Intérêts de la Intérêts de la culture culture

cellulairecellulaire

L'industrie des biotechnologies s 'est développée de façon exponentielle ces dernières années.

L'Europe compte à présent plus de 1500 entreprises actives. La croissance des biotechnologies s'appuie essentiellement sur une communauté technologique formée par les universités et les entreprises comme l'illustre l'éclosion des biovallées.

La cellule eucaryote est au cœur de cet enjeu économique du 3° millénaire.

En effet, elle constitue un véritable laboratoire vivant utilisé pour tester, par exemple, de nouveaux médicaments, ou encore dans des études plus fondamentales du fonctionnement et de la régulation d'un gène nouvellement identifié et de son produit.

Elle représente aussi un moyen de transférer un ou plusieurs gènes dans l'organisme.

De plus, la cellule peut être une usine productrice de molécules à usages thérapeutique et diagnostique.

Enfin, les récents progrès accomplis dans la connaissance des cellules souches annoncent de nombreuses applications notamment en médecine régénératrice.

Techniques générales de culture cellulaire

Mesure de la viabilité cellulaire et de la croissance

Caractérisation de la différenciation cellulaire

Mesure du cycle cellulaire

Clonage cellulaire

Transformation cellulaire

expression génique

Moyen d ’étude in vivo de la cellule « en entier »

Mécanismes oncogéniques

traitement ciblés

Identification cellulaire (ontogénese)

ex hématopoïèse

Production de cellules /tissus à visée thérapeutique

« ingénierie tissulaire » / thérapie régénératrice

Méthode diagnostique

Mécanismes oncogéniques / traitements ciblés

Ex les Leucémies Aigues (LA)

Hémopathies malignes caractérisées par un blocage de l ’hématopoïèse, associé à l’accumulation de cellules anormales , les cellules blastiques

pronostic très défavorable probabilité de guérison par chimiothérapie environ 30% sauf pour un type particulier :

la leucémie aigue promyélocytaire (LAM3)

LAM3

Formation d ’un gène de fusion codant pour une protéine de fusion

PML-RAR

Différenciation d ’une lignée cellulaire promyélocytaire, en présence d ’Acide Rétinoïque

Utilisation ATRA systématique dans le traitement d ’induction des LAM3

La leucémie myéloïde chronique (LMC)

Hémopathie myéloïde chronique caractérisée par l’accumulation des cellules de la lignée granuleuse (myélémie) et le risque d ’évolution vers une LA (acutisation)

t(9;22)

Leucémie myéloïde chronique

Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor

Blood, Vol. 96 No. 3 (August 1), 2000

Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia

N Engl J Med. 2002 Feb 28

CSH Totipotentes

-autorenouvellement

-différenciation

capacité de générer l’ensemble des cellules du sang périphérique

Précurseurs

Morphologiquement identifiables

Prolifération

Maturation

Progéniteurs différenciés

-cellules engagées dans une voie de différenciation régulée par des facteurs de croissances

-pas d ’autorenouvellement

-prolifération++

Étude de l ’hématopoïèse

Erythrob laste

M yélocyteneutrophile

P romonocyte

M égacaryocyte

M yélocyteéosinophile

M yélocytebasophile

E rythrocyte

Polynucléa ireneutrophile

M onocyte

Polynucléa ireéosinophile

Polynucléa irebasophile

M acrophage

P laquettes

myélogramme NFS

?

Progéniteurs différenciés

-cellules engagées dans une voie de différenciation régulée par des facteurs de croissances

-pas d ’autorenouvellement

-prolifération

-pas d ’identification morphologique

Cellule-souchepluripotente

Cellule-souchelymphoïde

Cellule-souchemyéloïde (CFU-GEMM)

Pré-T

Pré-B

BFU-E

CFU-GM

CFU-MK

CFU-Eo

CFU-Ba

Lymphocyte T

Lymphocyte B

Erythroblaste

Myélocyteneutrophile

Promonocyte

Mégacaryocyte

Myélocyteéosinophile

Myélocytebasophile

Lymphocytetransformé

Plasmocyte

Erythrocyte

Polynucléaireneutrophile

Monocyte

Polynucléaireéosinophile

Polynucléairebasophile

Macrophage

Plaquettes

CD 34+CD 38-LIN-DR-CD45 RO LO WCK IT LO W

CD34+Thy 1+CD10+CD45 RA +

CD3/CD1CD4/CD8

CD34+CD33-CD38+DR+LIN-

DRA C1

ID34+ /33+CD13+

CD41/42±

G pa

CD13/15

CD13/15/11b

CD41/42

G pa

CD13/15/11b

CD14

CD41CD42

CD38

Cy to µ+

s Ig+

FACS

Erythrob laste

M yélocyteneutrophile

P romonocyte

M égacaryocyte

M yélocyteéosinophile

M yélocytebasophile

E rythrocyte

Polynucléa ireneutrophile

M onocyte

Polynucléa ireéosinophile

Polynucléa irebasophile

M acrophage

P laquettes

myélogramme NFS

Cul

tures

CFU-GM

CFU-MK

CFU-E

CFU-Eo

CFU-Ba

Cellules Souches Hématopoïétiques Cellules Souches Hématopoïétiques totipotentestotipotentes

CSH Totipotentes

-autorenouvellement

-différenciation

capacité de générer l’ensemble des cellules du sang périphérique

Identification des cellules souches myéloïdes par le système de culture à long terme (Dexter)

système de culture à long terme adapté aux cellules souches lymphoïdes (Witlock)

Caractérisation en cytométrie de flux

Modèles animaux

Culture long terme (LTC) Système « Dexter »

Culture 15 j.+SH / SVF / HydroC

Irradiation à J 15

MHN

échantillonà tester

Culture 5 semaines

Nbre de CFU-GM = LTC-IC

= progéniteurs myéloïdes

Identification des progéniteurs myéloïdes

Test cells

Myeloid LTCmedium33°C

4 weeks

Lympoid LTCmedium

33°C

CFU-pre-B

Epo +PWM-SCCM

BFU-ECFU-GMCFU-GEMM

SF + IL-7

1 week

Switch

Identification des progéniteurs lymphoïdes

In vitro identification of human pro-B cells that give rise to macrophages,natural killer cells, and T cellsDamien Reynaud, Nathalie Lefort, Elodie Manie, Laure Coulombel, and Yves Levy-Blood 2003

Cellules de sang de cordon

CD34+/CD19-/CD10-

Culture sur lignée stromale (feder)

+ IL2 / IL15 / SCF

Tri sous population CD127+ (IL7a Rcp)

Tests de différenciation cellulaire in vitro

culture en milieu liquide + cytokines

Cellule NK

macrophages

Cellule T

Modèles animaux

Capacité des CSH de produire chez un receveur irradié des cellules matures fonctionnelles des lignées myéloïdes et lymphoïdes B et T

*Souris immunodéficientes tolérantes aux greffes xenogéniques (souris SCID, NOD-SCID)

*Système xenogénique homme /mouton

receveur = fœtus de mouton, système immunitaire non fonctionnel donc tolérance vis à vis des cellules humaines

possibilité de développement d ’une hématopoïèse humaine durable et transplantable à des receveurs secondaires

Intérêt : mesure du potentiel de reconstitution in vivo de CSH

test in vivo de facteurs régulant l ’hématopoïèse

Intérêts des cultures de progéniteurs médullaires pour le diagnostic des syndromes myéloprolifératifs (PV et TE).

Hémopathies caractérisées par une production excessive de GR et/ou de plaquettes

Anomalie des cellules souches hématopoïétiques :

*prolifération non contrôlée

*possibilité de croissance en milieu sans sérum et sans cytokine

Valeur diagnostique de la présence d ’une croissance « spontanée » (EEC/EMC) en culture clonogénique

Diagnostic des Thrombocythémies Essentielles

Critères positifs

*plaquettes > 600G/L

*BOM : augmentation du nombre de MK

/myélofibrose

Critères d’exclusion

* pas de PV

* pas de LMC

* pas de myélofibrose idiopathique

*pas de syndrome myélodysplasique

*pas de thrombocytose secondaire

WHO classification of tumors PVSG classification

TE : valeur diagnostique des cultures clonogèniques

Critères positifs

*plaquettes > 600G/L

*BOM : augmentation du nombre de MK

Critères d ’exclusion

* pas de PV

* pas de LMC

* pas de myélofibrose idiopathique

* pas de syndrome myélodysplasique

* pas de thrombocytose seondaire

?CFU-MK

The determination of spontaneous megakaryocyte colony formation is an unequivocal test for discrimination between essential thrombocythaemia

and reactive thrombocytosis.

EMC 24/24 TE0/20 TS 0/18 sujets sains11/20 PV + Thrombocytoses. 7/16 CML +Thrombocytoses.

EEC 21/24 EEC0/20 TS20/20 PV + Thrombocytoses.1/16 CML + Thrombocytoses.

Rolovic Z. et al. British Journal of Haematology 1995

Standardization and comparison of endogenous erythroid colony assaysperformed with bone marrow or blood progenitors for the diagnosis of

polycythemia veraThe Hematology Journal (2003) 0, 000–000

A STANDARDIZED ENDOGENOUS MEGAKARYOCYTIC / ERYTHROID COLONY(EMC/EEC) ASSAY FOR THE DIAGNOSIS OF ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA

Quels milieux de cultures ?

Quelle reproductibilité ?

Intérêt de la standardisation

Quelle valeur diagnostique ?

CFU-MK

BFU-E

Ingéniérie tissulaire / thérapie cellulaire

De nombreuses pathologies résultent d ’une perte ou de l ’atteinte d ’un organe entraînant une perte de cellules spécialisées , non compensée

maladie de Parkinson, déchirures méniscales, maladie autoimmune (DID) IDM…...

La possibilité de réparer ces atteintes par « remplacement cellulaire » devrait permettre la restauration de la fonction normale

Intérêt majeur sur la production de cellules/tissus normaux dans un but thérapeutique / médecine régénérative

Thérapie cellulaire autologue

Principe : prélever des cellules/tissu différenciés sur le receveur,

expansion in vitro/ex vivo

ré-introduction sur le site de la lésion pour « réparation »

Intérêt ; pas de conflit immunologique

Limite : quantité de matériel disponible

Exemples

réparation de déchirure méniscale par la production ex vivo de chondrocytes autologues

Fibroblaste pour brûlure sévère

Myocytes pour réparation cardiaque

Cellules ES et thérapie autologue

Tissus allogéniques et lignées cellulaires

*transplantation d ’organe,

*lignée cellulaire continue

ex lignée humaine neuronale et AVC

*tissu allogénique

Thérapie cellulaire allogénique

Cellules souches allogéniques

*greffe allogénique de moelle ou de CSP

dans les hémopathies autres pathologies

*cellules ES allogéniques

Tissue engineering and cell based therapies, from the bench to the clinic: The potential to replace, repair and regenerate

William L. Fodor1

Reprod Biol Endocrinol. 2003 Nov 13; 1(1): 102

Différenciation de Cellules ES de souris

Cellules ES

Corps embryoïdes

Précurseurs

neuronesastrocytes

ologodendrocytes

Cellules ES Précurseurs

Précurseurs

Précurseurs oligodendrocytaire

Précurseurs gliaux

Précurseurs motoneurones

Neurones dopaminergiques

Applications en thérapie cellulaire

1) Expansion cellulaire

Objectif : produire de grande quantité cellulaire à visée thérapeuthique

Ex : expansion de cellules hématopoïétiques

culture de kératinocytes

Ingéniérie tissulaire / thérapie cellulaire

2) thérapie génique

correction d’un déficit par transfection virale de cellules

ex : correction de déficits immunitaires héréditaires liés à l ’X, par greffe de CSH,

Difficultés technique ++

! prolifération clonale maligne induite par le retrovirus !

Transplantation d’Îlots PancréatiquesTransplantation d’Îlots Pancréatiques

• TechniqueTechnique

• Résultats actuelsRésultats actuels

• PerspectivesPerspectives

F. Bayle - PY. BenhamouDDépartement d’UUrologie - NNéphrologie - EEndocrinologie - CHU GrenobleGGroupe RRhin Rhône-AAlpes Genève pour la GGreffe d’ÎÎlots de LLangherans

Tours Octobre 2003

Prélèvement Prélèvement

ConditionnementConditionnement

du Pancréas à l’Îlotdu Pancréas à l’Îlot

DigestionDigestion Îlots avant purificationÎlots avant purification

TamisageTamisage

Purification : Purification : CentrifugationCentrifugationGradient de FicollGradient de Ficoll

Îlots purifiésÎlots purifiés(Coloration Dithizone)

LavageLavage

TransportTransport

ConditionnementConditionnement

Sécurité sanitaireSécurité sanitaire

ComptageComptage

Test fonctionnelTest fonctionnel

Injection intra-hépatique : :

Contrôle écho + scopieContrôle écho + scopie Anesthésie locale Anesthésie localeCathétérisme portal Cathétérisme portal Injection des Îlots Injection des Îlots