. Ensuite on incube les cellules avec l’anticorps primaire monoclonal anti-myogénine
88
F5D pendant la nuit à température ambiante. Enfin, les cellules sont lavées avec 1% de BSA
et mises en présence d’un anticorps secondaire, couplé à la rhodamine ou à la fluorescéine,
dilué à 1:200 dans une solution de PBS contenant 1% de BSA.
III.2.4.2 Immunofluorescence de la myosine
Neuf jours après culture des cellules en absence ou en présence d’AVP (10-7M) après
addition, ou pas, de 0,5% butanol-1 ou 0,5% butanol-2, les cellules sont fixées,
perméabilisées, comme pour la myogénine, et ensuite, incubées avec l’anticorps primaire
monoclonal anti-myosine sarcomérique dilué à 1:50 pendant 1h à température ambiante. Les
cellules sont lavées avec 1% de BSA et mises en présence d’un anticorps secondaire, couplé à
la rhodamine dilué à 1:200 dans une solution de PBS contenant 1% de BSA. On ajoute
ensuite le DAPI qui est un colorant spécifique du noyau pendant 5 minutes à température
ambiante (1µg/ml).
III.2.4.3 Immunofluorescence des PLD
Les cellules sont fixées par du formaldéhyde à 3,7% pendant 30 minutes. Elles sont
ensuite traitées pendant 10 min avec du NH4Cl puis par de la BSA à 0,1% pendant 20
minutes. Les anticorps polyclonaux anti-PLD1 ou anti-PLD2 dilués à 1:1000 dans du PBS
contenant 0,05% de saponine, 0,1% de BSA sont ensuite ajoutés pour la nuit à 4°C. Après
avoir lavé au PBS, on ajoute l’anticorps secondaire Alexa-Fluor anti-lapin (Molecular Probes)
dilué à 1:1000 pendant 1 heure. Le co-marquage avec le marqueur du Golgi a été effectué à
l’aide d’un anticorps monoclonal anti-G58k dilué à 1:50 et un anticorps secondaire, couplé à
la rhodamine, dilué à 1:200 dans une solution de PBS contenant 1% de BSA.
III.2.4.4 Immunofluorescence du PIP2
On a utilisé le même protocole que pour les PLD. L’anticorps primaire utilisé est un
anticorps monoclonal anti-PIP2 dilué à 1:500. l’anticorps secondaire est couplé à la
fluoresceine et dilué à 1:200 dans une solution de PBS contenant 1% de BSA.
III.2.4.5 Marquage de l’actine.
Après l’ajout de l’anticorps secondaire et lavage des cellules avec du PBS dans les
expériences d’immunofluorescence de PLD1, PLD2, PIP2, les cellules sont incubées en
présence de la phalloïdine couplée à la rhodamine. La phalloïdine est une toxine qui marque
spécifiquement l’actine F dans les cellules et qui nous permet de détecter les SFLS dans les
myoblastes L6.
89
III.2.5 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)
Pour réaliser ce dosage, on utilise le kit "Bio-Rad's protein assay". Ce dosage est basé
sur le changement de coloration du bleu de Coomassie en présence de concentrations
variables de protéines. Une fraction aliquote de la solution à doser est prélevée et complétée à
50µl avec de l'eau ou le tampon constituant la solution à doser. On ajoute 200µl de solution
"BioRad protein assay" diluée 5 fois dans de l'eau. Après agitation, la densité optique à
595nm est lue en microplaque 96 puits à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique de plaques
multipuits (PowerWave X, BIOTEK INSTRUMENTS) et la concentration est déterminée par
comparaison à une gamme étalon d’albumine sérique bovine (1-20µg de protéines) réalisée
dans les mêmes conditions.
III.2.6 Préparation des échantillons pour électrophorèse en conditions
dénaturantes (SDS-PAGE)
III.2.6.1 RhoA
Les cellules L6C5, cultivées dans des boîtes de culture de 100 mm de diamètre, sont
mises dans un milieu DMEM contenant de la BSA à 1% pendant 3h avant leur traitement ou
non par l’AVP pour 1 minute. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du PBS à 4°C
puis sont récoltées par grattage dans 0,5 ml de tampon d’homogénéisation (20 mM Tris-HCl
PH 7.6) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma P2714)
dilué à 1/4. Les cellules sont lysées et homogénéisées au potter de Dounce par 40 allers et
retours. Les homogénats cellulaires sont ultracentrifugés à 100 000g pendant 1h afin de
séparer la fraction cytosolique (soluble) de la fraction particulaire (insoluble). Cette dernière
est reprise dans un volume minimum de tampon de lyse avec inhibiteurs de protéases. Le
dosage des protéines (par méthode de Bradford) est réalisé sur un aliquot de chaque
échantillon. Un aliquot de chaque fraction est alors dilué dans le tampon de Laemmli
(composition finale : Tris 125mM, pH=6,8, saccharose 10%, SDS 2%, mercaptoéthanol 1% et
bleu de bromophénol 0,05%).
III.2.6.2 PLD1 et PLD2
Après huit jours de culture dans le milieu approprié, les cellules sont lavées deux fois
avec du PBS à 4°C, récoltées dans du PBS et centrifugées à 1000g pendant 10 min. Le culot
cellulaire homogénéisé dans le tampon (20 mM Tris-HCl PH 7.6, 100 mM NaCl, 1% Triton
90
X-100) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma P2714)
dilué à 1/4 est congelé à -20°C. Après décongélation, le dosage des protéines (par méthode de
Bradford) est réalisé sur un aliquot de chaque échantillon et le reste est dilué dans le tampon
de Laëmmli supplémenté avec de l’urée (2M).
III.2.6.3 Myogénine
Vingt-quatre heures après culture des cellules dans 1% de BSA en présence ou en
absence des agonistes appropriés, Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS à 4°C puis
sont récoltées par grattage dans 0,5 ml de tampon d’homogénéisation (20 mM Tris-HCl PH
7.6) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma P2714) dilué
à 1/4. Les cellules sont lysées et homogénéisées au potter de Dounce par 40 allers et retours.
Le dosage des protéines (par la méthode de Bradford) est réalisé sur un aliquot de chaque
échantillon. Un aliquot de chaque fraction est alors dilué dans le tampon de Laëmmli.
III.2.6.4 Les différentes isoformes de PKC
Vingt-quatre heures après culture de cellules en présence de TPA (1 nM ou 10 nM),
les cellules sont homogénéisées dans le tampon (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 2 mM
EGTA, 250 mM sucrose, 5 mM DTT, 100 mg/ml leupeptin, 100 mg/ml aprotinin and 3.5
mg/ml PMSF), et soniquées. Les homogénats cellulaires sont ultracentrifugés à 100 000g
pendant 1h afin de séparer la fraction cytosolique (soluble) de la fraction particulaire
(insoluble). Cette dernière est reprise dans un volume minimum de tampon de lyse. Le dosage
des protéines (par méthode de Bradford) est réalisé sur un aliquot de chaque échantillon. Un
aliquot de chaque fraction est alors dilué dans le tampon de Laëmmli.
III.2.7 Electrophorèse en SDS-PAGE et "Western-blotting"
Les électrophorèses sont réalisées sur un gel de polyacrylamide dont la concentration
dépend de la taille des protéines à séparer, en présence de 0,1% de SDS grâce à un appareil
pour électrophorèse pour minigels Biorad. Brièvement, pour deux mini gels on prépare le gel
de séparation en mélangeant dans un tube 6.9ml d'urée 8M, 4ml d'un mélange d'acrylamide à
30%, 3,8ml de Tris 1,5M pH8,8, 0,15ml de SDS 10%, 0,15ml d'ammonium persulfate 10% et
0,009ml de TEMED. Le mélange est vortexé avant d'être coulé. Après polymérisation, on
prépare un gel de concentration en mélangeant dans un tube 2,1ml d'eau, 0,5ml d'un mélange
d'acrylamide à 30%, 0,38ml de Tris 1M pH6,8, 0,03ml de SDS 10%, 0,03ml d'ammonium
91
persulfate 10% et 0,003ml de TEMED. Le gel de concentration est coulé au-dessus du gel de
séparation. Après polymérisation les gels sont placés dans la cuve de migration du système.
Les échantillons préparés comme décrit précédemment sont dénaturés à 100°C puis déposés.
La migration électrophorétique s’effectue à 120V à voltage constant. La migration peut être
suivie grâce au dépôt de marqueurs moléculaires précolorés dans un puits de référence. Les
masses moléculaires des protéines étudiées sont déterminées en référence à ces marqueurs
moléculaires. L’électrotransfert sur membrane Immobilon Millipore est ensuite réalisé dans
un appareil de transfert semi-sec Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instruments). Le transfert se
fait dans un système de « sandwich » imbibé de tampon de transfert (25mM de TrisHCl,
pH=8,3, 0,19 M de glycine, 20% de méthanol) par un courant électrique de 40 mA pendant
1h30. Le transfert effectué, les marqueurs de masse moléculaire sont également transférés et
peuvent servir de contrôle. La membrane est rincée par un tampon salin TBS-T (Tris-HCl
20mM, NaCl 137mM, pH=7,6, Tween 20 à 0,1%) puis saturée dans un bain TBS-T/BSA 1%
durant une nuit à 4°C. La membrane est ensuite rincée trois fois par du TBS-T durant 10 min,
puis incubée à température ambiante avec l'anticorps primaire dilué à la concentration voulue
pendant 1h. Elle est rincée 7 fois par du TBS-T puis incubée avec l'anticorps secondaire anti-
IgG couplé à la peroxydase. La membrane est soumise à une dernière série de lavages avant
révélation spécifique des protéines immunoréactives par chimiluminescence (kit ECL
Amersham).
III.2.7.1 Conditions spécifiques à chaque protéine détectée
- PLD1 et PLD2 (~120 KDa et ~90 KDa respectivement)
Le gel est à 8% de polyacrylamide, 0,1% de SDS et 4M d’urée. Les deux isoformes de
PLD sont détectées grâce à un anticorps anti-PLD1 ou anti-PLD2 (dilution 1/2000).
L’anticorps anti-PLD1 est dirigé contre des peptides correspondant aux résidus 1-16, 144-
162, 967-981, et 1027-1040 tandis que l’anticorps anti-PLD2 est dirigé contre une séquence
d’acides aminés située en N-terminal, les résidus 13-33. L’anticorps secondaire anti-lapin est
ensuite utilisé (dilution 1/5000). La saturation de la membrane s’effectue avec du lait à 10%
pendant 2 heures.
- Myogénine (~36 KDa)
Le gel est à 15 %. L’anticorps monoclonal anti-myogénine est dilué à 1/50 dans du
TBST-BSA 0,01 % et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris est dilué au 1/10000.
92
- RhoA ( 24 KDa)
Le gel est à 15 %. L’anticorps polyclonal anti-RhoA est dilué à 1/400 dans du TBST-
BSA 0,01 % et l’anticorps secondaire anti-lapin est dilué au 1/5000.
- Différentes isoformes de PKC
Le gel est à 10 %. Les anticorps monoclonaux anti-PKC-α, β1, γ, ι sont dilués à 1/500
dans du TBST-BSA 0,01 % et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris est dilué au 1/10000.
- Tubuline (50 KDa)
Pour la normalisation, les membranes ont été «strippées» (décapées de leurs anticorps)
et ré-incubées avec l’anticorps monoclonal anti-tubuline-α dilué à 1/2000 dans du TBST-BSA
0,01 % et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris dilué au 1/10000.
III.2.8 Mesure de l’activité PLD dans les cellules L6
Nous avons utilisé la propriété spécifique de la PLD, la transphosphatidylation.
L’emploi d’un alcool primaire comme le butanol-1 bloque la production du PA en faveur de
la formation du phosphatidylbutanol. Les cellules (15 x 104 cellules / boîte de 35 mm)
cultivées en présence de 10% de SVF, sont lavées avec du PBS et incubées pendant 2h dans
un milieu dépourvu de SVF, en présence de 2µCi/ml de [3H]-acide palmitique. Après deux
lavages avec du PBS, les cellules sont placées en milieu 1% BSA et traitées ou non, pendant
30 minutes, avec de l’AVP à 10-7 M ou du TPA à 1 et 100 nM en présence de 1% de butanol-
1. Dans certaines expériences la bréfeldine A (10 µg/ml) est apportée dans le milieu 1,5 h
avant ajout de l’AVP; dans d’autres, le TPA est ajouté au milieu de culture 24 h avant le
radio-marquage des cellules. Les incubations sont stoppées par élimination rapide du milieu,
lavage des cellules avec du PBS froid et addition de 0,5 ml de HCL 0,1 N dans du PBS. Les
cellules grattées sont transférées dans des tubes de verre bouchés à vis. Avant l'extraction
lipidique selon la technique de Bligh et Dyer (1959), de l'acide dipalmityl-phosphatidique
marqué au [14C] (144mCi/mmole) utilisé comme standard interne et du phosphatidylbutanol
(PBu) (1µg) utilisé comme entraîneur sont rajoutés dans chaque tube. Les lipides sont extraits
dans un mélange de solvants (méthanol/chloroforme 2/1 v/v) contenant 50 µM de
buthylhydroxytoluène (BHT) utilisé comme antioxydant. Les tubes sont vortexés durant 30
secondes. Après 30 minutes à température ambiante, un mélange de NaCl 0,15 M /
93
chloroforme (1/1 v/v) est ajouté et les tubes sont vortexés pendant une minute. Les phases
organique et aqueuse sont séparées par centrifugation de 5 minutes à 2500 rpm. La phase
organique est prélevée et évaporée à sec sous azote. Les résidus secs sont repris par un
mélange chloroforme/méthanol (2/1 v/v) et déposés sur plaque de silice. Le PBu et l'acide
phosphatidique (PA) sont séparés des autres phospholipides par CCM bidimensionnelle. Le
premier système de solvant est un mélange chloroforme/méthanol/ammoniaque aqueux 28%
(65/35/5.5 v/v/v). Après séchage des plaques sous atmosphère réduite pendant 2h, un mélange
de PBu/PA standards est déposé. La seconde migration s'effectue dans un mélange acétate
d'éthyle/isooctane/acide acétique (90/50/20 v/v/v). Les plaques sont séchées et colorées au
bleu de Coomassie à 0.03% dans une solution de NaCl 0.9%/méthanol 20% pendant 20 min,
puis lavées par une solution de NaCl 0.9%/méthanol 20% pendant 10min. Chacun des spots
d'intérêt est gratté puis sa radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide dans
un compteur Packard 1900TR. La quantité de PBu formé dans l'essai est exprimée en
pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides totaux, et corrigée par le rendement de
récupération de l’acide phosphatidique.
III.2.9 Traitement par l’exoenzyme C3 avec la méthode de « Scrape
loading »
Cette méthode est nécessaire pour faire pénétrer l’exoenzyme C3 de C.botulinum à
l’intérieur des cellules, la toxine n’ayant aucun effet lorsqu’elle est simplement ajoutée au
milieu de culture des cellules L6. Après vingt-quatre heures de culture en boîtes de 100 mm,
les cellules sont lavées deux fois par du PBS, puis par un tampon de grattage (114 mM KCl,
1mM NaCl, 5,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH7,5), grattées avec précaution dans 0,5 ml
du même tampon, contenant ou non 5µg/ml d’exoenzyme C3, lavées dans le milieu de culture
et ré-ensemencées dans une boîte de 35 mm. Après 24h de culture, la PLD est dosée comme
précédemment.
III.2.10 Dosage du PIP2 néosynthétisé
Les cellules L6 cultivées dans des plaques de 6 puits sont lavées deux fois par du
milieu MEM sans phosphate et sans sérum et incubées avec 50µci/ml de 33P-Pi à 37°C. Après
10 min, les cellules sont traitées, ou pas, avec 1% butanol-1 ou butanol-2 pour encore 10 min.
Ensuite, on ajoute 1nM d’AVP pour 5 min, et la réaction est stoppée par addition de 1 ml de
94
méthanol dans chaque puits. Les lipides sont extraits après acidification selon la méthode de
Bligh et Dyer (1959) et ensuite analysés par CCM monodimensionnelle. Les plaques de silice,
traitées par l’oxalate de potassium, sont développées dans un mélange de solvant: méthanol/
chloroforme/ammoniaque 28%/H2O (40/28/6/10 v/v/v/v), révélées par analyse au
Phosphorimager Storm afin de localiser le PIP2 marqué au P33. La radioactivité est ensuite
quantifiée par analyse des images digitales obtenues par Phosphorimager, à l’aide du logiciel
Image Quant.
III.2.11 Préparation des ARN
Les ARN totaux des cellules L6 sont extraits à l'aide du kit d'extraction Tri Reagent
(SIGMA). Les cellules récupérées dans du PBS-EDTA sont culottées à 1000 rpm à 4°C. Le
culot est repris dans 1ml de réactif Tri Reagent et les cellules sont homogénéisées par passage
dans une seringue. Les homogénats obtenus sont laissés 5 min à température ambiante pour
assurer une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques. Ensuite, on ajoute 0,2ml
de chloroforme et on agite vigoureusement pendant 15 sec. Les échantillons sont laissés 15
min à température ambiante puis centrifugés à 12000g pendant 15 min à 4°C. Le mélange se
sépare alors en une phase organique rouge contenant les protéines, une interphase contenant
l'ADN et une phase aqueuse incolore contenant l'ARN. La phase aqueuse est transférée dans
un autre tube auquel on ajoute 0,5ml d'isopropanol. Le mélange est incubé 10 min à
température ambiante, centrifugé ensuite à 12000g pendant 10 min à 4°C. L'ARN précipité
forme un culot au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1ml
d'éthanol 75%. L'échantillon est de nouveau centrifugé à 7500g, le surnageant est éliminé et le
culot est séché à l'air, avant d'être repris dans un volume minimum d'eau stérile. La
quantification des ARN se réalise par lecture spectrophotométrique à la longueur d'onde de
260nm. Les ARN sont ensuite conservés à -80°C.
III.2.12 RT-PCR
III.2.12.1 Trancription inverse (RT)
A partir des ARN préparés comme décrit ci-dessus, l'ADN complémentaire est
transcrit à l'aide de la transcriptase inverse M-MLV (PROMEGA). La réaction se déroule en
deux étapes. La première est la dénaturation des ARN en présence des amorces oligo (dT).
95
Dans un volume final de 16,5µl, 5µg d'ARN totaux sont incubés en présence de 500µM de
dNTP, 3,5µM d'oligo(dT), pendant 10 min à 70°C. Les tubes sont ensuite placés dans la glace
avant la deuxième étape de transcription. Dans le milieu de réaction sont alors ajoutés le
tampon concentré 10X (concentration finale: Tris-HCl 50mM, pH 8,3, 40mM KCl, 8mM
MgCl2, 1mM DTT), l'inhibiteur d'ARNase (1U/µl) ainsi que la transcriptase inverse (1U/µl).
Le tout est incubé 15 min à 25°C, puis 50 min à 42°C pour permettre la synthèse d’ADNc et
enfin 15 min à 70°C pour dénaturer les complexes ARN/ADNc.
III.2.12.2 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
L'ADNc ainsi synthétisé sert de matrice à l'amplification des transcrits de PLD1,
PLD2 et β-actine par « Polymerase Chain Reaction » (PCR). Les amorces spécifiques pour
l'amplification des transcrits de PLD1 ont été préparées sur la base des séquences publiées
afin de pouvoir discriminer les isoformes rPLD1a et rPLD1b. Les amorces sens et antisens
sont: 5’- AGGACAGTCTCTGGGCTCTC -3’ et 5’- TGCCTTTCCGTGAACCACAG -3’
respectivement. Les amorces spécifiques pour l'amplification des transcrits de PLD2 ont été
préparées sur la base de la séquence publiée de rPLD2. Les amorces sens et antisens sont:
5’- TGAACAGGGGCAGTGTTTCC -3’ et 5’- AGGTCTGGCCAGGTATTTGC -3’
respectivement. Les transcrits de la β-actine ont été amplifiés en utilisant les amorces sens et
antisens5’- TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3’ et 5’-CCTAGAAGCATTTGC
GGTGCACGATG –3’ respectivement. Dans un volume final de réaction de 50µl, on incube
5µl du milieu de réaction de la transcription inverse en présence de 200µM de dNTP, 0,4µM
de chaque amorce spécifique et 2 unité d'ADN polymérase Taq (Roche), dans un milieu
tamponné Tris-HCl 10mM, pH8,3, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2. Les conditions
d'amplification programmées sur le thermocycleur sont les suivantes: pour PLD1, 94°C
pendant 45 s, 54°C pendant 45 s et 72°C pendant 45 s, pendant 40 cycles; pour PLD2, 94°C
pendant 45 s, 56°C pendant 45 s et 72°C pendant 30 s, pendant 35 cycles; pour β-actine, 94°C
pendant 45 s, 65°C pendant 45 s et 72°C pendant 30 s, pendant 35 cycles.
III.2.12.3 Electrophorèse sur gel d'agarose des ADN
Les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont ensuite analysés par électrophorèse sur
gel d'agarose 2%. Le gel est préparé extemporanément en diluant 1g d'agarose dans 50ml de
tampon TBE (Tris-Borate 90mM, pH8, EDTA 1mM). La solution est portée à ébullition, puis
refroidie avant ajout de 5µl d'une solution de bromure d'éthydium (BET) 10 mg/ml. La
solution encore tiède est coulée dans la cuve de migration horizontale et après
96
refroidissement, le gel polymérise. Il est ensuite immergé dans le tampon de migration. Les
échantillons préparés dans une solution de dépôt (0,05% de bleu de bromophénol, 0,05% de
xylène cyanol et 6% de glycérol) sont déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration
se fait de la cathode vers l’anode sous tension constante à raison d’environ 100 volts, et en
présence d’un marqueur de taille. La position des fragments d’ADN ayant fixé du bromure
d’éthidium (BET) est révélée sous lumière UV et le gel est photographié à l'aide d'une caméra
CCD (ImageMaster VDS-CL, AMERSHAM BIOTECH).
III.2.13 Construction des plasmides pEGFP-hPLD1, pEGFP-hPLD2
et pEGFP-PABD
III.2.13.1 Amplification des séquences d'ADN codantes pour hPLD1, hPLD2
et domaine de fixation de PA
Les plasmides pCDNA3 contenant la séquence complète codante pour hPLD1b, hPLD2, ou
cRaf-1, ont servi de matrice pour l'amplification des séquences d'ADN de PLD1, PLD2 ou du
domaine de fixation de PA (PABD) de cRaf-1, par PCR.
Les amorces spécifiques pour l'amplification de PLD1, préparées sur la base de la séquence
publiée de hPLD1, sont:
5’-AGGTCGACATGTCACTGAAAAACGAGCCAC-3’ : sens
5’-AGGTCGACTTAAGTCCAAACCTCCATGGGC-3’ : antisens
(les nucléotides soulignés correspondent au site de restriction Sal1 ajouté afin de permettre
l'insertion du gène PLD1 dans le plasmide pEGFP-C1).
Les amorces spécifiques pour l'amplification de PLD2, préparées sur la base de la séquence
publiée de hPLD2, sont:
5’-AGGAATTCGATGACGGCGACCCCTGAGAGC-3’ : sens
5’-AGGTCGACCTATGTCCACACTTCTAGGGG-3’ : antisens
(les nucléotides soulignés correspondent aux sites de restriction EcoRI et Sal1 ajoutés afin de
permettre l'insertion du gène PLD2 dans le plasmide pEGFP-C1).
Les amorces spécifiques pour l'amplification du domaine de fixation de PA, préparées sur la
base de la séquence publiée de cRaf-1 humain, sont:
5’-AGAGATCTTTCAGGAATGAGGTGGCTGT-3’
5’-AGGAATTCGCCCTCGCACCACTGGGTCA-3’
97
(les nucléotides soulignés correspondent aux sites de restriction BglII et EcoRI ajoutés afin de
permettre l'insertion du domaine de fixation de PA dans le plasmide pEGFP-C1).
Dans un volume final de 100µl, on incube 1µg d’ADN plasmidique en présence de 200µM de
dNTP, 0,4µM de chaque amorce spécifique et 0,05U/µl d'ADN polymérase Taq « Expand
High Fidelity » (Roche), 10 µl de tampon 10X. Les conditions d'amplification programmées
sur le thermocycleur sont identiques pour PLD1 et PLD2 (94°C pendant 60 s, 52°C pendant
60 s et 72°C pendant 180 s, pendant 30 cycles). Pour amplier le domaine de fixation de PA,
les conditions utilisées sont les suivantes: (94°C pendant 45 s, 51°C pendant 45 s et 72°C
pendant 30 s, pendant 30 cycles).
III.2.13.2 Insertion des séquences amplifiées dans pEGFP-C1
Les séquences amplifiées par PCR sont analysées par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel
est visionné sous lampe UV et les bandes correspondant aux séquences de PLD1 et PLD2
sont découpées dans le gel et placées à 4°C. L'ADN amplifié est ensuite purifié à l'aide du kit
d'extraction Qiaquick gel (Qiagen). Comme décrit dans le protocole du kit, un volume de gel
est dissous dans 3 volumes de tampon QG et incubé 10 min à 50°C. Après dissolution totale
du gel, 1 volume d'isopropanol est ajouté. La totalité du volume est déposé sur une colonne
QIAquick et centrifugé 1 min. L'ADN est alors fixé sur la colonne et le filtrat est éliminé. La
colonne est lavée par 0,75ml de tampon PE afin d'éliminer toute trace d'agarose de la colonne.
L'ADN est élué du support par 50µl d'eau stérile par centrifugation.
A ce stade les séquences d'ADN de PLD1, PLD2, et du domaine de fixation de PA, amplifiées
grâce aux amorces décrites dans le paragraphe III.13.1 puis purifiées, possèdent à chacune de
leurs extrémités les sites de restriction introduits. Afin d'ouvrir ces sites, les séquences d'ADN
sont soumises à une digestion par les enzymes de restriction correspondantes. Parallèlement,
le plasmide pEGFP-C1 est ouvert dans les mêmes conditions et puis déphosphorylé par une
phosphatase alcaline. On réalise ensuite une ligation des séquences de PLD1, PLD2 ou
domaine de fixation de PA avec le plasmide pEGFP-C1 ouvert (Rapid DNA Ligation Kit,
Roche). Dans un volume final de 10µl, sont incubés 50 ng de plasmide avec 50 ng d'insert, en
présence de 1UI d'ADN ligase T4, 1µl tampon de dilution et 1µl de tampon de réaction 2X
pendant 30 min à température ambiante. La réaction est arrêtée par le froid à 4°C.
III.2.13.3 Transformation des bactéries
III.2.13.3.1 Compétence des bactéries
98
Des bactéries DH5α sont rendues compétentes afin de pouvoir être transformées avec les
plasmides préparés précédemment. L'ensemble des manipulations est réalisé à 4°C. Les
colonies de bactéries DH5α, isolées sur boîte de Petri, sont ensemencées dans 50ml de milieu
de culture BL. L'ensemble est incubé à 37°C pendant environ 3h sous agitation. Lorsque la
DO atteint 0,4 à 600 nm, la culture bactérienne est centrifugée à 3000rpm pendant 10 min. Le
culot est repris par 5ml de solution de CaCl2 0,1M et laissé 10 min dans la glace, puis la
solution est centrifugée à 3000 rpm pendant 10 min. Le culot bactérien est de nouveau repris
par 5ml de solution de CaCl2 0,1M et de nouveau centrifugé. Le culot bactérien final est
repris dans une solution de CaCl2 0,1M contenant 15% de glycérol. La suspension de
bactéries compétentes obtenue est divisée en aliquotes de 100µl et congelée à -80°C.
III.2.13.3.2 Transformation des bactéries compétentes
On ajoute 2µl du milieu de la ligation (paragraphe III.13.2) à 100µl de suspension de bactéries
compétentes fraîchement décongelées. Les bactéries sont incubées 30 min dans la glace avant
de leur faire un choc thermique à 42°C pendant 90 sec. Les bactéries sont ensuite remises
dans la glace pendant 5 min, on leur ajoute alors 1ml de milieu BL et on les incube à 37°C
pendant 1h. Après centrifugation, le culot de bactéries est repris dans 100µl de milieu BL puis
étalé sur boîte de Petri GL contenant de la kanamycine. Les bactéries non transformées par les
plasmides pEGFP-hPLD1b, pEGFP-hPLD2 ou pEGFP-PABD ne porteront pas la résistance à
la kanamycine et ne pourront donc pas pousser sur les boîtes.
III.2.14 Mutagénèse dirigée
Nous avons construit par mutagénèse dirigée une sonde mutée, dépourvue d’affinité pour le
PA, en substituant deux arginines (R398 et R401) par des alanines. Cette mutagénèse dirigée
a été effectuée à l’aide du kit « QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis kit » de Stratagene.
Il utilise un couple d’oligonucléotides complémentaires, longs d’une quarantaine de bases, qui
portent la mutation en leur milieu. Le principe est très semblable à celui de la PCR avec
quelques modifications: un cycle long de polymérisation avec l’ADN polymérase « Pfu
turbo » permet la reconstitution d’un plasmide muté, entier, double brin et circulaire. L’ADN
parental est ensuite digéré par l’enzyme de restriction DpnI, spécifique des ADN méthylés
produits in vivo, alors que le plasmide muté synthétique est conservé. Les bactéries
compétentes transformées par le plasmide muté, assurent l’amplification de ce nouveau
plasmide (Figure 16). Dans un volume final de 50 µl, on incube 10 ng d’ADN plasmidique
99
parental (pEGFP-PABD) en présence de 200µM de dNTP, 125 ng des amorces sens et anti-
sens qui portent la mutation, 2,5 UI de Pfu turbo et 5 µl de tampon 10X. Les conditions
d'amplification programmées sur le thermocycleur sont: un cycle de 95°C pendant 30 sec
suivi de 16 cycles (95°C pendant 30 sec; 78°C pendant 60 sec; 68°C pendant 5 min). Ensuite,
on met les échantillons dans la glace jusqu’à que la température atteigne ~37°C et on ajoute
10 UI de l’enzyme DpnI. Enfin, on remet les échantillons dans le thermocycleur à 37°C
pendant 1h.
Figure 16: Principe de la méthode de mutagénèse dirigée avec le kit QuickChange Stratagene.
100
IV RESULTATS
IV.1 Activation de la PLD par les inducteurs myogéniques
IV.1.1 Activation de la PLD par l’AVP via ARF, PKC et Rho
Il a été montré que l’hormone neuro-hypophysaire arg8-vasopressine (AVP), un
puissant inducteur de la différenciation myogénique, déclenche précocément l’activation des
voies de la PIP2-phospholipase C (PLC) et de la phospholipase D (PLD) dans les myoblastes
L6. De manière intéressante, la réponse myogénique peut intervenir pour des concentrations
nanomolaires d’AVP, auxquelles seule la PLD, et non la PLC, est activée (Naro et al., 1996).
Nous avons mesuré l’activité PLD en nous basant sur sa propriété de transphosphatidylation
et en mesurant la radioactivité du phopsphatidylbutanol formé, comme décrit dans Matériels
et Méthodes. En accord avec la littérature, nous avons observé une forte activation de la PLD
dans les cellules L6 dès 1 min de traitement par l’AVP; l'activité atteint un plateau à 5 min et
reste stable jusqu’à 30 min de traitement (non montré). Dans de nombreux systèmes
cellulaires, l’activité PLD est régulée par les petites protéines G Rho et ARF, ainsi que par les
PKCs.
Afin de déterminer les voies de stimulation de la PLD par l’AVP dans les cellules L6, nous
avons tout d’abord utilisé un inhibiteur spécifique de la protéine ARF, la bréfeldine A (BFA),
qui inhibe l'échange GDP/GTP au niveau de la protéine. Lorsque les cellules sont traitées
avec cet inhibiteur utilisé à une concentration de 10µg/ml, l'activation de la PLD induite par
l’AVP est diminuée de 46% (Figure 17). Ceci suggère donc que ARF est partiellement
impliquée dans l'activation de la PLD par l’AVP dans les cellules L6. Ensuite, nous avons
réalisé des expériences de rétrocontrôle négatif ou « down-régulation » des PKCs. Le
traitement prolongé des cellules par un ester de phorbol tel que le TPA inactive les PKCs.
Dans les cellules prétraitées pendant 24h avec 100nM de TPA, l'activation de la PLD par
l’AVP n’est que faiblement inhibée (-29%), ce qui suggère un rôle restreint des PKC (Figure
17).
101
Figure 17 : Effet de la bréfeldine A et de la « down-régulation » des PKC sur l'activation de la PLD par AVP.
Les cellules ont été incubées en absence ou présence de 100nM de TPA pendant 24h (pré-traitement
avec TPA). Les cellules ont ensuite été radiomarquées avec de l'acide [3H]-palmitique pendant 2h,
puis ont été lavées et traitées, ou non, par la Bréfeldine A (10µg/ml) pendant 1,5h avant la stimulation
par l’AVP (10-7M) pendant 30 min en présence de 1% de butanol-1. La réaction est arrêtée par
extraction puis les phospholipides sont fractionnés par CCM. La radioactivité associée au
phosphatidylbutanol est exprimée en % de la radioactivité associée aux PL totaux. Les résultats
représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les résultats sont analysés par
ANOVA et les moyennes sont comparées par un test de t protégé. * significativement différent des
cellules traitées avec de l’AVP seule p<0.05, ** p<0,01.
102
Pour rechercher l’implication de Rho dans la stimulation de la PLD par AVP, nous avons
évalué par Western-blotting l’effet de l’AVP sur l’activation de Rho c.à.d sur la translocation
de Rho du cytosol (fraction soluble) où elle est sous forme inactive, vers la fraction
particulaire insoluble où elle est sous sa forme active liée au GTP. Nous avons pu observer
une activation rapide de Rho dès 1 min de traitement par l’AVP (Figure 18).
Figure 18 : Effet de l’AVP sur la translocation de la protéine RhoA vers la fraction insoluble.
Les myoblastes L6 ont été cultivés en absence de serum et en présence de 1% BSA pendant 3h avant
leur traitement, ou non, par l’AVP pendant 1 minute. Les cellules ont été lysées et la fraction
particulaire séparée de la fraction cytosolique par ultracentrifugation à 100000g pendant 1h. Les
protéines (30µg) ont été analysées par Western-blotting avec un anticorps polyclonal anti-RhoA. Afin
de normaliser, les membranes ont étédécapées et révélées à nouveau par un anticorps anti-tubuline-α;
nous avons ainsi vérifié l'égalité des dépôts de protéines dans les divers puits.
Nous avons ensuite procédé à l’inactivation de la protéine Rho par un traitement des cellules
avec l’exoenzyme C3 de C.botulinum. Ce traitement induit la suppression quasi totale de
103
l’activation de la PLD par l’AVP (-74%), suggérant qu’elle est majoritairement Rho-
dépendante dans les cellules L6 (Figure 19).
Figure 19 : Effet de l’exoenzyme C3 sur l’activation de la PLD par l’AVP.
Selon la méthode de « scrape loading » décrite dans la partie Matériels et Méthodes, les cellules
récupérées dans 0,5 ml du tampon de grattage contenant ou pas l’exoenzyme C3 à 5µg/ml ont été
resuspendues et mises en culture 24h dans 10% de serum. Ensuite, les cellules ont été marquées puis
traitées ou non avec de l’AVP 10-7M pendant 30 min en présence de butanol-1 1% et l’activité PLD a
été mesurée. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les
résultats sont analysés par ANOVA et les moyennes sont comparées par un test de t protégé. *** :
significativement différent des cellules non traitées avec l’exoenzyme p<0.0001.
Ces observations se sont avérées essentielles pour la suite des travaux, car la protéine
Rho est considérée comme un acteur important de la différenciation myogénique. Du fait que
l’AVP, un inducteur myogénique, active la PLD majoritairement via Rho, nous pouvons
suggérer que la PLD pourrait être impliquée dans la différenciation des cellules L6.
- C3 + C3
104
IV.1.2 Activation de la PLD par le TPA via PKC
IV.1.2.1 Le TPA, à une faible concentration, induit la différenciation
myogénique
La PLD des L6 peut aussi être activée sous l’effet de la stimulation des PKC par l’
ester de phorbol TPA (Thompson et al., 1994). Nous avons cherché à déterminer si cette
activation s’accompagne d’une différenciation myogénique. Pour ceci, Nous avons traité les
cellules L6 quiescentes, cultivées dans un milieu dépourvu de sérum et contenant 1% de BSA,
avec du TPA utilisé à deux doses différentes (1 nM et 100 nM). Ensuite, nous avons étudié
l’effet de ces traitements sur une étape précoce de la différenciation qui consiste en
l’expression ainsi que l’accumulation nucléaire d’un facteur de transcription spécifique du
muscle, la myogénine. De manière intéressante, nous avons observé par Western-blotting que
le TPA utilisé à une faible dose (1 nM) induit l’expression de la myogénine de manière
similaire à l’AVP (utilisée comme contrôle positif montrant l’engagement des cellules dans la
différenciation). Au contraire, le TPA utilisé à une forte dose (100 nM) n’induit pas
l’expression de la myogénine (Figure 20). De plus, nous avons cherché à déterminer l’effet de
l’addition du TPA sur l’expression de la myogénine induite par l’AVP. Alors que le TPA
utilisé à 1 nM ne modifie pas l’effet de l’AVP, le TPA utilisé à 100 nM supprime totalement
la réponse myogénique induite par l’AVP (Figure 20).
Nous avons aussi évalué la différenciation myogénique en cherchant l’accumulation
nucléaire de la myogénine par immunofluorescence. Nous avons estimé le pourcentage de
noyaux myogénine-positifs par rapport aux noyaux totaux des cellules traitées. Ces
expériences montrent que le TPA à la concentration de 1nM, mais pas à celle de 100 nM,
induit une accumulation nucléaire de la myogénine similaire à celle induite par l’AVP (39%
des noyaux myogénine-positifs dans le premier cas, 38% dans le deuxième cas).
De plus, le TPA (100 nM) inhibe presque totalement l’accumulation nucléaire de la
myogénine induite par l’AVP. (Figure 21).
105
Figure 20 : Effet de deux doses différentes de TPA sur l’expression de la myogénine.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M, avec du TPA (1nM ou 100 nM) ou
conjointement avec les deux. Elles ont ensuite été homogénéisées dans un tampon hypotonique et les
extraits cellulaires ont été analysés par Western-blotting avec un anticorps monoclonal anti-
myogénine. Les spots sont quantifiés par vidéodensitométrie et les résultats sont exprimés en unités
arbitraires après normalisation avec la tubuline. Ils représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences
indépendantes
Toutes ces observations nous amènent à conclure que le TPA à 1 nM est capable par lui-
même, indépendamment des facteurs sériques, d'induire la réponse myogénique des
myoblastes L6. Par contre, utilisé à une forte dose (100 nM), le TPA est un inhibiteur de la
différenciation des cellules L6.
106
Figure 21 : Effet de deux doses différentes de TPA sur l’accumulation nucléaire de la myogénine.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M, avec du TPA (1nM ou 100 nM) ou
conjointement avec les deux. Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées puis incubées avec
l’anticorps primaire monoclonal anti-myogénine et l’anticorps secondaire FITC anti-souris qui
permet la révélation par fluorescence au microscope. Le diagramme à droite représente le
pourcentage moyen des noyaux myogénine-positifs par rapport aux noyaux totaux, déterminé dans 5
champs différents.
IV.1.2.2 La régulation de l’activité PLD par le TPA est dose-dépendante
Nous avons ensuite mesuré l’activité de la PLD dans les cellules L6 intactes traitées
avec les deux doses de TPA, 1nM et 100 nM (Figure 23). Le TPA stimule fortement l’activité
de la PLD, de l’ordre de 14,7 fois quand il est utilisé à 100 nM, et de l’ordre de 8,6 fois
AVP +TPA 1nM
AVP +TPA
100 nM
107
lorsqu’il est utilisé à 1 nM. Par ailleurs, nous avons remarqué que le TPA (1nM) stimule la
phospholipase D de manière similaire à l’AVP (Figure 23).
Figure 22 : Cinétique d’activation de la PLD par 1 et 100 nM TPA.
Pour les temps longs (4 à 20h) les cellules ont été incubées le temps indiqué avec 1 ou 100 nM de
TPA, puis ont été radiomarquées avec de l'acide [3H]-palmitique, et la PLD a été dosée comme
précédemment indiqué. Pour les temps courts (15 min à 2h), les cellules préalablement radiomarquées
ont été traitées avec les deux doses de TPA pendant le temps indiqué, en présence de butanol-1 1%
pendant les trente dernières minutes, et le phosphatidylbutanol a été quantifié comme précedemment
indiqué.
Nous avons évalué les cinétiques de l’activation de la PLD par les deux doses de TPA.
L’activation de la PLD par le TPA (1 nM et 100 nM) est maximale à 30-60 min et diminue
progressivement pour arriver au niveau basal après 20h de traitement (Figure 22).
Etant donné qu’il n’y a pas de différence entre les deux cinétiques, nous avons recherché
l’effet d’une restimulation des cellules L6 par les même doses de TPA, après un traitement
prolongé de 24h avec 1 et 100 nM de TPA. Cette fois-ci, nous avons observé un effet
Temps (heures)
PBut
(% d
es p
hosp
holip
ides
)
108
différent sur l’activité de la PLD, en fonction de la dose utilisée. Le TPA à 1 nM peut
restimuler l’activité de la PLD alors que le TPA à 100 nM n’a aucun effet (Figure 23).
Figure 23 : Effet sur l’activité PLD du retraitement des cellules par le TPA après un traitement prolongé.
Les cellules ont été incubées en absence ou en présence de 1 ou de 100nM de TPA pendant 24h (pré-
traitement avec TPA). Les cellules ont ensuite été radiomarquées avec de l'acide [3H]-palmitique
pendant 2h, puis ont été lavées et stimulées, ou non (Ctrl), avec de l’AVP (10-7M) ou du TPA (1 ou
100 nM) pendant 30 min en présence de butanol-1 1%. La réaction est arrêtée par extraction puis les
phospholipides sont fractionnés par CCM. La radioactivité associée au phosphatidylbutanol est
exprimée en % de la radioactivité associée aux PL totaux. Les résultats représentent la moyenne ±
SEM de 3ou 4 expériences indépendantes.
109
Ces observations suggèrent que les effecteurs de la PLD, probablement les PKCs, sont
« down-régulés » après un traitement de 24h avec 100 nM de TPA, mais pas avec 1 nM de
TPA.
Figure 24 : Effet d’un traitement prolongé par 1 ou 100 nM de TPA sur « la down-régulation » des PKCs.
Après un traitement prolongé de 24h par le TPA à 1 ou 100 nM, les myoblastes L6 ont été lysés et la
fraction particulaire a été séparée de la fraction cytosolique par ultracentrifugation à 100000g
pendant 1h. Les protéines ont été analysées par Western-blotting avec des anticorps monoclonaux
anti-PKC-α, β1, γ, ι.
110
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réalisé des expériences de Western-blotting pour
quantifier les isoformes de PKC dans les fractions particulaires et cytosoliques des cellules L6
traitées avec 1 nM et 100 nM de TPA. La quantité des PKCα et PKCγ est fortement diminuée
dans les deux fractions après 24h de traitement avec 100 nM de TPA alors que la quantité des
PKCβ1 et PKCι ne change pas. Par contre, un traitement prolongé avec 1 nM de TPA ne
down-régule aucune des isoformes de PKC (Figure 24).
De tous ces résultats nous avons pu conclure que le TPA, à une concentration de
l’ordre de 1 nM, suffisante pour induire une activation soutenue de PLD sans provoquer de
down-régulation des PKCα et PKCγ, est capable d’induire une différenciation complète des
myoblastes L6 en myotubes. A l’inverse, à forte concentration, le TPA qui induit une
activation importante mais transitoire de PLD, n’induit pas la différenciation et même inhibe
l’effet myogénique de l’AVP. Ces résultats confirment que l’activation de la PLD, à condition
que la PKC ne soit pas down-régulée, corrèle avec la différenciation.
IV.2 L’activité PLD est nécessaire à la différenciation myogénique
Pour rechercher une éventuelle implication de l’activité PLD dans le processus
myogénique, nous avons soit partiellement inhibé l’enzyme en traitant les cellules L6 avec la
BFA, soit inhibé la formation de son produit l’acide phosphatidique en utilisant le butanol-1,
qui en tant qu’alcool primaire détourne l’activité de la PLD vers la production du
phosphatidylbutanol au détriment du PA. Nous avons étudié l’effet de ces traitements sur la
différenciation myogénique induite par l’AVP en évaluant l’expression de la myogénine par
Western-botting. Nous avons observé que les deux traitements inhibent significativement
l’expression de la myogénine induite après 24h de traitement par l’AVP. Cette inhibition est
de l’ordre de 67% pour la BFA et de 60% pour le butanol-1. L’adjonction d’un alcool
secondaire, le butanol-2, qui n’est pas un substrat de la PLD et qui est considéré comme
contrôle pour évaluer d’éventuels effets aspécifiques de butanol-1, n’a pas d’effet inhibiteur
sur l’expression de la myogénine. (Figure 25).
111
Figure 25 Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’expression de la myogénine induite par AVP..
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M seule ou en présence de 10µg/ml de
bréfeldine A, de 0,5% butanol-1 ou de 0,5% butanol-2 (utilisé comme contrôle) pendant 24 h. Elles
ont ensuite été homogénéisées dans un tampon hypotonique et les extraits cellulaires ont été analysés
par Western-blotting avec un anticorps monoclonal anti-myogénine. Les spots sont quantifiés par
vidéodensitométrie et les résultats sont exprimés en unités arbitraires après normalisation avec la
tubuline. Ils représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les résultats sont
ensuite analysés par ANOVA et les moyennes sont comparées par un test de t protégé. * :
significativement différent des cellules traitées avec l’AVP seule, p<0.01.
Myogénine
C AVP AVP+ AVP+ BuOH-1 BuOH-2
AVP+BFA AVP BFA C
112
De plus, nous avons étudié l’effet de l’inhibition de la PLD par la BFA et le butanol-1 sur
l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par AVP, par immunofluorescence. Nous
avons évalué le pourcentage de noyaux myogénine-positifs par rapport aux noyaux totaux des
cellules traitées. La BFA inhibe totalement l’accumulation nucléaire de la myogénine. Le
butanol-1 inhibe le pourcentage de noyaux myogénine-positifs de 72% alors que le butanol-2
n’a qu’un faible effet (-14%) (Figure 26).
En parallèle, nous avons recherché si l’activité PLD est aussi impliquée dans la
différenciation myogénique induite par 1 nM de TPA. Nous avons alors traité les cellules L6
avec 1 nM de TPA en présence de butanol-1, et observé également que l’inhibition de la
formation de l’acide phosphatidique empêche la différenciation myogénique induite par le
TPA. En effet, nous avons observé une inhibition totale par le butanol-1 de l’accumulation
nucléaire de la myogénine induite par le TPA alors que le butanol-2 n’inhibe cette réponse de
TPA que de 25% (Figure 27).
L’un des marqueurs tardifs de la différenciation terminale des myoblastes L6 est
l’expression de la myosine sarcomérique dans les myotubes formés après un traitement par
l’AVP de plusieurs jours. Pour vérifier l’effet de l’inhibition de la production de l’acide
phosphatidique sur la différenciation terminale des myoblastes L6, nous avons laissé les
cellules traitées avec l’AVP en culture pendant 9 jours, en présence ou en absence de butanol-
1 et butanol-2. Les cellules contrôles, traitées avec l’AVP, fusionnent et donnent naissance à
des myotubes polynucléés exprimant la myosine sarcomérique détectée par
immunofluorescence. L’addition du butanol-1 empêche totalement la formation des myotubes
même si un très faible pourcentage de cellules arrivent à exprimer la myosine. Le butanol-2
n’a pas d’effet inhibiteur ni sur la formation des myotubes, ni sur l‘expression de la myosine
sarcomérique (Figure 28).
113
Figure 26 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par AVP.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M seule ou en présence de 10µg/ml de
bréfeldine A, de 0,5% butanol-1 ou de 0,5% butanol-2 (utilisé comme contrôle) pendant 24 h. Les
cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées puis incubées avec l’anticorps primaire monoclonal
anti-myogénine et l’anticorps secondaire FITC anti-souris qui permet la révélation par fluorescence
au microscope. Le diagramme du bas représente le pourcentage moyen des noyaux myogénine-positifs
par rapport aux noyaux totaux, déterminé dans 5 à 9 champs différents. Les résultats sont ensuite
analysés par ANOVA et les moyennes sont comparées par un test de t protégé. * : significativement
différent des cellules traitées avec l’AVP seule, p<0.01.
114
Figure 27 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par 1 nM de TPA.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec du TPA 1 nM seul ou en présence de 0,5% butanol-1 ou de
0,5% butanol-2 (utilisé comme contrôle) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été fixées,
perméabilisées puis incubées avec l’anticorps primaire monoclonal anti-myogénine et l’anticorps
secondaire rhodamine anti-souris qui permet la révélation par fluorescence au microscope. Le
diagramme du bas représente le pourcentage moyen des noyaux myogénine-positifs par rapport aux
noyaux totaux, déterminé dans 10 champs différents.
115
Figure 28 : Effet de l’inhibition de la production de PA sur la formation des myotubes induite par AVP.
Les cellules L6 ont été cultivées pendant 9 jours en absence (C) ou en présence d’AVP (10-7M) seule,
ou additionnée de 0,5% butanol-1 ou de butanol-2. Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées
puis incubées avec l’anticorps primaire monoclonal anti-myosine sarcomérique et l’anticorps
secondaire rhodamine anti-souris qui permet la révélation par fluorescence au microscope. Les
noyaux sont marqués en bleu par le DAPI.
De tous ces résultats, nous pouvons conclure que la PLD et son produit, l’acide
phosphatidique sont impliqués positivement dans la différenciation myogénique évaluée aussi
bien sur des critères précoces (expression et accumulation nucléaire de la myogénine), que
des critères terminaux (fusion des myoblastes et expression de la myosine sarcomérique).
116
IV.3 La PLD1 est impliquée positivement dans la différenciation
myogénique
Pour confirmer l’implication de la PLD dans la différenciation myogénique, nous avons
étudié l’effet de la surexpression des isoformes PLD1 et PLD2 sur ce processus. Pour cela,
nous avons transfecté les myoblastes L6 avec le plasmide pCDNA3, vide ou codant la PLD1b
ou la PLD2, étiquetées par l’hémaglutinine (HA). Afin d’estimer le taux de transfection, nous
avons cotransfecté les cellules avec des plasmides pEGFP-C1, codant pour la protéine à
fluorescence verte (GFP), et évalué le pourcentage de cellules à fluorescence verte. Nous
avons trouvé une même efficacité de transfection pour les trois plamisdes pCDNA3 (vide,
PLD1b et PLD2). Ensuite, nous avons traité les cellules transfectées avec ou sans AVP
pendant 24h et évalué leur capacité à accumuler la myogénine dans les noyaux par
immunofluorescence. Nous avons évalué le pourcentage de noyaux myogénine-positifs par
rapport aux noyaux totaux des cellules (Figure 29). En absence d’AVP, les cellules témoins
transfectées avec le pCDNA3 vide ainsi que celles transfectées avec le pCDNA3-PLD2 ne
présentent que 1% de noyaux myogénine-positifs, alors que les cellules transfectées avec le
pCDNA3-PLD1 présentent 6,8% de noyaux myogénine-positifs, reflétant l’engagement d’un
certain pourcentages de cellules dans la différenciation. Il est à signaler que le taux de
transfection apparent est relativement faible (~13%) et que le fait que nous ayons quand
même pu observer un effet significatif de la transfection de PLD1 sur la réponse myogénique
suggére qu’elle joue un rôle très important dans ce processus. De plus, en présence d’AVP,
les cellules témoins transfectées avec le pCDNA3 vide présentent 17,3% de noyaux
myogénine-positifs et la surexpression de la PLD1 potentialise l’effet de l’AVP, augmentant
de 62% la proportion des cellules présentant des noyaux myogénine-positifs par rapport aux
cellules témoins. Au contraire, la surexpression de la PLD2 a un effet négatif et diminue de
42% la proportion des cellules myogénine-positives. L’activité PLD des cellules transfectées
dans les mêmes conditions que précédemment a également été mesurée. Une augmentation de
l'ordre de 74 % et 44 % est observée pour les cellules transfectées avec les plasmides
pCDNA3-hPLD1b et pCDNA3-hPLD2 respectivement. Ainsi une augmentation sensible de
l'activité PLD cellulaire a été obtenue malgré le faible taux de transfection. Ceci montre donc
bien que les plasmides pCDNA3-hPLD1b et pCDNA3-hPLD2 permettent d'exprimer des
protéines PLD1 et PLD2 fonctionnelles.
117
Figure 29 : Effet de la surexpression de deux isoformes de PLD (PLD1b et PLD2) sur l’accumulation nucléaire de la myogénine.
Les cellules L6 ont été transfectées transitoirement pendant 18h avec les vecteurs pCDNA3 vide,
pCDNA3-PLD1b, ou pCDNA3-PLD2. Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de l’AVP
pendant 24h puis fixées, perméabilisées et incubées avec l’anticorps primaire monoclonal anti-
myogénine et l’anticorps secondaire rhodamine anti-souris qui permet la révélation par fluorescence
au microscope. Le diagramme du bas représente le pourcentage moyen des noyaux myogénine-
positifs par rapport aux noyaux totaux, déterminé dans 10 champs différents. Les résultats ont été
analysés par ANOVA et les moyennes comparées par un test de t protégé. ** : significativement
différent des cellules transfectées avec le vecteur vide, p<0.0001.
118
Tous ces résultats confirment l’implication positive de la PLD, et spécifiquement de la
PLD1b, dans la différenciation myogénique des myoblastes L6. Par contre, la PLD2 semble
avoir un effet négatif sur la réponse myogénique.
IV.4 La PLD1 est sélectivement down-régulée au cours de la
différenciation
IV.4.1 Au niveau des ARNm
Etant donné que les deux isoformes PLD1 et PLD2 ont un rôle diffférent dans la
différenciation myogénique, nous avons cherché à déterminer leur profil d’expression au
niveau des ARNm dans les myoblastes indifférenciés proliféralifs ou quiescents et dans les
cellules engagées dans la différenciation après un traitement par l’AVP de 2 jusqu’à 8 jours.
L'expression des ARNm de PLD1 et PLD2 a été recherchée par des expériences de RT-PCR à
partir des ARN totaux des cellules L6. Des couples d'amorces spécifiques de chaque isoforme
ont été choisis à partir des séquences publiées de la rPLD1 et de la rPLD2. Le couple
d'amorces spécifiques de PLD1 entoure la délétion présente chez PLD1b, permettant ainsi de
révéler simultanément la présence de deux variants d’épissage PLD1a et PLD1b. La séquence
de PLD2 à amplifier a été choisie dans une région non homologue à PLD1. Nous avons aussi
utilisé un couple d’amorces spécifiques de l’actine-β pour pouvoir normaliser. Dans la RT-
PCR réalisée avec les amorces spécifiques de PLD1, nous avons obtenu deux bandes d'ADN
amplifié, de 437 et 554 pb correspondant respectivement aux deux variants rPLD1a et
rPLD1b. Pour rPLD2, nous avons obtenu une bande de 488 pb correspondant au fragment
attendu (Figure 30). L’expression des rPLD1a et rPLD1b au niveau des ARNm est la même
dans les cellules prolifératives, quiescentes, et les cellules engagées dans la différenciation
après deux jours de traitement par l’AVP. Par contre, les ARNm de ces deux variants rPLD1a
et rPLD1b sont down-régulés à partir du jour 4 de la différenciation et deviennent presque
indétectables dans les myotubes différenciées par un traitement de six et huit jours en
présence d’AVP. Au contraire, l’ARNm de la rPLD2 reste exprimé à un niveau constant au
cours de la différenciation myogénique (Figure 30).
Donc nous avons pu montrer que les myoblastes L6 expriment les deux isoformes PLD1 et
PLD2 et que leur expression varie différemment au cours de la différenciation.
119
IV.4.2 Au niveau des protéines
Afin de confirmer l’expression des diverses isoformes de PLD au niveau des protéines, nous
avons réalisé des expériences de Western-blotting sur des extraits de cellules L6 quiescentes,
prolifératives ou différenciées, soit par un traitement de huit jours en présence d’AVP, soit par
une diminution du pourcentage du sérum dans le milieu de culture (Figure 31).
Figure 30 : Recherche de l’expression des PLD par RT-PCR au cours de la différenciation myogénique induite par AVP.
Les ARN totaux extrait de cellules L6 cultivées de 0 à 8 jours dans un milieu dépourvu de serum et
contenant 1% BSA en absence (Ctrl) ou en présence d’AVP (10-7M) ont été soumis à une transcription
inverse. Les ADNc ainsi obtenus ont été amplifiés par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de
PLD1, PLD2 et actine-β (utilisée pour normalisation). Les résultats sont représentatifs de 3
expériences indépendantes.
Nous avons ensuite fait des analyses densitométriques pour la quantification des bandes
obtenues. Ces expériences montrent clairement la présence des protéines PLD1 et PLD2 dans
les myoblastes L6. Dans les cellules différenciées par un traitement de huit jours en présence
d’AVP, la quantité de la protéine PLD1 est réduite de 60% par rapport aux cellules
quiescentes. De manière similaire, les cellules différenciées par réduction du pourcentage de
sérum à 1% dans le milieu de culture expriment seulement 42% de la quantité de la protéine
PLD1 par rapport aux myoblastes en prolifération, cultivés en présence de 10% de sérum.
120
Cette dernière observation montre que la down-régulaion de la PLD1 est liée au processus de
la différenciation, lui-même, et qu’elle n’est pas restreinte à l’effet de l’AVP. Concernant la
quantité de la protéine PLD2, nous n’avons pas observé de variation durant la différenciation
cellulaire (Figure 31).
Figure 31 : Recherche de l’expression des PLD par Western-Blotting dans les cellules L6 non différenciées ou différenciées en myotubes.
Les cellules sont cultivées pendant huit jours, soit dans un milieu dépourvu de sérum et contenant 1%
de BSA en présence, ou non, de l’AVP 10-7M, soit dans un milieu contenant 1% ou 10% de SVF. Elles
ont ensuite été homogénéisées, comme décrit dans Matériels et Méthodes, et les extraits cellulaires ont
été analysés par Western-blotting avec des anticorps polyclonaux anti-PLD1 et anti-PLD2. Les
bandes ont été quantifiées par vidéodensitométrie et les résultats normalisés avec la tubuline. Les
résultats donnés dans le texte représentent la moyenne de 6 expériences indépendantes.
En parallèle et comme contrôle de la différenciation des myoblastes, nous avons mesuré
l’activité de la créatine kinase, un marqueur tardif de la différenciation terminale, dans les
cellules traitées de la même manière que pour les expériences de Western-blotting (Figure
32).
Tous ces résultats montrent clairement que les deux isoformes de PLD sont exprimées
au niveau des ARNm et des protéines, et que l’expression de la PLD1, mais pas celle de la
PLD2, est down-régulée au cours de la différenciation myogénique. Nous en déduisons que
les deux isoformes de PLD jouent des rôles distincts. PLD1 pourrait être requise pour le
121
déclenchement du processus myogénique, et disparaître lorsque les cellules sont engagées.
PLD2 pourrait jouer plutôt un rôle de maintenance des fonctions cellulaires de base.
Figure 32 : Activité de la créatine kinase dans les cellules L6 différenciées, ou non, en myotubes.
Comme contrôle de la différenciation, l’activité de la créatine kinase (marqueur tardif de la
différenciation) a été mesurée pour les différents traitements. Elle a été mesurée dans les cellules
quiescentes (BSA), prolifératives (10% SVF), ou différenciées, soit après huit jours de traitement par
l’AVP, soit après huit jours de culture dans un milieu contenant 1% de SVF. Les activités sont
exprimées en mD0 par min et par µg de protéines.
IV.4.3 Au niveau de l’activité
Du fait que l’expression de la PLD1 est diminuée au cours de la différenciation, nous
avons décidé d’étudier la conséquence de cette down-régulation sur l’activité de la PLD des
cellules L6 indifférenciées prolifératives (cultivées en présence de 10% de sérum),
quiescentes (cultivées dans un milieu dépourvu de sérum) et différenciées soit par un
traitement de huit jours avec de l’AVP soit par réduction du pourcentage du sérum dans le
(mD
O/m
in/µ
g)
122
milieu de culture. Nous avons pu observer une baisse de 50% de l’activité de la PLD dans les
cellules différenciées par rapport à l’activité des cellules quiescentes ou en prolifération
(Figure 33). Donc, l’inhibition de l’expression de la PLD1 est accompagnée d’une diminution
de moitié de l’activité basale dans les cellules différenciées suggérant que l’activité restante
pourrait être attribuée à l’activité de la PLD2.
Figure 33 : Mesure de l’activité PLD dans les cellules non différenciées ou différenciées en myotubes.
L’activité PLD basale a été mesurée dans les cellules quiescentes (BSA), prolifératives (10% SVF), ou
différenciées, soit après huit jours de traitement par l’AVP, soit après huit jours de culture dans un
milieu contenant 1% de SVF. Les cellules sont radiomarquées avec de l'acide [3H]-palmitique
pendant 2h, puis sont lavées et incubées pendant 30 min en présence de butanol-1 1%. La réaction est
arrêtée par extraction puis les phospholipides sont fractionnés par CCM. La radioactivité associée au
phosphatidylbutanol est exprimée en % de la radioactivité associée aux PL totaux. Les résultats
représentent la moyenne ± SEM de 4 expériences indépendantes.
123
IV.5 La stimulation myogénique déclenche la formation PLD-
dépendante des « stress fiber like structures» (SFLS)
IV.5.1 La formation des SFLS est induite par l’AVP et le TPA dans les
cellules L6
Dans les cellules musculaires striées (squelettiques ou cardiaques), les SFLS, qui
perdurent pendant les premiers jours de la différenciation sont supposées jouer un rôle
primordial, en tant qu’ébauches des futures myofibrilles, sur lesquelles vont venir s’attacher
les multiples protéines sarcomériques formant finalement les fibres striées caractéristiques.
Du fait que l’AVP active Rho dans les cellules L6, et étant donné le rôle positif connu de Rho
dans la différenciation myogénique, dans la réorganisation du cytosquelette et dans la
formation des fibres de stress d’actine, nous nous sommes demandé si les inducteurs de la
myogénèse avaient une influence sur le cytosquelette d’actine des myoblastes L6. En réponse
aux deux agents myogéniques étudiés (AVP et TPA), nous avons observé que les myoblastes
L6 développent rapidement des SFLS détectées par marquage de l’actine F à la phalloïdine en
microscopie à fluorescence. Ces SFLS sont détectables dès 1 min de traitement, deviennent
plus épaisses à 10 min et restent stables pendant au moins 1 heure de traitement par AVP ou
TPA (Figure 34).
IV.5.2 La formation de SFLS par l’AVP et le TPA est PLD-dépendante
Ensuite, nous avons cherché à déterminer si la PLD est impliquée dans la formation
des fibres de stress induite par les deux inducteurs myogéniques (AVP et TPA). Pour ceci,
nous avons traité les myoblastes L6 avec le butanol-1 et le butanol-2 et nous avons observé
que la formation des SFLS induite par l’AVP et le TPA est totalement inhibée par le butanol-
1, alors qu’elle est peu affectée par le butanol-2 (Figure 35). Elle est donc dépendante de la
présence de PA. Cela est confirmé par l’effet du propranolol, un inhibiteur de la PA-
phosphatase qui provoque l’accumulation intracellulaire du PA en bloquant son métabolisme.
En effet, le propranolol induit, par lui-même, la formation des SFLS, suggérant ainsi que le
PA, par lui-même, est capable d’induire la formation les SFLS. L’exoenzyme C3, qui inhibe
fortement l’activation de la PLD par l’AVP, inhibe la formation des SFLS induite par l’AVP
(Figure 35), ce qui est en accord avec l’hypothèse d’un rôle de PLD dans leur formation.
124
Figure 34 : Effet de l’AVP (10-7M) et du TPA (1 nM) sur la formation des SFLS.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M ou du TPA 1 nM de 30 sec à 60 min. Les
cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées puis incubées avec la phalloïdine couplée à la
rhodamine qui permet la révélation des fibres d’actine par fluorescence au microscope.
125
Figure 35: Effet du propranolol, de l’exoenzyme C3, de 0,5% butanol-1 et de 0,5% butanol-2 sur la formation des SFLS.
Les cellules ont été traitées avec de l’AVP 10-7M ou du TPA 1 nM seuls, ou en présence de 0,5%
butanol-1 ou de 0,5% butanol-2 (utilisé comme contrôle), pendant 10 min. Elles ont aussi été traitées
par le propranolol 100 µM seul, pendant 15 min, ou prétraitées par 5 µg/ml de l’exoenzyme C3 avant
l’ajout d’AVP pour 10 min. Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées, puis incubées avec la
phalloïdine couplée à la rhodamine qui permet la révélation des fibres d’actine par fluorescence au
microscope.
Cependant, du fait que l’exoenzyme C3 supprime aussi l’activation d’autres effecteurs de la
protéine G Rho qui sont, avec la PLD, nécessaires à la formation des fibres de stress, il est
difficile de conclure que la PLD est le seul facteur responsable de la formation des SFLS
induite par l’AVP. Nous avons quantifié le pourcentage de cellules présentant des SFLS après
traitement par le propranolol et par l’AVP en présence ou en absence de butanol-1 ou de
butanol-2. Nous avons trouvé que 3% des cellules témoins présentent des SFLS contre 24%
pour les cellules traitées avec du propranolol et 56% pour les cellules traitées avec de l’AVP.
En présence du butanol-1, seulement 1,6% de cellules traitées avec de l’AVP présentent des
SFLS contre 40% pour les cellules traitées avec l’AVP en présence de butanol-2 (Figure 36).
126
De plus nous avons étudié la réversibilité de l’effet des alcools primaires sur la formation de
SFLS. Pour ceci, après l’addition du butanol-1 ou butanol-2 nous avons abondamment lavé
les cellules avec du PBS pour enlever toute trace d’alcool, et ensuite nous les avons traitées
avec l’AVP. Nous avons observé que l’élimination du butanol-1 rétablit presque totalement la
formation des SFLS par l’AVP (non montré).
Figure 36: Effet de l’AVP, du propranolol, du butanol-1 et du butanol-2 sur le pourcentage des cellules présentant des SFLS.
Les cellules ont été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M seule, ou en présence de 0,5% butanol-1 ou
de 0,5% butanol-2 (utilisé comme contrôle), pendant 10 min. Elles ont aussi été traitées par le
propranolol 100 µM seul pendant 15 min. Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées, puis
incubées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine qui permet la révélation des fibres d'actine par
fluorescence au microscope. Le diagramme représente le pourcentage moyen ± SEM des cellules
présentant des SFLS par rapport au nombre de cellules totales, déterminé dans 10 champs différents.
4 expériences indépendantes ont donné des résultats similaires.
127
* †
IV.5.3 La PLD1 est impliquée positivement dans la formation des SFLS
Du fait que c’est l’isoforme PLD1 qui semble être impliquée dans la différenciation
myogénique des myoblastes L6, nous avons voulu déterminer l’effet de la surexpression de
cette isoforme sur la formation des SFLS. Nous avons donc transfecté les myoblastes L6 avec
les plasmides pCDNA3 vide et pCDNA3-PLD1b et nous avons ensuite traité ou pas les
cellules transfectées avec l’AVP. Nous avons observé que 32,6% des cellules surexprimant la
PLD1 présentent des SFLS, en absence d’AVP, par rapport à 2,54% pour les cellules témoins.
En présence d’AVP, 61,12% des cellules transfectées par la PLD1 présentent des SFLS,
contre 45,84% pour les cellules transfectées par le vecteur vide (Figure 37). Nous en
déduisons que la PLD1 joue un rôle positif dans la formation des SFLS dans les myoblastes
L6, et faisons l’hypothèse que cela est relié à l’effet de la PLD1 sur la différenciation
myogénique.
Figure 37: Effet de la surexpression de la PLD1b sur le pourcentage des cellules présentant des SFLS.
Les cellules L6 ont été transfectées transitoirement pendant 18h avec les vecteurs pCDNA3-vide ou
pCDNA3-PLD1b. Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de l’AVP pendant 10 min puis
fixées, perméabilisées et incubées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine qui permet la révélation
par fluorescence au microscope. Le diagramme représente le pourcentagemoyen ±SEM des cellules
présentant des SFLS par rapport au nombre de cellules totales, déterminé dans 10 champs différents.
*: différent de transfecté PLD1b sans AVP, p<0,0001. †: différent de mock-transfecté + AVP,
p<0,001. Trois expériences indépendantes ont donné des résultats similaires.
0
10
20
30
40
50
60
70
pCDNA3 pCDNA3-PLD1b
pCDNA3 +AVP
pCDNA3-PLD1b +
AVP
pour
cent
age
des
Cel
lule
s av
ec S
FLS
128
IV.6 La PLD1 et le PA participent directement à la formation des
SFLS
IV.6.1 La PLD1, et non la PLD2, transloque vers les SFLS lors de la
stimulation myogénique
Etant donné l’implication de la PLD dans la formation des SFLS, nous avons voulu
étudier la localisation de la PLD endogène après la stimulation myogénique par l’AVP. Par
des expériences d’immunofluorescence, nous avons détecté la PLD1 endogène à l’aide d’un
anticorps polyclonal anti-PLD1 dans les myoblastes L6 stimulés ou non par l’AVP. Dans les
cellules témoins quiescentes, non stimulées, nous avons observé que la PLD1 est localisée
dans une zone péri-nucléaire qui pourrait correspondre à l’appareil de Golgi (Figure 38). Nous
avons co-marqué les cellules avec un anticorps monoclonal anti-G58k utilisé comme un
marqueur de l’appareil de Golgi (Figure 38). Après superposition des deux marquages, nous
avons observé une colocalisation partielle de la PLD1 avec le marqueur Golgien suggérant
que la PLD1 pourrait être localisée dans une sous fraction de compartiment golgien.
Figure 38: Localisation de la PLD1 endogène dans les cellules L6 par immunofluorescence.
Les cellules L6 quiescentes ont été fixées, perméabilisées puis incubées avec deux anticorps primaires,
anti-PLD1 (polyclonal ) et anti-G58k (monoclonal), et les anticorps secondaires Alexa anti-lapin et
rhodamine anti-souris, qui permettent la révélation par fluorescence au microscope, respectivement
de PLD1 (fluorescence verte) et G58k (fluorescence rouge). Les images ont été superposées (merge).
129
De manière intéressante, la simulation myogénique des cellules L6 par l’AVP induit une
translocation partielle de la PLD1 de la zone périnucléaire vers des structures filamenteuses.
Après un co-marquage des cellules avec la toxine phalloïdine qui reconnaît l’actine, nous
avons clairement observé que la PLD1 est relocalisée partiellement au niveau des SFLS lors
de la stimulation myogénique (Figure 39).
Figure 39: Effet de l’AVP sur la localisation de la PLD1 endogène dans les cellules L6.
Les cellules traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M pendant 10 min, ont été fixées, perméabilisées puis
incubées avec l’anticorps primaire polyclonal, anti-PLD1 et l’anticorps secondaire Alexa anti-lapin.
Elles ont été comarquées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine, et observées au microscope à
fluorescence. Les images ont été superposées (merge).
130
Ces résultats suggèrent que la PLD1 participe à la formation des SFLS induite par AVP, ce
qui pourrait expliquer son implication dans la réponse myogénique. Pour vérifier la spécificité
de ces observations, nous avons étudié la localisation de la PLD2 dans les cellules
quiescentes, ou stimulées par l’AVP. Etant donné que la PLD2 joue un rôle négatif dans la
réponse myogénique à l’AVP, elle ne devrait pas être impliquée dans la formation des SFLS
si notre hypothèse est correcte. Par immunofluorescence et à l’aide d’un anticorps polyclonal
anti-PLD2, nous avons observé que la PLD2, localisée, dans les myoblastes quiescents, au
niveau d’une zone périnucléaire qui se prolonge par des zones de marquage plus diffus, n’est
pas relocalisée au niveau des SFLS après traitement des cellules avec de l’AVP (Figure 40).
Nous pouvons ainsi proposer que la PLD2, contrairement à la PLD1, ne participe pas à la
formation des SFLS.
Figure 40: Effet de l’AVP sur la localisation de la PLD2 endogène dans les cellules L6.
Les cellules traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M pendant 10 min, ont été fixées, perméabilisées puis
incubées avec l’anticorps primaire polyclonal anti-PLD2 et l’anticorps secondaire Alexa anti-lapin.
Elles ont été comarquées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine, et observées au microscope à
fluorescence. Les images ont été superposées (merge).
131
IV.6.2 RhoA est partiellement relocalisée au niveau des SFLS
Nous avons déjà montré que l’AVP active la PLD majoritairement via Rho dans les
myoblastes L6. Du fait que RhoA interagit directement avec le domaine CRIV de PLD1
(Sung et al., 1997) alors qu’elle n’active pas directement la PLD2 (Sung et al., 1999a), nous
avons cherché à déterminer la localisation de RhoA, à l’aide d’un anticorps polyclonal anti-
RhoA, lors de la stimulation myogénique. Nous avons clairement observé que RhoA,
localisée dans les cellules L6 quiescentes dans le cytosol ainsi que dans des compartiments
vésiculaires, est aussi partiellement transloquée vers les SFLS après stimulation des cellules
par l’AVP (Figure 41). La colocalisation de RhoA et SFLS a été mise en évidence par co-
marquage des cellules avec la phalloïdine.
Figure 41: Effet de l’AVP sur la localisation de Rho endogène dans les cellules L6.
Les cellules traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M pendant 10 min, ont été fixées, perméabilisées puis
incubées avec l’anticorps primaire polyclonal anti-RhoA et l’anticorps secondaire Alexa anti-lapin.
Elles ont été comarquées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine, et observées au microscope à
fluorescence. Les images ont été superposées (merge).
132
Ces résultats nous permettent de suggérer que RhoA co-transloque avec la PLD1 au niveau
des SFLS lors de la stimulation myogénique, et que la stimulation de PLD1 par Rho se
produit à ce niveau.
IV.6.3 Le PA est sélectivement accumulé au niveau des SFLS lors de la
réponse myogénique
Pour aller plus loin dans la recherche du rôle de PLD, nous avons cherché à localiser
son produit, l’acide phosphatidique. Pour cela, nous avons construit un vecteur permettant
d’exprimer une sonde fluorescente reconnaissant spécifiquement le PA. Cette sonde est
constituée par le domaine fixateur de PA de la protéine Raf-1 couplé à la GFP (pEGFP-
PABD). Quand elle est exprimée dans les myoblastes quiescents, cette sonde montre une
fluorescence diffuse dans le cytosol et le noyau. Après stimulation par les deux agents
myogéniques, AVP et TPA, elle marque sélectivement de petites vésicules qui s’alignent
progressivement le long de structures fibreuses rappelant les SFLS (Figure 42). De plus, dans
les cellules traitées avec le TPA, la sonde marque aussi la membrane plasmique.
Figure 42: Marquage du PA à l’aide d’une sonde fluorescente spécifique.
Les cellules ont été transfectées transitoirement, pendant 18h, avec le plasmide pEGFP-PABD (sonde-
PA fluorescente). Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M ou du TPA 1 nM
pendant 10 min (AVP) ou 15 min (TPA), fixées, et visualisées au microscope à fluorescence.
133
Afin de savoir si les vésicules marquées par la sonde pEGFP-PABD s’alignent au niveau des
SFLS, nous avons co-marqué les cellules transfectées par la sonde avec la phalloïdine. Nous
avons observé que les vésicules marquées s’alignent tout au long des SFLS après 10 min de
traitement par l’AVP et 15 min de traitement par le TPA (Figure 43).
Figure 43: Effet de l’AVP et du TPA sur la localisation du PA dans les cellules L6.
Les cellules ont été transfectées transitoirement, pendant 18h, avec le plasmide pEGFP-PABD (sonde-
PA fluorescente). Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M ou du TPA 1 nM
pendant 10 min (AVP) ou 15 min (TPA), fixées, perméabilisées, puis incubées avec la phalloïdine
couplée à la rhodamine, et observées au microscope à fluorescence. Les images ont été superposées
(merge).
134
IV.6.3.1 Cinétique de marquage des fibres d’actine par le PA
Ensuite nous avons cherché à localiser, dans le temps et l’espace, la formation du PA
dans la cellule, afin de savoir si la synthèse du PA précède la formation des SFLS. Pour ceci,
nous avons transfecté les cellules L6 avec le pEGFP-PABD. Ensuite, nous avons traité ou pas
les cellules exprimant la sonde fluorescente avec l’AVP pendant des temps courts (30
secondes à 10 min). Comme nous l’avons déjà observé précédemment, la sonde montre une
fluorescence diffuse dans le cytosol et le noyau dans les cellules témoins quiescentes. Dès
30sec de traitement par l’AVP, les vésicules fluorescentes marquées par la sonde commencent
à se former et à s’aligner alors que les SFLS ne sont pas encore mises en place. Après 5-10
min de traitement par l’AVP, les SFLS sont clairement formées et marquées: la fluorescence
verte de la sonde suit des lignes ponctuées et les vésicules fluorescentes sont ainsi alignées au
niveau des SFLS (Figure 44). Ces observations suggèrent que le PA est formé localement dès
l’étape de mise en place des SFLS, et pourrait ainsi participer à leur formation.
IV.6.3.2 Spécificité de la sonde pour le PA
Afin de vérifier la spécificité du marquage de PA par la sonde, nous avons construit
une sonde contrôle mutée ayant perdu son affinité pour le PA. En fait, le PA se lie avec une
forte affinité dans une région d’environ 35 acides aminés de la partie C-terminale de la
protéine Raf1. Le site d'interaction avec le PA se trouve entre les acides aminés 390 et 426 de
Raf1 (Ghosh et al., 1996). Dans ce domaine de fixation de PA, il existe plusieurs acides
aminés basiques comme l’arginine et la lysine qui sont essentiels pour l’interaction avec le
PA. En se référant à la publication de Rizzo et al. (2002), nous avons construit par
mutagénèse dirigée une sonde mutée en substituant les deux arginines R398 et R401 par deux
alanines. Ensuite, nous avons exprimé cette sonde mutée dans les cellules L6 et comparé sa
localisation avec celle de la « sonde sauvage ». Après traitement par l’AVP, cette sonde mutée
conduit à un marquage périnucléaire sans relation avec les fibres d’actine, c.à.d. un marquage
totalement différent de celui induit par l’expression de la sonde sauvage (Figure 45).
Pour confirmer la spécificité de la sonde sauvage pour le PA, nous avons traité les
cellules qui expriment la sonde sauvage avec le propranolol, un inhibiteur de la PA-
phosphatase qui provoque l’accumulation intracellulaire du PA en bloquant son métabolisme,
même en absence d’une stimulation cellulaire (Naro et al., 1997; Grange et al., 2000).
135
Figure 44: Cinétique de marquage de SFLS par la sonde à PA.
Les cellules ont été transfectées transitoirement, pendant 18h, avec le plasmide pEGFP-PABD (sonde-
PA fluorescente). Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M de 30 sec à 10 min,
fixées, perméabilisées, puis incubées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine et observées au
microscope à fluorescence. Les images ont été superposées (merge).
136
Nous avons déjà montré que le propranolol, par lui-même, est capable d’induire la formation
des SFLS dans les myoblastes L6. De manière intéressante, le propranolol provoque la
localisation de la sonde au niveau de ces structures (Figure 45), confirmant la spécificité de
liaison de la sonde pour le PA, ainsi que la spécificité de son marquage au niveau des SFLS.
Figure 45: Contrôle de la spécificité de la sonde à PA.
Les cellules ont été transfectées transitoirement, pendant 18h, avec les plasmides pEGFP-PABD
(sonde-PA sauvage) ou pEGFP-PABD muté par substitution de deux arginines en alanines (sonde-PA
mutée). Les cellules transfectées avec la sonde-PA mutée ont été traitées avec de l’AVP 10-7M pendant
10 min. Les cellules transfectées avec la sonde-PA sauvage ont été traitées avec 100 µM de
propranolol pendant 15 min. Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées, puis incubées avec la
phalloïdine couplée à la rhodamine, et observées au microscope à fluorescence. Les images ont été
superposées (merge).
137
Nous montrons ainsi pour la première fois, par visualisation directe, que le PA est
formé localement au niveau des fibres d’actine, et au moment où les SFLS s’assemblent.
Toutes ces observations nous permettent de conclure que la PLD1 et le PA participent
directement au remodelage du cytosquelette d’actine induit lors de la myogénèse.
IV.7 La PLD et le PA interviennent dans la formation des SFLS en
induisant la synthèse localisée de PIP2
Des relations étroites entre la production de PA et la synthèse de PIP2 ont été décrites,
le PA étant régulateur de la PI(4)P 5-kinase, l’enzyme qui donne naissance à ce
phosphoinositide connu pour jouer un rôle majeur dans la réorganisation de l’actine cellulaire
et la formation des fibres de stress. Nous avons donc recherché si la stimulation myogénique
par l’AVP s’accompagne d’une synthèse de PIP2. Jusqu’à présent, la concentration d’AVP
que nous avons utilisée était de 100 nM. Du fait que cette concentration d’AVP active aussi la
PIP2-PLC qui hydrolyse le PIP2, nous avons, pour cette série d’expériences, utilisé l’AVP à 1
nM qui active la PLD sans induire l’hydrolyse du PIP2 par la PLC (Naro et al., 1997). En
adoptant une technique de marquage métabolique par le Pi-P33 pendant un temps très court,
qui privilégie le marquage du PIP2 néosynthétisé, suivi d’une analyse des phosphoinositides
par chromatographie sur couche mince, nous avons réussi à montrer que la stimulation
myogénique par l’AVP à 1 nM s’accompagne d’une synthèse rapide de PIP2. De plus, nous
avons observé que cette synthèse est inhibée sélectivement par le butanol-1, et non le butanol-
2, démontrant ainsi qu’elle dépend de l’activation de la PLD par l’AVP (Figure 46). Ce
résultat montre que le PA, produit de l’activation de la PLD par l’AVP, est impliqué dans la
synthèse du PIP2, probablement en activant la PI(4)P 5-kinase dans les myoblastes L6.
Etant donné que la PLD1 est transloquée au niveau des fibres de stress lors de la stimulation
myogénique par l’AVP et que le PA est accumulé au niveau de ces structures, nous avons
voulu étudier la localisation du PIP2 formé après stimulation des cellules par l’AVP afin de
savoir si ce phosphoinositide est synthétisé localement au niveau des SFLS. Pour ceci, nous
avons réalisé des expériences d’immunofluorescence, en utilisant un anticorps monoclonal
anti-PIP2 hautement spécifique, sur les cellules L6 traitées, ou non, par l’AVP. Nous avons
observé que le PIP2, localisé dans les cellules non stimulées dans des compartiments
périnucléaires, est accumulé dans les myoblastes stimulés le long des SFLS selon un pattern
identique à celui du PA (Figure 47).
138
Figure 46: Effet de l’inhibition de la production de PA sur la néosynthèse de PIP2 induite par AVP.
Les cellules ont été marquées métaboliquement par le Pi-P33 pendant un temps très court (10 min), qui
privilégie le marquage du PIP2 néosynthétisé. Les cellules ont ensuite été traitées, ou non, avec de
l’AVP 10-9 M seule, ou en présence de 1% butanol-1 ou de 1% butanol-2. La réaction est arrêtée par
1 ml de méthanol et les lipides sont extraits, analysés par CCM et révélés par analyse au
Phosphorimager Storm afin de localiser le PIP2 marqué au P33. Les spots sont quantifiés par
vidéodensitométrie et les résultats sont exprimés en unités arbitraires, en pourcentage par rapport à
la valeur +AVP. Ils représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les résultats
sont ensuite analysés par ANOVA et les moyennes sont comparées par un test de t protégé. *:
significativement différent de la valeur +AVP, p<0.05; **:p<0,01; NS: pas de différence significative.
Ces observations montrent que le PIP2 est localement accumulé au niveau des SFLS où le PA
est formé, ce qui conforte l’hypothèse que le PA induit la synthèse du PIP2 au niveau des
SFLS en activant la PI(4)P 5-kinase. Le rôle du PIP2 dans la formation des fibres de stress
étant largement connu, nous pouvons ainsi mieux comprendre comment la PLD1 et le PA
participent directement à la formation des SFLS.
139
Figure 47 : Effet de l’AVP sur la localisation du PIP2 dans les cellules L6.
Les cellules traitées, ou non, avec de l’AVP 10-7M pendant 10 min, ont été fixées, perméabilisées puis
incubées avec l’anticorps primaire monoclonal anti-PIP2, et l’anticorps secondaire FITC anti-souris.
Elles ont été comarquées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine, et observées au microscope à
fluorescence. Les images ont été superposées (merge).
140
V DISCUSSION, CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
L'objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été d’étudier le rôle de la PLD
dans la différenciation myogénique des myoblastes L6. Plusieurs résultats montrent
l’implication de la PLD dans la myogénèse. Tout d’abord, la PLD est activée de manière
similaire par deux inducteurs myogéniques différents, l’AVP et le TPA. L’effet myogénique
in vitro de l’AVP a déjà été décrit (Nervi et al., 1995; Minotti et al., 1998). Nous avons
observé que le TPA à 1 nM est capable, par lui-même, d’induire les étapes précoces de la
différenciation myogénique mise en évidence par l’expression et l’accumulation nucléaire du
facteur de transcription myogénine. Ainsi, l’activation de la PLD par le TPA via PKC, ou par
l’AVP via l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G (V1aR), est corrélée avec
l’induction de la différenciation. Le fait qu’une faible dose d’ester de phorbol induise une
réponse myogénique est nouveau, puisque le TPA est généralement considéré comme un
inhibiteur de la myogénèse (Cossù et al., 1983; Boczan et al., 2001). Cependant, ceci est en
accord avec certaines observations de la littérature, puisque le traitement des myoblastes de
poulet par les inhibiteurs de PKC inhibe leur fusion (David et al., 1990).
D’autre part, nous avons montré qu’une forte concentration de TPA (100 nM) qui
empêche la restimulation de la PLD après un premier traitement, inhibe fortement la
myogénèse. Cette perte de l’activation de PLD peut être attribuée à la « down-régulation » des
PKCα et PKCγ induite en 24h par cette dose de TPA (mais pas par 1nM de TPA). Même si
les cinétiques d’activation de PLD lors d’un premier traitement par les deux doses de TPA
sont similaires, on peut prévoir que le remplacement périodique du milieu de culture
contenant 100 nM de TPA maintient l’activité de la PLD à un niveau basal, alors qu’en
présence d’1 nM de TPA, un fort niveau d’activité PLD peut être restauré. On peut donc faire
l’hypothèse que le maintien de la PLD dans un état stimulable est nécessaire à la
différenciation myogénique.
Par ailleurs, nous avons observé que l’inhibition partielle de l’activité PLD par la
BFA inhibe la réponse myogénique à l’AVP. De plus, l’inhibition de la production de son
produit, l’acide phosphatidique, par le butanol-1 inhibe la différenciation myogénique induite
par le TPA ou l’AVP. Enfin, nous avons pu montrer que la surexpression de la PLD1b induit
141
la différenciation et potentialise l’effet de l’AVP. Tous ces résultats confirment l’implication
de la PLD, et particulièrement, la PLD1 dans le processus myogénique.
De manière surprenante, contrairement à la PLD1, nous avons trouvé que la
surexpression de la PLD2 exerce un effet négatif sur la différenciation des L6. Le fait que les
deux isoformes PLD1 et PLD2 ont des fonctions différentes dans un même type cellulaire a
souvent été rapporté. Par exemple, dans les mastocytes la PLD2, et non la PLD1, est
impliquée dans la formation des «ruffles» au niveau de l’actine corticale après la stimulation
antigénique (O’Luanaigh et al., 2002). La PLD2 est aussi l’isoforme impliquée dans
l’activation des ERKs dans les cellules HIRcB (Rizzo et al., 1999). Au contraire, la PLD1, et
non la PLD2, participe à la formation des fibres de stress dans les fibroblastes (Kam and
Exton, 2001). Cette différence dans les rôles physiologiques des deux isoformes de PLD peut
être attribuée au fait qu’elles ont des localisations subcellulaires distinctes (Colley et al.,
1997; Diaz et al., 2002). Ceci nous permet de suggérer que la PLD2, contrairement à la PLD1,
induit une accumulation de PA dans des compartiments non reliés aux acteurs moléculaires de
la myogénèse.
Nous avons trouvé que les myoblastes prolifératifs ou quiescents expriment la PLD2 et
les deux variants d’épissage de la PLD1 (PLD1a et PLD1b). De plus, nous avons observé que
les isoformes de la PLD1, mais pas la PLD2, sont « down-régulées » au cours de la
différenciation myogénique, aussi bien au niveau des ARNm que des protéines. Cette
régulation conduit à une baisse de l’activité basale de la PLD de 50% dans les myotubes
différenciés. L’activité résiduelle pourrait être attribuée à la PLD2, caractérisée par une
activité basale élevée. La diminution de l’expression de la PLD1 au cours de la différenciation
myogénique peut paraître contradictoire par rapport à son implication positive dans ce
processus. Cependant, étant donné que la PLD est rapidement activée par l’AVP ou le TPA et
que les réponses précoces à ces inducteurs myogéniques apparaissent dans un temps court (1-
15 min pour la formation des SFLS, 24 h pour l’expression et l’accumulation nucléaire de la
myogénine) et le fait que la down-régulation des ARNm de la PLD1 n’a lieu qu’à partir du
4ème jour de traitement, l’implication de la PLD1 dans les étapes précoces de la myogénèse est
tout à fait compatible. Par contre, les étapes tardives de la différenciation, comme la fusion
des cellules et l’expression des protéines contractiles, qui ont lieu après le 4ème jour peuvent
ne pas dépendre directement de la présence d’une PLD1 active.
Nous avons aussi montré que l’activation de la PLD par l’AVP dans les myoblastes L6
est partiellement PKC et ARF-dépendante, mais majoritairement Rho-dépendante vu la forte
inhibition (-74%) de cette activation par l’exoenzyme C3 de Clostridium botulinum. De plus,
142
nous avons observé que l’AVP induit la translocation et donc l’activation de Rho dans ces
cellules, ce qui suggère que Rho agit en amont de la PLD après le traitement par l’AVP.
L’implication de la protéine Rho dans l’activation de la PLD dans divers types cellulaires a
été décrite (Exton et al., 2002), et notamment dans l’activation de la PLD par l’insuline dans
les myotubes L6 (Standaert et al., 1996). Rho interagit directement avec la PLD1, et cette
interaction est indispensable à l’activation de cette enzyme (Sung et al., 1997; Du et al.,
2000). De plus, il est connu que Rho et PLD peuvent être activées par divers récepteurs à sept
domaines transmembranaires. Plusieurs études ont montré que les protéines Gαq/11, Gα12 ou
Gα13 peuvent activer les protéines Rho (Seasholtz et al., 1999). De manière intéressante, dans
les fibroblastes, l’AVP peut induire une formation Rho-dépendante des fibres de stress via la
médiation des protéines Gα12 (Gohla at al., 1999). Il semble donc probable que la stimulation
Rho-dépendante de la PLD par l’AVP dans les myoblastes L6 soit médiée par les protéines G
de type Gα12, mais ceci reste à démontrer. D’autre part, il est connu que Rho joue un rôle
essentiel dans la différenciation myogénique (Carnac et al., 1998; Takano et al., 1998; Wei et
al., 1998). De plus, il a été proposé que l’activation de Rho est un facteur déterminant pour le
devenir des cellules précurseurs myogéniques. En effet, les fibroblastes embryonnaires
peuvent subir soit une différenciation myogénique, soit une différenciation adipogénique
selon le statut d’activation de Rho, un niveau élevé d’activation orientant la différenciation
vers la myogénèse (Sordella et al., 2003). En se basant sur nos observations, nous pouvons
proposer que les effets myogéniques de Rho dépendent de sa capacité à activer, entre autres,
la PLD.
La différenciation de divers types cellulaires est accompagnée d’une augmentation de
l’activité et/ou de l’expression des PLD, suggérant l’implication de cette enzyme dans le
processus de différenciation. Même si le rôle de la PLD dans la différenciation de plusieurs
types cellulaires a été rapporté, les mécanismes par lesquels la PLD pourrait intervenir dans
les processus de différenciation ne sont pas encore bien précisés. Concernant l’implication de
la PLD dans la myogénèse, son intervention à différents niveaux pourrait être considérée.
Tout d’abord, la PLD pourrait activer l’isoforme de la phosphodiestérase AMPc-spécifique
(PDE4D3) sélectivement activable par la fixation du PA (Grange et al., 2000) et exprimée
dans les cellules L6. L’activation de la PLD par l’AVP conduisant à une accumulation de PA,
elle pourrait être responsable de l’activation rapide de la PDE4D3, et ainsi le PA pourrait
réguler les taux cellulaires de l’AMPc. Du fait que la différenciation myogénique requiert une
baisse des taux d’AMPc (Naro et al., 1999), l’activation de la PDE4D3 par le PA pourrait
participer aux étapes précoces de la réponse myogénique.
143
Une autre intervention possible de la PLD dans le processus de différenciation se situe
au niveau de l’expression de gènes spécifiques du muscle: l’inhibition de la production de PA
par la BFA ou le butanol-1 diminue de manière efficace l’expression de la myogénine, facteur
de transcription spécifique du muscle. De manière intéressante, l’AVP induit une
augmentation rapide de l’expression du co-régulateur myogénique des MRFs, MEF2,
nécessaire pour l’activation transcriptionnelle de la myogénine (Scicchitano et al., 2002). Par
ailleurs, il a été montré que RhoA est impliquée dans l’activation transcriptionnelle via la
régulation du facteur SRF (Hill et al., 1995). De plus, la protéine RhoA active est requise pour
l’expression des deux facteurs de transcription MEF2 et myogénine (Takano et al., 1998).
L’induction des gènes spécifiques du muscle par RhoA, y-compris la myogénine, implique
l’activation et l’augmentation de l’expression de SRF (Wei et al., 1998). Le mécanisme précis
par lequel RhoA active SRF n’étant pas encore clair (Sahai et al., 1998), une implication
possible de la PLD doit être considérée. Cette hypothèse est appuyée par le fait qu’il existe un
lien direct entre la réorganisation du cytosquelette d’actine et l’induction de la transcription
génique par SRF (Sotiropoulos et al., 1999). Cette dernière étude démontre que les signaux
affectant la polymérisation d’actine, incluant l’activation de RhoA, sont capables de réguler
l’activité transcriptionnelle de SRF, probablement via la diminution des taux cellulaires des
monomères d’actine, l’actine G. De plus il a été montré dans les cardiomyocytes néonataux
que l’organisation des fibres d’actine est aussi requise pour l’induction de l’activité
transcriptionnelle du SRF par RhoA (Wei et al., 2001). Du fait que l’implication de la PLD
dans le réarrangement du cytosquelette d’actine est bien acceptée (Cross et al., 1996; Kam
and Exton, 2001; O’Luanaigh et al., 2002), et que nos observations montrent clairement que
la PLD et le PA participent à la formation des SFLS induite par AVP et TPA, nous pouvons
proposer que la PLD est impliquée dans la transcription des gènes spécifiques du muscle via
la réorganisation du cytosquelette d’actine et l’activation de SRF qui en résulte.
Le remodelage du cytosquelette d’actine, PLD-dépendant, peut aussi participer d’une
autre manière à l’induction de la différenciation myogénique. En fait, contrairement aux
cellules non musculaires dans lesquelles les fibres de stress contrôlent surtout la
cytoarchitecture, les SFLS jouent un rôle crucial dans les cellules musculaires puisqu’elles
sont impliquées dans les étapes précoces de la myofibrillogénèse (Dabiri et al., 1997; Sanger
et al., 2002; Du et al., 2003). Comme nous avons observé que la formation des SFLS est PLD-
dépendante dans les myoblastes L6, nous pouvons suggérer que la PLD promeut la
différenciation myogénique en favorisant la myofibrillogénèse.
144
Comment la PLD1 pourrait contribuer à la formation des fibres de stress reste
hypothétique. Diverses données de la littérature permettent de proposer l’implication d’un
autre messager phospholipidique, le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). En effet, la
biosynthèse du PIP2 dépend d’une famille de PI4P 5-kinases, dont l’isoforme de type I est
stimulable par le PA (Jenkins et al., 1994). Comme le PIP2 est un cofacteur indispensable à
l’activité de PLD, il est supposé que l’activation de cette dernière induise une boucle
d’amplification conduisant à une accumulation massive et localisée des deux produits
phospholipidiques PA et PIP2. Le rôle du PIP2 dans la polymérisation de l’actine est
largement reconnu (Hilpela et al., 2004), et est attribué à la capacité qu’a ce phospholipide
d’interagir avec diverses protéines régulant l’état de l’actine en séquestrant les monomères, en
bloquant les filaments, ou en provoquant leur coupure, telles que profiline, gelsoline, cofiline
(Janmey et al., 1999). Le PA pourrait donc être considéré comme un facteur majeur contrôlant
localement les taux de PIP2, et par ce biais, le cytosquelette d’actine. Nos résultats montrant
que la stimulation de la PLD par l’AVP s’accompagne d’une synthèse et d’une accumulation
de PIP2 au niveau des fibres de stress sont en accord avec cette hypothèse (Figure 48).
Figure 48 : Séquences de signalisation déclenchées par la stimulation myogénique.
145
En conclusion, nous avons établi le rôle de la voie de signalisation de la PLD dans des
réponses physiologiques importantes pour la fonction du muscle squelettique. Notre travail
permet de démontrer, pour la première fois, que la PLD, et spécifiquement l'isoforme PLD1,
est nécessaire à la différenciation myogénique. Nous avons montré que le remodelage du
cytosquelette est impliqué de façon majeure. Selon le modèle que nous proposons, la PLD1
stimulée en réponse à RhoA induit l'accumulation de PA au niveau de l'actine. Le PA à son
tour provoque l'accumulation localisée de PIP2. Ce composé, de par ses actions sur diverses
protéines régulatrices de l'actine provoque (en synergie avec diverses autres protéines
effectrices de Rho) l'assemblage des SFLS. Comme évoqué dans les rappels bibliographiques,
les SFLS jouent un rôle important dans les phases initiales de la myofibrillogénèse. La PLD
peut donc promouvoir la myogénèse en favorisant la mise en place des fibres striées. Le
remodelage du cytosquelette d'actine, dont nous avons prouvé qu'il nécessite l'activité PLD,
semble intervenir aussi, lors de la myogénèse, à un autre niveau. En effet, il a été démontré
l'existence d'un lien direct entre le degré de polymérisation de l'actine cellulaire et l'activité du
"serum response factor" (SRF), un facteur de transcription connu pour réguler l'expression de
gènes spécifiques du muscle, directement (tels que l'α-actine), ou indirectement (tels que la
myogénine). Un système détecteur de la concentration de l'actine globulaire gouvernerait
l'activité de SRF. Cette régulation de SRF par l'actine est connue dans la cellule musculaire
lisse (Mack et al., 2001), et le cardiomyocyte (Wei et al., 2001), mais n'a pas été décrite dans
le myoblaste squelettique. Nos résultats montrant que l'inhibition de la PLD supprime
l'expression de la myogénine permettent de supposer l'existence d'une régulation de
l'expression génique, lors de la myogénèse, selon le schéma: PLD --> remodelage de l'actine -
-> activation de SRF --> expression des gènes du programme myogénique (Figure 49).
Une des questions majeures qui restent à résoudre est celle du mécanisme par lequel la
PLD et son produit PA interviennent dans la formation des SFLS. Le rôle respectif de PA et
PIP2 dans la formation des fibres de stress sera étudié de manière détaillée dans les
myoblastes.
- Pour vérifier l’hypothèse d’une boucle d’amplification impliquant simultanément PA et
PIP2, l’accumulation de PIP2 en réponse aux agonistes, AVP et TPA, sera comparée entre
cellules témoins et cellules n’exprimant pas la PLD (transfectants stables surexprimant une
PLD-dominante négative, ou cellules traitées par siRNA). Cette accumulation sera d’une part
évaluée par dosage du phospholipide, et d’autre part, par cytoimmunofluorescence.
Inversement, l’accumulation de PA (évaluée par dosage et par marquage à l’aide de la sonde
146
fluorescente spécifique) sera comparée entre cellules témoins et cellules surexprimant une
PI4P 5-kinase type I dominante négative, ou le domaine PH de PLCδ (fixateur spécifique de
PIP2, destiné à «titrer» ce messager dans la cellule).
- L’effet du blocage du PIP2 par microinjection de l’anticorps spécifique, ou par injection
d’un anticorps anti-PI4P 5-kinase, ou l’effet du blocage de PLD par injection d’un anticorps
anti-PLD, sur l’accumulation du phospholipide partenaire, et sur la réponse physiologique
(SFLS) sera évalué. De même, l’effet de la microinjection de PA ou de PIP2 sera étudié, ainsi
que l’effet de l’injection simultanée de PA et d’anticorps anti-PIP2. Ces expériences devraient
nous permettre de déterminer si le PA a un effet par lui-même, ou si son effet passe
obligatoirement par une accumulation de PIP2.
- Les effets in vitro du PA sur la polymérisation de l’actine seront étudiés à l’aide de
composants purifiés.
En ce qui concerne spécifiquement la différenciation myogénique, un lien direct entre
le réarrangement du squelette d’actine et l’acquisition du phénotype myocytaire sera
recherché. Pour ce faire, l’effet sur la réponse myogénique des drogues agissant
spécifiquement sur l’actine sera étudié. Seront testés notamment, les inhibiteurs de
polymérisation de l’actine latrunculine B et toxine clostridiale C2. Le jasplakinolide, qui
stabilise l’actine fibreuse, et donc promeut la polymérisation, le swinholide A et la
cytochalasine D qui séquestrent l’actine, seront aussi étudiés.
Les effets d’une surexpression d’actine, ou d’actine mutée ne pouvant s’intégrer aux
filaments, sur la différenciation seront étudiés. Enfin, on étayera l’hypothèse selon laquelle la
formation des fibres de stress en réponse aux agents différenciateurs (AVP ou TPA) module
l’expression des gènes spécifiques du muscle via l’activation de SRF. Pour ce faire, on
recherchera si l’activation des myoblastes est corrélée à une augmentation de l’expression de
gènes reporters gouvernés par un promoteur SRF-dépendant, tel que celui de l’α-actine
squelettique. On cherchera aussi à mettre en évidence la formation des complexes promoteur
de l’actine/SRF par la technique d’ « electrophoretic mobility shift assay ».
Enfin, l’implication de la PLD dans la différenciation des cellules myogéniques
primaires (cellules satellites du muscle de souris adultes, normales ou transgéniques atteintes
de dystrophies musculaires) sera étudiée à l’aide d’ outils moléculaires adaptés, notamment de
vecteurs viraux permettant la surexpression efficace de chacune des isoformes de PLD.
147
Figure 49 : Topographie des évènements impliquant la PLD lors de l’initiation de la myogénèse.
148
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