BIOCHIM1E, 1974, 56, 99-108.

Isolement de la transcortine humaine par chromatographic

Franc is LE GAILLARD, Andr6 RACADOT, Nicole RACADOT-LERoY et Michel DAUTR~-VAUX.

L a b o r a t o i r e de C h i m i e B i o l o g i q u e , Facu l t~ de M ~ d e c i n e , P l a c e de V e r d u n , 59045 L i l l e - C e d e x .

(10-7-1973).

d affinlte.

Summary . --- Human transcortin is isolated from serum by affinity chromatography followed by hydroxyapatite chromatography. The ligand sepharose is prepared by coupling periodic acid oxidized corticosterone with amino-Sepharose through dieyclo- hexylearbodiimid. The affinity gel so obtained is stable, its aetivity keeps always the same after 28 ehromatographies. Transcortin is o b t a i n e d pure w i t h a n a b o u t 50 p. cent yield.

A - - INTRODUCTION.

La t ranscor t ine humaine , ou C.B.G. (*) 6tait, encore r6cemment, isolde par des techniques ayant pour base une chromatographic d '6change d ' ions et plusieurs chromatographies d 'adsorpt ion sur hydroxyapat i te [!1]; une pur i f icat ion par plu- sieurs ehromatographies de gel-filtration 6tait en outre n6cessa i re : Slaunwhitc et al. [2] terrni- na ient la pur i f icat ion par gel-filtration sur Sepha- dex 675, Muldoon et Westphal [3] par gel-filtra- t ion sur Sephadex 6200. Afin de pouvoir t ra i ler de plus grandes quanti t6s de s6rum, ces derniers comrnen~aient le f rac t ionnement par un relargage au sulfate d ' ammonium, tandis que Lebeau et Bau- lieu [4] ut i l i sa ient la f ract ion IV~ obtenue par pr6cipi ta t ion 6thanolique de Cohn. Nous avons essay6 ces m6thodes classiques : ces protocoles sont tr6s longs et ne nous ont pas permis l 'obten- t ion d'nn.e t ranscor t ine pure puisque nous avons toujours d6cel6 la pr6sence d 'au moins un conta- m i n a n t par 61ectrophorbse en gel de polyacryla- mide et par immuno61ectrophor6sc ; le r endement est d 'autre par t faible ( inf6rieur h 30 p. cent) et la t ranscor t ine obtenue se d6nature faci lement dans les derni6res 6tapes de la purif icat ion.

Plus r6cemment, en 1971, une m6thode d'isole- ment de la t ranscor t ine humaine par chromato- graphie d'affinit6 a 6t6 d6crile par Rosner et

(*) Abrdoiat ions util isdes : C.B.G. : << Corticosteroid-binding-globulin~ . P.A.B. : paramino-benzoyl. D.C.C.I. : Dieyelohexylearhodiimide. H.C.A.C. : Aeide hydroxy-llf$ e6to-3 androst6ne-4

earboxylique- 17~. D.E.A.E. : Di6thyl-amino-6thyl. Tris : Tris(hydroxym6thyl)-amino-m6thane. D C.A.C. : Aeide dihvdroxy-llfJ, 17it c6to-3 andro-

stene-4 carboxylique fTl~.

Bradlow [5] et par T r a p p e t al. [6]. Rosner et Hochberg appl iquent cette technique h l ' i so lement de la t ranseor t ine de Rat [7].

La technique de Rosner consiste h coupler l 'h6misuccinate de cortisol h de l 'amino-Sepha- rose. Le cortisol-Sepharose obtenu est mis au contact avec du s6rum et en adsorbe la l ranscor- line. Nous avons va inement tent6 d 'appl iquer cette technique : de fait, apr6s contact entre te s6rum et le cortisol-Sepharose, on pent mettre en 6vi- dence par fluorim6trie des quanti t6s tr~s impor- tantes de cortisol dans le s6rum surnageant ; m6me aprbs des lavages r6p6t6s du cortisol-Sepha- rose ~ l 'a ide de d ioxanne et de dim6thylforma- mide h 50 p. cent, nous re t rouvons du cortisol dans le l iquide surnageant : il semble que la liai- son ester de l 'h6misuccina te coupl~ h l ' amino- Sepharose soit faci lement hydrolys6e dans le s6- rum. Hubener et Schmidt ont ainsi mont r6 que les est6rases du s6rum sont capables d 'hydro lyser les esters des hormones st6roides ; ceux-ci sont no tamment beaucoup plus labiles quand la fone- l ion alcool es! p r imai re el quand l 'acide est6ri- fiant a une longue chaine (4 h 12 carbones) [8], ce qui est le eas dans le couplage de l 'h6misuc- cinate de eortisol h l ' amino-Sepharose qui a pour eons6quenee d 'a l longer cons id6rablement la ehaine aeide est6rifiant le cortisol. Lorsque du cortisol-Sepharose est eonserv6 h 4°C clans une solution ant isept ique d 'azide de sodium h 0,02 p. cent, du cortisol appara i t dans le l iquide surna- geant : sa concent ra t ion augmente avec le temps, ce qui t radui t une l ib6rat ion cont inue du eortisol rn6me en l 'absence de s6rum. Ludens et al. [9, 10] ont pr6par6 un d6oxycort icost6rone-Sepharose suivant la technique de Rosner, en u t i l i sant de l 'h~m'succ ina te de d~oxycorticost~rone ; ils

100 F. Le Gail lard el coll.

essaybrent sans succbs d ' isoler les prot6ides l iant l 'a ldost6rone dans des homog6nats de re in de Rat et expl iqu6rent cet 6chec par une l ib6rat ion de st6ro:ide h par t i r de leur complexe l igand-Sepha- rose. L ' isolement de la t ranscor t ine h l 'a ide du cort isol-Sepharose de Rosner dolt doric n6cessiter des condi t ions bien pr6cises que nous n 'avons vra isemblablement pas pu retrouver.

La technique de T r a p p et al. permet l 'obten- l ion d 'un cortisol-Sepharose sans l iaison ester, mais elle est complexe. D 'une par t on synth6tise un d6riv6 du cortisol compor tan t en posi t ion 21 une chaine thio-(p.N-1 ph6nyl ) - succ inamid ique ; d 'aut re p~rt, un amino-Sepharose ~ long bras pr6par6 en couplant du P.A.B.-Sepharose (*) avec de l 'hexane 1,6-N-l-di-p.aminobenzamide. Les deux compos6s obtenus sont coupl6s l 'un "5 l 'autre par l ' in te rmbdia i re d 'une carbodi imide hydro- soluble. A cette complexit6 de technique s 'ajoute la n6cessit6 de d61ipider le s6rum avant la chro- ma tog raph i c d'affinit6, ce que T rapp , Seal el Doe

HO,~~O--N H--(CH~h

Sepharose

H.C.A.C.-SEPHAROSE

D.C.C.I. t dioxanne

COOH H~N--(CH2)~

NH I

0 (CH~h--NH H.C.A.C. + amino.Sepharose

HIO~ t CO--CH20H

corticosterone Fro . 1. - - H.C.A.C.-Sepharose pr~par~ par couplage

de H.C,A.C: ~ de l 'amino-Sepharose, par l ' i n le rmdd ia i re de dicyclohexylcarbodiimide, en milieu dioxanne.

L'H.C.A.C. est obtenu par oxydation periodique de la eorticost~.roae. L'amino-Sepharose est obtenu par fiXatiOn' de~'~:3~: diaminodipropylamine sur du Sepha- rose 4B activ~ ~rar le bromure de cyanog6ne selon la teehnique de Cuatrecasas [23].

accomplissent par chromatographic sur DEAE- cellulose (*) ; or, le volume de s6rum qui peut 6tre fracfionn6 en une seule fois par cetie tech- nique est assez l imit6 : 200 ml avec une colonne de 500 m m X 50 [1].

Pour rem6dier h l ' instabi l i t6 du cortisol-Sepha- rose de Rosner et ~ la eomplexit6 de eelui de Trapp, nous proposons dans cette publ ica t ion un l igand-Sepharose stable et de pr6para t ion simple, qui est fond6 sur la constatat ion que les substi- tuants du carbone 21 des st6roides semblent avoir peu d ' impor tance dans l 'affinit6 de leur l iaison avec la t ranscor t in ,e ; en effet, la progest6rone [11], le 21-d6soxycortisot [!12], le 21-d6hydrocor- tisol [~13J, les esters de cort icost6rone [14] ou de cortisol [61 se l ient tous for tement ~ la t ranscor- tine. Nous avons alors tent6 de subst i tuer un atome d'azote au carbone 21 lui-m6me. Cette op6- ra t ion a 6t6 r6alis6e par oxydat ion per iodique de la cort icost6rone puis couplage du produi t obtenu (acide hydroxy-11,~ c6to-3 androst6ne-4 carboxy- lique-175 nu H.C.~.C.) fi de l 'amino-Sepharose (fig. 1).

B - - MATERIEL ET TECHNIQUES.

T o u s l e s r6actifs sont de la qualit6 << purs pour analyses)> l 'or ig ine des autres r6actifs sera indi- qu6e au fur et h mesure de la descr ip t ion des techniques ; l 'eau est d6sionis6e puis distill6e.

Le s6rum utilis6 est un ¢ pull )> d '6chant i l lons divers collect6s dans un laboratoire de biologie ci inique.

1) TECHNIQUES.

a) Techniques g~n~rales.

La concent ra t ion des prot6ines 61u6es est appr6- ci6e par mesure de l ' absorbance "~ 280 nm, soit en enregis t rement cont inu ~ l 'a ide d 'un absorptio- m6tre Gilson, soit au spectrophotomb, tre Jobin et Yvon, type Stand M.V. Dans le cas de solutions de t ranseor t ine pure, le coefficient d 'ex t inc t ion ~ ~,~/m~ 280 n m = 0,645 [3] permet d 'en calculer

1 c m

la concent ra t ion r6elle.

Le cortisol ( Ikapharm ou Merck) est dos6 par f luorim6trie selon la m6thode de De Moor el al. [~5] h l 'a ide d 'un spectrof luor imOre Jobin et Yvon.

Les solutions prot6iques ont 6t6 concen t r&s dans un apparei l h micro-ul t raf i l t ra t ion Amieon 6quip6 de membranes Diaflo, type PM 10.

L'affinit6 des pr6para t ions de t ranscor t ine pour le cortisol a 6t6 mesur6e par dialyse h l '6qui l ibre

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

l s o l e m e n t de la l ranscor l i ne h u m a i n e . 101

['16, 3] ~h l 'a ide de cortisol radioact i f (cortisol 1,2 all-30 C/mM de New England Nuclear).

Les mesures de radioactivi t6s ont 6t6 effectu6es h l 'a ide d 'un spectrom6tre h sc int i l la t ion h trois canaux In te r -Technique (type SL 30 coupl6 h u n syst6me mult i 8) dans un l iquide sc int i l la teur au dioxanne.

condui tes h l 'a ide d 'un apparei l << disc electropho- resis ~> Canalco selon la m6thode de Davis [19]. Les gels sont color6s suivant le processus de Vesterberg [20].

b) Prdparation du H.C.A.C.-Sepharose.

La cort icost6rone est oxyd6e par l 'acide perio- dique, d 'apr6s la technique de Mason et al. [21].

TABLEAU I. Pourcentage de cortisol d~placd d'une mdme solution de transcorline par des doses

croissantes de H.C.A.C. Les mesures sont r~alis~es par dialyses it l'dquilibre avec une concentrat ion en cortisol ayant une activit~ sp~ci[ique de 0,9 × 10 a C.P.M. par V31ole.

H.C.A.C. a]out6

(t X 10 -a ~Mole)

0 0,03 0,30 3,00

30,00

Rapport H. C. A.C.

c0rtisol"

0 0,41 4,1

41 410

CPM/ml int6riour du sac

14.460 12.845 10 630 6.180 4.175

CPM/ml ext6rieur do sac

3. 250 3. 600 3. 630 3. 960 4.145

Pourcentage de c0rtisol d6plac6

i 0 17 36 80

100

Les immuno61ectrophor~ses, technique inter- m6diaire entre la macrom6thode selon Grabar et Wil l iams [17] et la microm6thode selon Scheideg- ger titS], sont ex6cut6es sur un syst6me et h l 'a ide de la technique d6crite par la firme Hyland. Les plaques sont r6v616es au vert de I.issanfine. Les 61ectrophorbses en gel de polyacrylanf ide sont

I00

~51

2~

o i l~ i~o rapporl ~

FIG. 2. - - Pourcentages de cortisol d~plac~ par des doses croissanles de H.C.A.C. ajoutdes d~ une solution de transcortine el de cortisol de concentration constante.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

10 mMoles de cort icost6rone ( Ikapharm ou Merck) sont disso.utes dans 800 ml d '6thanol absolu ; on y ajoute successivement 475 ml d 'acide per iodique 0,025 M, 15 ml d 'ac ide sulfur ique 2,5 M e t 300 ml d 'eau distill6e. Le m61ange est laiss6 15 h, sous agitation, h la temp6rature du laboratoire, puis le st6roide oxyd6 est pr6cipit6 par 61imination de l '6 thanol sous vide, h l '6vaporateur rotat if Buschi. Le pr6cipit6 est s6ch6 au dessiccateur sous vide, puis dissous dans 1 200 ml d '6ther redistill6. La solution 6th6r6e est ensuite extraite 3 fois par 1 000 ml de NaOH 0,01 M. Les extraits sodiques sont r6unis puis aeidifi6s par HC1 N jusqu'h l 'obtent ion d 'un pH de 3 environ. Le pr6cipit6 form6 est filtr6 sur un en tonno i r h verre fritt6, lay6 sur le verre fritt6 avec envi ron 100 ml d 'eau distill6e et s6ch6 au dessiccateur sous vide. Le renf lement est de 85 p. cent.

La puret6 du H.C.A.C. obtenu (fig. 1) est v6rifi6e par chromatographic en couche mince sur plaque de silicagel Merck, dans le systbme solvant chlo- ro fo rme /m6thano l / eau (80:19:1 ; V/V). Le po in t de fusion d6termin6 au bloc Maquenne (249°C - 256°C), est vois in des valeurs trouv6es par Mason et al. (253°C-258°C) et par Monder [22] (247°C - 255°C).

L 'amino-S6pharose est pr6par6 selon la tech- n ique de Cuatrecasas [23] en ut i l i sant 25 g de hromure de cyanog~ne (Eastman Kodak) et 200 mMoles de 3 ,3 ' -d iaminodipropylamine (Fluka) pour 100 ml de Sepharose 4B (Pharmacia) .

102 F. Le Gaillard el coll.

Le couplage du H.C.A.C. h l ' amino-Sepharose est r6alis6 en mil ieu d ioxanne par l ' in te rm6dia i re de d icyc lohexylearbodi imide (DCCI) : 10 mMoles de H.C.A.C. sont dissoutes dans 120 ml de d ioxanne ; h 100 ml d 'amino-Sepharose, soigneusement d6bar- rass6 de son eau par lavage au dioxanne, on ajoute la solution de H.C.A.C. et 10 mMoles de D.C.C.I. (Merck), dissoutes 4ans 3 ml de dioxanne. Le m61ange est laiss6 sous agitat ion douce, 24 heures h la temp6rature du laboratoire. Le gel est ensuite lav6 dans un en tonno i r h verre fritt6 successive- merit par 10 volumes de d ioxanne et 10 volumes de mOhanol , ce de rn ie r 6tant destin~ h dissoudre la dicyclohexylur6e fo rmic [24J. Puis le gel est r66quilibr6 dans du d ioxanne et un recyclage est effectu6 dans les m~mes co,nditions, en a joutant 10 mMoles de H.C.A.C. et 10 mMoles de DCCI. Apr6s lavage par le d ioxanne et le m~thanol, le gel est 6quilibr6 avec du d im6thyl formamide h 50 p. 100 puis lay6 sur colonne pendan t 48 h avec 10 litres de ce solvant. I1 est enfin r inc6 dans un en tonno i r h verre fritt6 par 10 li tres d 'eau distil- 16e. Le H.C.A.C.-Sepharo.se obtenu est conserv6 h 4°C dans une solut ion aqtwuse d 'azide de sodium h 0,02 p. 100 (poids/volume).

C) RESULTATS.

1) LA LIAISON H.C.A.G.-TBANSCORTINE.

L'affinit~ de la t ranscor t ine poair le H.C.A.C. a 6t6 6tudi6e par dialyse fi l '6quil ibre. Des fioles Packard sont garnies par 15 ml de tampon phos- phate de sodium 0,05 M, pH 7,4 con tenan t des ant ibiot iques (*) [3] et une dose traceuse de 37,5 X 10 .3 v.C de co rtisol (1,2 all), repr6sentant 1,25 × 10 -6 ~Mole. D'autre part , 30 ~Moles de H.C.A.C. (10 mg) sont dissoutes dans 10 ml d'6tha- nol absolu, puis des di lu t ions sont pr6par6es dans du tampon pour obteni r des concent ra t ions suc- cessives de 300 X 10 -a, 30 × 10 -a, 3 × 10 .3 , 0,3 × 10 -3 i~moles par ml. Des al iquots de 0,1 ml de ces di lut ions sont ajout6es respect ivement h 4 fioles. Dans tme 5 ~ fio~e qui servi ra de t6moin, on ajoute 0,1 ml de tampon seul. Chaque fiole revolt ensuite un sac de dialyse en ce l lophanne contenant 1 ml de solut ion h 33 × 10-6 ~moles de t ranscor t ine (1,72 mg × 10 -a mg) et 72 × 10 -6 ~moles de cor- tisol (26 × 10 -a ~g) par ml. Le tout est laiss(~ sous agitat ion h 4°C pendan t 48 heures, puis les radio- activit6s in ternes et externes aux sacs h dialyse sont mesur6es. Chaque exp6r imenta t ion est r6ali- s6e en double (tableau I). Les r6sultats exprim6s dans la figure 2 mon t r en t qu,e le H.C.A.C. poss~de moins d'affinit6 pour la t r anscor t ine que le cor-

(*) Stre~ptomyeine : 0,02 mg/ml. P6meilline G : 500 U par ml.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

tisoI puisque, pour d6plac.er 50 p. cent du cortisol 1i6, une quanti t6 de H.C.A.C. envi ron 7 fois sup6- r ieure h celle du cortisol est n6cessaire. Pour cette raison, le s6rum devra 6tre d6barrass6 de son cor- tisol endog~ne avant la chromatographie d'affi- nit6. Ces r6sultats ne sont cependant qu ' indicat i fs , car la l iaison de la fonct ion carboxyl ique du H.C.A.C. h l ' amino-Sepharose modifie vraisembla- b lement cette affinit6.

2) COUPLAGE DU H.C.A.C. A L'AMINO-SEPHAROSE.

Pour mesurer le taux de f xa t i on de I'H.C.A.C. • ~ l 'amino-Sepharose 2 mMoles de eor t ieost&one sont ajout6es h 10 I~C de cort icost~rone (1,2 ,~H) (New England Nuclear - - 50 C/mMole) et oxy- d6es selon la m6thode d6taill6e au chapi t re tech- nique ; 5 ml d 'amino-Sepharose sont trait~s avec 0,5 mMole de I'H.C.A.C. triti6 obtenu. Apr~s la- vage, la radioact ivi t6 du gel est mesur6e : 0,5 ml et 1 ml de gel dilu6 au demi par de l 'eau distill6e sont compt6s dans 15 ml de l iquide sc in t i l la teur au d ioxanne con tenan t 3,8 p. 100 (P/V) de Cab-O- Sil (Eastman). Paral lblement, sont compt6s des t6moins con tenan t du cortisol (1,2 ~H) d 'activit~ sp6cifique connue et les m~mes volumes de Se- pharose. Apr~s un nouveau cycle de fixation du H.C.A.C., les m~mes dosages sont effectu6s. Le p remier cycle f xe 0,5 ~Mole de H.C.A.C. par m] de gel et 0,7 ~Mole de H.C.A.C. suppl~mentai re est cot~pl~e apr~s le deuxi~me cycle.

I1 peut sembler in:utile d 'effectuer deux cycles puis de di luer l 'H.C.A.C.-Sepharose obtenu avec un volume 6gal de Sepharose ; cependant le gel ainsi dilu6 pr6sente moins d 'adsorp t ion non sp6- cifique vis-h-vis des pro t6ines.

3) CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE.

La technique utilis6e est une var iante de celle de Rosner et Bradlo~v [5] que no.us avons adapt~e aux propri6t~s part icul i~res de notre ligand-Se- pharose.

a) Adsorption de la transcortine sur le H.C.A.C.- Sepharose.

1 l i tre de sbrmn est dialys~ pendan t 48 heures co ntre 10 litres de NaC1 0,2 M qu 'on change une fois aprb, s 24 heures. I1 est e nsui te d6barrass6 des corticost6ro'ides endogbnes par addi t ion de 20 g de charbon Norit (Prolabo) et 2 g de Dextran T 70 (Pharmacia) ~5]. Aprbs incuba t ion de 30 minutes

37°C, le s6rum est filtr6 sur papie r Wha t ma n 1 dans un en tonno i r h verre fritt~, puis il est ajout~ h 100 ml de H.C.A.C.-Sepharose dilub avec 100 ml de Sepharose 4B normal . La suspension est agit~e douceinent 1 heure h la temp6rature du labora- toire, puis 6 heures h 4°C. Le s6rum surnageant

l s o l e m e n t de la t r a n s c o r t i n e h u m a i n e . 103

est d6cant6 pu t s le gel est lay6 sur un e n t o n n o i r v e r r e f r i t t6 p a r 100 ml de t a m p o n p h o s p h a t e

de s o d i u m 0,05 M - N a C 1 0,2 M, p H 7,0. Le l avage est p o u r s u i v i darts une c o l o n n e (150 m m × 40 m m ) h 4°C avec le m 6 m e t a m p o n (d6bit de 4 ml p a r min ) jusqu ' f i ce que les dens i t6s o p t i q u e s de l ' e f f luen t h 280 n m a v o i s i n e n t 0,1.

c o r r e s p o n d a n t au co r t i so l 1i6 du s6 rum (c) et du s u r n a g e a n t (d) incub6s h 60~C, son t dues aux p r o - t6ines l i an tes au t res que la t r a n s c o r t i n e , s6rum- a l b u m i n e p r e s q u e e x c l u s i v e m e n t ; le r a p p o r t de ces ch i f f res d o n n e le f a c t eu r de d i l u t i on dfi au <<volume m o r t ~> d u gel. Les r a d i o a c t i v i t 6 s donn6es p a r le co r t i so l li6 to ta l du s6 rum (a) et du

TABLEAU II.

Rdsultats d'une dialyse mul t ip le d'~quilibre de 48 h h 4°C d'un sdrum traitd au charbon-dextran el du mdme sdrum apr~s contact avec le gel d'a[finit~ (surna- geant) avant et apr~s incubat ion d 60°C.

Dilutions 1/5 de :

Sdrum

Surnageant

CPM/ml int6riear

du sac

17.130

5.170

CPM/ml ext6rieur

du sac

3. 000

CPM/ml CPM/ml ! dns au [dusau corti:ol Pourcentages

cortisol 1i6 i lid h la de total ! transcorline transcortine

100 14.130 12.830 (a ) ( A )

2.170 1.070 (B) 1 260 (B')

(b)

1. 300 (c)

1 . 1 0 0 (d)

Sdrum ineub6 h 600 C 4. 300 ,,

Surnageant incubd 4 1,0 • ~ 60 ° C

9 , 8

4 sacs de 1 ml (en double exemplaire) sont dialvs6s ensemble contre 80 ml de tampou phosphate 0,05 M de pH 7,4 contenant 0,3 ug de coi'tisol de 0,2 .gcuries de cortisol (1,23H).

(A = a c ; B = b d ; B ' = e - - - - B . - - ) . d

L ' a d s o r p t i o n de la t r a n s c o r t i n e sur le gel est m esu r6e en u t i l i s an t une p r o p r i 6 t 6 p a r t i c u l i 6 r e de ce l le -c i : l ' i n a c t i v a t i o n i r r 6 v e r s i b l e h 60°C d6c r i t e p a r D a u g h a d a y et al. [26] ; ce t te i n a c t i v a - t ion est d ' a u t a n t p lus g r a n d e que le t a u x de cor- t isol dans le m i l i e u est f a ib le [27] ; ic i e l le est to ta le c a r le co r t i so l a 6td adso rb6 s u r c h a r b o n - d e x t r a n .

1 ml de s6 rum t ra i t6 au c h a r b o n - d e x t r a n et 1 ml de s6 rum s u r n a g e a n t le gel son t d i lu6s avec 4 ml de t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,05 M pH 7,4. Une d ia lyse m u l t i p l e h r 6 q u i l i b r e [28, 29] est r6al is6e : 8 sacs de d ia lyse (4 sacs en d o u b l e e x e m p l a i r e ) c o n t e n a n t r e s p e c t i v e m e n t 1 ml de la d i l u t i o n du s6rum, 1 ml de la d i l u t i on du sd rum s u r n a g e a n t et 1 ml des m 6 m e s d i l u t i ons incub6es 30 m i n h 60°C, son t p longds dans un m 6 m e r6ci - p ien t . Celu i -c i est r e m p l i de 80 ml de t a m p o n c o n t e n a n t 0,3 ~g de co r t i so l et une dose t r a c e u s e de 0,2 ~uC de co r t i so l (1,2 all) (30 C p a r mMole) . Le tout est laiss6 sous ag i t a t ion 48 h e u r e s h 4°C pu ts la r a d i o a c t i v i t 6 e x t e r n e et les r a d i o a c t i v i t 6 s i n t e r n e s sont mesu r6es ( tab leau II). Les va l em ' s

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

s u r n a g e a n t (b) d o i v e n t 6tre d i m i n u 6 e s des ch i f f r e s p r 6 c d d e n t s p o u r o b t e n i r les r a d i o a c t i v i t 6 s co r r e s - p o n d a n t u n i q u e m e n t an co r t i so l 1i6 h la l r a n s c o r - t ine : A = a - c et B = b - d ; B qu i r e p r 6 s e n t e le co r t i so l l i6 fi la t r a n s c o r t i n e non adso rb6e est co r r ig6 en le m u l t i p l i a n t p a r le f a c t eu r de d i lu-

t ion : B' = B. ~ c C'est ce t te d e r n i b r e v a l e u r (B') d

qu i est r e t e n u e p o u r c a l c u l e r le p o u r c e n t a g e de B'

t r a n s c o r t i n e non a d s o r b @ : - - X 100 qu i est A

ic i de 9,8 p. c e n t ( tab leau II) .

b) Elut ion de la transeortine.

T e c h n i q u e .

Apr6s lavage , le gel est 61u6 s u c c e s s i v e m e n t p a r 1 v o l u m e de t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,001 M de p H 7,0 (vo lume e o r r e s p o n d a n t au v o l u m e du gel) des t in6 fi 61iminer le t a m p o n de fo r ce i o n i q u e 61ev6 p r6c6den t , pu t s p a r une so lu t ion de co r t i so l h 0,2 m g p a r ml darts le m 6 m e t a m p o n ju squ 'h ee que le co r t i so l a p p a r a i s s e darts l ' e f f luen t de la co lonne . Le (<volume m o r t >> du co r t i so l est

104 F . L e G a i l l a r d e l co l l .

m e s u r 6 ; un v o l u m e 6gal de so lu t i on de co r t i so l h 0,2 m g p a r ml d a n s du t a m p o n Tr i s 0,05 M - NaC1 0,1 M de p H 8,5 est a lo r s pass6 , p u i s le bas de la c o l o n n e est fe rm6. Le gel est i n c u b 6 90 m i n u t e s h 25°C h l ' a i de d ' u n e j aque t t e t h e r m o s t a t 6 e , p u i s r e f r o i d i ~ 4°C p e n d a n t 15 h e u r e s . La t r a n s c o r t i n e

30rA ~B lc

10 2~) 30 40 ,5,] fractions de I0 ml

Fro. 3. - - Courbe d'~lution par chromatographie d 'af f ini t~ (colonne 40 mm × 140 ram).

L'61ution est r6alis6e /t 3 temp6ratures diff6rentes avec un tampon Tris 0,05 M-NaC1 0,1 M de pH 8,5 contermnt 0,2 mg de cortisol par ml :

A : incubat ion 90 minutes h 25°C puts 15 heures 4°C - - 61ntion h 4°C.

B : incubation 90 minutes h 25°C et 61ution h 25°C. C : incubation 90 minutes h 37°C et ~lution h 37°C.

A

est e n s u i t e 61u6e h 4°C p a r p a s s a g e d ' u n vo lume de la s o l u t i o n de c o r t i s o l t a m p o n n 6 e h p H 8,5 6gal au v o l u m e du gel.

Le t e m p s d ' i n c u b a t i o n "h 25°C p e r m e t l ' 6 tab l i s - s e m e n t d ' u n 6qu i l i b re de la t r a n s c o r t i n e e n t r e le H .C .A.C. -Sepharose et le c o r t i s o l en so lu t ion , ce d e r n i e r d S p l a c a n t la t r a n s c o r t i n e et p e r m e t t a n t son 61ution.

'1"

B

C

D

E

FIG. 4. - - lmmunodlec trophor~se des prdparations isoldes.

A : s~rum de d6part. B : t ranscor t ine pure obtenue apr6s chromatographie

sur hydroxyapat i te . C : pic obtenu h 4°C par chromatographie d'affinitd

(fractions n °' 1 h 4). D : pic obtenu h 4°C par chromatographic d'affinit~

(fractions n °~ 5 h 12). E : prot6ines pr~cipit6es pendant la dialyse du pic

pr6c6dent - - Immuns6rnm de Lapin an t i -humain total Hyland.

13IOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

A B C Fro. 5. - - E lec t rophor~se en gel de p o l g a c r y l a m i d e

des pics obtenus par chromatographic d 'af f ini t~. La fl~che montre la zone correspnndant h la t ranscort ine.

A : pic obtenu par 61ution /~ 4°C. B : pic obtcnu par 61ution & 25°C. C : pic obtenu par 61ution h 37°C.

Le gel est e n s u i t e p o r t 6 90 m i n u t e s h 37~C p u t s 61u6 p a r un v o l u m e de e o l o n n e de la s o l u t i o n de co r t i so l . I1 est e n s u i t e lay6 a b o n d a m m e n t p a r de l ' e au d is t i l l6e et c o n s e r v 6 d a n s u n e s o l u t i o n d ' a z i d e de s o d i u m h 0,02 p. cen t , h 4°C. Les f r ac - t i o n s o b t e n u e s h 4°C son t r6un ie s , d i a ly s6es sous a g i t a t i o n p e n d a n t 48 h e u r e s c o n t r e 10 v o l u m e s de t a m p o n p h o s p h a t e d,e s o d i u m 0,001 M de pH 6,8 p u t s l y o p h i l i s 6 e s .

D i s c u s s i o n .

La f ixa t ion de la t r a n s c o r t i n e su r le gel a 6t6 r~al is6e en b a t c h e c o m m e le p r 6 c o n i s e Cua t re - ca sas [31] p o u r les s y s t ~mes l i an t h fo r t e aff ini t6 ;

l s o l e m e n t de la t ranscor t i ne h u m a i n e . 105

elle est d 'autre par t int6ressante en ra ison du gra~nd volume de s6rum utilis6 au d6part ; l'61u- t ion r6alis6e sur colonne permet au contra i re de re t rouver la t ranscor t ine sous un faible volume.

La t ranscor t ine peut 6tre 61u6e di rectement h 25°C, mats elle est alors net tement moins purifi6e : la figure 3 montre les 61utions successives du gel

4°C, 25°C et 37°C; le pic impor tan t h 25°C souille la t ranscor t ine dans le cas d 'une 61ution directe. Cette con tamina t ion est cependant par-

t iel lement compens6e pendan t la dialyse des fract ions recueillies, puisque celle-ci provoque une pr6cipi ta t ion abondante d ' immunoglobu l ines (figure 4 E).

La composi t ion des pics a 6t6 6tudi6e par immuno61ectrophor6se (figure 4 C) et D) et par 61ectrophor6se en gel de po lyacry lamide (figure 5). Le pic obtenu h 4°C contient , outre la t ranscor t ine , beaucoup de prot6ines diff6rentes migran t en 61ectrophor6se de la zone 7 h la s6rum-

TABLEAU III.

Rendemen t de deux [ract ionnements types.

Etape de l'isolement

S6rum de d6part (1000 ml) . . . . . . . . .

I~lu'~t lyopbilis6 de la chromatogra- phic d'affinit6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I~,luat lyophilis6 de la chromatographie sur hydroxyapatite (transcortinc)..

Pr0t6ines l~lution du gel d'affinit6 h t~* C

71 000

82

14

Prot6ines ~lution du gel d'affinit~

directe ~ 2~oC

72 000

143

17

Pour l'un, le H.C.A.C.-Sepharose a 6t6 61u6 h 4°C ; pour l'autre, l'61ution du gel a 6t6 conduite directement h 25°C (en mg de prot6ine par litre de s6rum).

4"

A B FIG. 6. - - Electrophor~se en gel de polyacrylamide

de transcortine pure obtenue apr~s chromalographie sur hydroxyapatite (A) el d'un s~rum humain (B).

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

a lbumine. L 'arc de pr6cipi ta t ion de la t ranscor- tine (figure 4 C et D) et la zone de migra t ion en polyacry lamide (figure 5 A) sont bien visibles. Le pic obtenu ~ 25°C ne cont ient que des immuno- glohulines et de la s6 rumalbumine (figure 5 B ) ; le pic obtenu h 37°C, des immunoglobul ines (figure 5 C).

Plus de 99,8 p. cent des prot6ines du s6rum sont 61imin6s par la chromatographic d'affinit6 (tableau III). Cependant l ' adsorp t ion non sp6ci- fique de prot6ines sur le H.C.A.C.-Sepharose rend obligatoire une deuxi6me Oape de puri f icat ion par chromatographic sur hydroxyapat i te .

4) CHROMATOGRAPHIE sun HYDROXYAPATITE.

La pr6para t ion lyophilis~e est dissoule dans 2 ml de tampon phosphate de sodium 0,001 M de pH 6,8, dialysbe sous agitat ion pendan t 15 heures conire 500 ml du m6me tampon, puts d6pos6e sur une colonne d 'hydroxyapa t i t e (hydroxyapat i te HT- Biorad) (50 m m × 25 ram) ~qui]ihr6e dans le tampon phosphate 0,001 M de pH 6,8. L'61ution est condui te h 4°C par des tampons phosphate de sodium de pH 6,8 et de molari t6 0,001 M e t 0,005 M (d6bit : 0,4 ml par min) . L 'hydroxyapat i te est ensuite r6g6n6r6e par un tampon phosphate de potassium 0,650 M de pH 6,8 [30].

106 F. Le Gaillard et coll.

Le passage du tampon phospha te de sodium 0,001 M de pH 6,8 dans la colonne, pe rmet d'61i- mine r l 'excbs de eort isol encore pr6sent dans la p r6para t ion lyophi l is6e ; la t ranseor t ine reste adsorb6e. Cette adsorp t ion n 'a pas 6t6 observ6e par Seal et Doe [lJ , par Muldoon et Westphal [3] et pa r Rosner et B r a d l o ~ [5], con t ra i r emen t d 'aut res auteurs comme Lebeau et Baulieu [4~ ou Schne ider et S launwhi te [32]. Cette discor- dance est due, sans doute, aux diff6renees de qualit6 de l ' hydroxyapa t i t e employ6e. La trans- eor t ine est 61u6e avee le tampo,n phospha te 0,005 M.

que I'H.C.A.C. sur l ' amino-Sepharose dans les m6mes condit ions. I1 semble que l ' hyd roxy le en 17a r6agisse avec la d i cyc lohexy lca rbod i imide (D.C.C.I.) et soit ainsi responsable du faible ren- dement du couplage. Rosner et Bradlow [5] << act ivent ~ l 'h6misucc ina te de cort isol en le metta~nt en contact avec la D.C.C.I. en mil ieu d ioxanne ; un pr6cipi t6 de d icyc lohexylur6e se fo rme et apr~s fi l tration, l 'es ter (< activ6 >> est ajout6 h l ' amino-Sepharose en suspension dans le d ioxanne pour pe rmet t re la r6act ion de couplage ; le m6canisme d'un.e telle ¢ act ivat ion >> n'est

TABLEAU IV.

Rendement en transcortine gl partir de 2 600 ml de sdrum.

I~tape de l'isolement

S6rum de d6part 2600 ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Eluat de la chromatographic d'affinit6 . . . . . . . . . . .

Eluat de la chromatographic sur hydroxyapatite..

Transcortine mg

101

72

52

Pr0t6ines mg

1:85. 000

213

47 (')

(*) Poids de prot6ine lyophilis6e apr6s dialyse de l'61uat.

Fractionnement sur une colonne d'affinit~ de 200 ml de H.C.A.C.-Sepharose dilu6 avec 200 ml de Sepharose 4B (50 m m × 200 mm).

- - puts une colonne d'hydroxyapatite de 100 ml (25 mm × 250 mm).

La t ranscor t ine obtenue est pure en immnno- 61ectrophor6se (figure 4 B) et en 61eetrophorbse en gel de po lyac ry lamide (figure 6). Le r endemen t

chaque 6tape de la pr6para t ion a 6t6 d6termin6 par dosage immunologicpm [33]. Les r6sultats de divers f rac t ianne~mnts sont repr6sent6s darts les tableaux III et IV. Par r appor t au taux de trans- cortin,e s6rique init ial , le taux de r6cup6rat ion a 0 6 de 72 p. cent aprbs la ch romatograph ic d'affi- nit6 et de 52 p. cent aprbs la ch romatograph ic sur hydroxyapa t i t e . La t ranscor t ine obtenue a con- serv6 h ce stade toute son activit6 l iante vis-h-vis du c o r t i s o l : le dosage du cortisol dans 1'61uat 0,005 M mont re en effet 6,7 I~g de cort isol par mg de t ranscor t ine . Or, h l '6tat de saturat ion th6orique, la t ranscor t ine lie 6,9 gg de cort isol par mg, chiffre qui cor respond h 1 Mole de cor- tisol par Mole de t ranscor t ine .

D - - DISCUSSION.

Pour p r6pare r notre l igand-Sepharose, il p a r a i s s a i t l o g i q u e d 'u t i l i ser le eort isol plut6t que la cort icost6rone. Effect ivement , nous avions c o m m e n c 6 par oxyder le cort isol pa r l ' ac ide pe r iod ique ; mats l ' ac ide dihydroxy-11~, 17~ c6to-3 androst6ne-4-carboxylique-17~ obtenu (D.C.A.C.) se fixe avec un r endemen t 5 fois mo ind re

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

cepen~la~nt pas e xpliqu6 par les auteurs. R6cem- merit, i l a 0 6 d6montr6 que la D.C.C.I. peut indu i re la format ion d 'un anhydr ide entre deux mol6eules d 'ac ide amin6 ayant leurs fonct ions amines bloqu6es ; cet anhydr ide permet un rende- ment plus 61ev6 dans la synth~se pep t id ique en phase solide [34]. Mats s i u n tel anhydr ide se formai t entre les fonct ions carboxyl iques l ibres de l 'h6misuccinate , r ien n ' emp6che th6orique- ment sa format ion entre deux mol6cules de D.C.A.C. ou deux mol6cules de H.C.A.C. Or, la D.C.C.I. ent ra lne un pr6cipi t6 de d icyc lohexylur6e avec l 'h6misuccin,ate et avec ]e D.C.A.C. mats pas avec I'H.C.A.C. La seule diff6rence s t ructura le pouvant exp l iquer ce ph6nom~ne est 1'absence d ' hyd roxy le en 17.ct dans le H.C.A.C.

Cuatrecasas [23] a d6cri t le couplage de succi- nyl,oestradiol h de l ' amino-Sepharose en mil ieu aqueux, h l 'a ide de ca rbod i imide hydrosoluble , mats cette t echn ique s 'est r6v616e inappl icable notre cas pa r t i cu l i e r et ne pe rmet pas la fixation sur l ' amino-Sepharose , ni du D.C.A.C., ni du H.C.A.C.

La quanti t6 de s6rum h ajouter au H.C.A.C.- Sepharose a 0 6 d6termin6e exp6r imenta lement de mani~re h obteni r une adsorp t ion d 'au moins 90 p. cent de la t ranscor t ine totale. Elle peut

I s o l e m e n t d e la t r a n s c o r t i n e h u m a i n e . 107

c e p e n d a n t 6 t re a u g m e n t 6 e si on se c o n t e n t e d ' u n p o u r c e n t a g e d ' a b s o r p t i o n m o i n d r e ; ce lu i - c i es t e n c o r e de 81 p. c e n t l o r s q u e le v o l m n e de s 6 r u m est t r ip l6 .

L '61u t ion de la t r a n s c o r t i n e es t r6a l i s6e a v e c des eon~cen t r a t i ons e n l i g a n d s s e n s i b l e m e n t i d e n - t i q u e s d a n s le gel et d a n s le t a m p o n (0,5 ~Mole p a r ml) ; l ' 6 q u i l i b r e es t p o u r t a n t d 6 p l a c 6 v e r s le c o r t i s o l d u t a m p o n . Ce lu i -c i est , en effet , p l u s a c c e s s i b l e et i l a, s a n s d o u t e auss i , u n e af f in i t6 p l u s f o r t e p o u r la t r a n s c o r t i n e que le H.C.A.C. -Sepha- rose .

P a r m i les p ro~6 ines r 6 c u p 6 r 6 e s a p r b s c h r o m a - t o g r a p h i e d ' a f f in i t6 , R o s n e r et B r a d l o w [5] n ' o n t o b s e r v 6 que la p r 6 s e n e e de t r a n s e o r t i n e et d ' i m m u n o g l o b u l i n e s p a r 6 1 e e t r o p h o r b s e s u r p a p i e r . T r a p p et al. [61 m o n t r e n t , p a r 6 1 e e t r o p h o r ~ s e en gel de p o l y a e r y l a m i d e que l e n t gel a v a i t r e t e n u de la s 6 r u m a l b u m i n e et d ' a u t r e s f r a c t i o n s de mi - g r a t i o n i n t e r m 6 d i a i r e . N o u s a v o n s t r o u v 6 u n r6- s u l t a t s i m i l a i r e h ce lu i de T r a p p , p a r 61ec t ropho- rbse en gel de p o l y a e r y l a m i d e . D a n s l e u r eas e o m m e d a n s le n 6 t r e , la t r a n s c o r t i n e es t o b t e n u e p u r e a p r 6 s u n e e h r o m a t o g r a p h i e s u r h y d r o - x y a p a t i t e .

Le H .C .A .C . -Sepha r os e p r 6 s e n t e l ' a v a n t a g e d ' e t r e s i m p l e "~ p r 6 p a r e r et d ' e t r e s t a b l e : i l n ' y a p a s de l i b 6 r a t i o n de l i g a n d d o n c p a s de p e r t e de t r a n s e o r t i n e , d ' a u t r e p a r t , le H .C .A .C . -Sepha rose se m o n t r e t o u j o u r s aus s i a e t i f a p r 6 s les 28 e h r o - m a t o g r a p h i e s que n o u s a v o n s e f fec tu6es j u s q u ' ~ p r 6 s e n t .

La c h r o m a t o g r a p h i e d ' a f f i n i t 6 es t u n e t e c h n i q u e qu i t e n d ~ r e m p l a e e r o u ~ e o m p l 6 t e r de p lu s en p l u s les m 6 t h o d e s de f r a e t i o n n e m e , n t e l a s s i q u e s , g r~ee ~ sa s i m p l i e i t 6 et h s o n e f f i eae i t& Son a p p l i e a t i o n ~ l ' i s o l e m e n t d e la t r a n s e o r t i n e 6 ta i t t r6s s 6 d u i s a n t e , 6 t a n t d o n n 6 la c o m p l e x i t 6 et les r 6 s u l t a t s a l 6 a t o i r e s d e l ' i s o l e m e n t t r a d i t i o n n e l . L ' H . C . A . C . - S e p h a r o s e p e r m e t d ' i s o l e r r a p i d e m e n t des q u a n t i t 6 s a p p r 6 e i a b l e s de t r a n s e o r t i n e , ee q u i n o u s p e r m e t t r a d ' e n p r 6 e i s e r la e o m p o s i t i o n d ' 6 t u d i e r sa s t r u e t u r e et s on m o d e de l i a i s o n a v e e les c o r t i c o s t 6 r o i d e s .

Remerciements .

No.us remercions v ivement le Professeur M. Lin- quet te et le Labo.ratoire d 'Endocr inologie du Service de Clinique M6dicale Est du CHU de Lille dont l 'a ide matdr ie l le nous fu t pa r t i eu l i6 rement prfcieuse. Cc t rava i l a 6t~ rdalis6 avec l 'aide du CNRS dans le cadre de I'ERA 32 (Professeur G. Biserte).

l~suM~.

La t ranscor t ine h u m a i n e est isol~e du s~rum par ehromatograph ie d 'aff ini t6 suivie d 'une chromatogra-

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

phie sur hydroxyapat i te . Le l igand-Sepharose est pr~- par~ en eouplan t de la eort ieost~rone oxyd~e par l 'acide per iodique sur l ' amino-Sepharose , pa r l ' in te r - m~diaire de dicyclohexylcarbodi imide. Le gel d 'aff ini t6 ob tenu est stable, son activit~ est tou jours la m~me apr6s an moins 28 ehromatographies . La t r ansco r t ine est obtenue pure avec u n r endemen t d ' env i ron 50 p. cent pa r rappor t an s6rum de d6part .

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