INTRODUCTION

Différentes spécialités médicales ou scientifiques permettent l'études des tissus. Parmi elles la biologie moléculaire, biochimie.. Utilisent le plus souvent des automates (ex automates d'hématologie Cytométrie de flux elle permettent de quantifier, elles permettent de mesurer des produits solubles mais ne permettent pas de voir le matériel prélevé. Ce sont des méthodes basées sur des dosages ou des mesures

L' ana path est une méthode d'étude basée essentiellement sur l'image qui permet l'identification des cellules. Elle nécessite de ce fait une préparation particulière des échantillons. Elle permet plus difficilement une quantification.

Une étude d'un tissu en Ana-Path va demander une excellente conservation donc une très bonne fixation .

La zone intéressante de l'échantillon (repérage macroscopique) sera préparée de manière à permettre la confection de coupes fines (inclusion, coupe)

la reconnaissance des tissus ou des ilots cellulaires passent le plus souvent par une coloration et donc nécessite une réaction colorée stable qui se fixe spécifiquement sur la structure à étudier.

Elle s'appuie souvent sur un marquage immunologique (Immunohistochimie, immunofluorescence)

On cherche toujours à conserver une ressemblance maximum entre l’aspect sous le microscope et l’aspect à l’état vivant.

On dispose de différents moyens techniques pour conserver un échantillon biologique

La fixation est souvent la première étape de la chaîne de

préparations de ces échantillons. Pourquoi fixer?Une fois prélevé un tissu subit des modifications + ou- importantes. On doit, soit recréer les conditions d’origine (impossible), soit figer en l’état (tuer) les constituants le plus tôt possible pour immobiliser les structures

La fixation inhibe l’autolyse

Quand une cellule meurt la membrane des lysosomes est détruite les enzymes digestives cathepsines sont libérées dans le cytoplasme

La fixation empêche la putréfaction

C’est la destruction des tissus par les microorganismes certains appartiennent à la flore normale cela donne un phénomène équivalent à l’autolyse et il peut y avoir libération de gaz qui entraîne la formation de microcavités donnant un aspect de vacuolisation.

•Elle rend le tissu capable de supporter les traitements ultérieurs avec un minimum de déformationsLa fixation fige les molécules in situ, notamment les antigènes, et préserve l'aspect structural du tissuToutefois elle peut entrainer d’autres effets •Elle provoque la solidification du matériel colloïdal par réticulation du gel cytoplasmique genant la diffusion des réactifs à l'intérieur du tissu.Les fixateurs peuvent ainsi inhiber plus ou moins les immunoréactions• une modification des antigènes et changer leur affinité pour les anticorps

Artefacts de fixation

Le fixateur peut aussi être responsable d’autres artefacts:

Durcissement des tissus

Modification du volume des tissus

Modification des affinités tinctoriales des tissus (mordançage)

Fluorescence indésirable.

Pigments

Effet de la fixation sur l’indice de réfraction des tissus

L’indice de réfraction des structures cellulaires est homogène et de l’ordre de 1.35.

On ne peut donc pas les différencier sur des coupes fraîches non colorées;

La fixation peut modifier l’indice de réfraction des éléments cellulaires de manière particulière.

On pourra les différencier avant toute coloration.

Différents types de fixateurs: On dispose de différents types de fixateurs. On peut les classer selon leur mode d’action.

•Dénaturation

Méthode physique: chaleur, microondes dessiccation.

La chaleur est aussi une méthode de déshydratation Ce sont toujours des méthodes dénaturantes

Méthode chimique:

Solvants organiques alcool, acétone, sprays… qui agissent comme agents déshydratants (dénaturation)

• Fixateurs chimiques additifs

Fixation des lipides

Les lipides complexes liés aux protéines peuvent être conservés par les fixateurs additifs.

Les triglycérides et les esters de cholestérol conservés par le formol, sont extraits par les solvants organiques, alcool-acétone, éther (fixateurs dénaturants) et toluène, xylène ..qui interviennent au cours de la technique de préparation des blocs.

Leur étude passe par la congélation.

Fixation des glucides:

Les polysaccharides:

le principal est le glycogène. Il peut se trouver sous 2 formes, libre (soluble dans l’eau)ou polymérisée et liée à des protéines.

On cherche à préserver la forme libre dont la molécule est hydratée. Les agents déshydratants entraînent un perte de ces molécules d'eau et une dénaturation du glycogène libre avec perte de

solubilité et précipitent ces glucidesDe plus il est possible que les aldéhydes induisent des ponts intermoléculaires modifiant ainsi les propriétés de solubilité du glycogène.Ils sont préservés par la congélation

Fixation des acides nucléiques

Ils sont conservés par les fixateurs dénaturants mais ils

peuvent être fragmentés.

Ils sont hydrolysés par les acides

Le formol entraine la création de pontage de l’ADN avec les histones; ces pontages ADN-proteines sont moins stables que les pontages proteines-proteines , mais cette propriété est utilisée lors des techniques d’immunoprécipitation chromatinienne.

Fixation des protéines On s’intéresse surtout à la fixation des protéines qui forment un réseau tridimensionnel autour duquel on conserve d’autres molécules.

•Il est essentiel de bien les fixer pour conserver une bonne morphologie.

•Il faut inactiver les enzymes responsables de l’autolyse.

Il est nécessaire de connaître les modifications apportées par le fixateur, aux caractères physiques et chimiques des protéines tissulaires.On pourra ainsi choisir le fixateur le plus approprié à la recherche que l’on veut effectuer.

Les fixateurs dénaturants:

Ils modifient la structure tertiaire des protéines

Inactivent les sites enzymatiques et préservent les sites antigéniques, ils insolubilisent les protéines.

Parmi les méthodes de fixation dénaturantes physiques

•La dessiccation simple séchage•La lyophilisation ou évaporation lente, sous vide, de la glace, contenue dans l’échantillon congelé •La chaleur (cocotte minute, micro-ondes) est utilisée couramment pour démasquer les sites antigéniques sur les coupes déparaffinées avant marquage en immunohistochimie

Depuis quelques années plusieurs auteurs ont montré que la chaleur, généralement fournie par un four à micro-ondes, mais aussi par d’autres systèmes de chauffage comme par exemple un autoclave ou un bain-marie,pouvait être un excellent fixateur pour les réactions immunohistochimiques.Les micro-ondes pénètrent instantanément et profondément dans les tissus et bloquent ainsi très rapidement le processus d’autolyse.Certains auteurs préconisent une fixation au micro-ondes, de 5mn, dans une solution de NaCl sans autre fixateur

Les fixateurs déshydratants:L’un des rôles de l’eau dans les organismes vivants est de maintenir en solution les différents constituants cellulaires, en particulier les protéines. Si l’on enlève l’eau, les protéines "collent" entre elles (leurs charges ne sont plus neutralisées par le dipôle de l’eau) : la structure du tissu est ainsi figée.

La dénaturation d’une protéine par élimination de l’eau modifie sa structure tertiaire, la molécule peut exposer ses sites hydrophobes vers le solvant

Les agents chimiques déshydratants

Ethanol

Utilisé à des concentration supérieure à 80% pour la fixation

Il dénature les protéines ce qui entraîne leur coagulation. Une déshydratation sans dénaturation protéiques est observée à -15°C L’éthanol est utilisé en mélange avec du formol ou même seul pour fixer les frottis.

H H

H C C OH

H H

Ethanol Alcool éthylique

Acétone dimethylcétone propanone

est utilisé pour la fixation des coupes à congélation, avant marquage en immunofluorescence.

Elle permet l’extraction des lipides favorisant ainsi la mise en évidence des antigènes membranaires .

Comme l’éthanol, l’acétone provoque un déformation de la structure des protéines qui peuvent exposer leurs sites hydrophobes vers le solvants

Acétone

Méthanol

(toxique)

Méthanol

Action similaire à l’éthanol, comme l’acétone et l’éthanol il provoque un durcissement important des tissus les rétracte

Les solvants déshydratants sont utilisés également au cours de la déshydratation, avant inclusion dans un milieu hydrophobe, souvent après passage dans d’autres fixateurs, et entraîneront l’élimination des molécules solubles non fixées.(lipides)

Fixateurs précipitants

Acide picrique explosif sous forme anhydreIl précipite les protéines,c'est une molécule polaireIl se fixe par son oxygène négatif sur des molécules chargées positivement.Modifie leur solubilité

Inhibe la TAQ polymerase et casse les molécules d'ADN par création de lien entre les histones qui entourent l'ADN

=>pb analyse quantitative ou qualitative de l'expression genique des tissus

Acide acétiqueIl précipite les acides nucléiques et améliore ainsi l’aspect des noyaux. On le trouve dans la composition deplusieurs fixateurs (Bouin, Carnoy…) On l’utilise en solution à 5% en mélange pour ses effets de gonflement et de tolérance (ne durcit pas les tissus), lorsque l’on veut contrecarrer les effet de fixateur qui rétractent ou durcissent

Les fixateurs additifsIls créent des ponts intra- et inter-moléculaires, ce qui immobilise les molécules.Aldéhydes (contraction de alcool déshydrogéné)Ils ont pour formule générale :

R C=OH

Ils réagissent essentiellement avec les groupements aminés des protéines. Les plus couramment utilisés sont Le formaldéhyde, (formol)Le glutaraldéhyde (en microscopie électronique

Formaldéhyde H C=O

H C'est l'agent de fixation le plus souvent utilisé, seul ou en combinaison avec d'autres réactifs dans de très nombreux fixateursMécanisme d’action du formaldéhyde sur les protéines Il réagit avec les composés ayant un hydrogène actif : les groupes amine, imine, hydroxyle, carboxyle, sulfhydryle, pour former des ponts méthylène entre les chaînes protéiques et à l’intérieur même d’une protéine La plupart des réactions entre formol et protéines sont réversibles une partie du formol reste fixé aux protéines (groupes aminés

R

R C

OH=NH2

OHR HYDROXYLE

R SH SULFHYDRYLE ou THIOL

R NH2 AMINE

R C

OH=O CARBOXYLE

IMINE

H H

C=O +R NH2 R N C OH + H2N R’

H H H

H H

R N C N R’ + HOH

H H

Effet des aldéhydes sur les protéinesRéaction fonction amine et aldéhyde addition

condensation

constitution d’un groupement hydroxyméthylé instable réagit avec un autre groupe formation d’un pont méthylène

Effets du formol sur les protéines

V Labas & collNeurobiologie et diversité cellulaires CNRS/ESPCI UMR 7637

Le formol peut réagir avec les chaînes latérales des résidus Lys Arg His Cys. La proportions des espèces peptidiques évoluent avec le temps jusqu'à atteindre des formes de plus en plus modifiées peut aller jusqu'à disparition des peptides intactes

Le formol accentue la basophilie des structures.

Le formaldéhyde réagit avec certaines amines pour donner des composés fluorescents dont la longueur d’onde d’émission varient selon les protéines fixées.Cette fluorescence peut gêner l’interprétation des réactions d’immunofluorescence.

Effet du glutaraldéhyde sur les protéines

C’est un dialdéhyde il va s’associer à 2 groupement aminés

R’

H2N

R

H2N

Le glutaraldéhyde est un bon fixateur mais de pénétration lente

Le glutaraldéhyde

Il est utilisé en protocole standard de fixation en microscopie électronique car il préserve bien l’ultrastructure cellulaire. Il souvent suivi d’une postfixation au tretroxyde d’osmium

L’utilisation du glutaraldéhyde entraîne un fluorescence jaune-vert avec les filtres pour la fluoresceine et rouge-orange avec les filtres pour la rhodamine. Cette fluorescence gênante est probablement due au liaison imines C=N car elle disparaît si on réduit ces doubles liaisons. Le glutaraldéhyde n’inhibe les réactions antigène-anticorps et peut être utilisé en mélange avec du formaldéhyde en immunohistochimie

Le tétroxyde d’osmium

Lipide insaturé

Tétroxyde d’osmium

Ce fixateur agit surtout sur les doubles liaisons des lipides insaturés. Il peut être utilisé pour des fixations en vue d’un marquage immunohistochimique. Il inhibe la fluorescence due au glutaraldéhyde. Il provoque un noircissement des structures et peut entraîner un échauffement lors de la polymérisation

O

O

ROH

+

O

O

RO

O

O

RO

R’NH2 +

OH

OH

RO

NHR’

BenzoquinoneProtéine

Groupe hydroxyle

ProtéineGroupe aminé

Benzoquinone

Acide tannique:

C7H6O5

Acide picrique:

Forme des composés d'addition avec les protéines: les picrates

Fixateurs additifs utilisés en histologie

•Formol tamponné: Ce fixateur pénètre rapidement et de façon continue. Il provoque un léger durcissement des tissus ce qui est un avantage pour la dissection.

C’est un très bon fixateur tissulaire, peu déshydratant (limite les déformations).Les pièces peuvent y rester assez longtemps sans altérations majeures. C’est un assez mauvais fixateur cellulaire pas d’étude des grains. C’est un fixateur de faible coût.

A température et pression du laboratoire le formol est un gaz incolore et inflammable. On le trouve dans le commerce en solution saturée dans l’eau (à 40%) on l’utilise à 10% de la solution mère soit 4%

Il polymérise facilement sous la forme de paraformaldéhyde, aussi les solution du commerce sont stabilisée par 10% à 20% de méthanol Les solutions de formol du commerce peuvent être stabilisées au méthanol et il est préférable de le préparer extemporanément à partir de paraformaldéhyde par débobinage à chaud du polymère.

On l’utilise en solution tamponnée

On utilise souvent des mélange de différents types de fixateurs:•Bouin aqueux : formol + acide acétique +acide picrique. Très bon fixateur pour les petites pièces (pénétration lente) mais il provoque un durcissement important des tissus et donne une coloration jaune•Dubosc Brazil (Bouin alcoolique): plus pénétrant que le bouin aqueux utilisé pour des petites biopsies notamment les PBR

Rappel:l’acide picrique inhibe la TAQpolymérase.

A.F.A. Alcool Formol Acétique pénétration similaire au Dubosc Brazil sans acide picrique permet une éventuelle technique de PCR

D’un coût modéré et polyvalent, il est de plus en plus employé

Préparation de la solution de fixation

La solution doit répondre à certaines contraintes.

Contraintes liées à la pression osmotique:

La membrane cellulaire de la cellule vivante est assimilée à une membrane semi-perméable=> passage d'eau et de certains ions.

La cellule vivante est en permanence en équilibre avec le milieu dans lequel elle baigne.

Cette semiperméabilité n'est pas détruite par les fixateurs aldéhydiques

.

La solution fixatrice doit être osmotiquement équilibrée par rapport au milieu cellulaire du tissu étudié

vertébrés: 300mOsM

invertébrés marins: 1100 mOsM

Osmole: unité (non SI) représentant le nombre de particules qui peuvent être osmotiquement actives (attirer les molécules d.eau).

Osm = C[1 +a(n-1)] C= concentration molaire, mol/l =coeff de dissociation du soluté (0 pas de dissolution, 1 dissolution totale) n= nombre de particules obtenue par la dissolution (ex: glucose=1; NaCl=2

Solution hypotonique

Solution hypertonique

Solution isotonique

Effet de la pression osmotique dans le tampon de préparation des fixateurs

H2O

H2O

Solution tampon isotonique + agent fixateur rétractant

Solution isotonique

Effet rétractant de certains fixateurs

Contraintes liées au variation du pH

Lors d'une fixation il faut tenir compte de l'acidification du milieu au cours du temps le pH des solutions est maintenu de façon à conserver des valeurs proches de celle du milieu vivant étudié, par des systèmes tampons (mélange de substances ionisées susceptibles de fixer les ions H+ dans le milieu).

On utilise surtout le tampon phosphate (tampon minéral)

Mammifères: Bactéries Végétaux supérieurs

pH (sang) = 7,3 pH = 6,8 pH = 7 à 7,2

Le pH a un rôle essentiel au niveau des protéines:

- conformation La charge varie avec le pH : en milieu acide, les protéines s'ionisent comme des bases et sont chargés positivement. En milieu alcalin, elles forment des anions.

- polymérisation - dissolution minimum de solubilité à pHi

Choix du fixateurDépend

•du volume de la pièce

•Des traitements que l’on souhaitera effectuer par la suite, et donc, des effets du fixateur sur les structures que l’on souhaite tout particulièrement étudier.

•Du coût et de son impact sur l’environnement

Comment fixer?La fixation se fait en général par immersion dans un bain de fixateur. On plonge rapidement la pièce dans un grand volume de fixateur (on ne doit pas ajouter le fixateur sur la pièce déposée dans un pot vide)

Il faut veiller à ce que la nature du pot à prélèvement soit compatible avec le fixateur.(ex.Acetone choisir un contenant compatible)

On peut accélérer la fixation dans un four à microondes

En recherche la fixation peut être réalisée par perfusion sur l’animal anesthésié. Nous n’avons pas vu de différence avec une fixation au microondes

La préparation de l’échantillon au moment de la fixation permet de lever certaines contraintes liées au fixateur lui même

Contraintes liées à la vitesse de pénétration dans l’échantillon

La fixation doit être rapide. La vitesse de diffusion varie d’un fixateur à l’autre, la qualité de fixation aussi.

Vitesse de pénétration du fixateur

Le formol pénètre le prélèvement à une vitesse de 1mm à 1,5mm/ heure

=> Faire des tranches pour les échantillons volumineux

Durée de fixation: elle dépend du fixateur lui même et du volume du prélèvement. En général, pour la microscopie optique, elle dure plusieurs heures à plusieurs jours suivant le fixateur et le volume de la pièce.

Pour l’histologie standard elle s’effectue à température ambiante.

En microscopie électronique on place les prèlevement à4°C pendant toute la durée de la fixation

On ne doit pas négliger les effets secondaires:

Réversibilité de la réaction nécessitant une saturation des sites aldéhydes par la glycine dans certains cas (cf immuno)

Interaction avec d’autres groupements des molécules à fixer introduction possible de bruit de fond (ex autofluorescence)

La congélation

Elle permet une conservation des tissus par immobilisation par le froidTumorothèque IF Examens extemporanés Microscopie électronique

Intérêt en histologie

Conservation des sites antigéniquesDurcissement rapide des tissus pour coupe de qq micromètresEtudes de tissus qui ne supportent pas d’agents déshydratants

MéthodeCongélation immédiate dans N2 liquide -196°

Une congélation lente (-30°C) endommage les tissus par formation de micro cristaux de glace qui continuent à se développer au congélateur et entraînent des artefact d’architecture une hyper tonicité  du milieu intercellulaire de plus en plus marquée au fur et à mesure de la croissance des cristaux

De plus, il est important de limiter les phénomènes de caléfaction La caléfaction ( du latin calefacere : chauffer) est un phénomène d'isolation thermique d'un liquide par rapport à une surface chaude ayant atteint une température seuil Ts supérieure à la température

d'ébullition du liquide Te. Ce phénomène est dû à la formation d'une

couche de vapeur entre la surface chauffante et le liquide, rendant le Transfert thermique beaucoup plus lent

La caléfaction est couramment observée quand une goutte d'eau tombe sur une poêle très chaude. La goutte semble rouler sur la surface et ne se vaporise pas immédiatement .

Pour limiter les effets de caléfaction on congèle dans l'ispentane préablement refroidit en donnant un mouvement de rotation à l'échantillon pour evacuer le nuage de vapeur créé au contact du liquide froid et favoriser le gradient thermique entre l'acier chaud et le liquide de congélation.

Cette méthode permet une congélation plus RAPIDE et plus HOMOGENE

En dessous de -130°C on peut stocker des échantillons sans altérations majeures (conservation de réplication cellulaire conservation des sites antigéniques…)

CONCLUSIONPas de fixateur idéal, quelques exemples

Analyse morphologique en microscopie photonique:

Formol tamponné AFA (Bouin !)Analyse morphologique en microscopie électronique:

Glutaraldéhyde

Analyse des lipides

congélation est indispensable recours à des résines hydrosolubles polymérisant à froid est parfois nécessaire pour permettre une bonne analyse morphologiqueAnalyse des protéines par immunohistochimie

Formol tamponné AFA ParaFormaldehyde préparation extemporannée

Immunofluorescence

Congélation, paraformaldéhyde

Analyse des ARN après extraction:

congélation indispensable - conditions très strictes

Temps d'ischémie moins de 30 minutes, 50% environ des ARN détruits après 1 heure d'ischémie

Matériel RNAse free (absence de contact avec les RNAses cutanées)Analyse de l'ADN après extraction

la congélation préférable à la fixation: la fixation risque d'empêcher l'analyse desegments d'ADN longs (plus de 350 paires de bases) et entraîne des altérations artefactuelles qui peuvent être faussement interprétées comme des mutations.

Si l fixation est nécessaire ( qualité morphologique)

Pas de fixateurs acides (Bouin AFA)=> hydrolyse de l'ADN

Utiliser formol tamponné ou Paraformaldehyde

Hybridation in situ :

Congélation, formol tamponné paraformaldéhyde

Et après…

Après la fixation les prélèvements subissent d’autre traitements :

• déshydratation

• inclusion

• coupe

•Éventuellement marquage

Les lames seront ensuite colorées et lues