PRELIMINARY NOTES 441

is higher than that of norepinephrine. The ratio of the concentration of metabolites (normetanephrine plus 3,4-dihydroxymandelic acid) to that of norepinephrine is lowest in the hypothalamus. In hypothalamus the concentrations of the precursor and metabolites of norepinephrine are relatively small in spite of a high concentration of norepinephrine. This fact suggests that hypothalamus is rich in the storage form of norepinephrine which is granule-bound and inaccessible to the inactivator enzymes.

In caudate nucleus in which dopamine is present in very high concentration, the concentration of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (metabolite of dopamine) is smaller than that of 3,4-dihydroxymandelic acid (metabolite of norepinephrine) and the concentration of norepinephrine is also high. This fact indicates that a large part of the dopamine in caudate nucleus is converted to norepinephrine.

The authors wish to thank Dr. Y. KAKIMOTO and Dr. T. MAEDA for their technical advice and Miss K. TAKEUCHI for her kind help.

Department of Pharmacology, Osaka University, Medical School,

Osaka (Japan)

MASAMI MATSUOKA

HIROSHI YOSHIDA

R E I J I IMAIZUMI

z A. BERTLER AI~D E. ROSENGREN, Acta Physiol. Scand., 47 (I959) 35 ° and 51 (1961) 95. M. VOGT, J. Physiol., 123 (1954) 451. A. CARLSSON, Pharmacol. Rev., I I (1959) 490.

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6 E. ROSENGREN, Acla Physiol. Scand., 49 (196o) 37 o. 6 j . AXELROD, J. K. INSCOE, S. SENOH AND B. WITKOP, Biochim. Biophys. Acta, 27 (1958) 21o.

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10 A. CARLSSON AND M. LINDQVIST, Acta Physiol, Scand., 54 (1962) 83. ll y . KA.KIMOTO AND M. D. ARMSTRONG, personal communicat ion. 13 T. ITOH, M. MATSUOKA, K. N&K&JIMA, K. TAGAWA. &ND IR_. IMAIZUMI, Jap. J. Pharmacol.,

12 (1962) 13o. 13 W. S. YoN EULER, Acta Physiol. Scand., 33, Suppl. 118 (1955) 57- 14 H . WEIL-MALHARBE, Biochem. J., 51 (1952) 311. is M. MATSUOKA, Jap. f . Pharmacol., in the press. 16 M. MATSUOKA, H. YOSHIDA &ND R. IMAIZUMI, Biochem. Pharmacol., I I (1962) 11o9. 17 E. MANNARINO, N. KIRSHNER AND B. S. NASHOLD, J. Neurochem., io (1963) 373.

Received October 3Ist, 1963 Biochim. Biophys. Acta, 82 (1964) 439-441

PN 1344

Influence de la respiration ana*robie du nitrate et du fumarate sur le m~tabolisme fermentaire d'Aerobacter aerogenes

Aerobacter aerogenes peut croltre dans des conditions oti la fermentation ana~robie d 'un glucide constitue l'unique source d'6nergie disponible. Un tel processus d'oxydo- r6duction ne requiert point la participation d'un accepteur physiologique d'hydrog~ne externe. Nfanmoins, l'organisme utilis6 r6duit des quantit6s 61ev6es de nitrate ou de fumarate lorsqu'il se trouve plac6 en prdsence de glucose et en l'absence de 0 2.

Biochim. Biophys. Acta, 82 (1964) 441-444

442 P R E L I M I N A R Y NOTES

T A B L E A U I

BILANS DE FERMENTATION

NOuS avons utilis~ la souche L III-I. Le milieu est tamponn6 ~ pH 7. Dans tousles cas, le glucose constitue la source d'6nergie. II est employ6 g une concentration proche de 4 mM. Les cultures ana6robies sont rdalis6es sous atmosphere de N 2, ~ 37 °. Les cultures a6robies sont effectu6es dans des fioles g toxine agit6es A 32°. Tousles r6sultats analytiques correspondent A la fin de la phase exponentielle et sont exprim6s en moles du produit pour ioo moles de glucose consomm6es. Les d6gagements de CO 2 et de H~ sont d6termin6s par la m6thode manom6trique de Warburg. Les a c i d e s f o r m i q u e e t a c 6 t i q u e s o n t isol6s d u m i l i e u p a r e n t r a t n e m e n t A la v a p e u r p u i s sdpar~s e t dos6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r c o l o n n e de si l ice h y d r a t 6 e . L ' a c i d e L - m a l i q u e es t e x t r a i t ~ l ' 6 the r , purif i6 p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r sil ice e t ident i f i6 p a r la m e s u r e d u p o i n t de fus ion e t du p o u v o i r

r o t a t o i r e de son sel de c i n c h o n i n e .

Accepteur Cultures anadrobies

NO3- Fumarate

Cultures ad~obies

02

H 2 22.5 19 o o 8o 6o o o E t h a n o l 73 68 3 3 i i 13 i 3 Ac6to~ne 1.4 o o.7 o.2 2 6 1.5 4 B u t a n e d i o ! 8.5 i o.5 o 4 5 o o A c 6 t a t e 83 83 15 ° 120 135 120 68 55 F o r m i a t e i 16 133 85 95 80 97 6 2 S u c c i n a t e 9 2 o o 14 ° 15o 5 - - L a c t a t e 5 3 I 2 7 7 2 3 P y r u v a t e o o 21 16 2.5 2 1.5 1.6 CO 2 17 19 i o o i o i 155 125 25o 28o M a l a t e . . . . 250 15 ° - - - - F u m a r a t e d i s p a r u . . . . 435 37o - - - -

D~s lors, on pouvai t se demander si la respiration des deux accepteurs exerce une action profonde sui le m6tabolisme fermentaire. Le probl~me pos6 couvre un domaine 6tendu. Nous pr~senterons seulement ici quelques observations pr~liminaires.

De nombreux bilans de fermentat ion ont 6t6 r6alis6s (Tableau I). Ils ont permis une 6tude comparat ive de l 'influence du nitrate, du fumarate et de l 'oxyg~ne. R6sumons les principaux r~sultats obtenus: (i) les cultures ana6robies avec NO s- et a6robies, ne donnent jamais lieu ~ une product ion de Hz; (2) des quantit6s ~qui- mol6culaires de CO 2 et de H 2 sont form6es par les cultures ana6robies sans accepteur; (3) la pr6sence de fumarate accrolt de trois ~ quatre lois le volume de H 2 produit par mole de glucose ferment6e; (4) la formation d '6thanol se t rouve for tement r6duite dans les cultures avec accepteur (NO~-, fumarate ou 02); (5) la somme: moles d 'ac6tate -}- moles d '6thanol, est sensiblement la m~me dans les cultures avec NO 3- et dans les cultures sans accepteur; (6) la product ion d'ac6toine, de 2,3-butanediol et de lactate, est g6ndralement peu affect6e ; (7) des quantit6s assez ~levdes de pyruva te s 'accumulent clans les cultures ana6robies avec NO3- , cet interm6diaire n 'appara i t point normalement en ana6robiose et en l 'absence d 'accepteur, il ne s 'en forme que des traces en presence du fumarate ou de 02; (8) on t rouve pros de deux lois plus d 'ac6tate dans les cultures avec NO 3- que dans les cultures ana6robies sans accepteur, cet acide s 'accumule aussi dans les cultures a~robies; (9) la prdsenee de NO3- dans les cultures ana6robies entraine une 16g~re diminution de la teneur en formiate, les cultures a6robies ne contiennent en fin de croissance que des traces de ce m6taboli te; (IO) l 'accroissement consid6rable de la product ion de CO2 provoqu6 par le nitrate ou le iumarate constitue un fait marquant , celle-ci n ' a t te in t cependant jamais les

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PRELIMINARY NOTES 443

valeurs tr~s 61ev6es obtenues en a6robiose; (II) des quantit6s importantes de L-malate apparaissent dans les cultures ana6robies contenant du fumarate; (12) la teneur en succinate des cultures fermentant le glucose est toujours extrSmement faibte, elle est nulle ou ndgligeable en pr6sence de NO3- , elle devient tr~s dlev~e dans les cultures avec fumarate.

L'absence de production de H~ dans les cultures sur NO 3- a vraisemblablement pour origine l'inhibition par NO~- de l 'hydrog6nase (EC 1.98.1.1 ) et de l'hydrog~ne- lyase. Notre point de vue s'est trouv6 confirm6 par les r6sultats d'une dtude rdalisde avec des extraits enzymatiques et des suspensions cellulaires. D'autre part, il a 6t6 vdrifi6 que le nitrite produit au cours de la r6duction du nitrate, s 'accumule dans le milieu de croissance. Comme nous l 'avons ant6rieurement d6montr61, la r~pression exerc6e par O 3 sur la biosynth~se de l 'hydrog6nase et de l 'hydrog~nelyase rend les cultures a6robies inaptes £ former H 2. I1 est probable qu'une partie de l 'hydrog~ne et du CO2 form6s par les cultures sur fumarate, provient non pas de la fermentation du glucose mais de celle de l 'accepteur. Nous reviendrons ult6rieurement sur ce point.

Une inhibition de la biosynth&se ou de l 'activit6 de l'alcool: NAD (NADP) oxydo- r6ductase, pourrait se trouver £ l'origine du fait que les cultures avec accepteur contiennent de faibles quantit6s d'6thanol. L'hypoth~se explicative qui retiendra particuli~rement notre attention est celle d'une competition entre la d6shydrog6nase et la n i t ra te - -ou fumarique--r6ductase, envers les 61ectrons provenant du NADH 2 (NADPH2).

L'accumulation du pyruvate clans les cultures avec NO3- peut ~tre due ~ l'inhi- bition d 'un ou plusieurs syst~mes enzymatiques jouant un r61e dans le catabolisme oxydatif de ce compos6, ou ~ une acc616ration de la glycolyse.

Une observation pr6sente ~ nos yeux un certain int~rSt: l 'accumulation de quantit6s importantes d'ac6tate dans les cultures ana6robies avec nitrate ou fumarate. L'origine de ce ph6nom~ne r6side sans aucun doute dans le fait que chez notre souche, le cycle de Krebs n'op~re jamais ~ une vitesse significative en l 'absence de O 2 (r6f. 2). De plus, il a 6t6 6tabli que plusieurs enzymes de cette voie m6tabolique sont presents

l '6tat de traces dans les cellules provenant de cultures ana6robies avec ou sans accepteur. L'accumulation d'ac6tate dans les cultures a6robies sugg~re l 'hypoth~se selon laquelle ce m6tabolite serait form6 plus vite qu'il n 'est respir6.

L 'appari t ion de volumes sensiblement 6gaux de CO 2 et de H 2 dans les cultures ana6robies sans accepteur, montre que ces deux gaz sont issus du formiate. Par contre, la formation massive de CO 2 dans les cultures sur NO~- doit avoir une tout autre cause puisque les cellules sont alors ddpourvues d'activit6 hydrog~nelyase. On doit 6carter d'embl6e les dventualit6s selon lesquelles le CO 2 proviendrait du cycle de Krebs ou de la condensation non oxydative du pyruvate en ac6toine. En effet, des quantit6s tr~s faibles de ce dernier compos6 et de butanediol sont form6es par les cultures avec NO 3- (Tableau I). Finalement, nous retiendrons comme ofigines possibles la d6- carboxylation oxydative du pyruvate ou du iormiate et le shunt des hexose mono- phosphates. Signalons enfin un fait qui m6rite quelque attention: les cultures ana6- robies avec et sans accepteur produisent le CO 2 avec des cin6tiques dissemblables; en l 'absence d'accepteur le gaz n 'apparal t qu'en fin de croissance, alors qu'en presence de nitrate ou de fumarate il se forme d~s le d6but de la phase exponentielle.

Dans le cas des cultures avec fumarate, l ' interprdtation des r~sultats est rendue plus difficile par le fait qu'une partie de l 'accepteur est vraisemblablement ferment~e

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ind6pendamment du glucose. A l'appui de notre opinion, retenons les observations suivantes: (I) la souche utilis6e se d6veloppe faiblement dans un milieu priv6 de 02, contenant du fumarate comme seule source de carbone et d'6nergie ; (2) les suspensions cellulaires lav6es provenant de cultures ana6robies sur milieu glucos6 avec fumarate, fermentent cet acide en l'absence de glucose. La formation d'une quantit6 61ev6e de succinate n 'a ici rien de surprenant. Elle montre simplement qu'en ana6robiose, le fumarate est r6ellement utilis6 comme accepteur d'hydrog6ne. Par contre, l 'accumu- lation de L-malate pouvait paraltre 6trange. Elle s'explique par la synth6se d'une fumarate hydratase (L-malate hydro-lyase, EC 4.2.1.2) inductible qui a 6t6 extraite des cellules et caract6ris6e. Nous nous trouvons certainement 1~ en pr6sence d'un cas int6ressant de comp6tition enzymatique qui m6riterait d'etre 6tudi6 d'une mani6re plus approfondie. Deux syst6mes utilisent un substrat commun, le fumarate; l'un catalyse sa r6duction en succinate et l 'autre son hydratation en L-malate. Lorsque la croissance s'arr4te, les deux produits se trouvent en quantit6s presque 6quivalentes (Tableau I). I1 se pourrait donc que pendant le d6veloppement de l'organisme, aucun des deux enzymes ne soit favoris6 par rapport ~ l'autre.

Bien que plusieurs faits exp6rimentaux demeurent encore inexpliqu6s, une con- clusion se d6gage nettement de notre 6tude : chez A. aerogenes le nitrate et le fumarate rendent possible une oxydation plus pouss6e de la mol6cule de glucose, mais ces deux accepteurs ne permettent point comme l'oxyg6ne une combustion compl6te de l'ali- ment carbon6.

Laboratoire de Chimie Bactdrienne, Centre National de la Recherche Scientifique,

Marseille (France)

PIERRE FORGET

FRANCIS PICHINOTY

1 F. PICHINOTY, Biochim. Biophys. Acta, 64 (1962) III. 2 F. PICHINOTY, F. MOTTET, J. BIGLIARDI-RouvIER ET P. FORGET, Z. Naturforsch., i8b (1963) 492-

Regu le 9 ddcembre, 1963

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