Interactions entre acides aminés et acides nucléiques. III — Etude par absorption et résonance magnétique nucléaire de la formation de complexes entre le tryptophane et les

BIOCHIMIE, 1971, 53, 331-345.

Interactions entre acides aminds et acides nucldiques. III - - Etude par absorption et rdsonance magndtique nucldaire

de la formation de complexes entre le tryptophane et les constituants des acides nucldiques (*),

par Jean-Luc DIMICOLI et Claude H~Ll~NE

avec la col laborat ion de Franc ine BRUNet Annie MILLET. C.N.R.S., Centre de Biophysique Mol~culaire, 45- Orleans 02.

(19-4-1971)

Summary. - - Absorption and proton magnetic resonance studies show that tryptophan (and other indole derivatives) can form molecular complexes with bases, nucleosides or uucleotides in aqueous solutions. In most cases these complexes have a I : 1 stoichiometry and absorb at longer wavelengths than the two components. This new absorption is ascribed to electron transfer from the indole ring of tryptophan to the purine or the pyrimidine ring of the nucleic acid component. Pyrimidines are found to be better electron acceptors than purines and protonatcd derivatives better acceptors than the corresponding unprotonated species. The upfield shifts of the purine and pyrimidine protons due to complex formation with tryptophan indicate that the aromatic rings are stacked parallel to each other in the complex.

Apparent association constants as well as enthalpy and entropy variations have been determined from both absorhauce and proton magnetic resonance measure- ments. Values obtained under different experimental conditions are dicussed with respect to self-association of tryptophan molecules and contribution from complexes of different stoichiometries. The results obtained in fluid solutions are com- pared to those previously obtained in aggregates formed in frozen aqueous mixtures.

INTRODUCTION.

La reconnaissance s61ective d 'un acide nucl6i- que par une enzyme ou une prot6ine est indis- pensable h diff6rentes 6tapes de 1'expression du g6n6me cellulaire [1]. La par t ie interagissante de l 'acide nucl6ique peut dire reconnue soit parce qu'elle poss~de une stru~cture part ieul i6re, soit parce qu' i l existe des in teract ions sp6cifiques entre certains r6sidus acides amin6s de 1'enzyme et les bases de l 'acide nucl6ique. L 'exis tence de forces d 'or igine 61ectrostatique entre group ements ionis6s des deux mol6cules (par exemple, entre groupes phosphate et acides amin6s basiques) a 6t6 d6montr6e [2, 3]. Un certain nombre d'6tudes ont 6t6 consacr6es aux in teract ions entre polypep- tides et acides nucl6iques [4, 5], entre polypep- tides basiques e,t mononuel6ot ides [6, 7] et entre polynucl6otides et acides amin6s basiques [8J. Bien qu 'une sp6cificit6 Lit pu 6tre raise en 6vi- dence dans un certain nombre de cas (par exem- pie entre polylysine et acides nuel6iques r iches en A-T) [4, 5], l 'or igine de cette sp6cificit6 n'a pu

(*) Pour les parties I et II voir rSf6rences [9] et [10].

~tre 61ucid6e. Une approehe possible de ee pro- bl6me r6side dans l '6tude des in terac t ions entre monom6res (acides anlin6s et leurs d6riv6s, bases, nucl6osides et nucl6otides). La mise en 6vidence de complexes entre ces monom6res et la d6termi- nation de leur structure peut fournir des informa- tions sur l 'o r ig ine et la nature des in terac t ions au niveau des macromol6cules. La d6terminat ion du r61e de la s t ructure des polym6res dans la formation des complexes entre monom6res et poly- m6res consti tue 6galenlent une 6tape n6cessaire dans la compr6hension de la s61ectivit6 des interactions entre enzymes et acides nucl6iques. En outre, l '6tude des in teract ions monom6res-mono- m~res et monom~res-polym~res peut permet t re de contr ibuer h 6,clairer l 'or igine du code g6n6tique.

Dans une 6tude pr6cddente [9, 10], nous avons montr6 que le t ryp tophane et les nucl~osides interagissaient en solution aqueuse congel6e. La cong61ation d 'une solution aqueuse s 'accompagne de la format ion d'agr6gats des molecules du solut6 accumul6cs au cours de la cr is tal l isat ion de la glace [11, 12]. Lorsque la solution aqueuse con- t ient deux types de solut6s, la format ion d'agr~-

23

332 J e a n - L u c Dimico l i et Claude H~l~ne.

gats mixtes peut permettre la raise en 6vidence d ' in teract ions non d6tectables en mil ieu fluide en solution dilu6e [9, 12~. C'est ainsi que l 'on peut 6tudier par fluorescence et absorpt ion la forma- t ion de complexes entre le t ryptophane et les nucl6osides obtenus par cong61ation de solutions aqueuses relat ivement dilu6es (10 -3 M) [9, 10~. Cette 6rude ne perlnet cependant pas d 'avoir accbs aux param6tres thermodynamiques caract6- r isant l '6quil ibre de formation des complexes L 'augmentat ion des concentra t ions en solution aqueuse devrait favoriser la formation des complexes (la cong61ation n '6tant en d6finitive qu 'un moyen d 'accroitre art if iciel lement les concentra- t ions locales des deux solut6s). Nous d6crivons ici nne 6rude par absorpt ion et par r6sonance magn6- tique nucl6aire de la formation de complexes entre le t ryptophane (et autres d6riv6s ~ noyau indolique) et les const i tuants des acides nucl6i- ques (bases, nucl6osides et nucl6otides). Les deux m6thodes permettent de d6terminer les constantes d '6quil ibre ainsi que les enthalpies et entropies de r6action. En outre, les modifications des d6place- ments chimiques des diff6rents protons de deux mol6cules permettent de pr6ciser 1cur posi t ion relative dans le complexe et de proposer une structure st6r6ochimique des complexes. Les complexes form6s par les d6riv6s h noyau indole et les const i tuants des acides nucl6iques sont carac- t6ris6s par une nouvelle bande d 'absorpt ion r6- sultant d 'un transfert de charge du noyau indole (donneur) verb le noyau pur ique ou pyr imid ique (accepteur). Les mesures de r6sonance magn6tique nucl6aire permettent de mont re r que les noyaux aromatiques des deux par tenaires dans le complexe sont situ6s darts des plans parallbles et que leur interact ion est h l 'or igine de la formation des complexes. Le rSle des interact ions 61ectrosta- l iqnes entre substi tuants ionis6s est 6galement d6- crit.

METHODES EXPERIMENTAI,ES.

Les compos6s utilis6s au cours de cette 6tude prov iennent de California Corporat ion for Bio- chemical Research.

Absorption :

Les spectres d 'absorpt ion ont 06 enregistr6s h l 'aide d 'un spectrophotomOre Cary 14. Pour met- ire en 6vidence la formation des complexes, des cellules tandem ont 6t6 utilis6es : lorsque les solu- t ions des deux r6actifs sont dans les deux compar- t iments de la cellule, on enregistre la somme de leurs spec t res ; apr6s m61ange, on obtient un spectre qui est la superposi t ion des spectres du

complexe et des deux composants non engag6s dans le complexe. La d6terminat ion des constantes d 'association a 6t6 faite en di luant une soultion contenant le corps B en grand exc6s (g6n6ralement 0,05 M) et le corps A en faible concentrat ion (g6n6ralement 0,005 M). La dilution est effectu6e avec une solution du corps A h la m6me concentrat ion. L'analyse des r6sultats a 6t6 faite suivant les mdthodes propos6es par BENEsI-HILDE- BRAND [13], SCATCHARD [14] et FOSTER et al. [15] (voir paragraphe r6sultats).

Les spectres d 'absorpt ion en fonction de la tem- p6rature ont 6t6 enregistr6s avec un spectrophoto- mbtre Perkin-Elmer modble 402. La densit6 op- tique .~ une longueur d 'onde d6termin6e peut 6tre enregistr6e Bur un enregistreur XY dont l 'entr6e X est directement reli6e au thermocouple plongeant darts la cellule.

R~sonance magndtique nucl~aire (RMN) :

Les spectres de RMN ont 6t6 enregistr6s avec un spectrom6tre Briicker HFX 90 Mhz. Quand cel a 6tait n6cessaire, les spectres 6taient accumuI6s sur un calculateur Fabr i teck 1 072 pour am61iorer le rapport signal sur bruit .

Toutes les mesures ont 6t6 faites par rappor t une r6f6rence externe. En effet, il n 'a pas 6t6 trou- v6 de r6f6rence in terne inerte en pr6sence d 'une grande concentra t ion de mol6cules du type tryptophane en solution aqueuse. Ceci confirme l'existence d ' in teract ions hydrophobes entre les parties non polaires des compos6s aromatiques en solu- t ion aqueuse et les chaines satur6es de solut6s tels que les alcools, amines, etc... [16, 17].

L'emploi d 'une r6f6rence externe n6cessite 1'es- t imation de la correction de susceptibil i l6 magn6- tique. Cette est imation a 6t6 faite ~ par t i r de la lot d 'addit ivit6 de WmDEMANN sur les susceptibilit6s massiques des solutions et de la lot [18J sur la correct ion de susceptibilit6 magn6tique. Les sus- ceptibilit6s des solut6s utilis6s sont celles publie'es, ou, si celles-ci ne sont pas report6es, ont 6t6 cal- cul6es h par t i r des co nstantes de PASCAL. Les den- sit6s des solutions ont 6t6 mesur6es par pycno- m6trie.

On a done : 5 r6el = 5 obs - - A (Xso 1 - - Xr~f.)

O6 : 8 r6el est le d6placement r6el, obs le d6placement observ6,

A un factenr g6omOrique d6pendant du capil laire utilis6,

X~o ~ est la susceptibilit6 volumique de la solution,

Xr~ f e s t la susceptibilit6 volumique de la r6f6rence.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

Complexes du t r y p t o p h a n e avec les acides nucldiques . 333

La m 6 t h o d e u t i l i s6e p o u r 6 t u d i e r les c o m p l e x e s n6cess i te de m e s u r e r les v a r i a t i o n s des d6p l ace - merits c h i m i q u e s des p r o t o n s de la mo l6cu l e A en p r 6 s e n c e d ' u n g r a n d exc6s de m o l 6 c u l e B. Si X~ est la s u s c e p t i b i l i t 6 v o l n m i q u e de la s o l u t i o n di - lu6e de A e t X 2 cel le de la s o l u t i o n c o n c c n t r 6 e de B, les d 6 p l a c e m e n t s r6e ls s e r o n t r e s p e c t i v e - merit 6~ et 62 a v e c :

51 = 6o~ - - A (X I - - X,¢f.)

~.~ = ~o~ - - A (X 2 - - Xr¢~)

e t l a v a r i a t i o n r 6 e l l e : ~ 2 - - 5 1 = 5ob~ ~ - -~o~ - - A (X 2 - - X~). L ' 6 v a l u a t i o n du t e r m e A (X 2 - - X~) p o u r des c o n c e n t r a t i o n s de c o r p s en excbs inf6- r i e u r ~ 5.10-~ M, g r a c e ~ la m 6 t h o d e e x p o s @ ci- dessus m o n t r e que ce t e r m e est i n f 6 r i e u r ~ 1 Hz et d6c ro i t 6 v i d e m m e n t avec la c o n c e n t r a t i o n d u co rps en excbs. P o u r des d 6 p l a c e m e n t s m a x i m u m obse rv6s s u p 6 r i e u r s h q u e l q u e s d i z a i n e s de h e r t z , la c o r r e c t i o n de s u s c e p t i b i l i t 6 m a g n 6 t i q u e est doric du m 6 m e o r d r e de g r a n d e u r que l ' e r r e u r c o m m i s e su r la m e s u r e des d 6 p l a c e m e n t s .

La t e m p 6 r a t u r e a 6t6 d 6 t e r m i n 6 e g r a c e ~ la m e s u r e de l ' 6ca r t e n t r e la r 6 s o n a n c e des p r o t o n s des g r o u p e m e n t s C H 2 et OH de l ' 6 t h y l b n e - g l y c o l ou e n t r e ce l le des g r o u p e m e n t s GH:~ et OH d u m6- thano l . I , ' 6 t a l o n n a g e de VAN-GEET [ 1 9 ] a 6t6 u t i - ]is6.

E n m i l i e u ac ide , les m e s u r e s ou t 6t6 f a i t e s en u t i l i s a n t so i t les mo la l i t 6 s soi t les m o l a r i t 6 s des compos6s 6 tudi6s . Les m o l a r i t 6 s ou t 6t6 m e s u r 6 e s p a r a b s o r p t i o n n l t r a v i o l e t t e ou r e c a l c u l 6 e s ~ p a r - t i r des m o l a l i t 6 s et des m e s u r e s de dens i t6 des so lu t ions . L ' a c c o r d e n t r e les d e u x m 6 t h o d e s est en g6n6 ra l b o n : 1 '6car t ne d6pas s e j a m a i s 2 p. 100 qui est de l ' o r d r e de la p r 6 c i s i o n des m e s u r e s de c o n c e n t r a t i o n s 61ev6es au Cary . Seule l ' a d 6 n o s i n e s e m b l e ne pa s d o n n e r de b o n s r6su l t a t s , ce qu i t e n d r a i t h p r o u v e r que l ' a d 6 n o s i n e c o m m e r c i a l e u t i l i s6e est h y d r a t 6 e .

E n m i l i e u n e u t r e , le p H d6s i r6 es t o b t e n u p a r a d j o n c t i o n s s u c c e s s i v e s de I)C1 ou de NaOD. Le pH est m e s u r 6 g rhce ~ u n e 61ec t rode m i x t e SOLEA. L a c o r r e c t i o n c l a s s i q u e p D = p H + 0,4 a 6t6 s y s t 6 m . a i i q u e m e n t n t i l i s6e [20]. La f o r c e i o n i q u e es t m a i n t e n u e c o n s t a n t e grfice h u n e quar t - t i t6 suffisan.te de NAG1. D,ans le m o d e o p 6 r a t o i r e ut i l i s6 , l'6tu~de des d i v e r s sy s tbmes a 6t6 f a i t e en f o n c t i o n des mo.l, a r i t6s m e s u r 6 e s d i r e c t e m e n t p a r spec t ropho tom6t r i~e d ' a b s o r p t i o n .

E n m i l i e u ac ide , t o u t e s les s o l u t i o n s son t f a i t e s h p a r t i r d ' u n e s o l u t i o n m b r e d i lu6e du c o m p o s 6 A u t i l i s6e p o u r d i s s o u d r e des q u a n t i t 6 s c r o i s s a n t e s

d u c o m p o s 6 B. Si l ' on t r a v a i l l e h c o n c e n t r a t i o n de A s u f f i s a i n m e n t fa ib le , les effets de v a r i a t i o n de la c o n c e n t r a t i o n de A dfl at] v o l u m e du solut6 B ne p e r t u r b e n t p a s les m e s u r e s .

E n m i l i e u n e n t r e , u n e s o l u t i o n m~re du c o r p s A en d6 fau t es t u t i l i s6e h la fois p o u r d i s s o u d r e u n e q u a n t i t 6 d o n n 6 e du c o r p s B cn exc6s et p o u r d i l u e r ce t tc d e u x i b m e s o l u t i o n h des c o n c e n t r a - t i o n s de p lu s en p lu s f a ib les d o n s la l i l n i t e de ]a c o n d i t i o n [B]o > 10 [A]o ou [B] o e t tAt o s o n t les c o n c e n t r a t i o n s to ta l e s r e s p e c t i v e m e n t de B e t A. Les r6su l t a t s d o n n 6 s en m i l i e u n e u t r e son t c eux o b t e n u s p o u r des c o n c e n t r a t i o n s en A sn f f i sam- m e n t fo ib les p o u r l i m i t e r au m a x i m u m les effets d ' a u t o a s s o c i a t i o n de A t r6s i m p o r t a n t s en sohl- t i on a q u e u s e n e u t r e p o u r les n u c l 6 o s i d e s et les n u c l 6 o t i d e s [211.

RI~SULTATS.

1) Mise en ~oidence de la formation tie complexes intermol~culaires entre d~rioks it noyaux indoliques el constituants des acides nucl~iques.

La f o r m a t i o n de c o m p l e x e s i n l e r m o l 6 c u l a i r e s en s o l u t i o n s a q u e u s e s c o n c e n t r 6 c s p e u t 6 t r e d 6 m o n - t r6e p a r a b s o r p t i o n et r 6 s o n a n c e n ] a g n 6 t i q u e nu- c l6a i r e (RMN). E n m i l i e u ac ide (HC1 1 N ou 0,1 N), les m61anges de t r y p t o p h a n e (0,25 M) et des nu - c l6os ides (0,0~1 M) a b s o r b e n t "A des l o n g u e u r s

' 1 ~ ® ~1~ @ ....... T ~ r ~ h a n < [ ! ....... a t ,de ,mdole acehquelA.A

0 ,4 ( _ : ' ~uenos ,ne I

i ~L pH 7

O2

\

J , , J , b r - t , - ' ~ " ' ~ -~ ' r ~ , ~ . , 350 400 k(rcn) 450 330 350 370A(nm}

FIG. 1. - - a ) Spectres d ' absorp t ion (1 = 1 c m ) dans HC1 1N du t ryp tophane seul h une concentra t ion de 0,25 M (...) et des m61anges de t ryp tophane 0,25 M avee les nucl6osides su ivants h la concent ra t ion de 0,01 M : cytidine ( ), ad6nosine ( - - - - - - ) et guanosine ( - - . - - ) . Les spectres d 'absorp t ion des nuel6osides seuls (0,01 M) ne sont pas repr6sent6s mats se s i tuent h plus courtes longueurs d 'onde que celui du t rypto- phone 0,1 M. l l a dt~ tenu compte de l ' absorp t ion r4si- duelle du t ryp tophane ~t grandes longueurs d 'onde dons le calcul des constantes d 'associat ions.

b) Spectres d ' absorp t ion (1 = 1 cm) de solut ions aqueuses h pH 7 (cacodylate de sodium 1 M) d'acide indole acdtique 0,1 M (...) et des m61anges d'acide indole ae6tique 0,1 M avec la t hymid ine ( - - . - - ) , l 'u r id ine ( - - - - - - ) et la cyt idine ( ) h des concentra t ions de 0,02 M.

BIOCHIM1E, 1971, 53, n ° 3.

334 Jean-Luc Dimicoli et Claude H~l~ne.

d 'onde plus grandes que les deux mol6cules s6pa- r6es (figure la ) . En mil ieu neutre (cacodyla te de sodium 1 M h pH 7), des r6sultats analogues sont obtenus pour les m61anges d ' ac ide indole ac6tique et de nucl6osides p y r i m i d i q u e s (figure lb ) . Les spect res d ' absorp t ion des m61anges d ' ac ide indole ac6tique et de nucl6osides pur iques sont pra t ique- merit la superpos i t ion des spectres des deux composants s6par6s.

En R,MN, les r6sonances des pro tons des noyaux pur iques et py r imid iques sont d6plac6es vers les hauts champs quand on ajoute du t r y p t o p h a n e en

R'ff~rence Ezttr~t HMS Tem#rature 20+05"C 510-'MTrlpto~haaeDCI1N GainBF~ ~ / ~ " " - - . i,..,.~,/, . . . . . . .

S.IO"M Trlptophane DCI 1N Gain BF 80 H=~J Gain BF "5

~',vo,,e*,~'~ ',''J;'+'~'~'~'/'~+'' ~ ' ~'~ ~' 2.10~M hd~,osi,~ DCIIN 6~i, BFSO

Fro. 2a.

R~f~rence etter~ ~ S01uti0nsda~sD:0 IM NaG pO:7.9_+0J , ,

Tern~ra~re 24+0,5"C

1,11o ~ M AciSe 3i,d@-ac~tiqt~ Gain BF 20 " 7 / " ' ' " ~' "

])IO"M Ac~e 3indolyl-ac~tiq~e ;; Gain BF 20 IO~M 5N~P Gain BF80 ii

i i

I I-

~..,:~-,,G" ,,,,,e~!e,,~'~,4 , t . ~ , t ' , ~ ~ ~ ~-~ !O 'M 5AMP Gain BFSO

He, H 2

" k t ' L L L

ppmJ9 | " 18 . . . . '

Fro. 25.

Fro. 2. - - Spect res de rdsonance m a g n 6 t i q u e n u c l 6 a i r e m o n t r a n t le d 6 p l a c e m e n t des r a i e s de r6 sonance des p r o t o n s Hs et Hs de l ' a d ~ n o s i n e ou de I 'AMP en pr6- sence de t r y p t o p h a n e ou d ' ac ide i n d o l e ac6t iqne .

a) darts DC1 1 N. 1 - - T r y p t o p h a n e 0,5 M. 2 - - Addnos ine 0,02 M + T r y p t o p h a n e 0,5 M. 3 - - Addnos ine 0,02 M.

b) en m i l i e u n e u t r e pD = 7,9. 1 - - Acide i ndo l e acd t ique 0,11 M. 2 - - Aeide i n d o l e ac~ t ique 0,11 M + AMP 0,01 M. 3 - - AMP 0,01 M.

mil ieu acide ou de l ' ac ide indole ac6tique en mi- l ieu neutre (figure 2). Les d6placements observ6s sont diff6rents pour les diff6rents p ro tons d 'une

m6me mol6cule. Alors que la format ion de coin- plexes entre l ' ac ide indole ac6tique et les nucl6o- sides pur iques h pH 7 ne peut pas 6tre raise en 6vidence p a r absorp t ion (voir ci-dessus), cette format ion est n6anmoins d6montr6e p a r RM, N.

Darts routes les mesures d6cri tes ci-dessus, le nucl6oside est en faible concent ra t ion pa r r appor t au d6riv6 h noyau indol ique. Pour permet t re ces mesures, le t r y p t o p h a n e n 'est suffisamment soluble qu'en mi l ieu acide. En mi l ieu neutre, la solubilit6 de l ' ac ide indole ac6tique est suffisante pour at- t e indre des concent ra t ions de 0,5 M pour des valeurs du pH voisines de 7. La solubil i t6 de la t ryp tamine est 6galement suffisante pour effectuer des mesures ~ pH < 6. Pour les mesures d 'absorp- t ion en mi l ieu neutre, le nucl6oside py r imid ique peut 6t re utilis6 h forte concent ra t ion (0,1 M) et le t r y p t o p h a n e i~ concent ra t ion plus faible (0,01 M). Cela n 'est pas possible en RMN car les effets de courants annula i res des noyaux pyr imi - diques sont faibles [23I (voir ci-dessous). E n mi- l ieu acide, les nucl6osides sont tr6s solubles et peuvent 6tre util is6s en exc6s pour effectuer les mesures en absorp t ion et en RMN. Darts ce der- n ier cas, on observe que los pro tons du d6riv6 noyau indole subissent 6galement un d6placement vers les hauts champs.

2) Rdle du pH.

Comme nous l 'avons d6jh montr6 dans le paragraphe pr6c6dent , les r6sultats obtenus /t pH 1 different de ceux obteuus h pH 7. Les deux mol6- cules engag6es darts les complexes (nucl6oside et d6riv6 h noyau indol ique) poss6dent des groupe- merits ionisables. Pour pr6c ise r le r61e respect i f de ces diff6rents groupements dans les propri6t6s des complexes, l ' absorp t ion caract6r is t ique du complexe ou les d6placements chimiques des protons out 6t6 6tudi6s en fonct ion du pH. La figure 3 donne, p a r exemple, les var ia t ions de l ' absorpt ion h 2 longueurs d 'onde des m61anges cyt id ine- t ryptophane. Une p remibre var ia t ion impor tan te de l ' abso rp t ion a l ieu pour des valeurs du pH voisines du pK du noyau p y r i m i d i q u e (pK _~ 4,2 pour la cy t id ine) . Une seconde var ia t ion a lieu pour des valeurs du pH voisines du pK du groupement ca rboxyle du t r yp tophane (pK ~ 2,4). Cette seconde var ia t ion n 'est pas observ6e si le t r y p t o p h a n e est remplac6 p a r la t ryp tamine , mo- 16cule darts laquelle seul le groupement NH3+ est main tenu (pK _ 9,4). Une 6tude analogue avec l ' ad6nos ine au l ieu de la cy t id ine mont re que la nouvelle absorp t ion h grandes lougueurs d 'onde observ6e en mil ieu ac ide (.figure l a ) n ' a p p a r a l t que lorsque le noyau pur ique a fix6 un proton.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

Complexes du tryptophane avec les acides nuclEiques. 335

Dans le cas des m61anges t ryptophane-ad6nine, on observe un d6placement supp16mentaire du spectre d 'absorpt ion du complexe vers ]es grandes longueurs d 'onde en mi l ieu trbs acide (HC1 2 M) (figure 4a). Get effet cor respond h une deuxibme protonation du noyau pur ique qui peut Ore raise en 6vidence par RMN (figure 4b). La r6sonance des protons de l 'ad6nine se d6place vers les bus champs quand ]a concentra t ion en HC1 augmente de 0,1 h 4 .M. Ce ph6nom6ne est 6galement ob- serv6 avec l 'ad6nosine bien que des concentra- tions plus 61ev6es en acide soient n6cessaires. La premi6re protonat ion de ] 'ad6nine (pK = 4,2) et

0,3 a - -m~ a " xx "o k (e)(A) X = 350 nrr~ \ \ xA

4\ 0.2 :~ e - - o - _ o . • \

0.1 ~k~

FIG. 3. - - Variations avee ]e pH de l'absorption des complexes tryptophane-cytidine ( - ) et tryptamine ( ---- ) h deux longueurs d'onde (340 et 350 nm).

Concentration en cytidine : 2,3 × 10-2 M. La force ionique est gard6e constante (NaC1 1 M).

Concentration en tryptophane ou tryptamine = 1,15 × 10-2 M.

de l 'ad6nosine (pK ~ 3,45) se produi t sur N 1 (bien que la charge posi t ive soit r6part ie sur tout le cycle purique). Duns les deux cas (ad6nine et ad6nosine), le proton fix6 en C s se d6place beaucoup plus que celui fix6 en C~ au cours de ]a deuxibme protonat ion. Ceci indique que le deuxibme proton se fixe vra isemblablement en N 7 ( o u e n N 0 pour l 'ad6nine si 1'on admet que cette mol6cule existe en solution sous la forme tauto- m6re NTH ). L 'ampl i tude des d6placements montre que cette deuxibme charge posi t ive est probable- ment tr~s localis6e. Les d6placements des r6so- nances des protons de l 'ad6nine et de l 'ad6nosine en fonction du pH peuvent 6tre analys6s pour eal- culer les valeurs du pK des ionisat ions correspondantes que Yon peut sch6matiser pa r l '6qui l ibre suivant :

K A H ~ -< -~ AH + + H + (1)

Si la concentra t ion en ions H + est trbs sup6rieure /t la concentra t ion totale en ad6nine, les d6place- ments chimiques 5AH~+ et bAH + sont ]i6s par ]a

relat ion :

8 -- 8An + - K - : (8 - ~An~÷ ) (2)

[H ~]

Si l 'on pose A5 : 8 - - 8An + eL A6 + : 8 A H ~ + - - 8 A I I +,

]a relat ion (2) s '6crit sous la forme :

A8 - - K : ( A s - - .x~ +) (3)

[H +]

Les r6sultats exp6rimentaux v6rifient l '6quation (3) (figure 4b) en prenant pour ]es concentra t ions [H÷], les valeurs H o de la fonetion d 'acidit6 de

~{AMMF.T [ Z 2 ] . Les valeurs du pK calcul6es sont - - 0 , 32 , - - 1 , 2 et - - 0 , 8 8 pour ] 'ad6nine, ] 'addnosine e t l a guanine.

0.4

<

O3

\ \ \ Try ( ~ H o = l \ \ \ M 61onge ( ~ H o =_0,2 \ ~ M ~ lange

• H 0 : _0,68

J i I ~ i i

( ~ Ad6nine 4,8x10-3r',4 (Ho=.q21

( ~ Tryptophane0,13M (Ho=_0,2]

, t i { { 300 350 460 A (rim) 450

9 0 0 ~ ~ .~ - -

°~o__ ~ ,0 \ © ~ . . ~ n i n e O,01M \

H~o (H=) ~\ pK=-_O~2

~ 20 vo

o

~ J - . £ - - - .L. 1 0 1 Ho 2

Fro. 4. - - a) Absorpt ion des m~]anges t ryptophane (0,13 M) et adenine (4,8 × 10-3 M) en solut ions aqueuses acides de constantes d'acidi t6 Ho ~gales h 1, - - 0 ,2 et - - 0,68.

b) D6placements des signaux de r6sonance des protons H_~ et Ha de l'addnine en fonction de la constante d'acidit6 Ho.

c) Analyse des r6sultats de la figure 4b suivant l'dquation (3), (voir texte).

3) Stoechiomdtrie des complexes.

Duns le p remie r paragraphe, nous avons montr6 que la formation de complexes entre ]es compos6s poss6dant ]e noyau indole et les nucl6osides s'ae-

BIOCHIM1E, 1971, 53, n ° 3.

336 Jean-Lue Dimicoli et Claude Hdl~ne.

c o m p a g n e de l ' a p p a r i t i o n d ' une nouve l l e abso rp - t ion et d 'une mod i f i c a t i on des d6p lacemen t s chi- ln iques des p ro tons des deux mol6cules . La m6- rhode des v a r i a t i o n s con t inues [24] peu t 6tre uti- lis6e p o u r d 6 t e r m i n e r la s t oech iom6t r i e des com- p lexes soit en abso rp t i on soit en t M N . La s o m m e des c o n c e n t r a t i o n s [A] o e t [B] o des deux const i - tuan ts A et B du c o m p l e x e est gard6e cons t an te

[A]o et le r a p p o r t r -- va r i e de 0 fi 1. Si

[A]o + [B]o le c o m p l e x e form6 a p o u r s t oech iom6t r i e 1:1, sa c o n c e n t r a t i o n est r e s p e c t i v e m e n t donn6e en abso rp t i on et en RMN pa r les r e l a t ions :

D lAB] (4)

e x i A8 [A] o

[AB] = - (5) ASaB

off D est la densi t6 op t ique du c o m p l e x e dans une cel lu le de t ra je t o p t i q u e 1 cm, fi nne l o n g u e u r d ' o n d e ~, off son coef f ic ien t & e x t i n c t i o n est s.

A8 = 8 - - 8 A et A6Au = 8A~ - - 5 A off 8, 5A, 6A~ r ep r6sen t en t r e s p e c t i v e m e n t les d6p l acemen t s chi- lu iques d ' un p r o t o n p o u r la mol6cu le A darts le m~lange, p o u r la mol6cule A isol6e et p o u r la mo- 16cule A engag6e dans le complexe .

4

...... , . , / - - \ ...... [ ® ......

I ! , I / . . - . . . . . - . \ \ \ .-°

/ / ( / " " : \ ,

05

/ . . ~o\ .....

2 ~ f ° - - ° \

Fro. 5. - - Courbes de Job pour les mdlanges t ryptophane -ad6nos iue ( a e t e) et t ryp tophane -cy t id ine (b et d). Concentration totale dgale ~t 0,3 M dans HCI 1 M). Rdsultats obtenus par absorption ( a e t b) et par RMN (c et d). Voir texte et dquations (4) et (5).

S'il ne se f o r m e q u e des c o m p l e x e s 1:1, les

e o u r b e s o b t e n u e s en p o r t a n t D ou A5 × [A] o en

f o n c t i o n de r p a s s e r o n t p a r u n m a x i m u m p o u r

r - - 0,5 et s e r o n t s y m 6 t r i q u e s .

E n n f i l i eu n e u t r e , les c o u r b e s o b t e n u e s o u t ef-

f . ec t ivemen t l e u r m a x i m u m p o u r r = 0,5 et s o n t

sym6t r iques quel le que soi t la c o n c e n t r a t i o n totale uti l is~e (*). Des r6sul ta ts i d e n t i q u e s sont obtenus en nf i l ieu ac ide sauf darts le cas des m61anges t r y p t o p h a n e - a d 6 n o s i n e p o u r lesquels on observe for te c o n c e n t r a t i o n une d i s sym6t r i e impor t an t e (figure 5).

S ' i l se f o r m e u n i q u e m e n t des c o m p l e x e s 1:1 en t re deux mol6cules A et B, les d i f f6rents protons de la mol6cu le A, p a r exemple , s u b i r o n t des d6p lacemen t s p r o p o r t i o n n e l s q u a n d la concen t ra - t ion en mol6cules B a u g m e n t e r a . En m i l i e u acide, la f igure 6 n lon t re que les d6p lacemen t s subis pa r les p r o t o n s de la c y t i d i n e p o u r d i f f6rentes concen- t r a t ions en t r y p t o p h a n e sont p r o p o r t i o n n e l s . Ce n 'es t pas le cas p o u r I t s m61anges des bases ou nuc l6os ides p u r i q u e s avec I t t r y p t o p h a n e (figure 6).

c %

I I I I I 0.1 03 ~ryptop~ne] 0.5

Fro. 6. - - Var ia t ions des r a p p o r t s des ddplaeements eh imiques des p r o tons H~ et He de la eyt idine et des p r o tons H2 et Ha de l 'ad6nosine, en fonet ion de la con- een t ra t ion en t r y p t o p h a n e en mi l ieu aeide (DCI 1 M),

En mi l i eu neut re , les d6p lacemen t s observ6s sont p r o p o r t i o n n e l s (aux e r r eu r s d ' exp6 r i ences pr6s) darts I t s cas su ivan t s h 20°C : UMP ou AMP + ac ide i ndo le ac6 t ique ~ fo rce i o n i q u e I = 1 ; AMP ou ad6nos ine + t r yp t an f ine ~ pD = 5.

Darts p lus ieurs cas (u r id ine + ac ide indo le ac~tique, AMP + ac ide indo le ac6 t ique /t force i on ique I = 3, UM~P ou AMP -4- t r y p t a m i n e pD = 7,9), les d6p lacemen t s des di f f6rents protons ne sont pas p r o p o r t i o n n e l s , l eurs r appo r t s v a r i a n t de fa~on p r a t i q u e m e n t l in6a i re avec la c o n c e n t r a t i o n en d6riv6 h n o y a u indo le (figure 7)

(*) Cependant il faut noter que la symdtrie des courbes de Job est peu affect6e par la prdsence, en faible proportion, de complexes dont la stoechiomdtrie est diff6rente de 1 : 1.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

Complexes du tryptophane avec les acides nucldiques. 337

(comme cela est observ6 avec l ' ad6nos ine en milieu ac ide , f igure 6).

Pu i sque le compos6 ~ noyau indo le est en exc6s par r a p p o r t au nuc l6os ide ou au nucl6ot ide , la format ion de c o m p l e x e s 2 : 1 ( indole : nuc l6o t ide ) est tr6s p robab le . I1 faut en p lus sou l igne r que la con t r ibu t ion de tels c o m p l e x e s d i m i n u e q u a n d la t emp6ra tu re augmente . En effet, la pen te de la droi te ob tenue en p o r t a n t le r a p p o r t des d6place- ments de deux p r o t o n s di f f6rents en f o n c t i o n de la c o n c e n t r a t i o n en i ndo le d i m i n u e et t end vers 0 quand la t e m p 6 r a t u r e augmen te (figure 7).

Z

!I - - ° ~ - - o ~ - - 9 " C

26 'C

~ ' C 82"C

82'C

9"C

,~ ' 0; 0 O,2 3

Fro. 7. - - Variations h diffdrentes temp6ratures des rapports des d6placements vers les hauts champs des rates de rdsonance des protons H~, H8 et H , de I'AMP en fonction de la concentration en acide indole acdtique (AIA). pD = 8,3 ; I =- 3.

La d i s sym6t r i e d e s . c o u r b e s de J o b dans le cas des m61anges t r y p t o p h a n e - a d 6 n o s i n e en m i l i e u ac ide peu t 6tre a t t r ibu6e ~ la p r6 sence de com- p lexes de s t o e c h i o m 6 t r i e d i f f6rente dans lesquels un n o m b r e de mol6cu les de t r y p t o p h a n e s u p d r i e u r

l 'un i t6 se ra ien t engag6es (par exemple , des com- p lexes 2:1). La f o r m a t i o n de tels c o m p l e x e s pen t 6tre li6e ~ l ' au toas soc i a t i on du t r y p t o p h a n e , auto- assoc ia t ion qui peu t O r e mise en 6v idence p a r RMN. Lo r sque la c o n c e n t r a t i o n en t ryptophane en mi l i eu ac ide (HC1 0,5 M) a u g m e n t e de 0,025 ~t 0.5 M, les p r o t o n s des g r o u p e m e n t s GH 2 et CH de la cha ine ac ide amin6 se d6p lacen t vers les hau t s c h a m p s r e s p e c t i v e m e n t de 15 et 14 HZ (*) t and i s que le p r o t o n fix6 h l ' a tome C 2 du n o y a u indo le se d6place 6ga lement ve rs les hau t s c h a m p s de 12 Hz. Les r6sonances des protons des nuc l6os ides ne d6penden t pas de la c o n c e n t r a t i o n en m i l i e u ac ide (HC1 0,5 M), m o n t r a n t que les au toassoc ia -

t ions de nuc l6os ides sont peu i lnpor t an te s dans ces cond i t ions . En mi l i eu neut re , les nuc l6os ides sont suscep t ib les de s ' au toas soc i e r [21]. L ' a b s e n c e d ' au toa s soc i a t i ons en nf i l ieu ac ide peu t d o n c 0tre a t t r ibu6e aux r6puqlsions 61ectrostat iques en t re les n o y a u x p u r i q u e s ou p y r i m i d i q u e s charg6s pos i t i - venlent .

4) Ddtermination des constantes d'associations.

Dans le cas de la f o r m a t i o n d 'un c o m p l e x e AB ent re 2 mol6cules A et B, les r6sul ta ts d ' a b s o r p t i o n et de RMN p e u v e n t s ' ana lyse r s i m p l e m e n t si la c o n c e n t r a t i o n tota le [B]o de l 'nn des e o m p o s a n t s du c o m p l e x e est tr6s sup6 r i eu re ~ eel le [A]o de l ' ant re .

K (6) A + B.< ~" AB

[AI o 1 1 1

(7) - - D = ~ X 1 q- X X ~ X l I B]o BENESI et HILI)EBRAND '13 I.

D ~. D (8 ) - - = K × a X 1 - - K

rA]o [B] o [A] o SCATCHARI) [14]. FnsTm~ et al [15].

.X6 (9) " -- K (A~al ~ . AS)

IB]o FOSTEn et FYFE [25].

La s ign i f ica t ion des symboles D, 1, _~5 et ASAB est la m6me que cel le donn6e au p a r a g r a p h e p r & c6dent .

L ' ana lyse des r6sultats d ' a b s o r p t i o n su ivan t les r e l a t ions [7] et I8] et des r6sul tats de RMN sui-

TABLEAU I.

Constantes d'association d~termindes 6 20°C par absorption en milieu acide pour les mdlanges de tryptophane et de nucl~osides.

Les mesures sont faites dans HC1 1 M (Ho = - -0 ,2) sauf pour l 'ad6nine.

K (M - l )

K (M -t)

i Ad6aosine I Ad6nosine ( i ) / (2) 5,5 f 8 ,9

Cytidine Ad6nine ( i)

(2) I1o ~ t , i

3,6 5,2

6uanosine Cytidine t ( l )

i - -

6,5

Ad6nine r lt) ~tl0 =--0,68

5,2

3,0

AMP (!)

4,65

(*) I1 est cependant possible que les effets de concen- trations sur les protons des groupements GH: et GH de la ehaine ali phatique soient dus anssi h nn d6p|a- cement des dquilibres entre rotam6res [38].

(1) Valeurs de K mesur6es en pr6sence d'un excbs de tryptophane.

(2) Valeurs de K mesur6es en prdsence d'nn exc6s du nucl6oside.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

338 J e a n - L u c D i m i c o l i e t Claude Hdl~ne.

v a n t la r e l a t i o n [9] d o n n e des r e p r 6 s e n t a t i o n s l i n 6 a i r e s d 'of l l ' o n p e u t c a l c u l e r les v a l e u r s de K, e et ASAB. Que lques e x e m p l e s son t d o n n 6 s s u r les f igures 8 et 9. Les v a l e u r s des c o n s t a n t e s d ' a s - s o c i a t i o n K o b t e n u e s p a r a b s o r p t i o n et RMN son t d o n n 6 e s d a n s les t a b l e a u x I, I I et III . On c o n s t a t e que les v a l e u r s o b t e n u e s p a r les d e u x m 6 t h o d e s son t en b o n a c c o r d . Les v a l e u r s de K o b t e n u e s h p a r t i r des m e s u r e s d ' a b s o r p t i o n s o n t i n d 6 p e n - d a n t e s de la l o n g u e u r d ' o n d e cho i s i e . Les diff6- r e n e e s son t du m 6 m e o r d r e de g r a n d e u r que l ' e r - r e u r e x p 6 r i m e n t a l e .

r e s t e n t l i n 6 a i r e s e n p r 6 s e n c e de c o m p l e x e s 2 : 1 en f a ib l e s p r o p o r t i o n s [26, 27]. Q u a n d les r a p p o r t s des v a r i a t i o n s de d 6 p l a c e m e n t c h i m i q u e des d i f f& r e n t s p r o t o n s d ' u n e m 6 m e m o l 6 c u l e r e s t e n t cons- t a n t s l o r s q u e la c o n c e n t r a t i o n du c o r p s e n exe6s v a r i e , i l ne se f o r m e que des c o m p l e x e s I : 1. Les d i f f 6 r e n c e s e n t r e ]es c o n s t a n t e s d ' a s s o c i a t i o n me- s u r 6 e s p o u r les d i f f 6 r e n t s p r o t o n s son t a l o r s dues a u x i n c e r t i t u d e s s u r les m e s u r e s des d6p , l acements c h i m i q u e s . On p e u t d 6 d u i r e des r 6 s u l t a t s p r 6 s e n - t6s d a n s les t a b l e s 2 et 3 que la p r 6 c i s i o n s u r la d 6 t e r m i n a t i o n des c o n s t a n t e s est de l ' o r d r e de

TABLEAU ]1.

Constantes d'association et ddplacements chimiques extrapol~s (AS~B) ddterminds par RMN en mileu acide pour les mdlanges de tryptophiine

et de nucl~,osides. T = 24 ° _ 1 °.

(1) Addnosine . . . . . . . . . . . . . .

(1) Addnosine . . . . . . . . . . . . . .

(1) Ad6nosine . . . . . . . . . . . . . .

(1) Addnine . . . . . . . . . . . . . . . .

(1) Guanosine . . . . . . . . . . . . . .

(1) Guanosine . . . . . . . . . . . . . .

(1) Guanine . . . . . . . . . . . . . . . .

(1) Cytidine . . . . . . . . . . . . . . . .

(2) Addnosine . . . . . . . . . . . . . .

(2) Addnosine . . . . . . . . . . . . . .

(H.)

+ 0,20

K (M -i)

H e 5 ,9 H s 6,3

H e 4 ,7 H s 4 HI, 5,5

H~ 5,2 H 8 4,1

A ~

H~ 99 H s 36

H2 111 H s 50 Hi , 43

He 110 H s 60

- - 0,20

H~ 4 H2 115 - - 0,20 H s 2 ,8 H s 127

q- 0,63

- - 0,20

H~ 9 H l , 8

H 8 5,4 HI, 6,5

H 8 5 ,4

H 6 2,7 H~ 3,1

H~ 9 ,6

H~ 8,7

- - 0,20

- - 0,20

0,20

H 8 47 Hi , 53

H 8 62 H~, 54

H 8 87

H o 69 H~ 84

H=~ 26

H~ 27,5

(1) Valeurs d6termindes en pr&ence d 'un exc6s de t ryptophane. (2) Valeurs ddtermin6es en pr6sence d 'un exc6s de nuel6oside, la resonance

eelle du pro ton fix6 en C~ du noyau indole. suivie 6tant

E n RMN, les v a l e u r s des c o n s t a n t e s d ' a s s o c i a - t i o n s p o u r les d i f f 6 r e n t s p r o t o n s d ' u n e m 6 m e mo- 16cule ne son t pa s en g6n6 r a l i d e n t i q u e s . Les d i f - f 6 r e n c e s p e u v e n t s ' e x p l i q u e r so i t p a r l ' i n e e r t i t u d e e x p 6 r i m e n t a l e s u r la m e s u r e des d d p l a c e m e n t s c h i m i q u e s ( s u r t o u t l o r s q u e ces d 6 p l a c e r n e n t s s o n t f a ib l e s ) , so i t p a r la p r 6 s e n c e de c o m p l e x e s 2 : 1 d o n t l ' e x i s t e n c e a 6t6 sugg6r6e d a n s c e r t a i n s c a s au p a r a g r a p h e p r 6 c 6 d e n t . I1 a d6jh 6t6 m o n t r 6 qu, e les r e p r 6 s e n t a t i o n s s u i v a n t les 6 q u a t i o n s (7 - - 9)

BIOCHIM1E, 1971, 53, n ° 3.

10 p. 100. Q u a n d les r a p p o r t s des v a r i a t i o n s de d 6 p l a c e m e n t c h i m i q u e e n v i s a g d s c i -de s sus v a r i e n t de m a n i 6 r e m o n o t o n e en f o n e t i o n de la c o n c e n t r a - t i o n d u c o r p s en excbs, les d i f f 6 r e n c e s e n t r e ]es c o n s t a n t e s m e s u r 6 e s p o u r d i f f 6 r e n t s p r o t o n s son t a t t r i b u 6 e s h la p r 6 s e n c e de c o m p l e x e s 2 : 1. D a n s ce cas, les c o n s t a n t e s d ' a s s o c i a t i o n et les d6p lace- m e n t s c h i m i q u e s o b t e n u s p a r e x t r a p o l a t i o n ne r e p r 6 s e n t e n t que des v a l e u r s a p p a r e n t e s que l 'on ne p e u t a t t r i b u e r a u x setfls c o m p l e x e s 1 : 1. Les

C o m p l e x e s du t r y p t o p h a n e avec les ac ides nuc l~ iques . 3 3 9

v a l e u r s d e s d 6 p l a e e m e n t s e h i m i q u e s n e p e u v e n t p a s a l o r s ~ t r e u t i l i s 6 e s p o u r d 6 t e r m i n e r l a s t &

r 6 o e h i m i e d e s c o m p l e x e s .

l o r s q u e le t r y p t o p h a n e e s t e n e x e c s . C e t t e d i f f6 -

r e n e e n ' e s t p a s o b s e r v 6 e a v e e l a e y t i d i n e d 6 m o n -

t r a n t a i n s i q u e l ' a u t o a s s o e i a t i o n d u t r y p t o p h a n e

TABLEAU I l i a .

Constantes d'association obtenues par absorption en mil ieu neutre (pH = 7) en presence de cacodylate de sodium 1 M.

K (M -1)

Uridine , Uridine + + 5-hydroxytryptophane Tryptophane

i

2 ,1 l 1 ,7

Cytidiue + 5-hydroxytryptophane

1 ,7

Cytidine + Tryptophane

1 ,0

TABLEAU I l l b .

Conslantes d'associalion (K) et d~placements chimiques extrapol~s ( h S a n ) obtenus par RMN dans les condit ions indiqu~es dans la premiere colonne. La force i o n i q u e (I) es t m a i n t e n u e c o n s t a n t e avee du c h l o r u r e de s o d i u m .

Complexe K {M -l)

U M P -~- A I A H~ 0 ,7 pD ~ 7 ,9 - - I = 1 H 6 0 , 6

U M P + A I A pD ~ 7 ,9 - - I ~ 3

Uridine --{- A I A pD ~ 7 ,9 - - I = 1

Uridine -{- A I A pD = 7 ,9 - - I ~ 3

A M P -~- A I A pD ~--~ 8 , 3 - - I ~ I

AM P ~ - AIA pD ~ 8 , 3 - - I ~ 3

Adenos ine + T r y p t a m i n e pD = 5 ,5 - - I ~ 0 ,1

AM P -~- T r y p t a m i n e pD ~ 4 , 9 - - I ~ 0 ,1

AM P -71- T r y p t a m i n e pD ~ 7 ,9 - - I ~ 0 , 2

U M P -+- Tryptamine pD = 7 ,9 - - I ~ 0 , 2

H 5 1 ,0 H 6 1 , 2 I41 , 1 ,1

H~ 1 , 0 H i , 1 , 5

H~ 1 ,1 H i , 1 , 7

H~ 1 , 8 H~ 1 ,8 H 1 , 1 ,7

H~ 2,8 H s 2 , 0 H i , 2 , 9

Hu 3 , 4 H s 3 , 3 HI , 3 ,1

H 2 6 , 4 H s 6 , 3 H i , 6 , 4

I-I s 5 , 5 H. 2 6 , 9 H t , 6 ,1

H.~ 1 , 8 H 6 1 , 7 H i , 2 ,1

ACAS {Hz)

H 5 85 H~ 114

H~ 76 H~ 88 H 1 , 64

H 5 128 H 1 , 69

H,~ 143 H 1 , 71

H., 71 H , 56 H t , 54

He 67 H 8 62 H 1 , 50

H~ 82 H 8 58 H[, 53

I-L 78 H i 43 H l , 51

H 8 54 H-2 74 H I , 66

H 5 117 H 6 113 H i , 92

L e s e o n s t a n t e s d ' a s s o c i a t i o n m e s u r 6 e s p o u r l e s

m 6 1 a n g e s a d 6 n o s i n e - t r y p t o p h a n e e t g u a n o s i n e -

t r y p t o p h a n e e n m i l i e u a e i d e s o n t b e a u c o u p p l u s 61ev6es l o r s q u e le n u e l 6 o s i d e e s t e n e x e c s q u e

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

n ' e n e s t p a s r e s p o n s a b l e . Ces r 6 s u l t a t s m o n t r e n t h n o u v e a u q u e l e s m 6 1 a n g e s e n t r e n u e l ~ o s i d e s p u r i -

q u e s e t t r y p t o p h a n e e n m i l i e u a e i d e n e p e u v e n t

p a s ~ t r e d 6 e r i t s s e u l e m e n t p a r l ' ~ q u a t i o n [6] .

340 Jean-Luc Dimicol i el Claude H~l~ne.

Les c o u r b e s de JOB [24] en a b s o r p l i o n ou en RMN p e u v e n t 6tre ca lcul6es & p a r t i r des p a r a - m6 t re s K, e on ASAB d 6 t e r m i n 6 s p a r l ' ana ly se des r6sul ta t s e x p 6 r i m e n t a u x se lon les r e l a t i o n s (7 - - 9).

rD'~: 0~ @ o" / A= Adenc~,ne [A]0=47x10-aM / BzTryp/ophane[B]o variaNe ~nm

HCI 1 N / - - o i "

o/

20nm

I I i I I 0 10 20 ~ 30

LOJo

" ~ I " ~ % A = T,.,yptophon e IA]0= 5,2 ×I0.3M

o

320nm~

0,05 0,1 -15" 0,15

Fail. 8. - - a) Analyse des rdsultats d 'absorption pour les m61anges t ryptophane-ad6nosine en milieu acide (HC1 1 M) selon l '6quation (7).

b) Analyse des r~sultats d 'absorption pour les m~- langes t ryptophane-cyt idine en milieu acide (HC1 1 M) selon l '6quation (8). La eytidine est en exe&s ; la concentration en t ryptophane est gardde constante et ~gale & 5,2 X 10-3 M.

c) M6me analyse qu'en b) pour les mfilanges cyti- d ine- t ryptophane (cytidine en exc6s) en milieu neutre (cacadylate de sodium 1 M, pH = 7).

Q u a n d il ne se f o r m e que des c o m p l e x e s 1:1, ]a c o u r b e calcul6e et la c o u r b e c x p 6 r i m e n t a l e s ont en exce l l en t a c c o r d c o m m e le m o n t r e la f igure 10 d a n s le cas du c o m p l e x e c y t i d i n e - t r y p t o p h a n e en mi l i eu ac ide . Dans le cas des m61anges ad6nos ine - t r y p t o p h a n e la co u rb e ca lcul6e est t rbs d i f f6rente de la co u rb e e x p 6 r i m e n t a l e (figure 10). Une c o u r b e t h 6 o r i q u e en exce l l en t a c c o r d avec la

60{3

400

200

[B]o

100

50

(~) Adenosine + Tryplophane DCI 1N

H2 (o) Adenosine 3x10"aM

- ~ . ~

H a ~

@ AMP + AIA - H , pD : 8.25 ~ . I : 1

H s o ° ~ °"-O~o.. H,, "-o~>o o ~ , .

2 5 5 0 7 5 A~"

~0 @ AMP +Tr-yptamine pD = 785

600 I = 0,2

400 ~ o o......o~.

200 "~" "~" ~ ~

25 50 75 L~6-

Fail. 9. - - Analyse des rdsultats de RMN pour les protons de l 'addnosine ou de I'AMP :

a) Tryptophane-addnosiffe en milieu aeide (DC1 1 M) ; le t ryptophane est en exe6s et l 'ad6nosine en concentrat ion fixe 3 X 10-3 M (o) ou 2 × 10-2 M (A).

b) AMP 4- aeide indole aedtique (AIA) & pD = 8,25. e) AMP + t ryptamine & pD = 7,85.

c o u r b e e x p 6 r i m e n t a l e p e u t 6tre calcul6e en suppo- san t qu ' i l se f o r m e & la fois des c o m p l e x e s 1:1 et 2:1 ( t r y p t o p h a n e : a d 6 n o s i n e ) . La c o n s t a n t e d ' 6qu i l i b re p o u r la f o r m a t i o n des c o m p l e x e s 1:1 est s u p p o s 6 e 6gale ~ ce l le d6 te rmin6e e x p 6 r i m e n - t a l e m e n t q u a n d l ' a d 6 n o s i n e est en excbs (dans ces c o n d i t i o n s , il ne se f o r m e p a s de c o m p l e x e s conte- n a n t 2 mol6cu les de t r y p t o p h a n e p o u r 1 mol6cu le d ' a d 6 n o s i n e ) . La c o n s t a n t e d ' 6 q u i l i b r e 2:1 et les d 6 p l a c e m e n t s c h i m i q u e s d a n s les c o m p l e x e s I : l et 2:1 p e u v e n t a lors 6tre ca lcul6s [17] p o u r obte-

BIOCHIMIE, 1971, 53, n" 3.

Complexes d u tryptophane auec les acides nucldiques. 341

nir un bon accord avec la courbe expCrimentale (figure 10).

Les constantes d'association A diffkrents pH et a diffkrentes forces ioniques ont CtC mesurkes afin de prkciser le rBle des interactions Clectrostati- ques entre groupe~nents ionisds dans la formation des complexes (table 3). D'une manikre gCnCrale, on observe que la prCsence de charges de m h e signe sur les deux molCc~11es diminue la stabilitC du complexe ; tandis que la presence de charges de signes opposds l'augmente. Une augmentation de force ionique din~inue les effets des rkpulsions electrostatiques entre charges de mCme signe et augmente la stabilitk du complexe. 11 faut aussi noter que la formation de con~plexes 2: l semble favorisbe a force ionique ClevCe. La presence de complexes 2: l limite les possibilites d'interpreta- tion plus prCcises, les paramktres obtenus n'ktant alors que des parametres apparents.

FIG. 10. - Courbe de Job expCrimentale (0) et cal- culCe en su~pposant l'existence de complexes 1 : l seule- ment ( -- ) a partir des param8tres K et h a ~ ~ obtenus par l'analyse des rCsultats de RMN en milieu acide DC1 1 M pour les mClanges tryptophaue-cytidine et tryptophane-adbnosine. La courbe en tirets dans le cas des melanges tryptophane-adhosiue a Ct6 calculke en supposant l'existenee de complexes 1 : 1 et 2 : 1 (AB et AB, oh A reprksente I'adhosine et B le trgptophane). Les paramktres choisis (17) pour calculer la courbe sout : hi:i = 10 M-1 (valeur obtenue en prCsence d'un excks dYadCnosine, roir (texte) ; Ka:i = 2,3 M-1. Pour le proton H, : Aah8 = 19 HZ, ASARP = 54 HZ. Pour l e proton Hp : ABAB = 55 HZ, ASABP = 111 HZ.

5 ) Enfhalpies et entropies de formation des complexes.

Les enthalpies A H de rkactions de formation des complexes et lles variations d'entropies AS correspondantes ont CtC dktermindes a la fois par absorption et par RMN. L'absorption d'un complexe donnk a CtC lnesurde en fonction de la temperature et la concentration en complexe deter- minCe en supposant que son coefficient d'extinction est indkpendant de la tempkrature. (Dans le cas de complexes tels que ceux CtudiCs ici, il a

dBja CtB montrC que les variations des coefficients d'extinction avec la telnpkrature sont faibles [%I).

En RMN, les constantes d'associations K ont CtC mesurees i diffkrentes temperatures. Ides variations des dCplacements chimiques dbpendent de la temperature et diminuent sensiblement quand la temperature augmente (cet effet est analogue a celui observe avec les coefficients d'extinction).

Les valeurs de A H et AS pewent etre calculCes a partir des reprCsentations de Vant'Hoff qui sont linkaires dans le domaine de temperature Ctudii! (figure 11). I,e tableau 4 resume les rCsultats obtenus. Dans tous les cas, les valeurs de A H et A S sont negatives. L'enthalpie libre de formation des complexes AG = A H - TAS est toujours trks faible et negative.

FIG. 11 . - ReprCsentation de Vant'Hoff des variations des constantes d'associations du tryptophane avec la cytidine (absorption) ou avec la guanine (RMN) en milieu acide (DCl 1 M).

La formation de com~plexes intermoli.culaires entre derivCs a noyau indole et les constituants des acides nuclCiques est dCmontrCe par l'appari- tion d'une nouvelle absorption (bande large et diffuse) et par une modification des deplace~nents chimiques des protons des deux mol6cules dans le complexe. La nouvelle absorption qui apparait a grandes longueurs d'onde par rapport aux deux co~~nposants pris sCparCment peut etre attribnee ii un transfert de charge du noyau indole (donneur d'electron) vers le noyau purique ou pyrimidique (accepteur d7Clectron). Le noyau indole est un bon donneur d'klectrons qui fornle des con~plexes du type de ceux dCcrits ici avec un grand nonibre de nlolCcules organiques 129-321. Les proprietes

3 4 2 J e a n - L u c D i m i c o l i e t Claude Hdldne.

accepteur d'61ectrons des d6riv6s pur iques et pyr imidiques sont real connues. Les calculs th6o- r iques mont ren t que les bases pyr imid iques doi- vent Ore de meilleurs accepteurs d'61ectrons que les bases pur iques [33]. L 'ordre inverse est cal- cul6 en ce qui concerne les propri6t6s de donneur d'61ectrons. En mil ieu neutre, la nouvelle bande d 'absorpt ion des complexes correspondant au

le cycle pur ique ou pyr imid ique est proton6. Alors qu 'aucune bande ~ t ransfert de charge n'est observ6e en mil ieu neutre dans le cas des d6riv6s puriques, une telle bande cara ct6ristique du com- plexc apparai t eu mil ieu acide. Lorsqu 'une deuxi6me protonat ion est possible (cas de l'ad6- n ine par exemple), le complexe du t ryptophane avec la forme deux fois protonde absorbe h Ion-

TABLEAU IV.

Enthalpies (AH), entropies (AS) et enthalpies libres (AG) de [ormation des complexes entre d~riv~s dt noyau indole

et nucl~osides ou nucl~otides. (Les valeurs obtenues par RMN sont la moyenne des valeurs mesur6es pour chacun des

protons observables).

Conditions ] Complexe

HC1 1M, abs.

HC1 1M, abs.

DCI 1M, RMN

DC1 1M, RMN

DCI 1M, RMN

DC1 1M, RMN

DC1 1M, RMN

p D ~ 7,9 I = 3 RMN

p D : 7 , 9 I ~ - - I RMN

pD = 8,9 1----3 RMN

p D z 4 , 9 I w 0 , 1 RMN

p D = 7 , 9 I - - - - 3 RMN

A d 6 n i n e

+ tryptophane

Cytidine -~- tryptophane

C y t i d i n e

+ tryptophane

AH {kcal.mole -t)

- - 3 , 9

- - 2 , 6

- - 2 , 8

G u a n i n e -~- tryptophane - - 3,6

A d f i n i n e

+ tryptophane

A d f i n o s i n e

+ t r y p t o p h a n e

G u a n o s i n e

-~- tryptophane

UMP + AIA

AMP + AIA

AMP -{- AIA

AMP -~- tryptamine

Uridine -~- AIA

3 , 2

- - 4 , 1

- - 2 , 8

- - 1 , 4

- - 1 , 5

- - 1 , 8

4 , 1

- - 1 , 8

AS (eal.*K-l.mole-l)

- - 9 , 7

- - 6 , 7

- - 7 , 4

- - 8 , 9

- - 8 , 8

- - 1 1

- - 5 , 9

- - 4 , 3

- - 3 , 9

- - 4 , 3

- - 9 , 8

- - 5 , 2

AG h 293 °K (keal. mole -1 )

- - 1 , 0

- - 0,65

- - 0,65

- - 1 , 0

- - 0 , 6

- - 0 , 9

- - 1 , 1

- - 0 , 1 5

- - 0,35

- - 0,55

u 1 , 2

- - 0 , 3

t ransfert de charge n ' appara i t qu'avec les d6riv6s pyr imidiques , ce qui con.firme que les bases puriques sont de mauvais accepteurs d'61ectrons. La pro tonat ion du cycle pur ique ou pyr imid ique doit augmenter l 'affinit6 61ectronique de ces compos6s par r i n t roduc t ion d 'une charge positive. C'est ce que l 'on observe exp6rimentalement : chacun des complexes t r yp tophane -nuc l6os ide (ou base) absorbe /i plus grandes longueurs d 'onde lorsque

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

gueurs d 'onde encore plus grandes que celui avec la forme une fois prpton6e. Si la l imite vers les grandes longueurs d 'onde de la bande d'absorp- t ion h t ransfert de charge des complexes avec un m~me donneur peut 6tre consid6r6e comme une mesure du pouvoir accepteur d'61ectrons des bases pur iques et pyr imidiques , l 'affinit6 61ectro- nique de ces compos6s d6croit dans l 'ordre :

CH + > AH ÷ > GH ÷ > T,U > C > A,G

Complexes du t ryp tophane avec les acides nucldiques. 343

En RMN, on observe un d6placement vers les hauts champs des rdsonances des protons des deux mol6cules engag6es dans le complexe. Un tel d6plaeement est dft essentiel lement fi des effets de courants annulaires des dleetrons ~ d 'une mo- ldeule sur r au t re [34]. L ' in t roduc t ion d'6tats exei- tds nouveaux (6tats de transfferts de charge) dans le comp,lexe est susceptible en outre de modif ier le terme paramagn6t ique i~ntervenant dans le caleul du d6placement ch imique d~un proton. La pro- babilit6 de t ransfer t de charge dans les complexes faibles d6crits ici n'est pas suffisante pour don- ner des effets mesurables en RMN. Les d6pla- cements observ6s des diffdrents protons dans les complexes mont ren t que le noyau indole et le

plexe pour essayer de proposer une st6r6ochimie de ce complexe. I1 faut cependant p rendre garde aux effets dventuels de charges loca~is6es [37] pouvant eondui re h des d6placements diff6rents de ceux attendus .h pa r t i r de l 'effet de courants d 'dlectrons ~ (*). Le spectre des 4 protons du cycle h 6 atomes du noyau indole n 'est pas analy- sable au p remie r ordre dans les ddriv6s utilis6s au cours de cette 6rude. I1 est donc diffieile d'6tu- dier les effets dus h la format ion de complexes sur les ddplacements ch imiques relatifs de ces protons (seul le proton li6 h l 'a tome C, 2 donne des ddplacements analysables). L ' in t roduc t ion d 'un substituant en posi t ion 5 comme dans la 5-hy- d roxyt ryp tamine (sdrotonine) pe rmet de lever

TABLF~AU "V.

Variations des couplages entre les protons H I, et Ha, du ribose dans les complexes entre nucldosides ou nucldotides et ddrivds d ~oyau indole.

Nueldoside Couplage Couplage Conditions ou nucl6otide dans nucldoside danslesconditions

seul d6crites

0,5 Guanosine 3,8 Hz 2,6 Hz M tryptophane, DCI 1M . . . . . . . . .

0,5 M tryptophane, DCI 1M . . . . . . . . .

0,4 M AIA,1 ~ 3, pD --~ 7,8 . . . . . .

0,5 M AIA,1 : 3, pD ~ 7,8 . . . . . .

0,083 M tryptamine, 1 : 0,1 pD ~ 4,5

0,1 M tryptamine, I --: 0,1 pD ---- 4,5.

0,1 M tryptamine, I z 0,1pD ~ 5 . . .

0,5 M AIA, I ~ 1, pD z 8,2 . . . . . .

0,5 M AIA, I ~--- 3, pD ~ 8,2 . . . . . .

0,5 M AIA, I ~ 1, pD ---- 8 . . . . . . .

Addnosine

Uridinc

UMP

UMP

AMP

Addnosine

5,2

4,2

5,1

4,2

3,2

4,3 3,6

2,6

5,5

6,1

4,8

4,8

AMP 5,6 4,3

AMP 5,2 3,3 I

Uridine 4,9 2,9

noyau pur ique ou pyr imid ique sont engagds dans des associations du type plan sur plan. En g6nd- ral, on observe que les pro tons du cycIe pur ique ou py r imid ique subissent un ddplacement plus impor tant que ceux du r i b o s e ; parrot ces der- niers, le proton H1, qui est le plus pr6s du cycle est le plus affect6. Quand les expdriences sont r6a- lis6es avec un exc6s de ddriv6 pyr imid ique , les protons du t ryp tophane ne subissent que de tr6s faibles ddplacements. Ce r6sultat est at tendu puis- que les effets de courants d'61ectrons ~ du cycle pyr imid ique sont beaucoup plus faibles que ceux des 61ectrons r: d 'un cycle pur ique pour lequel la d61ocalisation est plus importante.

On peut penser ut i l iser les d6pl.aeements des r6sonances des diff6rents protons dans le com-

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

cette ambigiiit6. Dans les complexes entre la s6ro- tonine ct l 'ad6nosine en mi l ieu aeide, ce sont les protons du cycle ~ 6 atomes de la s6rotonine et du d6rivd pur ique qui sont les plus ddplac6s vers les hauts champs. Un ph6nom6ne analogue a d6jfi 6t6 observ6 dans l '6tude des auto-associations des nucl6osides ou nucldotides puriques. Ces observa- tions sont interprdtables par une in teract ion prd- f6rentielle entre les cycles h 6 atomes des mol6- cules dans le eomplexe.

Dans t o u s l e s cas 6tudi6s de complexes entre d6riv6s fi noyau indole et ntrcl6osides ou nucl6o- tides, le couplage entre les deux protons H1, et H 2 du r ibose diminue darts le complexe (table V). Cet

(*) Et dgalement h la prdsence de complexes 2 : 1.

3 4 4 J e a n - L u c D i m i c o l i et Claude Hdl~ne.

effet p e u t ~tre a t t r i b u d h u n c h a n g e m e n t d a n s ]a c o n f o r m a t i o n d u r i b o s e qu i p a s s e de la s t r u c - t u r e 2' h la s t r u c t u r e 3' e n d o , c o m m e cela est o b s e r v d p a r e x e m p l e l o r s q u e la c o n c e n t r a t i o n c n sels m d t a l l i q u e s a u g m e n t e [35] ou d a n s le cas de l ' a u t o a s s o c i a t i o n de c e r t a i n s n u c l d o t i d e s E211.

Les c o n s t a n t e s d ' a s s o c i a t i o n s d 6 t e r m i n 6 e s h la fo is p a r a b s o r p t i o n et RMN son t f a i b l e s ( q u e l q u e s moles -D et du m 6 m e o r d r e de g r a n d e u r que ce l les m e s u r d e s p o u r des c o m p l e x e s d u m ~ m e t y p e [29- 32]. Les e n t h a l p i e s de f o r m a t i o n et les v a r i a t i o n s d ' e n t r o p i e s o n t n6ga t ives . Ce d e r n i e r r 6 su l t a t m o n t r e que le c h a n g e m e n t de l ' o r g a n i s a t i o n d u s o l v a n t n ' e s t p a s le f a c t e u r p r 6 d o m i n a n t d a n s la f o r m a t i o n des c o m p l e x e s . L ' e n t h a l p i e l i b r e de for - m a t i o n est t o u j o u r s t r b s f a i b l e m e n t ndga t ive . La f o r m a t i o n des c o m p l e x e s e n t r e dd r ivds h n o y a u i n d o l e et les d6r ivds p u r i q u e s et p y r i m i d i q u e s fa i t a p p e l h des i n t e r a c t i o n s 61ec t ro s t a t i ques du t y p e VAN DER WAALs-LONDON e n t r e les n o y a u x a r o m a t i q u e s des d e u x c o m p o s a n t s . Les g r o u p e - i n e n t s i on i sd s des s u b s t i t u a n t s j o u e n t c e p e n d a n t u n r61e n o n ndg l igeab le , n o n s e u l e m e n t d a n s la s t ab i l i t 6 des c o m p l e x e s m a t s auss i d a n s l e u r st6- r d o c h i m i e . La p r 6 s e n c e d ' n n e b a n d e h t r a n s f e r t de c h a r g e n ' a p p a r a i t que c o m m e u n e c o n s 6 q u e n c e d u r e c o u v r e m e n t des n u a g e s d l e c t r o n i q u e s des cyc les a r o m a t i q u e s d a n s le c o m p l e x e . E n fai t , ]es cons - / a n t e s d ' a s s o c i a t i o n s son t p lu s dlevdes a v e c les d6 r iv6s p u r i q u e s a l o r s que le t r a n s f e r t de c h a r g e est p lu s i m p o r t a n t a v e c les d6 r iv6s p y r i m i d i q u e s .

La f o r m a t i o n de c o m p l e x e s e n t r e le t r y p t o - p h a n e et les b a s e s des a c i d e s n u c l 6 i q u e s p e u t 6 t re i m p l i q u 6 e d a n s les i n t e r a c t i o n s e n t r e e n z y m e s (ou p r o t 6 i n e s ) et a c i d e s nuc l 6 i ques . U n e 6rude p a r f l u o r e s c e n c e a m o n t r 6 que les a c i d e s a m i n d s a ro - I n a t i q u e s i n t e r a g i s s e n t avec les a c i d e s n u c l d i q u e s , ]es n o y a u x a r o m a t i q u e s p o u v a n t s ' i n t e r c a l e r e n t r e les b a s e s [36]. Ce t y p e d ' i n t e r a c t i o n s p e u t i n t e r - v e n i r p a r e x e m p l e p o u r f ixe r u n a e i d e n u c l 6 i q u e d a n s u n e p o s i t i o n d 6 t e r m i n 6 e p a r r a p p o r t h l a c h a i n e p o l y p e p t i d i q u e d ' u n e e n z y m e . E n ou t r e , l ' i n t e r c a l a t i o n d ' u n n o y a u a r o m a t i q u e c o m m e ]e n o y a u i n d o l e e n t r e les b a s e s d ' u n a c i d e n u c l d i q u e p e u t e n t r a l n e r u n c h a n g e m e n t de c o n f o r m a t i o n loca l de l ' a c i d e n u c l d i q u e , c h a n g e m e n t qu i p e u t O r e n 6 c e s s a i r e au f o n c t i o n n e m e n t u l t d r i e u r du c o m p l e x e e n z y m e - a c i d e n u c l 6 i q u e .

Remerciements.

Nous tenons /~ remercier MM. les Professeurs Ch. SA- DJ~ON et M. PTAK pour l ' in tdrdt qu ' i ls ont portd h e e t ravai l .

R~SUM~.

Une dtude pa r absorp t ion et rdsonance magndtique nucl6aire ddmontre que le t ryp tophane et d ' au t res ddrivds possddant le noyau indole fo rmen t des complexes inter lnoldeulaires avec les bases, les nueldosides on les nucldotides en solut ion aqueuse. Dans la majeure par t ie des cas, les complexes formds ont essentielle- inent une stoeehiomdtrie 1 : 1. Ces complexes possSdent une nouvelle absorpt ion h des longueurs d 'onde plus grandes que les deux composants sdpards. Cette nouvelle absorpt ion est a t t r ibude h u n t r ans fe r t de charge du noyau indole (donneur) vers le noyau pur ique ou pyr imidique (accepteur). Les ddrivds pyr imid iques sont mei l leurs aceeptenrs d 'dlectrons que les ddrivds puriques. L'dtude de la fo rmat ion des complexes h diffdrentes valeurs du pH mont re que les bases protondes sont de mei l leurs accepteurs d 'dlectrons que les bases neutres. Le ddplacement vers les hau ts champs des rdsonances des protons du ddrlvd indol iqne et du dd- rivd pur ique ou pyr imidique ddmontre que les noyaux arolnat iques des deux par tena i res dans le complexe sont empilds parall61ement. Fun h l 'autre .

Les constantes d 'assoeiat ion, les en tha lp ies de forma t ion et les var ia t ions d 'entropie ont dtd ddtermindes par les deux mdthodes. Le r61e joud par les autoasso- ciat ions des solutds et la cont r ibu t ion de complexes dont la stoechiomdtrie est diffdrente de 1 : 1 sont dis- cutds. Les rdsul ta ts obtenus en mil ieu fluide sont com- pards h ceux obtenus an td r ieurement en solutions aqueuses eongeldes.

ZUSAMMENFASSUNG,

Eine Untersuchung durch Absorpt ion und nuklear- magnet ische Resonnanz beweist, dass das Tryptophan und andere den Indolkern besi tzende Derivate inter- molekulare Komplexe mi t den Basen, Nukleosiden oder Nukleot iden in Wasser l5sung bilden. In der Mebrheit der Fiille haben die gebildeten Komplexe wesentl ich eine 1 : 1 - Stoichiometrie. Diese Komplexe besitzen eine neue Absorpt ion bet grSsseren WellenHingen als die zwei ge t rennten Komponenten. Diese neue Absorp- t ion wird einem Uber t ragen tier Ladung des Indol- kernes (des Donors) auf den Pur in - oder Pyr imid in - kern (dem Akzeptor) zugeschrieben. Die Pyr imidinde- r iva te sind bessere Elekt ronenakzeptoren als die Pur in- derivate. Die Untersuchung der Komplexbi ldung bet verschiedenen pH-Werten zeigt, dass die Protonbasen bessere Elekt ronenakzeptoren als die neu t ra len Basen sind. Das Versetzen der Protoue des Indolder iva ts und des Pur in - oder Pyr imid inder iva t s nach den hohen Resonnanzfe ldern beweist , dass die a romat ischen Kerne tier beiden P a r t n e r e inander paral le l aufges- chichtet sind.

Die Assozia t ionskonstanten, die Bi ldungsenthalp ien und die Entropien~inderungen sind durch beide Metho- den bes t immt worden. Die durch die Autoassoziat ion der gelSsten Substanzen gespielte Rolle und der Beitrag der Komplexe mi t e iner Stoichiometrie, die yon 1 : 1 verschieden ist, werden besprochen. Die im fliissigen Medium erhal tene Ergebnisse werden mi t denjenigen verglichen, welche vorher mi t gefrorenen WasserlS- sungen erha l ten wurden.

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Documents

Interactions entre acides aminés et acides nucléiques. III — Etude par absorption et résonance magnétique nucléaire de la formation de complexes entre le tryptophane et les