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Enzymes recopiant les acides nucléiques. Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN DNA polymérase DNA dépendante DNA polymérase RNA dépendante RNA polymérase DNA dépendante RNA polymérase RNA dépendante Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’ - PowerPoint PPT Presentation
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Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Enzymes recopiant les acides nucléiquesEnzymes recopiant les acides nucléiques
Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN
DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase RNA dépendanteRNA polymérase DNA dépendanteRNA polymérase RNA dépendante
Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’
La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle.
L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates(XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP)
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LES ADN POLYMÉRASESLES ADN POLYMÉRASES - Un brin d'ADN matrice- Un brin d'ADN matrice
- Une amorce oligonucléotidique- Une amorce oligonucléotidique
- Une synthèse du brin nouveau 5'- Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'
3'(OH)3'(OH) 5'5'
5'5' 3'3'
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase DNA dépendante
Ces enzymes recopient l’ADN en ADN.Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique.La réaction catalysée est:(dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi
Amorce avec une extrémité 3’-OH libre
La nouvelle chaîne est synthétisée dansle sens 5’ 3’
Règle de complémentarité et de polarité inverse
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
La DNA polymérase 1La DNA polymérase 1
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Fragment de KLENOWFragment de KLENOW
Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli.
Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ 5’.
Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle e complémentarité.(fonction d’édition)
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LES ARN POLYMÉRASESLES ARN POLYMÉRASES
- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.
- Présence de nucléotides : NTPs et d'ions - Présence de nucléotides : NTPs et d'ions
magnésium (Mgmagnésium (Mg2+2+).).
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- Une synthèse du brin nouveau dans le - Une synthèse du brin nouveau dans le
sens 5'sens 5' 3'. 3'.
- Absence de fonction d'édition.- Absence de fonction d'édition.
- Nécessité de reconnaître le promoteur - Nécessité de reconnaître le promoteur
spécifique correspondant.spécifique correspondant.
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
A : rappels sur le génomeLes nucléotidesLes acides nucléiques
La chromatine
B: Les outils de la biologie moléculaireEnzymes qui coupent les acides nucléiquesEnzymes qui changent les contraintes des ANEnzymes qui travaillent sur les phosphatesEnzymes qui recopient les acides nucléiques
C: Les techniques de la biologie moléculairePurification des acides nucléiquesElectrophorèse sur gel
Plan du cours : première partie
Qu’est ce que la biologie moléculaire ?
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La transcription inverse du génome rétroviral
Le t-RNA sert d’amorce à la transcriptase inverse pour la synthèse de l’ADN « strong stop »
5’
t-RNA Lys3
La RNAse H dégrade l’ARN dans un heteroduplex ADN/ARN Premier saut de brin : le DNA néo synthétisé s’apparie à la région R de l ’ARN.
Elongation de l’ADN par la transcriptase inverse ( brin - )
La RNAse H dégrade la plus grande partie de l’ARN à l’exception d’une région riche en purines (ppt)
Synthèse du second brin d ’ADN ( brin + )
La région riche en purines et le t-RNA sont dégradés par la RNAse H
PBSR ’ U5 ’R U5 RU3PPTPBS
U3 ’PBS ’ R ’ U5 ’ PBS
U3 R U5 PBS
Second saut de brin : le DNA néo synthétisé s’apparie à la région PBS de l ’ARN.
U3 R U5 PBS
La synthèse de l ’ADN proviral est complétée
U3 R U5U3 ’ R ’ U5 ’
3 ’
LTR LTR
Les extrémités de l ’ADN proviral sont redondantes. Il s’agit des LTR, nécessaires à l’intégration
Synthèse des deux brins de l ’ADN proviral à partir de l ’ARN génomique
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Préparation des acides nucléiquesPréparation des acides nucléiques
L’ADN se trouve dans le noyau des celluleseukaryotes.
La première étape de la préparationconsistera à isoler les noyaux des autresorganites
On utilisera la technique de centrifugationdifférentielle.
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Isolement de noyauxIsolement de noyaux
On découpe finement lemorceau d’organe à extraire
On découpe finement lemorceau d’organe à extraire
On homogénéise de manièredouce dans une solutiontampon placée entre 0°C et 4°C.
On homogénéise de manièredouce dans une solutiontampon placée entre 0°C et 4°C.
On filtre à froid l’homogénatpour éliminer les morceauxde tissus et les cellules intactes
On filtre à froid l’homogénatpour éliminer les morceauxde tissus et les cellules intactes
On centrifuge le filtrat à 600gpendant 10’
On centrifuge le filtrat à 600gpendant 10’
On reprend le culot de noyauxà froid dans un tampon
On reprend le culot de noyauxà froid dans un tampon
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)(rad.s angulaire vitesse -1
)(cm.sion sédimentat de vitesse -1V
)meffectif(crayon effr
La centrifugationLa centrifugation
effrg .2
Srv eff ..2 S = M (1-V.)
f
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Principes de la centrifugationPrincipes de la centrifugation
Saccharose
La sédimentation en gradient de saccharosesépare les macromolécules en fonction deleur masse moléculaire
La sédimentation en gradient de saccharosesépare les macromolécules en fonction deleur masse moléculaire
Une centrifugation en gradient deChlorure de Césium sépare lesmacromolécules en fonction de leurdensité
Une centrifugation en gradient deChlorure de Césium sépare lesmacromolécules en fonction de leurdensité
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Séparation selon le poids moléculaire ou la densitéSéparation selon le poids moléculaire ou la densité
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Si l'on charge un mélange d'ADN et d'ARN sursur un gradient de Chlorure de Césium 6Met que l'on centrifuge à l'équilibre, chaquemacromolécules se répartit selon sa densité. (a)
Supposons que l'on traite ce mélange d'ADNet d'ARN par une RNase on n'observe plus qu'unebande qui migre à la densité de l'ADN. (b)
Si l'on charge un mélange d'ADN et d'ARN sursur un gradient de Chlorure de Césium 6Met que l'on centrifuge à l'équilibre, chaquemacromolécules se répartit selon sa densité. (a)
Supposons que l'on traite ce mélange d'ADNet d'ARN par une RNase on n'observe plus qu'unebande qui migre à la densité de l'ADN. (b)
a b
den
sité
On charge un échantillon d'ADN dans un tubeet un échantillon de protéine dans un autre.A l'équilibre, on obtient les bandes en c et d.
Dans le tube e on fait centrifuger un échantillon de chromatine. On obtient une bande en e
On charge un échantillon d'ADN dans un tubeet un échantillon de protéine dans un autre.A l'équilibre, on obtient les bandes en c et d.
Dans le tube e on fait centrifuger un échantillon de chromatine. On obtient une bande en e
c e
den
sité
d
Centrifugation en gradient de Chlorure de CésiumCentrifugation en gradient de Chlorure de Césium
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Isolement de noyauxIsolement de noyaux
On découpe finement lemorceau d’organe à extraire
On découpe finement lemorceau d’organe à extraire
On homogénéise de manièredouce dans une solutiontampon placée entre 0°C et 4°C.
On homogénéise de manièredouce dans une solutiontampon placée entre 0°C et 4°C.
On filtre à froid l’homogénatpour éliminer les morceauxde tissus et les cellules intactes
On filtre à froid l’homogénatpour éliminer les morceauxde tissus et les cellules intactes
On centrifuge le filtrat à 600gpendant 10’
On centrifuge le filtrat à 600gpendant 10’
On reprend le culot de noyauxà froid dans un tampon
On reprend le culot de noyauxà froid dans un tampon
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Les noyaux sont éclatés
mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl)et de protéinase K ;le détergent détruit les membranes etla protéinase digère les protéines associées à l'ADN
Il y a séparation de la phase aqueuseet de la phase phénolique.L'ADN va dans la phase aqueuse et lesprotéines dénaturées restent à l'interphase
Centrifugation à haute vitesse Les macromolécules vont au fond du tube
Extraction par le phénol
Centrifugation en gradient de chlorure de césium
Précipitation à l'éthanol à froid
Extraction et purification de l'ADNExtraction et purification de l'ADN
DNA
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Loi de Beer-LambertLoi de Beer-Lambert
l
I0 I
I
IA
I
IT
TT
010
0
log
100%
A = Absorbance
T = Transmission
La loi de Beer-Lambert
clA ..)L (molion Concentrat :
(cm) optiqueTrajet :
)cm mol (L molaireAbsorbance:
1-
-1-1
c
l
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Pour l'ADN natif, on estimequ'une absorbance de0,212 sous 1 cm de traversécorrespond à une concen-tration de 10 µg/ml
L'absorbance molaire estune caractéristique physiqueassociée à une molécule.
L'absorbance molaire desacides nucléiques est lamoyenne de l'absorbancemolaire de chaque base.
Molécule λmax (nm) ε.10-3(M-1.cm-1)
Trp 280 219 5,6 47,0
Tyr 274 222 193 1,4 7,0 48,0
Phe 257 206 188 0,2 9,3 60,0
His 211 5,9
Cys 250 0,3
Adénine 260,5 13,4
Adénosine 259,5 14,9
Guanine 275 8,1
Cytosine 267 7,1
Uracil 259,5 8,2
Thymine 264,5 7,9
DNA 258 6,6 (par base)
RNA 258 7,4 (par base)
Absorbance molaireAbsorbance molaire
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Spectre d'absorption de l'ADNSpectre d'absorption de l'ADN
ADN d'E Coli natif
max : 258 nm
0.16
0.31
A260nm
A280nm
2
A260nm
A280nm
< 1.85si l'ADN est contaminé par des protéines
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Dénaturation de l'ADNDénaturation de l'ADNQuand on chauffe une molécule d'acide nucléique, elle sedénature. La double hélice se sépare.Il y a rupture des liaisons hydrogènes et désempilement desbases.La dénaturation de l'ADN s'accompagne d'un effethyperchromique. L'absorbance de la molécule augmente.
t°
t°
On peut donc suivre la dénaturation thermique d'un acide nucléique en mesurant la variation de l'absorbance en fonction de la température.
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max : 258 nm
hyperchromicité
ADN d'EColi à 25°C
ADN d'EColi à 82°C
HyperchromicitéHyperchromicité
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Ab
sorb
ance
(26
0 n
m)
tm=48°C
La température de demidénaturation ( tm) est latempérature pour laquelle50% de l'ADN est dénaturé
Courbe de dénaturation thermiqueCourbe de dénaturation thermique
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Effet de la force ioniqueEffet de la force ionique
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La stabilité des acides nucléiquesdépend de la teneur en GC de l'acidenucléique.
Appariement G-C = 3 liaisons hydrogènesAppariement A-T = 2 liaisons hydrogènes
Effet de la composition en paires GCEffet de la composition en paires GC
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Gels d'électrophorèseGels d'électrophorèse
L'électrophorèse
v
Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique
La particule atteint très rapidement une vitesse limite v= q.E/f avec
q: charge de la particule;
E: champ électrique;
f: coefficient de frottement particule/solvant
+
_
E
q
v
-
q dépend de la charge de la macromolécule
f dépend de la taille (encombrement)
q dépend de la charge de la macromolécule
f dépend de la taille (encombrement)
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En faisant varier la concentration d'acrylamide et de bis acrylamide, on obtient des mailles très différentes par polymérisation.
CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH méthylène bis acrylamide
Gel de polyacrylamideGel de polyacrylamide
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Electrophorèse sur Gel de polyacrylamideElectrophorèse sur Gel de polyacrylamide
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Détermination du poids moléculaire d'un ANDétermination du poids moléculaire d'un AN
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Plan du cours : deuxième partie
D : Réplication de l’ADNDéfinitions élémentairesMécanismes de la réplication chez EColiMécanisme de la réplication chez les eucaryotesMécanismes de la réparation
E: La TranscriptionLes prokaryotesLes eucaryotes
F: La TraductionLe Code génétiqueL’initiationL’élongationLa terminaison
G : De l ’ADN aux protéinesComment cela a-t-il commencé ? ??!!
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La réplication de l'ADN chez E.coli
● Définitions élémentaires
● Mécanismes de la réplication
Origine de réplication
Initiation de la réplication
Déplacement de la fourche de réplication
Fragments d'Okazaki
● Généralités
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Généralités sur la réplicationGénéralités sur la réplication
La réplication est semiconservative
La réplication est bidirectionnelle
Les brins neo synthétisés ont une origine commune
Trois propriétés sont communes à tout système de réplication
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Réplication de la double hélice d ’ADNRéplication de la double hélice d ’ADN
En séparant les brins de l'ADN, ilest possible de copier chaque brin.
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A partir de la structure Watson-Crick du DNA on peut construire plusieurs modèle de réplication
un modèle conservatifou
semi conservatif.
Après une division
Chaînes parentales
Après 2 divisions
Modèles possibles de réplicationModèles possibles de réplication
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Expérience de Meselson et StahlExpérience de Meselson et Stahl
La première évidenceexpérimentale d'une
réplication semi-conservative
La première évidenceexpérimentale d'une
réplication semi-conservative
On cultive des bactériesE.coli dans un milieucontenant un isotope
lourd de l'Azote15N
Quand tout l'ADN estmarqué, on transfert les cellules dans un
milieu de culture avec de l'azote normal léger
14NOn prélève ensuite àdes temps variablesun échantillon de la culture et on analysel'ADN sur un gradient
de densité de ClCs
On cultive des bactériesE.coli dans un milieucontenant un isotope
lourd de l'Azote15N
Quand tout l'ADN estmarqué, on transfert les cellules dans un
milieu de culture avec de l'azote normal léger
14NOn prélève ensuite àdes temps variablesun échantillon de la culture et on analysel'ADN sur un gradient
de densité de ClCs
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La réplication est semi-conservativeLa réplication est semi-conservative
La densité de 15N est supérieure à ladensité de 14N.Si la réplication était conservative, on observeraitaprès une division deux bandes: une lourde etune légère. En réalité on observe un seule bande de densité intermédiaire. La réplication estsemi-conservative.
La densité de 15N est supérieure à ladensité de 14N.Si la réplication était conservative, on observeraitaprès une division deux bandes: une lourde etune légère. En réalité on observe un seule bande de densité intermédiaire. La réplication estsemi-conservative.
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Modèles possibles de réplication Modèles possibles de réplication Unidirectionnelle ou BidirectionnelleUnidirectionnelle ou Bidirectionnelle
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La réplication est bidirectionnelleLa réplication est bidirectionnelle
La microscopie électronique nous montreque la progression de la réplication estbidirectionnelle ce qui est confirmé parune expérience de marquage à lathymidine tritiée.
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Mode d'action des DNA polymérases
La réplication de l'ADN est catalysée par une DNA polymérase DNA dépendante
La réplication nécessite un modèle l'ADN matrice et une petite séquence oligonucléotidique, l'amorce ou primer.
Les substrats de la DNA polymérase sont les 4 désoxynucléotides triphosphate: dATP, dGTP, dCTP et dTTP
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DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase DNA dépendante
Cette enzyme recopie de l’ADN en ADN.
Elle nécessite une amorce d’acide nucléique.
Amorce avec une extrémité 3’-OH libre
La réaction catalysée est:(dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi
La nouvelle chaîne est synthétisée dansle sens 5’ 3’
Règle de complémentarité et de polarité inverse
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L' ADN POLYMÉRASEL' ADN POLYMÉRASE - Un brin d'ADN matrice- Un brin d'ADN matrice
- Une amorce oligonucléotidique- Une amorce oligonucléotidique
- Une synthèse du brin nouveau 5'- Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'
3'(OH)3'(OH) 5'5'
5'5' 3'3'
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ThyGua
Cyt
La formation de la liaison ester entre le 3'OH du nucléotide n et le phosphate α dunucléotide n+1 entraîne l'éliminationd'un pyrophosphate
La polymérase sélectionnela dATP car la thymine estcomplémentaire de la Guanine
La polymérase sélectionnela dATP car la thymine estcomplémentaire de la Guanine
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Polymérisation des nucléotidesPolymérisation des nucléotides
Séquence Quick Time dans Réplication (Polymerisation des nucléotides)
