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Université Montpellier I Année Universitaire
2010-2011
Mémoire
Master I audiologie et troubles du langage
Innervation des cellules ciliées internes
en imagerie confocale
par
Nicolas VANNSON
Inserm U1051 – Institut des Neurosciences de Montpellier
Equipe « physiologie et thérapies des maladies de l’audition »
Directeur : Jean-Luc Puel
Responsable de stage : Jérôme Bourien
80, rue Augustin Fliche
34091 Montpellier Cedex 5, France
2
A mon oncle Denis, tragiquement décédé
3
REMERCIEMENTS
Je tiens, en premier lieu, à témoigner ma reconnaissance au Professeur Jean-Luc PUEL de
m'avoir donné l’opportunité de travailler au sein de son laboratoire.
Mes premiers remerciements se portent tout naturellement vers le Docteur Jérôme BOURIEN, mon
maître de stage qui ma fait découvrir, non sans passion, le monde de la recherche scientifique. Un
grand merci à lui pour avoir accompagné mes premiers pas dans ce monde totalement inconnu. Je
remercie également le Docteur Régis Nouvian pour ces superbes schémas et images de cellules
ciliées internes et ses explications sur la synapse à ruban.
J’adresse également de vifs remerciements à Christophe MICHEL pour son soutien, ses explications
et surtout les réponses à mes innombrables questions.
Enfin, je remercie l'ensemble des membres de l’équipe 02, « physiologie et thérapies des maladies de
l’audition ».
En-dehors du domaine scientifique, je profite de l’occasion pour remercier la famille Aptel de m’avoir si
bien accueilli à Montpellier, les premiers jours de mon long périple.
4
Sommaire
Introduction ............................................................................................................................................. 5
2. Matériel et méthode ............................................................................................................................ 6
2.1 Modèle animal ................................................................................................................................ 6
2.2 Acquisition des images confocales ................................................................................................ 6
2.3 Analyse des images ....................................................................................................................... 7
3.Résultats............................................................................................................................................... 9
3.1 Images simulées ............................................................................................................................ 9
3.2 Données réelles ........................................................................................................................... 10
4. Discussion......................................................................................................................................... 13
Bibliographie ......................................................................................................................................... 16
5
INTRODUCTION
Les cellules ciliées internes (CCI) sont les cellules sensorielles auditives de la cochlée. Elles
assurent la mécano-transduction des ondes sonores en influx nerveux. Chaque CCI est pourvue dans
sa partie baso-latérale de synapses à ruban (Fig.1A) impliquées dans la libération du
neurotransmetteur (le glutamate) dans la fente synaptique (Nouvian, Beutner et al. 2006). Chaque
cellule dispose de 10 et 25 synapses (Fig.1B) selon la position de la cellule le long de la cochlée
(Meyer, Frank et al. 2009). Une synapse est fonctionnelle lorsqu'un ruban fait face à une densité de
récepteurs au glutamate (les récepteurs AMPA)
L’innervation d’une cellule ciliée interne est particulière ((Liberman 1980) et fragile (Kujawa
and Liberman 2009). Dans la mesure où un neurone auditif contacte une seule cellule ciliée interne au
moyen d’un seul contact synaptique, une cellule ciliée interne constitue donc l’unique entrée
sensorielle de 10 à 25 neurones. Lorsque cette innervation est altérée (suite à un traumatisme
acoustique par exemple (Kujawa and Liberman 2009)) , le codage de l’information sonore est dégradé
ce qui induit des déficiences auditives.
Le but de ce travail est de développer un algorithme d'analyse d’images en 3 dimensions (3D)
de l’innervation des CCI à partir d’images confocales. Cet outil permettra, d'une part, d'estimer de
manière fiable et automatique le nombre de synapses par CCI et d'autre part de faire des mesures de
volume du marquage du ruban et de la densité de récepteur AMPA. Les algorithmes ont été mis au
point et étalonnés sur des images simulées puis utilisés sur des images confocales acquises chez des
gerbilles normo-entendantes adultes.
Figure 1: Innervation de la cellule
ciliée interne. (A) En réponse à un
signal sonore, les stéréocils se
défléchissent, la cellule se dépolarise,
puis elle libère du glutamate dans la
fente synaptique. Le glutamate capté
par des récepteurs AMPA évoque des
courants post-synaptiques excitateurs
au niveau du bouton synaptique puis
des potentiels d’action dans les
neurones. (B) Un ruban synaptique
(flèche verte) a une forme ellipsoïdale
(longueur~228 nm, largeur~118 nm) et
est entouré d’un halo de vésicules de
glutamate. La flèche rouge désigne la
densité de récepteurs au glutamate.
B A
Ruban
Récepteurs au glutamate
200 nm
10 µm
6
2. MATERIEL ET METHODE
2.1 Modèle animal Le modèle animal utilisé dans cette étude est celui de la gerbille normo-entendante adulte
(Meriones unguiculatis). La gerbille est un modèle animal utilisé en recherche expérimentale car son
audiogramme est parmi les rongeurs (après le chinchilla), celui qui se rapproche le plus de celui de
l’homme (Ryan 1976). La gerbille adulte dispose d’un audiogramme (Fig.2A) plat entre 1 et 16 kHz
translaté, par rapport à celui de l’homme, de 1,5 octaves vers les hautes fréquences (Muller 1996). Par
ailleurs, une cochlée de gerbille est dotée d’approximativement 1000 cellules ciliées internes (Lenoir
M, Bourien J, données non publiées) et 16 987 ± 3049 (moyenne ± écart-type) neurones auditifs (Earl
and Chertoff 2010). En fonction de la localisation le long de la membrane basilaire, il existe entre 12 et
25 synapses par CCI (Meyer, Frank et al. 2009).
2.2 Acquisition des images confocales Les cochlées de gerbilles adultes ont été prélevées puis marquées en immuhistochimie à
l’aide de l’anticorps anti-CtPB2 (vert) qui reconnaît la protéine ribeye (Nouvian, Beutner et al. 2006) du
ruban synaptique ainsi que le noyau des cellules ciliées internes. Les récepteurs AMPA (GluR2/3) ont
été marqués avec un anticorps anti-GluR2/3 (rouge). L’acquisition des images a été effectuée à l’aide
d’un microscope laser confocal (Microscope inverse 1 Zeiss Axioobserver / LSM 5 LIVE DUO) de
l’apex à la base toutes les 70 CCI (voir Fig. 4). Dans la mesure où une cochlée de gerbille compte en
moyenne 1000 CCI, 12 à 16 points de mesures ont été nécessaire pour échantillonner une cochlée.
Chaque point de mesure contenait entre 5 et 8 CCI. Les images brutes (coupes successives d’un
échantillon) ainsi obtenues forment un stack (pile de plans focaux dont le nombre varie de16 à 32 en
fonction de la position sur l’axe apex-base). Les images confocales sont composées de trois canaux :
Rouge (red), Vert (green), Bleu (blue), format RGB. Chaque plan focal à une dimension spatiale en (x,
y) de 71,43 x 71,43 µm (soit 1024 x 1024 pixels) et une résolution en z de 0,5 µm. Avec ce
paramétrage le volume d’un voxel (pixel en 3D, x y z) est de 0,7 x 0,7 x 0,05 soit 0.0025 µm3.
Figure 2: Audiogrammes et reconstruction 3D d'une cochlée de gerbille. (A) Seuils auditifs en dB SPL (référence: 20 µPa) de l’homme (en bleu) et de la gerbille (en rouge). L’audiogramme de la gerbille a été déterminé par audiométrie comportementale (Ryan 1976).(B) Modélisation 3D d’une cochlée de gerbille adulte réalisée par Bourien J. et Lenoir M. d’après la carte fréquentielle publiée par (Müller 1996). La spirale rouge correspond au contour extérieur de la membrane basilaire estimé à 11,1 mm par M Müller. La cochlée de gerbille compte 3 tours pour une hauteur de 2,2 mm (Harris, Rotche et al. 1990)
A B
7
2.3 Analyse des images
a. Pré-traitement des images
Au préalable, les stacks d’images confocales ont été analysées manuellement sous ImageJ®
(open software) afin de vérifier le bon alignement des plans focaux. Toute image non alignée a été
systématiquement recalée et réalignée a posteriori sous Matlab®. Le logiciel ImageJ® a ensuite
permis d’extraire les images par canal, et par plan, tout en supprimant le canal bleu du fait de
l’absence de marquage. Pour chaque canal restant (rouge et vert), une série de prétraitements a été
réalisée manuellement dans l’ordre suivant : i) filtrage médian 4x4, ii) sous-échantillonnage d’un
facteur 2, et iii) correction gamma, iv) seuillage manuel guidé par l’histogramme d’intensité des
couleurs (pour le canal vert, le marquage des noyaux étant plus clair que celui des rubans,
l’histogramme d’intensité est bimodal).
b. Algorithmes d’analyse 3D
L’analyse des images confocales à proprement parlé s’est faite en 3 étapes :
Détection des noyaux et des éléments synaptiques : Les structures anatomiques
Figure3: Points d’acquisition d’images confocales. (A-D) Exemple d'acquisition de quatre stacks d’images, projetées en z, de l’apex, à la base). (C-B) indiquent respectivement les points de mesures à 2 kHz (point 5) et à 8 kHz (point 8). En outre, une cochlée peut avoir entre 12 et 16 points de mesures. Au centre, projection en (x, y) d’une cochlée de gerbille adulte d’après la carte fréquentielle publiée par M. Müller 1996
A
B C
D
8
recherchées (ruban synaptique et noyau cellulaire dans le canal vert ou densité de récepteurs dans le
canal rouge) apparaissent dans des images confocales sous la forme d’amas de voxels adjacents
d’intensité forte. Pour détecter ces amas, nous avons développé un algorithme de classification
ascendant hiérarchique qui agrège, de proche en proche, les voxels en contact latéral. Cet algorithme
commence tout d’abord par agréger les voxels voisins (voxels qui partagent une face) ; dès que
l’algorithme commence à agréger des voxels distants (voxels qui ne partagent par une face), le
programme informatique considère que l’amas de voxels est circonscrit et clos. Appliqué séparément
sur le canal vert et sur le canal rouge, cet algorithme permet donc de détecter indépendamment les
noyaux cellulaires, les rubans synaptiques et les densités de récepteurs (voir Fig. 4).Dans cette étude,
les seuils en intensité ont été déterminés qualitativement sur le canal rouge et le canal vert pour retenir
les voxels les plus intenses. Le choix des seuils était guidé par l’histogramme des intensités. La
détection des rubans synaptiques et des densités de récepteur nécessite une valeur de seuillage alors
que la détection des noyaux nécessite 2 valeurs de seuillage (une valeur haute et une valeur basse).
Pour détecter la colocalisation d’un ruban synaptique et d’une densité de récepteurs, nous
avons utilisé la propriété de diffusion des marqueurs synaptiques qui tend à marquer la structure cible
bien au-delà de ses limites anatomiques. En combinant les canaux vert et rouge, la colocalisation
apparait donc en jaune (voir Fig 4B). La détection du nombre de synapses dites « complètes » peut
ensuite se faire avec l’algorithme de classification hiérarchique ascendant cité précédemment mais
cette fois-ci sur le canal mixte jaune. Cette procédure est appelée étape de détection dans la Fig. 4.
Association synapses-CCI : La position 3D de chaque ruban synaptique, de chaque densité
de récepteurs et de chaque synapse complète est ensuite calculée automatiquement en moyennant en
x, y, et z les coordonnées des voxels constituant chaque amas détecté. Avec cette information, il est
possible d’associer chaque synapse complète au noyau de cellule ciliée interne le plus proche. Cette
procédure est appelée l’étape de clustering dans la Fig. 4.
Mesure de volume des éléments synaptiques: Pour finir l’analyse, chaque synapse
complète est isolée en 3D en prélevant un petit volume de 9 x 9 x 4 voxels centré sur la position
centrale de la synapse (voir Fig 4B). Une fois isolé, le volume du marquage du ruban synaptique, de la
densité de récepteurs ou du volume de la colocalisation peut aisément être réalisé. La forme d’un
ruban synaptique étant ellipsoïdal en première approximation, son volume vaut 4
3𝜋 × 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑒𝑢𝑟 ×
𝑙𝑎𝑟𝑔𝑒𝑢𝑟 × ℎ𝑎𝑢𝑡𝑒𝑢𝑟 (Nouvian, Beutner et al. 2006). Les synapses coupées car situées sur les bords du
stack ont été exclues de cette analyse. Il faut noter que ces mesures ont été faites sur les données
brutes sans sous échantillonnage. Cette procédure est appelée l’étape d’isolation et reconstruction
3D dans la Fig. 4.
Les trois algorithmes ont été implémentés sous Matlab®.
9
3. RESULTATS
Les algorithmes ont été mis au point et étalonnés sur des images simulées puis utilisés sur
des images confocales acquises chez des gerbilles normo-entendantes adultes.
3.1 Images simulées
Pour évaluer les algorithmes, nous avons développé une librairie de fonctions sous Matlab®
permettant de distribuer dans un volume des sphères de rayon, de couleur, et de position variables.
Dans cette simulation, le canal vert contient 4 sphères alignées, de couleur vert pâle (niveau 138/255)
de rayon 5 µm pour modéliser les noyaux de cellules ciliées internes, et 20 sphères alignées de
couleur vert vif (190/255), de rayon 1 µm, pour modéliser 20 rubans synaptiques (Fig. 5A). Le canal
Figure 4 : Les trois étapes de la méthode d’analyse (détection, clusterisation et de mesure de volume) illustrées sur des données simulées. (A) Seuls les canaux vert et rouge du stack d’images confocales (raw data) sont analysés par l’algorithme de détection 3D. Dans le canal vert, les noyaux des CCI sont marqués en vert pale alors que les rubans synaptiques sont marqués en vert vif. L’algorithme de détection appliqué séparément sur le canal vert et le canal rouge permet de circonscrire les contours des noyaux cellulaires, des rubans synaptiques et des densités de récepteurs. Dans cet exemple, 8 densités de récepteurs en rouge, 3 noyaux cellulaires en vert pâle et 9 rubans synaptiques en vert vif. Après fusion des canaux vert et rouge, l’algorithme détecte 8 synapses complètes (en jaune). (B), L’algorithme de clusterisation, à défaut de marquage membranaire, associe les synapses complètes au noyau cellulaire le plus proche. A l’issue de cette étape, l’association noyau-synapses est représentée avec une même couleur. Dans cet exemple, une des 9 densités de récepteurs ne colocalise pas avec un ruban synaptique. (C) L’algorithme d’isolement des synapses complètes permet de faire des mesures de volume des éléments pré et post-synaptiques.
10
Figure 6: Analyse du point de mesure n°8. (A) Projection en z du point de mesure n°8 (zone codant pour le 8 kHz). (B) Après détection 3D et clusterisation ce point de mesure analysé comporte en moyenne 21± 4.8 synapses/CCI (moyenne ± écart-type). Les axes sont orthonormés et exprimés en µm. De plus, chaque synapse associée au noyau le plus proche est de la même couleur que ce dernier (ex: noyau rouge et ses 25 synapse rouges). Il y a au total 144 synapses complètes pour 7 noyaux
rouge comporte 17 sphères alignées de couleur rouge (226/255) de rayon 0,5 µm pour modéliser les
densités de récepteurs (Fig. 5B). Dans cette simulation, les rubans synaptiques et les densités de
récepteurs ont été placés aux mêmes emplacements, seules 2 densités de récepteurs sont absentes.
L’algorithme de détection 3D (Fig. 5C) retrouve parfaitement les 17 synapses colocalisées
(synapses complètes). Après clusterisation (Fig. 5D), les synapses complètes sont correctement
associées au noyau cellulaire le plus proche (synapses et noyau de même couleur). Le nombre moyen
de synapses par cellule ciliée interne peut ensuite aisément être calculé: 4 ± 1,26 (moyenne ± écart-
type).
3.2 Données réelles
Détection et clusterisation
A
Figure 5: Exemple d'analyse par algorithmes de détection et de clusterisation. Les données simulées dans le canal vert contiennent 20 rubans (vifs) et 4 noyaux (pâles) et 17 récepteurs AMPA (Ampar) dans le canal rouge. Après passage de l’algorithme de détection on retrouve bien nos 4 noyaux et nos 20 rubans (A) et nos 17 récepteurs AMPA (B). La densité de récepteur AMPA et les rubans sont parfaitement superposés donc l’algorithme doit donc trouvé 17 synapses colocalisées. (C). L’algorithme de clusterisation (D) donne le nombre de synapses colocalisées/noyau. Les axes sont en µm et non orthonormé pour faciliter la lecture.
B
A B
C D
11
La Fig.6A représente la projection en z d’un stack d’images confocales (point de mesure n°8 à
8 kHz). Après détection 3D et clusterisation, le point de mesure n°8 comporte 7 cellules ciliées internes
et 144 synapses soit 21± 4,8 synapses/CCI (moyenne ± écart-type). On peut observer que le nombre
de synapses par cellule ciliée interne peut varier du simple au double pour un même point de mesure
(n=14 pour la 3ème CCI en bleu ciel et n=27 pour la cellule voisine en vert).
Cette analyse a été menée sur 3 cochlées de gerbilles normo-entendante adulte. Les
paramètres de correction gamma et de seuillage des images confocales ont été ajustés
qualitativement pour chaque point de mesure. Le nombre moyen de synapses par cellule ciliée interne
a été représenté dans la Fig. 7 en fonction de la position du point de mesure par rapport à l’apex
(position exprimée en mm) et de la fréquence de codage du point de mesure (exprimé en kHz). Cette
distribution suit clairement une courbe en cloque légèrement asymétrique avec une densité de
synapses par CCI faible à la base et à l’apex (n=12 synapses/CCI à l’apex et n=13 synapses/CCI à la
base) et forte entre 1 kHz et 16 kHz. Cette distribution a été ajustée par un polynôme du second degré
pour une qualité d’ajustement R2=0.7 (voir Fig. 7). Il faut noter que certains points de mesure n’ont pas
pu être exploités en raison de problèmes de marquage de la densité de récepteurs (1 seul point de
mesure dans la zone du 4 kHz et du 8 kHz). La mesure est également incomplète pour les hautes
fréquences car la préparation des cochlées est plus difficile à la base.
Estimation des volumes
Chaque synapse détectée a été isolée puis reconstruite en 3 dimensions sans sous-
échantillonnage.
La Fig.8 représente 4 synapses en 3D prélevées dans 4 zones différentes de la cochlée (de
Figure7:Nombre de synapses/CCI.
Les cercles évidés rouges
correspondent à la moyenne du
nombre de synapses/CCI par point de
mesure de l'apex à la base. 12,5 à 15
en passant par le maximum à 23 à 4
kHz.(n=3cochlées).
Dans cette représentation, la fréquence
de codage (axe des abscisses en gris)
a été rajoutée à la position des points
de mesure (axe des abscisses en noir)
pour faciliter la lecture.
Figure 8: Exemple de reconstruction de synapses en 3D. Reconstruction en 3D par l'algorithme d'isolation et de reconstruction 3D. Les axes (x, y, z) sont orthonormés et exprimés µm. (en rouge, le volume du marquage de la densité de récepteurs et en vert celui du ruban synaptique).
Apex < 200 Hz Point 5 à 2kHz Point 8 à 8kHz Base à 32 kHz
12
l’apex à gauche à la base à droite). Le vert correspond au marquage du ruban synaptique et le rouge
au marquage de la densité de récepteurs. Les volumes sont représentés en semi-transparence pour
permettre la visualisation de la colocalisation. Ces représentations permettent d’estimer facilement le
volume du marquage du ruban synaptique et de la densité de récepteurs. Les volumes moyens sont
donnés dans le Tableau 1.
Le tableau 1 fait apparaître deux résultats intéressants : i) le volume du marquage du ruban
synaptique est toujours inférieur à celui de la densité de récepteurs (Student, p<0.05), ii) le volume du
marquage des éléments pré et post synaptiques augmente pour les cellules ciliées de l’apex vers la
base. Ce résultat soutient l’existence d’un gradient apex-base, les cellules ciliées internes de l’apex
seraient dotées de synapses plus petites alors qu’en revanche les synapses de la base seraient en
moyenne plus volumineuses.
Localisation Apex
f<200 Hz
Point de mesure 5 f=2 kHz
Point de mesure 8 f=8 kHz
Base f=32 kHz
Volume marquage ruban (µm3)
0.082 ± 0,007 0.167 ± 0,071 0.168 ± 0,069 0.172 ± 0,054
Volume marquage densité de récepteurs AMPA (µm3)
0.126 ± 0.052 0.264 ±0.129 0.281 ± 0.112 0.339 ± 0.109
Tableau 1 : Estimation des volumes des marquages pré et post-synaptique. Ce tableau indique les valeurs numériques correspondant aux points de mesure de la figure précédente (voir Fig. 8). Le volume du marquage du ruban synaptique semble toujours inférieur à celui de la densité de récepteurs AMPA. Pour exemple, à 32 kHz, le volume du marquage de la densité de récepteur est deux fois plus grand que le volume du marquage du ruban synaptique. Il semble également que le volume du marquage dépende de la position de la cellule ciliée interne le long de cochée. Plus la cellule ciliée interne est proche de la base, plus le volume du marquage des éléments pré et post-synaptiques augmente. Les moyennes sont exprimées moyenne +/- écart-type.
Figure 9: Histogramme de distribution des volumes pour le point de mesure 5. (A) Distribution du volume du marquage des rubans synaptiques. (n=106). Le volume moyen est de 0,1552 µm3
±0,077 (moyenne± écart-type). (B) Distribution du volume du marquage des densités de récepteurs AMPA. (n=106). Le volume moyen est de 0,2173 µm3 ±0,1299 (moyenne± écart-type). Pour ce point de mesure, 143 synapses ont été détectées mais seules 106 (73,6%) ont été retenues en raison des effets de bord et de la vérification manuelle post analyse.
13
Pour aller plus loin dans l’analyse morphologique des synapses, nous avons représenté dans
la Fig. 9 l’histogramme des volumes du marquage des rubans synaptiques (histogramme vert) et
l’histogramme des volumes du marquage de la densité de récepteur (histogramme rouge) du point de
mesure n°5 (zone codant pour le 2 kHz). L‘histogramme vert est caractérisé par un mode centré sur le
0,15 µm3 et une faible dispersion des valeurs par rapport à la valeur moyenne (Fig. 9A).
L’histogramme rouge est caractérisé par un mode centré sur 0,22 µm3 mais avec une dispersion des
valeurs 1,6 fois plus grande que pour l’histogramme vert (0,13 µm3 versus 0,08 µm3). Ce résultat
suggère que dans la zone de codage du 2 kHz, le volume des rubans synaptiques est plus petit que
celui de la densité de récepteur mais aussi plus homogène. Autrement dit, ce résultat laisse penser
qu’il existe une plus grande diversité volumique au niveau post que présynaptique (Fig. 9B).
Pour conclure cette étude, nous avons souhaité corréler le volume du marquage des éléments
pré et post-synaptiques en confocale avec la mesure directe faite en microscopie électronique par
(Meyer, Frank et al. 2009). Pour le point de mesure n°5, le rapport des volumes du ruban synaptique
est estimé à 11,02. Ce résultat indique qu’en microscopie confocale, le marquage du ruban synaptique
surestime approximativement d’un facteur 10 son volume exact. En supposant que la diffusion des
marqueurs est isotropique, la distance entre le centre du marquage du ruban synaptique et le centre
du marquage de la densité de récepteurs est de 183,3± 6,1 nm (moyenne +/- écart-type), soit 8,2 nm
(<5%) de moins que la valeur exacte estimée en microcopie électronique de 191,5 nm (voir Fig. 1).
Cette mesure de distance pourrait devenir un excellent indicateur anatomique de la synapse à ruban.
4. DISCUSSION
Les travaux de M. Charles Liberman menés initialement chez le chat (Liberman, 1980), ont
montré que l’innervation des cellules ciliées internes est constituée de 3 contingents de neurones
afférents : des neurones à seuil d’activation bas caractérisés par une activité spontanée supérieure à
18 potentiels d’action par seconde (HSR : high spontaneous rate), des neurones à seuil d’activation
moyen caractérisés par une activité spontanée intermédiaire comprise entre 0,5 et 18 potentiels
d’action par seconde (MSR : medium spontaneous rate), et des neurones à seuil d’activation haut
caractérisés par une activité spontanée inférieure à 0,5 potentiel d’action par seconde (LSR : low spike
rate). Cette classification a ensuite été confirmée chez d’autres espèces dont le guinea-pig (Brown,
Kujawa et al. 1998) et la gerbille (Schmiedt, Mills et al. 1990). Cette diversité neurofonctionnelle est à
l’origine de l’incroyable dynamique de codage de l’intensité acoustique permise par une cochlée de
mammifère (120 dB). Le rôle des neurones activés à forte intensité de stimulation (neurones LSR)
seraient aussi essentiel pour la détection des sons dans le bruit (Costalupes, Young et al. 1984). Sur le
plan anatomique, des travaux récents menés par le même groupe (Liberman, Wang et al. 2011)
semblent indiquer que les neurones HSR, MSR et LSR disposent d’une synapse à ruban
anatomiquement différente avec pour les HSR, des petits rubans synaptiques et des grosses densités
de récepteurs et pour les LSR, des gros rubans synaptiques et des petites densités de récepteurs.
L’objectif de ce travail était de développer une bibliothèque d’algorithmes d’analyse d’images
14
confocales dans le but de caractériser l’innervation des cellules ciliées internes. Cette bibliothèque,
testée et étalonnée préalablement sur données simulées, permet de déterminer : i) le nombre de
synapses à ruban par cellule, ii) le volume du marquage du ruban synaptique et de la densité de
récepteurs au glutamate, iii) la distance ruban synaptique/densité de récepteurs. L’estimation du
nombre de synapses est l’opération la plus délicate à mener car l’utilisateur doit choisir des seuils en
intensité dans le canal vert pour isoler les noyaux (2 seuils) et les rubans synaptiques (1 seuil) et dans
le canal rouge pour isoler les densités de récepteurs (1 seuil). L’utilisateur peut objectiver le choix des
seuils d’après les histogrammes d’intensité. L’intensité du canal rouge doit aussi être préalablement
ajustée à l’aide d’une correction gamma (amplification non-linéaire𝑦 = 𝑥𝛾) comprise entre 0,2 et 1 dans
cette étude. Les 3 résultats de cette étude sont discutés ci-dessous.
Nombre de synapses à ruban par cellule ciliée interne Dans cette étude, le nombre de synapses à ruban par cellule ciliée interne a été mesuré sur
trois cochlées de gerbille normo-entendante, de l’apex à la base, toutes les 70 cellules (voir Fig. 7).
Comme observé par l’équipe de Tobias Moser (Meyer, Frank et al. 2009), le nombre de synapses par
CCI fait clairement apparaitre une distribution en cloche (polynôme d’ordre 2), en fonction de la
fréquence de codage de la CCI, avec un maximum de 23 synapses par cellule à 4 kHz. La forme de
cette courbe correspond à l’audiogramme inversé (audiogramme en miroir) de la gerbille présenté en
Fig. 2A. En effet, on peut constater que la partie plate de l’audiogramme comportemental (1-16 kHz,
(Ryan 1976) de la gerbille correspond à la région de la cochlée dans laquelle l’innervation des cellules
ciliées interne est la plus dense. Cette correspondance, déjà mentionnée par Moser et ses
collaborateurs chez la gerbille, est également observée chez la souris (Meyer, Frank et al. 2009). Pour
renforcer l’estimation du nombre de synapses par cellule ciliée interne, il sera indispensable à l’avenir
de procéder à un marquage du cytoplasme des cellules ciliées internes à l’aide de l’anticorps myosine
7A. Ce triple marquage aura deux avantages : i) il permettra de séparer les rubans synaptiques
fonctionnels proches de la membrane plasmique des rubans synaptiques en cours de recyclage qui
flottent dans le cytoplasme (ces derniers représenteraient 5% de rubans synaptiques selon (Meyer,
Frank et al. 2009). ii) il permettra d’associer avec certitude chaque synapse à sa cellule ciliée interne
d’origine. En absence de triple marquage dans cette étude, nous avons associé chaque synapse à la
cellule ciliée interne la plus proche ce qui semble être, a posteriori, un choix acceptable puisque nos
résultats sont parfaitement corrélés avec ceux du groupe de Tobias Moser.
Volume des éléments pré et post-synaptiques Dans cette étude, un soin tout particulier a été accordé à la caractérisation des éléments pré
(ruban synaptique) et postsynaptique (densité de récepteurs) qui constituent une synapse à ruban
« complète ».. Cette investigation fait suite à l’article publié récemment par le groupe de M. Charles
Liberman (Liberman, Wang et al. 2011). La Fig.8 montre un gradient croissant du volume du
marquage des rubans synaptiques et du volume de la densité de récepteurs de l’apex vers la base. Ce
résultat est surprenant au vu de l’hypothèse du groupe de Liberman puisque l’évolution du volume des
éléments pré et post-synaptiques devrait se faire en sens inverse.
Ce résultat est d’autant plus étonnant que les enregistrements unitaires réalisés chez la gerbille
15
((Schmiedt, Mills et al. 1990); (Ohlemiller and Echteler 1990) ; (Muller 1996)) montrent que la
proportion de neurones HSR diminue de l’apex à la base ce qui laissait penser, en respect de
l’hypothèse de Liberman, que le volume du marquage pré-synaptique devait en effet augmenter de
l’apex à la base mais pas celui du marquage de la densité de récepteurs. Cette discordance nous
mène à penser que l’hypothèse du groupe de Liberman est peut-être vraie mais que la technique du
confocale n’est peut-être pas la plus adaptée pour la démontrer. Il serait sans doute plus pertinent
d’utiliser la technique STED qui offre une meilleure résolution (150 nm en z ; (Meyer, Frank et al.
2009)) ou la microscopie électronique 3D.
La distance ruban synaptique/densité de récepteurs
Dans ce travail, nous avons montré que l’imagerie confocale surestime approximativement le
volume du ruban synaptique d’un facteur 11. En revanche, le calcul de la distance qui sépare le centre
du marquage du ruban synaptique du centre du marquage de la densité de récepteurs est très fiable
(erreur relative inférieure à 5% par rapport à la mesure directe en microscopie électronique). Ce critère
pourrait donc devenir pertinent dans le contexte de la classification des neurones selon la morphologie
de leur synapse.
En conclusion, ce travail a montré qu’il était possible d’estimer de façon fiable, à partir
d’images confocales en double marquage (anti-CtPB2 et anti-GluR2/3), le nombre de synapses à
ruban par cellule ciliée interne. Le critère fondé sur le volume des éléments pré et post-synaptique
proposé par le groupe de Liberman ne semble pas robuste chez la gerbille car le marquage surestime
largement le volume de la structure cible (> à un facteur 11 pour le ruban synaptique et sans doute
davantage pour la densité de récepteurs). Nous avons toutefois mis au point un indicateur de distance
qui pourrait permettre de classifier les neurones selon la distance ruban synaptique/densité de
récepteur de leur synapse. La bibliothèque de fonctions développée pendant ce stage permettra à
terme d’étudier l’impact du traumatisme acoustique sur l’innervation des cellules ciliées interne. Il a en
effet été montré qu’un trauma réversible entraine une désafférentation de plus de à 50% des synapses
sans effet sur le seuil audiométrique tonale. L’équipe pourra ainsi étudier plus précisément le type de
neurones préférentiellement atteint par le traumatisme sonore. Il est probable qu’il s’agisse du
contingent des neurones à haut seuil (neurones LSR).
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