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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
*************
FACULTE DES SCIENCES
*************
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
*************
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN
SCIENCES DE LA VIE
*************
Option : BIOTECHNOLOGIE – MICROBIOLOGIE
ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LEVURES DU FRUIT
DU FIGUIER DE BARBARIE " Opuntia ficus-indica "
DE LA REGION DE VAKINANKARATRA
Présenté par : RANDRIANANTOANDRO Miary Hobitiana
Maître ès Sciences
Soutenu publiquement le 12 Septembre 2014
Devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur RALISON Charlotte
Encadreurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaina
Professeur RAHERIMANDIMBY Marson
Examinateurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel
Docteur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna
" L'Eternel est mon berger : je ne manquerai de rien. Il me fait reposer dans de verts
pâturages, Il me dirige près des eaux paisibles. Il restaure mon âme, Il me conduit dans les
sentiers de la justice, à cause de son nom. Quand je marche dans la vallée de l'ombre de la
mort, je ne crains aucun mal, car tu es avec moi : ta houlette et ton bâton me rassurent. Tu
dresses devant moi une table, en face de mes adversaires ; Tu oins d'huile ma tête, et ma
coupe déborde. Oui, le bonheur et la grâce m'accompagneront tous les jours de ma vie, et
j'habiterai dans la maison de l'Eternel jusqu'à la fin de mes jours."
Psaume 23 : 1 – 6
REMERCIEMENTS
Le présent travail a été réalisé avec l’étroite collaboration entre le laboratoire de
Microbiologie de l’université Athénée Saint Joseph Antsirabe (ASJA) et le laboratoire de
Biotechnologie-Microbiologie du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée de
la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo.
Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude:
Au Professeur RAHERIMANDIMBY Marson, Doyen de la Faculté des Sciences,
Responsable du parcours Biotechnologies, Professeur Titulaire au Département de Biochimie
Fondamentale et Appliquée et Co-encadreur de ce mémoire de nous avoir proposé ce sujet, de
nous avoir donné la permission de soutenir ce mémoire et pour la confiance qu’il nous a
accordée.
Au Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina, Chef du Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée, Maître de Conférences au Département de Biochimie
Fondamentale et Appliquée et encadreur pour sa disponibilité à la réalisation de ce mémoire
malgré ses multiples responsabilités, sa rigueur scientifique et ces précieux conseils nous ont
permis de travailler dans les meilleures conditions.
Au Professeur RALISON Charlotte, Chef du laboratoire de Biochimie Appliquée aux
Sciences de l’Alimentation et à la Nutrition et Professeur Titulaire au Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée, qui me fait l’honneur de présider le jury de ce
mémoire, malgré ses nombreuses occupations.
Aux Docteurs RAMAMONJISOA Daniel et RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna,
Maîtres de Conférences au Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, pour
l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail et d’avoir accepté de juger ce mémoire.
Nous tenons également à remercier :
Le Professeur RALAMBORANTO Laurence, Recteur de l’université Athénée Saint Joseph
Antsirabe et Professeur Titulaire au Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée,
de nous avoir permis de travailler dans les laboratoires de l’ASJA
Le Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina, Résponsable des laboratoires de
l’université Athénée Saint Joseph Antsirabe et Maître de Conférences au Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée, de nous avoir accueillie au sein des Laboratoires de
l’ASJA.
Mes parents qui m’ont toujours soutenue financièrement et moralement durant toutes mes
années d’études.
Tous mes collègues qui ont fait que ce travail s’est passé dans une bonne ambiance.
Enfin, à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce mémoire.
Table des matières
GLOSSAIRE ............................................................................................................................... i
LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................. iii
LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. iv
LISTE DES PHOTOS ................................................................................................................ v
LISTE DES TABLEAUX ......................................................................................................... vi
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
Partie 1: Synthèse bibliographique I-LES LEVURES ....................................................................................................................... 3
I-1. Historique ........................................................................................................................ 3
I-2. Caractéristiques microbiologiques des levures ................................................................ 3
I-2.1. Définition .................................................................................................................. 3
I-2.2. Habitats ..................................................................................................................... 3
I-2.3. Morphologie et structure .......................................................................................... 4
I-2.3.1. Morphologie .......................................................................................................... 4
I-2.3.2. Structure ................................................................................................................. 5
I-2.4. Reproduction des levures .......................................................................................... 6
I-2.4.1. Multiplication végétative ou asexuée .................................................................... 6
I-2.4.2. Multiplication sexuée ............................................................................................ 6
I-2.5. Classification des levures ......................................................................................... 7
I-3. Physiologie et croissance des levures .............................................................................. 8
I-3.1. Les besoins nutritifs .................................................................................................. 8
I-3.1.1. Source de carbone .................................................................................................. 8
I-3.1.2. Source d’azote ....................................................................................................... 9
I-3.1.3. Oligoéléments et facteurs de croissance ................................................................ 9
I-3.2. Les besoins physico-chimiques ............................................................................... 9
I-3.2.1. La température ....................................................................................................... 9
I-3.2.2. Le pH ................................................................................................................... 10
I-3.2.3. L’aération ............................................................................................................. 10
I-3.2.4. Pression osmotique et activité de l’eau ................................................................ 10
I-3.3. Le métabolisme des levures .................................................................................... 10
I-3.3.1. Métabolisme aérobie ............................................................................................ 10
I-3.3.2. Métabolisme fermentaire .................................................................................... 11
I-4. La levure en biotechnologies ..................................................................................... 11
II- GENERALITES SUR LE FIGUIER DE BARBARIE ...................................................... 13
II-1. Le figuier de barbarie dans le monde ........................................................................... 13
Table des matières
II-2. Etude botanique du figuier de barbarie ........................................................................ 14
II-2.1. Famille des CACTACEAE ................................................................................... 14
II-2-2. Espèce Opuntia ficus-indica ................................................................................. 14
II-3. Ecologie du figuier de barbarie .................................................................................... 17
II-3.1. Physiologie ............................................................................................................ 17
II-3.2. Exigences du figuier de barbarie ........................................................................... 17
II-4. Importance agro-économique du figuier de barbarie et ses utilisations ....................... 18
II-5. Le figuier de barbarie à Madagascar ............................................................................ 19
III- LA FERMENTATION ALCOOLIQUE ........................................................................... 21
III-1. Historique .................................................................................................................... 21
III-2. Aspect biochimique de la fermentation alcoolique ..................................................... 22
III-3. Les facteurs affectant la fermentation ......................................................................... 24
III-3.1. Le substrat ............................................................................................................ 24
III-3.2. Les besoin en oligoéléments ................................................................................ 24
III-3.3. L’aération ............................................................................................................. 25
III-3.4. La température ..................................................................................................... 25
III-3.5. Le pH ................................................................................................................... 25
III-3.6. L’éthanol .............................................................................................................. 25
III-3.7. Le gaz carbonique ................................................................................................ 25
III-3.8. La souche utilisée ................................................................................................. 25
III-4. La fermentation dans l’industrie ................................................................................. 26
Partie 2: Matériels et méthodes I- Matériel végétal .................................................................................................................... 27
I-1. Le lieu de la cueillette .................................................................................................... 27
I-2. Les fruits ........................................................................................................................ 27
I-3. Méthode ......................................................................................................................... 28
II- Isolement des levures de la figue de barbarie..................................................................... 28
II-1. But ................................................................................................................................ 28
II-2. Principe ......................................................................................................................... 28
II-3. Matériels ....................................................................................................................... 28
II-3.1. Les verreries .......................................................................................................... 28
II-3.2. Le milieu d’isolement ............................................................................................ 29
II-4. Technique d’isolement ................................................................................................. 29
II-4.1. Préparation de l’échantillon .................................................................................. 29
II-4.2. Inoculation de l’échantillon dans le milieu ........................................................... 29
Table des matières
II-4.3. Isolement des colonies .......................................................................................... 30
II-4.4. Purification des souches ........................................................................................ 30
II-4.5. Conservation des souches ...................................................................................... 30
III- Identification des souches de levures isolées à partir de la figue de barbarie ................... 31
III-1. Etude des caractères culturaux .................................................................................... 31
III-2. Etude des caractères morphologiques ......................................................................... 32
III-2.1. Examen à l’état frais ............................................................................................ 32
III-2.2. Test de viabilité ou coloration au bleu de méthylène .......................................... 32
III-3. Etude des caractères physiologiques ........................................................................... 33
III-3.1. Test catalase ......................................................................................................... 33
III-3.2.Type respiratoire ................................................................................................... 34
III-3.3. Facteurs physico-chimique .................................................................................. 34
III-3.3.1. Influence de la température ............................................................................... 34
III-3.3.2. Influence de la pression osmotique ................................................................... 35
III-3.3.3. Influence du pH ................................................................................................. 35
III-4. Etude des caractères biochimiques ............................................................................. 36
III-4.1. Principe ................................................................................................................ 36
III-4.2. Méthodes .............................................................................................................. 36
III-4.3. Matériels .............................................................................................................. 36
III-5. L’auxanogramme du carbone...................................................................................... 38
III-5.1. Principe ................................................................................................................ 38
III-5.2. Matériels .............................................................................................................. 38
III-5.3. Méthode ............................................................................................................... 38
III-5.4. Lecture ................................................................................................................. 38
IV- Etude de la fermentation .................................................................................................... 38
IV-1. Etude avec la cloche de Durham................................................................................. 39
IV-1.1. Milieu de culture .................................................................................................. 39
IV-1.2. Mode opératoire ................................................................................................... 39
IV-1.3. Lecture ................................................................................................................. 39
IV-2. Fermentation en batch avec un bioréacteur ................................................................ 40
IV-2.1. Préculture ............................................................................................................. 40
IV-2.2. Culture discontinue .............................................................................................. 40
IV-2.2.1. Principe ............................................................................................................. 40
IV-2.2.2. Mode opératoire ................................................................................................ 40
IV-2.2.3. Lecture .............................................................................................................. 41
IV-3. Méthodes analytiques ............................................................................................. 41
IV-3.1. Mesure de la croissance de la levure ................................................................... 41
Table des matières
IV-3.1.1. Turbidité ........................................................................................................... 41
IV-3.1.2. Détermination de la concentration en biomasse ............................................... 42
IV-3.2. Mesure de la consommation du substrat ............................................................. 42
IV-3.2.1. Dosage à la liqueur de Fehling ......................................................................... 42
IV-3.2.2. Détermination de la concentration en substrat .................................................. 43
IV-3.3. Mesure de la production en éthanol ..................................................................... 45
IV-3.4. Traitement des résultats de la fermentation discontinue ...................................... 45
IV-3.4.1. Expression des vitesses ..................................................................................... 45
IV-3.4.1.1. Formation de biomasse .................................................................................. 45
IV-3.4.1.2. Consommation de substrat ............................................................................ 46
IV-3.4.1.3. Formation de produit ..................................................................................... 46
IV-3.5. Les rendements de conversion ............................................................................. 47
IV-3.5.1. Rendement de conversion du substrat en biomasse .......................................... 47
IV-3.5.2. Rendement théorique ........................................................................................ 48
IV-3.5.2.1. Rendement en produit .................................................................................... 48
IV-3.5.2.2. Rendement théorique total ............................................................................. 48
IV-3.5.2.3. Rendement théorique de maintenance ........................................................... 48
IV-3.5.3. Rendement réel ................................................................................................. 49
IV-3.5.3.1. Rendement en produit .................................................................................... 49
IV-3.5.3.2. Rendement réel total ...................................................................................... 49
IV-3.5.3.3. Rendement réel de maintenance .................................................................... 50
Partie 3: Résultats et discussion I- Isolement des souches de levure de la figue de barbarie ...................................................... 51
II- Identification des souches de levure .................................................................................... 51
II-1. Etude des caractères culturaux ..................................................................................... 51
II-2. Etude des caractères morphologiques .......................................................................... 52
II-2.1. Examen à l’état frais .............................................................................................. 52
II-2.2. Test de viabilité ..................................................................................................... 54
II-3. Etude des caractères physiologiques ............................................................................ 55
II-3.1. Type de respiration ................................................................................................ 56
II-3.2. Influence de la pression osmotique ....................................................................... 56
II-3.3. Influence de la température ................................................................................... 56
II-3.4. Influence du pH ..................................................................................................... 56
II-4. Tests biochimiques ....................................................................................................... 57
II-5. Auxanogramme ............................................................................................................ 58
Table des matières
III- Fermentation ...................................................................................................................... 59
III-1. Etude avec la cloche de Durham ................................................................................. 59
III-2. Culture discontinue ou fermentation en Batch ............................................................ 60
III-2.1. Evolution de la concentration en biomasse dans le milieu .................................. 62
III-2.2. Evolution de la consommation de substrat dans le milieu ................................... 62
III-2.3. Evolution de la production d’éthanol dans le milieu ........................................... 62
III-3.1. Rendement de conversion du substrat en biomasse ............................................. 64
III-3.2. Rendement de conversion du substrat en produit ................................................ 64
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 67
ANNEXE ................................................................................................................................. 68
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIE ............................................. 75
i
GLOSSAIRE
Actinomorphe : caractéristique d'une fleur qui présente une symétrie radiale.
Antiscorbutique : qui est propre à guérir le scorbut.
Apiculé : terminé au sommet en pointe courte et aigüe.
Aréole : coussin portant des épines et sur lequel prennent naissance les poils laineux, les
feuilles, les rameaux latéraux et les fleurs.
Arille : excroissance charnue ou membraneuse enveloppant une graine.
Bacciforme : désigne un fruit charnu en forme de baie.
Biomasse : masse totale d'organismes vivants dans un biotope déterminé à un moment donné.
Elle peut être estimée par unité de surface, s'il s'agit d'un milieu terrestre, ou bien par unité de
volume s'il s'agit d'un milieu liquide.
Biocatalyseur : macromolécule biologique, cellule, organite cellulaire ou microorganisme,
porteur d'activité catalytique (enzymatique).
Biosynthèse : formation de substance par un être vivant dans son milieu interne ou dans les
excrêtats que sont le mucus, la coquille, l’écorce, etc.
Biotechnologie : application de la science et technologie aux organismes vivant et à d’autres
matériaux vivants ou non vivants pour la production de savoir de bien et de service.
Déhiscence : ouverture spontanée d'organes végétaux clos suivant des zones définies.
Diatomée : algue brune unicellulaire présente dans les milieux aquatiques et enveloppée par
un squelette externe siliceux.
Cladode : tige aplatie, dont l’aspect et les fonctions sont analogues à ceux d’une feuille.
Ecosystème : ensemble formé par une association ou communauté d'êtres vivants et son
environnement biologique, géologique, édaphique, hydrologique, climatique, etc..
Epigyne : qui naît sur l’ovaire ou au-dessus.
Galerie API : ensemble de petits tubes prêts à l’emploi permettant l'identification de micro-
organismes par la réalisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturisés.
ii
Glochides : épines fines de quelques millimètres de long, de couleur brunâtre, se décrochant
facilement, et peuvent s’implanter solidement dans la peau et sont très difficiles à retirer.
Périanthe : ensemble des enveloppes qui assurent la protection des organes reproducteurs de
la fleur (étamines et pistil) ; il comprend le calice composé de sépales et qui assure une
fonction de protection et accessoirement une fonction chlorophyllienne, puis la corolle
composée de pétales (lames minces et colorées) pouvant attirer des animaux pollinisateurs.
Périgyne : qui entoure l’ovaire.
Scorbut : maladie provoquée par la carence en vitamine C.
Sessile : caractérise en botanique une feuille, une fleur ou un fruit directement attachés à la
tige.
Succulent : qui emmagasine de l’eau dans des tissus spongieux situés dans les racines, les
tiges ou les feuilles.
Ubiquitaire : présent en tout lieu ou en plusieurs lieux simultanément. (omniprésence)
Xérophyte : plante adaptée pour survivre avec très peu d’eau. Adj. : xérophile
iii
LISTE DES ABREVIATIONS
ADP: Adénosine diphosphate
ATP: Adénosine triphosphate
CAM: Crassulacean Acid Metabolism
LDA : lysine désaminase
LDC : lysine décarboxylase
MAEP : Ministère de l’Agriculture, de l’Elevage et de la Pêche
NADH : nicotinamide adénine dinucléotide
Pi: ion phosphate
UA : unité d’absorbance
iv
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Représentation schématique d’une cellule de levure ................................................................5
Figure 2: Schéma des reproductions asexuée et sexuée d’une levure ......................................................7
Figure 3: Détail de l’Opuntia Ficus-Miller ............................................................................................16
Figure 4: Schéma détaillé de la dégradation du glucose par les levures en anaérobiose .................... 23
Figure 5: Courbes des cinétiques de la concentration en biomasse X, en substrat S et en
produit P, lors de la culture en discontinu sur milieu glucosé 3% de la souche de
Saccharomyces cerevisiae .......................................................................................................................61
Figure 6 : Courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat qS et à
l’éthanol vP, lors de la culture en discontinu sur milieu glucosé à 3% de la souche de
Saccharomyces cerevisiae .......................................................................................................................61
v
LISTE DES PHOTOS
Photo 1 : Géolocalisation du lieu de récolte ...........................................................................................27
Photo 2 : Figues de barbarie ...................................................................................................................27
Photo 3 : Schéma du test de pouvoir fermentaire ...................................................................................39
Photo 4 : Photo des 4 souches retenues pour l’identification .................................................................52
Photo 5: Morphologie des souches de levure .........................................................................................53
Photo 6: Exemple de souche de levure colorée au bleu de méthylène ...................................................54
Photo 7: La montée de la cloche de Durham ..........................................................................................59
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Composition centésimale de la figue de barbarie ................................................................18
Tableau 2: Récapitulatif des caractères macroscopiques des souches de levure isolées .......................51
Tableau 3: Caractères microscopiques des quatre souches de levure ....................................................53
Tableau 4: Viabilité des quatre souches de levure .................................................................................54
Tableau 5: Caractères physiologiques des quatre souches pures de levure ...........................................55
Tableau 6: Caractères biochimiques des quatre souches pures de levure ..............................................57
Tableau 7: Auxanogramme des quatre souches pures de levure ............................................................58
Tableau 8: La concentration en biomasse, la consommation en substrat et la production
d’éthanol pendant la culture de la souche de Saccharomyces cerevisiae................................................60
Tableau 9: Evolution de la vitesse spécifique en biomasse, en substrat et en produit ...........................63
Tableau 10: Tableau récapitulatif des rendements .................................................................................64
INTRODUCTION
GENERALe
1
INTRODUCTION
Un grand nombre de substances que nous utilisons chaque jour, résulte de l’exploitation des
microorganismes dont l’origine remonte à la plus haute antiquité. Cependant, il a fallu
attendre les découvertes de Pasteur en 1876 pour voir s’établir les connaissances précises
permettant la naissance de l’industrie des fermentations. Le développement de cette nouvelle
industrie a donné une preuve éclatante du rôle utile des microorganismes (SIMON et
MEUNIER, 1970).
Les microorganismes constituent un groupe extrêmement diversifié d’organismes invisibles à
l’œil nu (bactéries, champignons, algues, protozoaires) qui se distinguent les uns des autres
par leur forme, leur taille et leur mode de vie. Parmi les nombreux organismes
microscopiques cités, la levure, un champignon unicellulaire, compte parmi les plus
exploitées pour les besoins de l’Homme (LECLERC H., 1975). En effet, les levures ont
occupé et occupent toujours une place primordiale dans le domaine agroalimentaire,
notamment par leur pouvoir fermentaire. De plus, dans le domaine scientifique, les levures
constituent un matériel expérimental de choix, aussi bien en recherche fondamentale qu’en
recherche appliquée, en raison de leur double état de microorganismes et d’eucaryotes (POL
D., 1996).
Les levures sont largement distribuées dans la nature car elles sont capables de coloniser
presque tous les écosystèmes existants. Elles sont particulièrement abondantes dans les
milieux riches en sucres directement assimilables tels les fleurs et les fruits mûrs (BOUIX et
LEVEAU, 1991).
De nombreuses études ont démontré que les conditions du milieu de vie des
microorganismes, dont les levures, influent sur leurs activités métaboliques et peuvent générer
de nouvelles souches spécifiques à ce milieu (SABART M., 2009). Ainsi, les écosystèmes
particuliers de Madagascar pourraient engendrer des caractéristiques intéressantes propres aux
souches de levure, non trouvées nulle part ailleurs, qui se sont adaptées dans les niches
écologiques particulières du pays.
2
Madagascar est un pays où les fruits tropicaux ou exotiques sont abondants et il en exporte
même un certain nombre comme les litchis, les bananes et la vanille (http://www.madagascar-
services.com/85-importer-madagascar/exportateur-fruits-et-legumes.html).
L’Opuntia ficus-indica ou figuier de barbarie est une plante tropicale de la famille des
CACTACEAE. Elle est originaire du Mexique, s’est répandue dans le monde et a été
introduite à Madagascar par les navigateurs européens. C’est une plante vivace xérophyte
qui se développe surtout dans les régions chaudes et semi-désertiques (MONTAGNAC P,
1960). A Madagascar, on la rencontre partout mais surtout dans la région Atsimo-Andrefana
dont le climat convient parfaitement à l’exigence de la plante (RATIANJANAHARY, 2004).
Avec le développement des marchés de fruits exotiques dans le monde, la culture industrielle
de Opuntia ficus-indica s’est multipliée dans certains pays tropicaux. Les fruits ou figues de
barbarie sont en général consommés frais, ils sont très rafraichissants et nutritifs. La totalité
des sucres présents dans le fruit mûr est constituée de glucose et de fructose (CODEX
ALIMENTARUS, 1994) d’où il représente une niche écologique favorable au développement
des levures.
L’objectif de ce travail est d’isoler puis d’identifier les levures de la figue de barbarie cueillie
dans la région de Vakinankaratra.
Pour bien cerner le travail, notre étude comporte les étapes suivantes :
La première partie sera consacrée à l’étude bibliographique des levures, de la figue de
barbarie et de la fermentation ;
La deuxième partie comprendra les matériels et les méthodes utilisés durant le travail ;
et enfin, nous présenterons dans la troisième partie les résultats obtenus suivis d’une
discussion.
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
3
I-LES LEVURES
I-1. Historique
Les levures sont les premiers microorganismes utilisés par l’Homme depuis des millénaires,
en particulier dans la fabrication des boissons alcoolisées et des pains par fermentation
(BOUIX et LEVEAU, 1991 et POL D., 1996). Elles sont également les premiers
microorganismes à être observés au microscope par A.Van Leeuwenhoek en 1680 qui les a
dessinées. Ce n’est qu’avec les travaux de Pasteur en 1866-1876 que le rôle des levures dans
la fermentation alcoolique a été mis en évidence. A peu près à la même époque (1860-1917),
la levure fut à l’origine du développement de la biochimie avec notamment les travaux de
Büchner. A l’heure actuelle, les levures constituent un matériel expérimental de choix, aussi
bien en recherche fondamentale qu’en recherche appliquée, en raison de leur double état de
microorganismes et d’eucaryotes (POL D., 1996).
I-2. Caractéristiques microbiologiques des levures
I-2.1. Définition
Le mot levure, selon PHAFF et al., (1968), provient du mot latin « levare » qui se traduit par
lever. Ce mot a été appliqué aux levures en raison de l’aptitude de ces microorganismes à
produire du CO2 pendant la fermentation et à lever la surface mousseuse d’un milieu liquide
de fermentation (OTENG-GYANG, 1984).
Les levures peuvent être définies comme des eucaryotes microscopiques. Elles sont des
hétérotrophes faisant partie du groupe des champignons dont on les distingue par leur
caractère unicellulaire et l’absence de vrai mycélium (au moins dans la plus grande partie de
leur cycle biologique) (GUIRAUD, 1998).
I-2.2. Habitats
Les levures sont des espèces ubiquitaires, largement distribuées dans la nature. Elles se
rencontrent surtout sur les végétaux riches en sucres directement assimilables (BOUIX et
LEVEAU, 1991)
En effet, les milieux fortement concentrés en sucres représentent un de leurs environnements
préférés, comme les sirops, le miel, les fleurs et de nombreux fruits (LECLERC, 1975 et
OTENG-GYANG, 1984).
On trouve également des levures à la surface ou à l’intérieur d’autres êtres vivants, dans les
eaux, dans l’atmosphère et dans le sol (LEVEAU et BOUIX, 1993 et POL D., 1996).
Synthèse bibliographique
4
Par ailleurs, le sol constitue un large réservoir assurant leur survie dans des conditions
défavorables (LECLERC H., 1975).
I-2.3. Morphologie et structure
I-2.3.1. Morphologie (LARONE, 2011)
Les cellules végétatives des levures peuvent être sphériques, ovoïdes, allongées, cylindrique
ou apiculées. Il y en a même celles qui sont en forme de bouteille comme les levures du genre
Pitysporum.
La taille cellulaire varie de 2 à 50µm de long. La largeur est moins variable et se situe entre 1
et 10µm.
Une cellule de levure est constituée par :
Une membrane double
Une paroi cellulaire protège la cellule contre les agressions extérieures; cette paroi est doublée
intérieurement par la membrane cytoplasmique semi-perméable, qui permet, par osmose, des
échanges sélectifs avec le milieu ambiant.
La paroi de la levure a une épaisseur de 1,5 à 2µm. Par sa rigidité, elle confère à la cellule une
forme caractéristique. Sa composition chimique est la suivante : polysaccharides 80%,
protéines 10 à 20%, lipides 7 à 10% et les sels minéraux 5%.
Dans la paroi des levures existent des protéines qui se caractérisent par leur richesse en acides
aspartique et glutamique, en sérine et en thréonine. Plusieurs de ces protéines sont des
enzymes.
Le cytoplasme
Le cytoplasme, le siège de l'activité métabolique de la cellule, comporte souvent des
inclusions cytoplasmiques telles que :
- les vacuoles qui emmagasinent les réserves de nutriments,
- les ribosomes au niveau desquels sont synthétisées les protéines,
- les mitochondries qui produisent l'énergie cellulaire au dépend des sucres.
Le noyau
Le noyau est indispensable car il règle l'activité de la cellule et contient le génome.
Synthèse bibliographique
5
Figure 1 : Représentation schématique d’une cellule de levure ( Gaillardin et Heslot, 1987)
I-2.3.2. Structure (GUIRAUD, 1998)
Les levures ont une structure typique des cellules eucaryotes. Leurs principales particularités
sont les suivantes :
les mitochondries sont au nombre de 30 à 50 et sont réprimées en présence de forte
concentration de glucose. Cependant, même après croissance en anaérobiose
complète, l’activité des enzymes respiratoires n’est pas nulle. Les protéines localisées
dans les mitochondries sont codées par des gènes nucléaires et synthétisées au niveau
des ribosomes cytoplasmiques.
le nombre de vacuoles et leur taille est fonction de l’âge de la cellule. Elles sont
entourées d’une membrane monocouche (tonoplaste) constituée de phospholipides,
stérol et protéines. Les vacuoles sont riches en enzymes solubles, en particulier de type
hydrolase.
Synthèse bibliographique
6
une cellule de levure comporte un vrai noyau. Les chromosomes des levures ont une
structure semblable à celle des autres eucaryotes avec un enroulement d’ADN en
"grain de chapelet". Les levures peuvent être haploïdes, diploïdes ou polyploïdes. Ce
dernier état est très fréquent chez les souches industrielles.
le plasmide, une petite molécule d’ADN bicaténaire, est un élément extra-
chromosomique présent dans certaines levures dont presque toutes les souches de
Saccharomyces cerevisiae. Il est localisé dans le noyau à raison d’une ou plusieurs
copies. Il est très utilisé en tant que vecteur au cours de transformations génétiques.
I-2.4. Reproduction des levures
Les levures ont un mode de multiplication bien spécial. Elles se reproduisent aussi bien par un
cycle asexué (végétatif) que par un cycle sexué (sporulation) en fonction des conditions
favorables ou défavorables du milieu (LARPENT et LARPENT-GOURGAUD, 1997). De
plus, les populations de levure connaissent un cycle de vie complexe, dans lequel on trouve
alternativement des cellules haploïdes et des cellules diploïdes. Pour la plupart des levures, la
reproduction asexuée est le mode majeur de multiplication (BONALY, 1991).
I-2.4.1. Multiplication végétative ou asexuée
Le bourgeonnement représente le mode de reproduction végétative le plus courant chez les
levures. A l’exception de quelques genres, les bourgeonnements apparaissent dans les zones
situées aux extrémités de grands axes des cellules végétatives lorsque celles-ci ont une forme
ovoïde ou allongée. Le bourgeonnement multilatéral caractérise les cellules sphériques telles
que celles des Saccharomyces ou Debaryomyces. On reconnait l’âge de la cellule de levure
par le comptage sous microscope du nombre des cicatrices que chaque bourgeonnement ait
laissé à la surface de la cellule et une cellule mère donne environ 20 à 25 cellules filles
(LARPENT et LARPENT-GOURAUD, 1997).
I-2.4.2. Multiplication sexuée
Il existe des cellules haploïdes " a " et des cellules haploïdes "α " qui correspondent à des
signes sexuels distincts ; c'est la fusion entre une cellule " a " et une cellule " α " qui donne
naissance à une cellule diploïde " a/α ".
Synthèse bibliographique
7
Tant que l'environnement est favorable, les cellules diploïdes se multiplient par
bourgeonnement. Lorsque le milieu dans lequel elles se trouvent devient défavorables, elles
cessent de se multiplier par bourgeonnement et sporulent : chaque cellule repasse en phase
haploïde par un processus de méiose. On obtient finalement quatre noyaux haploïdes qui sont
inclus dans les spores (ou ascospores) contenues dans un sac appelé asque. L'enveloppe de
l'asque se rompt à maturité et libère alors deux cellules " a " et deux cellules " α " qui peuvent
recommencer le cycle (GUINET R., 1992).
A : multiplication asexuée, B : multiplication sexuée
Figue 2 : Schéma des reproductions asexuée et sexuée de levure
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Yeast_lifecycle.svg?uselang
I-2.5. Classification des levures (KREGER-VAN, 1984)
Les champignons levuriformes sont des protistes eucaryotes. LODDER et KREGER VAN
RIJ ont établi en 1952 une classification des champignons levuriformes qui fait autorité. Selon
ces auteurs, on trouve des champignons levuriformes dans trois des familles qui constituent
l’embranchement des THALLOPHYTES :
A
A
B
a
haploïde
α
haploïde
a/α
diploïde
Synthèse bibliographique
8
dans la famille des ENDOMYCETACEAE qui fait partie de la classe des
ASCOMYCETES
dans la famille des SPOROBOLOMYCETACEAE qui fait partie de la classe des
BASIDIOMYCETES, bien que d’autres auteurs les rangent parmi les « fungi
imperfecti »
dans la famille des CRYPTOCOCCACEAE qui fait partie de l’ordre des
CRYPTOCOCCALES dans la classe des « fungi imperfecti » ou
DEUTEROMYCETES.
Les ENDOMYCETACEAE, comme toutes les autres ASCOMYCETES sont caractérisées par
leur aptitude à former, dans certaines conditions, des spores internes.
Les SPOROBOLOMYCETACEAE peuvent également donner des spores, mais celle-ci sont
externes, portées à l’extrémité des stérigmates, et sont projetées au loin au moment de leur
maturité tandis que les CRYPTOCOCCACEAE ne forment jamais de spores.
La classification générale des levures est représentée en annexe 1.
I-3. Physiologie et croissance des levures
I-3.1. Les besoins nutritifs
Pour se maintenir, croître et se reproduire, la levure doit trouver dans son milieu les éléments
nécessaires à la synthèse cellulaire et des conditions physico-chimiques favorables.
I-3.1.1. Source de carbone
Les sources carbonées sont d’une grande importance pour les champignons puisqu’elles
fournissent le carbone nécessaire pour la biosynthèse de constituants cellulaires variés tels que
les glucides, les lipides, les protéines, les acides nucléiques etc. (BOTTON, 1991). Les
levures utilisent des sucres comme source principale de carbone et par conséquent d’énergie.
Les sources les plus efficaces sont des oses (glucose, fructose et mannose) qui sont utilisables
par plus de 400 espèces de levures identifiées (POL, 1996).
D’autres levures particulières utilisent des sources de carbone non conventionnelles ; elles
sont capables d’oxyder des acides organiques et des alcools (éthanol, Glycérol) (OTENG-
GYANG, 1984).
Synthèse bibliographique
9
I-3.1.2. Source d’azote
La plupart des levures sont capables d’assimiler différentes sources d’azote organique et
inorganique pour la biosynthèse d’acides aminés, de protéines, d’acides nucléiques et de
vitamines (LARPENT et LARPENT-GOURGAUD, 1997) (GUIRAUD, 1998).
Parmi les sources d’azote minéral, les sels d’ammonium sont les plus couramment
utilisés.
Parmi les sources d’azotes organiques, les acides aminés sont essentiellement utilisés
en fonction des capacités de désaminations des levures. Les acides glutamique et
aspartique et leurs amines constituent ainsi de bonnes sources d’azote.
La croissance des levures est plus importante en présence d’acides aminés ou de sels
d’ammonium qu’avec des peptides car seules, les molécules les plus simples comme les
acides aminés seront assimilables par la levure (HARDING et KIRSOP, 1979).
L’urée est utilisée par beaucoup de levures et donne des croissances identiques à celle
obtenues avec des sels d’ammonium. Les levures ne peuvent pas fixer l’azote libre. Toutes les
levures ne sont pas aptes à utiliser des sources d’azote minéral. Les levures qui assimilent les
nitrates utilisent également les nitrites mais la réciproque n’est pas vraie.
I-3.1.3. Oligoéléments et facteurs de croissance
Les levures ont besoin d’éléments nutritifs pour assurer un développement adéquat. Il s’agit
de sels minéraux et d’oligoéléments nécessaires à de très faibles concentrations (LOURENS
et REID, 2002). WILDIERS, en étudiant le métabolisme de la levure, montra que ces
microorganismes exigeaient la présence dans leur ration d’une substance organique active à
faible concentration : le « bios ». Ce dernier, appelé aussi facteur de croissance, est en général
un complexe de vitamines (mesoinositol, biotine, β alanine, acide pantothénique, etc.). Les
facteurs de croissance agissent souvent à des doses infinitésimales comme biocatalyseurs
(LARPENT GOURGAUD et SANGLIER, 1992).
I-3.2. Les besoins physico-chimiques
Comme pour tout microorganisme, la croissance des levures est influencée par divers
facteurs physico-chimiques du milieu dont les principaux sont : la température, le pH,
l’aération, la pression osmotique et l’activité de l’eau.
I-3.2.1. La température
Les températures d’incubation des cultures de levure, sont généralement proches de celles qui
permettent la propagation des levures dans leurs environnements naturels et se situent entre
25°C et 30°C.
Synthèse bibliographique
10
Toutefois, ces températures ne sont pas rigoureusement les températures optimales de
croissance que les levures trouvent dans certains habitats, à savoir les régions à température
constamment basse ou élevée (ROSE, 1987).
I-3.2.2. Le pH
Les levures présentent une tolérance élevée aux pH extrêmes. Elles tolèrent des gammes très
larges allant de 2,4 à 8,6. Entre ces valeurs, le pH intracellulaire est compris entre 5,8 et 6,8
(BOUIX ET LEVEAU, 1991). Cependant, PHAFF et ses collaborateurs (1978) ont noté que
la plupart des levures connues, ont une bonne croissance à des pH proches de 3 (BOUIX et
LEVEAU, 1991).
I-3.2.3. L’aération
Les levures peuvent être classées selon leur mode de production énergétique, utilisant la
respiration ou la fermentation. Il est important de noter que ces processus sont principalement
réglés par des facteurs environnementaux (WALKER et al., 1997). En effet, toutes les levures
sont capables de se développer en présence d’oxygène, il n’y a pas de levures anaérobies
strictes, certaines sont aérobies strictes et d’autres sont aéro-anaérobies facultatives (BOUIX
et LEVEAU, 1991).
I-3.2.4. Pression osmotique et activité de l’eau
L’effet de la pression osmotique varie d’une souche de levure à l’autre. La plupart des
souches ne peuvent se développer pour des activités de l’eau inférieures à 0,90, mais certaines
tolèrent des pressions osmotiques plus élevées correspondant à une activité de l’eau de l’ordre
de 0,60 mais avec un métabolisme lent (LEVEAU et BOUIX, 1979).
I-3.3. Le métabolisme des levures
Les levures sont des organismes hétérotrophes, ce qui signifie qu'ils prélèvent des constituants
organiques dans leur environnement afin de se développer. Pour produire de l'énergie, les
levures utilisent deux processus différents : la respiration qui est un métabolisme aérobie et la
fermentation alcoolique qui est un métabolisme anaérobie (COT, 2006).
I-3.3.1. Métabolisme aérobie (KAPPELI, 1986)
Les levures utilisent la respiration en milieu aérobie (présence de dioxygène). Ce
métabolisme sert à produire des molécules d’ATP, source d'énergie de la cellule.
Synthèse bibliographique
11
Au cours du métabolisme oxydatif, une partie du glucose métabolisé génère des
intermédiaires utilisés pour l'élaboration de nouvelles cellules, en consommant l’énergie
fournie par la chaîne respiratoire. Le rendement théorique en biomasse en conditions
oxydatives est d’environ 0,5 g/g de glucose consommé.
En présence d’oxygène, le glucose est en partie dégradé en H2O et CO2, après avoir emprunté
successivement la voie de la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques et la chaîne
respiratoire.
L'équation bilan de la respiration cellulaire est :
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 36ATP
I-3.3.2. Métabolisme fermentaire
La concentration critique à laquelle le glucose est métabolisé en éthanol et en CO2 en dépit
d’un excès d’air se situe dans l’intervalle de 35 à 280g/l. Aux environs d’une concentration de
5% de glucose, il y a inhibition de la synthèse des enzymes respiratoires, le métabolisme est
donc fermentaire quelque soit le niveau d’aération. Ce phénomène est connu sous le nom
« d’effet glucose » ou « effet Crabtree », il conduit à la production d’éthanol. Durant cette
phase, le rendement en biomasse sèche est faible, de l’ordre de 0,15g/g de glucose
consommé. Après disparition du glucose, la levure va s’adapter à son nouvel environnement
et utiliser l’éthanol. Le rendement en biomasse peut alors atteindre 0,7g/g d’éthanol
consommé (BOTTON, 1991).
En absence d’oxygène, les levures utilisent la voie d’Embden-Meyerhof-Parnas pour
l’oxydation des hexoses. Les deux dernières étapes de cette voie comportent la
décarboxylation du pyruvate en acétaldéhyde et la réduction de ce dernier en éthanol. Cette
voie représente 95% de la glycolyse chez Saccharomyces cerevisiae et Candida utilis et ne
produit que deux molécules d’ATP par molécule de glucose consommé.
La croissance des levures en anaérobiose ne se déroule correctement que dans des milieux
comportant des vitamines, des acides gras insaturés et de l’ergostérol car ces composés ne
peuvent être synthétisés en l’absence d’oxygène.
I-4. La levure en biotechnologies (BOIDIN, J. et al, 2005)
Les levures représentent certainement le groupement le plus important de microorganismes
exploités par l’Homme.
Depuis la plus haute antiquité, elles ont jouées un rôle de premier ordre dans l’alimentation
humaine : vinification, panification, brasserie, fromagerie.
Synthèse bibliographique
12
La plus ancienne utilisation est la fabrication de boisson alcoolisée à partir de fruits mûrs aux
sucres solubles : la fermentation peut se produire spontanément, dès le pressurage, grâce à la
présence de levures sauvages.
Les levures ont donc d’abord été utilisées comme agents de la fermentation et produites en
tant que telles. Cependant, leur composition, toujours riche en protéines de haute valeur
biologique et en vitamines, les font aussi considérer depuis une cinquantaine d’années comme
un aliment de grande valeur nutritive pouvant rentrer dans la ration alimentaire animale ou
humaine. Dans ce but, la production de "levure alimentaire" ou POU (Protéine d’Organisme
Unicellulaire) s’effectue sur des substrats très variés :
- le lactosérum par exemple, produit résiduel des fromageries, est un excellent milieu
de culture permettant de développer des levures utilisant le lactose comme source de carbone ;
ce sont des souches de Kluyveromyces lactis qui ont donné le meilleur rendement.
- les mélasses de betterave et de canne à sucre, riches en saccharose permettent
d’obtenir des biomasses protéiques ou des levures pour la panification, les espèces les plus
couramment cultivées sur ces substrat étant saccharomyces cerevisiae et candida utilis.
- les liqueurs sulfitiques, résidus de la fabrication de la pâte à papier, riches en
pentose, ainsi que les hydrolysats cellulosiques provenant de déchets forestiers, pailles de blé
ou autres céréales, fournissent des milieux de culture (exemple pour candida utilis).
- enfin les hydrocarbures, essentiellement les paraffines normales, le gasoil
paraffinique, le méthane et le méthanol peuvent servir de substrat pour la croissance de
nombreuses espèces du genre candida.
Après avoir été utilisée comme facteur de fermentation à des fins alimentaires, puis comme
agent de production de protéines, la dernière utilisation des levures tend à faire jouer à ces
microorganismes un rôle d’agent bioénergétique. En effet, ces dernières années, la crise
mondiale remis à l’ordre du jour la recherche de production d’alcool industriel (source
d’énergie) pouvant servir de substitut ou d’additif à des carburants d’origine fossile. Les
levures, essentiellement des souches de Saccharomyces, grâce à leur haute capacité
fermentaire peuvent assurer la bioconversion de nombreux produits végétaux en éthanol.
Les matières premières disponibles pouvant conduire à la fabrication d’alcool carburant sont
reparties en trois groupes :
- les produits sucrés, contenant des composés hydrocarbonés sous forme de mono ou
disaccharide donc directement fermentescibles, c’est le cas des mélasses déjà citées :
on évalue actuellement à 3,3 tonnes la quantité moyenne de mélasse nécessaire à l’obtention
de 1 tonne d’alcool.
Synthèse bibliographique
13
- les produits amylacés, présents dans les tubercules, racines ou graines sont des
réserves glucidiques sous forme d’amidon non directement fermentés par les levures.
La préparation du moût de fermentation nécessite alors une hydrolyse par voie chimique ou
par voie enzymatique, ce qui augmente les prix de production de l’éthanol.
Les graines amylacées (le riz en Asie, le maïs aux Etats-Unis et l’avoine en Europe) sont
utilisées depuis longtemps comme source d’éthanol.
Il faut noter que la production de céréales est en priorité orientée vers l’alimentation.
- les produits cellulosiques, présentent vraisemblablement le plus d’intérêt pour
l’avenir dans la production d’alcool carburant par les levures, la cellulose étant le composé
hydrocarboné renouvelable le plus abondant dans la nature.
Cependant, ces matières premières nécessitent, comme dans le cas de l’amidon, un
prétraitement hydrolytique destiné à libérer les monomères de la cellulose. Cela implique
l’intervention de la cellulase, produit essentiellement par les moisissures du genre Aspergillus
ou Trichoderma, ou la réalisation de culture mixte levure-bactérie, cette dernière assurant la
dégradation de la cellulose en glucoses qui seront alors fermentés par les levures. Cette
technologie difficile à mettre en œuvre pourrait dans l’avenir être supplantée par l’utilisation
de souches de levures auxquelles on aurait conféré, par la manipulation génétique, des
propriétés cellulasiques.
II- GENERALITES SUR LE FIGUIER DE BARBARIE
II-1. Le figuier de barbarie dans le monde
L’espèce Opuntia ficus indica, connue sous le nom de figuier de barbarie, est originaire du
Mexique, où elle est appelée Nopal. L’espèce était inconnue en Europe avant les voyages de
Christophe Colomb et fut décrite de façon précise pour la première fois en 1535 par
l’espagnol Gonzalo Fernandez de Oviedo y Valdes dans son histoire des Indes occidentales.
L’espèce s’est diffusée rapidement en Europe et notamment dans le bassin de la Méditerranée
et s’y est naturalisée au point de devenir un élément caractéristique du paysage comme en
Corse. Sa diffusion est due autant à l’Homme (qui embarquait des cladodes comme aliment
anti-scorbutique) qu’aux oiseaux qui, en mangeant les fruits, assurent la dispersion des
graines. Elle s’est répandue également dans l’hémisphère sud, notamment en Afrique du Sud,
à Madagascar, à La Réunion et à l’île Maurice, en Inde et au Sri Lanka, ainsi qu’en Australie
et en Nouvelle-Calédonie (www.fr wikipedia.org/wiki/figuier_de_Barbarie).
Synthèse bibliographique
14
D’après PERRIER de la BATHIE, le figuier de barbarie, compterait parmi les nombreuses
espèces asiatiques et américaines introduites, à partir de 1500, à Madagascar par les premiers
navigateurs européens (MONTAGNAC, P., 1960).
II-2. Etude botanique du figuier de barbarie
II-2.1. Famille des CACTACEAE (www.plantes-botanique.org/famille_cactaceae)
Le figuier de barbarie est une espèce de plante de la famille des CACTACEAE. Les plantes
de cette grande famille, appelées communément les cactus, comportent 155 genres et 1800
espèces connus. Les milieux caractéristiques des cactacées subissent des pluies occasionnelles
entrecoupées de longues périodes de sècheresse et bénéficient d’une rosée nocturne
abondante. Ce sont des arbres, des arbustes et de sous-arbrisseaux persistants xérophytes, plus
ou moins succulents.
Les individus peuvent êtres isolés ou former des ensembles plus ou moins étendus, comme
des fourrés ou des tapis. Ces plantes vivaces sont des xérophytes qui réalisent leur économie
hydrique grâce à leurs surfaces évaporantes réduites (suppression des feuilles, stomates
enfoncés dans un épiderme épais et ouverts seulement quelques heures par jour ou la nuit) et à
leur système radiculaire superficiel étendu, drainant le maximum d’humidité (pluie et rosée).
Les racines plus profondes n’ont qu’un rôle de fixation. Les tiges chlorophylliennes
constituent alors de véritables réservoirs d’eau.
Les fleurs généralement solitaires et sessiles sont bisexuées et actinomorphes. La couleur des
fleurs est très variée, seul le bleu est absent. Le périanthe est épigyne, rarement périgyne,
parfois persistant à la fructification. Les étamines, pétales, sépales et bractées sont
nombreuses et disposées en spiral, sans calice et corolle bien différenciées.
Le fruit est bacciforme, à déhiscence, persistante et à succulence variable. Le péricarpe est
plus ou moins coriace.
Les graines au nombre de cinq, à plus de 3000 par fruit, ont un embryon droit ou recourbé et
peu ou pas d’albumen, mais un périsperme et un testa lisse ou munis d’appendices arillés.
II-2-2. Espèce Opuntia ficus-indica
C’est une plante arborescente qui peut atteindre 3 à 5 mètres de hauteur. Son organisation en
cladodes, couramment appelée "raquettes, est particulière. Les cladodes sont des tiges
modifiées de forme aplatie, de 30 à 40 cm de long sur 15 à 25cm de large et de 1,5 à 3 cm
d’épaisseur. Unis les uns aux autres, les cladodes tendent à former des branches. Ceux de la
base se lignifient pour former au-delà de la quatrième année de croissance un véritable tronc.
Synthèse bibliographique
15
Ces cladodes assurent la fonction chlorophyllienne à la place des feuilles, et sont recouverts
d’une cuticule cireuse (la cutine), qui limite la transpiration et les protège contre les
prédateurs.
Les feuilles ont une forme conique et ont seulement quelques millimètres de long. Elles
apparaissent sur les cladodes jeunes et sont éphémères.
A la base des feuilles se trouvent les aréoles (environ 150 par cladode) qui sont des bourgeons
axillaires modifiés, typiques des cactacées. Leur méristème selon les cas, produit des épines et
des glochides (sorte de poils), ou bien émet des racines adventives, de nouveaux cladodes et
des fleurs. Il est à noter que même l’ovaire, donc le fruit, est recouvert d’aréoles susceptibles
d’émettre à nouveau des fleurs ou des racines.
Les épines proprement dites, blanchâtres, sclérifiées, solidement implantées, sont longues de
1 à 2cm. Il existe des variétés de figuier de barbarie inermes, sans épines.
Les racines du figuier de barbarie sont peut profondes mais assez étalées dans la partie
supérieure du sol. Il s'agit donc d'un système racinaire relativement superficiel (KAVIRINDI
et al., 2010).
Les fleurs sont à ovaire infère, uniloculaire. Le pistil est surmonté d’un stigmate multiple. Les
étamines sont très nombreuses. Les sépales peu apparentes et les pétales bien visibles de
couleur jaune à rouge-orangée.
Le fruit comestible, ou figue de Barbarie, est une baie charnue, uniloculaire, à nombreuses
graines (polyspermiques) dont le poids peut varier de 150 à 400g. Il dérive de l’ovaire infère
adhérente au réceptacle floral. Certains auteurs le considèrent comme un faux arille. Sa
couleur est variable selon les variétés : jaune, rouge, blanc… la forme est également très
variable, non seulement selon les variétés mais aussi selon l’époque de formation : les
premiers sont arrondis, les plus tardifs ont d’avantage une forme allongée de pédoncule. Le
nombre de graines est très élevé de l’ordre de 300 pour un fruit de 160g
(RABEMANANTSOA, 2010).
Synthèse bibliographique
16
En résumé, on peut classifier le figuier de barbarie comme suit,
CLASSIFICATION (MABBERLEY, D.J., 1987)
Règne : VEGETAL
Embranchement : SPERMAPHYTES
Classe: DICOTYLEDONES
Ordre: CARYOPHYLLALES
Famille: CACTACEES
Genre: Opuntia
Espèce: ficus-indica
Noms vernaculaires : cactus, figuier de barbarie, Nopal, raquette ou raketa
Figure 3 : Détail de l’Opuntia Ficus-Miller (THEDOR MORGAN BOCK, 1999)
Aréole
Aréole
Cladode
ou
raquette
Epines
Feuilles
Jeune
pousse
Fleur
Fruit ou
figue
Synthèse bibliographique
17
II-3. Ecologie du figuier de barbarie
II-3.1. Physiologie
Sur le plan physiologique, Opuntia ficus-indica est une plante à photosynthèse de type CAM
(Crassulacean Acid Metabolism). Elle a la particularité de fixer le dioxyde de carbone et de
libérer de l’oxygène pendant la nuit et de fermer ses stomates pendant le jour. Ce mécanisme
permet une moindre perte d’eau par évapotranspiration pendant les heures les plus chaudes.
La pénétration de l’air par les stomates ouverts s’effectue donc pendant la nuit (SUTTON,B.G
et al,1981)(LEUTTGE,U.,1993).
II-3.2. Exigences du figuier de barbarie
Le figuier de barbarie possède une grande adaptation aux conditions les plus hostiles comme
l’aridité du climat ou la salinité des sols. Cependant, cette plante exige certaines conditions
pour survivre :
- La plante n’a aucune exigence vis-à-vis de la nature chimique du sol, et peut supporter, sans
dommage, des sols gypseux ou des sols légèrement salins, à condition qu’ils soient bien
drainés. Ainsi, elle s’adapte facilement à tous les sols, à l’exception de ceux gorgés d’eau ou
inondés, même temporairement. Il faut éviter les cuvettes humides et les berges alluvionnaires
des rivières (WALALI-LOUDY, 2004).
Les sols préférés par cette plante sont les sols légers, sablonneux-limoneux, ayant un pH acide
de 5,1 à 6,7, mais Opuntia ficus-indica est rencontrée même sur le sol calcaire. Il s’agit de sol
généralement pauvre en matières organiques (0,1-1,5%) (NERD,A ;KARADI,A. ;
MIZHARI,Y.,1991).
- Le figuier de barbarie craint les basses températures hivernales. Le seuil de tolérance varie
de -10°C à -5°C. Quand à la température maximale, elle est en moyenne de 40°C.
La pluviosité annuelle exigée est très variable et dépend de l’altitude du milieu.
Le figuier de barbarie peut être rencontré dans les sites de caractéristiques différentes. On le
trouve sur des sites situés entre 1800 et 2 200m d’altitude, avec une pluviosité annuelle
variant de 400 à 500mm et une température annuelle avoisinant les 16-18°C.
Par ailleurs, des sites dans les zones d’altitudes comprises entre 0 à 1000m peuvent aussi être
identifiés, mais dont la pluviosité annuelle ne dépasse pas 200mm ; et où la température
annuelle varie de 26°C à 40°C (RATIANJANAHARY, 2004).
Synthèse bibliographique
18
II-4. Importance agro-économique du figuier de barbarie et ses utilisations (KENNY,
2004)
L’adaptation du figuier de barbarie aux conditions désertiques et semi-désertiques lui permet
de constituer une culture à intérêts écologiques et socio-économiques indéniables. En effet, il
constitue un bouclier contre la désertification et l’érosion des sols. Il est également cultivé
pour la régénération des terres. Il ne demande pas de pratiques culturales spécialisées ni
d’apport de fertilisant. Mais, malgré cet attrait naturel, peu d’intérêt a été accordé à cette
espèce. Avec le développement des marchés de fruits exotiques dans plusieurs pays, les
efforts se sont multipliés pour en faire une culture industrielle, soit en tant que culture
fourragère, soit en tant que culture maraichère. La production des fruits reste cependant
l’aspect la plus recherchée et la plus développée.
Le figuier de barbarie prend de plus en plus d’importance en tant que facteur de
développement des régions sèches.
En effet, beaucoup de personnes lui consacrent un intérêt particulier à cause des nombreuses
opportunités et possibilités d’utilisation qu’il offre sur le plan socio-économique. On citera ci-
dessous, les nombreuses potentialités que l’on peut tirer de chacune des parties de la plante.
Les fruits sont en général consommés frais, ils sont très rafraichissants et nutritifs. Ils se
caractérisent, par rapport aux autres fruits (à pH comprise entre 3 et 4) par un pH relativement
élevé (pH~5,6). La totalité des sucres présents dans le fruit est constituée de glucose et de
fructose (CODEX ALIMENTARUS, 1994).
Composition de la figue de barbarie Opuntia ficus-indica (ANONYME, 1993)
Tableau 1 : Composition centésimale de la figue de barbarie
Constituant Fruits (%)
Eau 80,0
Protéines 1,0
Lipides totaux 0,7
Glucides disponibles 14,8
Fibres brutes 2,3
Récemment dans certains pays du monde, le fruit est conditionné industriellement et stabilisé
par différentes méthodes (froid, séchage, chaleur) ou transformé, comme par exemple, en
laissant fermenter les fruits, on obtient une boisson très agréable (MAATAOUI, 2006).
Synthèse bibliographique
19
Le cladode est surtout utilisé dans le domaine alimentaire, tant pour l’Homme que pour les
animaux. Il est utilisé en tant que légume pour l’humain et considéré comme un complément
alimentaire pour les bovidés, les chèvres et les moutons sous forme fraiche ou séché, ensilé ou
sous forme de farine (SHOOP, M.C.1977).
La distillation des cladodes permettent de produire une boisson alcoolisée, la tequila, au
Mexique.
Le cladode est aussi une matière première pour la fabrication de shampoing, d’assouplissant
de cheveux, de crèmes, et de lait hydratant pour le visage.
La plante fournit un excellent bois de chauffage et une flamme éclairante. Elle constitue
aussi des haies vives, infranchissables aux animaux sauvages et ses résidus constituent un
excellent fertilisant (BARRINGER, S.A. et al, 1996).
La fleur du figuier de barbarie peut être utilisée en infusion pour lutter contre les troubles de
l’appareil digestif. Elle a aussi une propriété diurétique et peut être un remède contre le
disfonctionnement de la prostate et contre les maux de reins.
En Amérique, on extrait une farine blanche des graines, qui bouillie, est façonnée en une sorte
de pain. On peut aussi, à partir des graines, extraire de l’huile utilisée dans les produits
cosmétiques. L’huile, qui est obtenue par pression à froid des grains de fruit, contient entre
autres 65% d'acides gras essentiels (acide linoléique ou vitamine F, et acide alpha-linoléique)
qui ont une fonction nourrissante, ainsi qu'un taux de vitamine E supérieur à 100 mg/100 g
qui lui confère une action antioxydante.
II-5. Le figuier de barbarie à Madagascar
A Madagascar, l’espèce Opuntia ficus-indica se retrouve dans plusieurs régions mais les plus
productrices se trouvent à l’extrémité sud de Madagascar, plus précisément dans la partie Sud
Ouest de Madagascar dans la région Atsimo-Andrefana surtout dans la province de Toliara
dans le district d’Ampanihy (LARSON P., 2004). La plantation de figuier de barbarie se fait
sur des espaces étendues, pour occuper les terrains dénudés.
En 1940, la plantation a été plus intense dans la région d’Ambovombe où il y avait une ferme
d’élevage bovin, 30 hectares furent plantés aux alentours de cette ferme. Par la suite, un
programme d’extension fut établi en 1950 portant les surfaces cultivées à 2600 hectares. Plus
tard, vers 1956, un périmètre de 1000 hectares fut valorisé dans la région d’Ejeda. Il faut noter
qu’à cette période, la plantation était destinée uniquement à l’alimentation animale (MAEP,
2005).
Synthèse bibliographique
20
Ce n’est qu’à la suite de la sécheresse de 1991, que la consommation des fruits a augmenté et
son utilisation comme complément nutritionnel a été accentué au niveau de la population.
En cette année, les fruits ont inondé tous les marchés des villes et villages situés sur l’axe
Fort Dauphin-Toliara, à savoir les régions d’Amboasary, d’Ambovombe, de Tsihombe, de
Beloha et de Betioky.
Actuellement, on rencontre régulièrement les fruits de figuier de barbarie sur les marchés. La
production de la région d’Ambovombe en est la plus élevée.
Les fruits murissent sur pied. La période de récolte s’étend généralement du mois de février
jusqu’en juillet mais quelques variétés peuvent produire des fruits pendant toute l’année.
Du point de vue rendement, une plantation bien entretenue peut donner 15 à 20 tonnes de
fruits à l’hectare.
La commercialisation de ces fruits est assurée par les producteurs eux-mêmes qui les récoltent
et les emmènent directement au marché. La production est maximale en Juin-Juillet et elle est
presque inexistante pendant les quatre derniers mois de l’année, de Septembre à Décembre.
La production annuelle de figue de barbarie à Madagascar est de 1000 tonnes/an
(RATIANJANAHARY, 2004).
Le figuier de barbarie dans la région de Vakinankaratra
La région de Vakinankaratra se situe sur les Hauts Plateaux de Madagascar. Elle est l’une des
22 régions de la grande île et appartient à la province d’Antananarivo (RADIMILAHY C.,
2001). La région possède le climat le plus frais de Madagascar. Elle est connue pour son sol
volcanique fertile qui favorise l’élevage et l’agriculture (RAKOTOARINOSY O.M., 2010).
Comme dans de nombreuses régions de Madagascar, l’espèce Opuntia ficus-indica se
retrouve dans la région de Vakinankaratra, surtout dans les sites bien exposés au soleil et à sol
bien drainé. Aucune plantation n’existe dans la région et les figuiers de barbarie y sont
sauvages, à l’exception de quelques pieds à destination ornementale ou utilisés comme
arbustes de haie de protection.
Synthèse bibliographique
21
III- LA FERMENTATION ALCOOLIQUE
III-1. Historique
L'homme a utilisé la fermentation alcoolique depuis des millénaires, pour la fabrication de
boissons alcoolisées, sans connaître les processus biologiques impliqués.
Des documents signalaient, par exemple, que les boissons fermentées étaient préparées par
les Babyloniens quelques 2000 ans avant Jésus Christ. L’usage du vin se perd dans la nuit des
temps et la tradition biblique y fait allusion. Les Thraces, les Germains et d’autres encore
connaissaient la bière (MANIL P., 1968).
En 1815, pour la première fois, l’équation brute de la réaction biochimique de la
décomposition du glucose en éthanol fut établie par Gay-Lussac. Puis s’opéraient ensuite le
développement de diverses conceptions sur le mécanisme de la fermentation. En 1830, Jöns
Jakob Berzelius et Justus von Liebig attribuaient, dans une "théorie mécaniste de la
fermentation", une action catalytique à certaines substances. En 1837-1838 Charles Cagniard
de la Tour, en France, Theodor Schwann, en Allemagne, proposaient que les levures trouvées
dans les fermentations étaient responsables de la décomposition des sucres.
Un chimiste allemand, Martin Hahn, tentait d'isoler des protéines de levure (Saccharomyces
cerevisiae) en broyant ces levures dans un mortier avec du sable fin et de terre de diatomées.
Cependant, la préparation d'extrait de levures se conservait mal. Se souvenant que le sucre
permet de conserver les fruits, un des ses collègues, Hans Buchner, proposa d'ajouter du
saccharose à l'extrait de levure. Cette idée fut mise à l'épreuve par Eduard Buchner qui
observa que l'adjonction de sucre entraînait la formation de bulles dans le mélange. Eduard
Buchner conclut à la fermentation, processus décrit par Louis Pasteur comme "la vie à l'abri
de l'air".
En publiant ses observations, Eduard Buchner concluait : "la complexité de la levure n'est pas
indispensable au déroulement de ce processus. Le ferment actif du jus n'est probablement
qu'une substance dissoute, sans aucun doute une protéine : nous la baptiserons zymase",
responsable de la transformation du sucre en éthanol.
La préparation d'extraits de cellules ouvrit donc la voie à de nombreuses découvertes parmi
lesquelles la préparation et la purification d'enzymes. On sait maintenant que la "zymase" des
extraits de levures est en fait un mélange d’enzymes dont l'ensemble catalyse les réactions de
la glycolyse.
Synthèse bibliographique
22
Si le processus de fermentation était pendant longtemps demeuré inchangé, les installations de
distillation se sont agrandies et constamment renouvelées. Vers le XIXème siècle, l’apparition
de nouvelles techniques de distillation a permis d’obtenir des alcools de vie consommables de
bonne qualité : le whisky issu de la fermentation de diverses céréales, le rhum issu de la
mélasse.
Par définition, la fermentation est une réaction de transformation d’un substrat par des
microorganismes. Pour la fermentation alcoolique elle se définit par le phénomène qui
transforme les sucres, généralement du glucose et du fructose en alcool : éthanol et anhydride
carbonique par des levures du genre Saccharomyces (JOURET, 1989).
III-2. Aspect biochimique de la fermentation alcoolique
Au cours d’une réaction biologique, trois types de réactions se superposent, selon le degré de
la réaction, on observe :
(NAVARRO et GOMA, 1976)
la réaction de synthèse de biomasse :
Substance organique + substance minérale + O2 biomasse +CO2 – Q1 + H2O
la réaction métabolique liée au maintien en vie des cellules :
Substrat CO2+ H2O – Q2
les réactions de bioconversion ou synthèse des produits :
Substrat produits – Q3
Où Q : énergie libre
La fermentation des hexoses par les levures se fait suivant la réaction de GAY-LUSSAC qui
se passe en anaérobiose :
C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH20H + énergie (chaleur)
En fait, ce n’est qu’un bilan global car les étapes de la fermentation alcoolique forment un
ensemble organisé de réactions, qui, du glucose par exemple, aboutissent à l’éthanol et à
l’ATP. Ce dernier sera utilisé pour la synthèse de nouveaux tissus, de l’entretien et la
croissance des cellules (RASOANARIVO, 2004).
Ce catabolisme glucidique effectué par les levures en fermentation alcoolique est appelé Voie
d’EMBDEN MEYEROFF dont la réaction est détaillée par le figure 4.
Synthèse bibliographique
23
Figure 4 : Schéma détaillé de la dégradation du glucose par les levures en anaérobiose
(MOLL, 1991)
Glucose
2[Acide glycérique 2P]
Glucose6P
2[D-Glycéraldéhyde3P]
2[Acide glycérique1, 3diP]
Fructose6P
Mg+
2[Ethanol]
2[Acétaldéhyde]
2[ Phospho-enol pyruvate]
ADP
ATP
ADP
Mg+
ATP
HS déshydrogénase
Aldoisomérisation
Phosphofructokinase
Hexoisomérase
hexokinase
Alcool déshydrogénase
Pyruvate décarboxylase
Pyruvate kinase
Kinase + glycérate mutase
2NAD+
2NADH
2 ATP + Pi
2 ATP
2 ADP
2NADH
2 ADP
Fructose1, 6diP
Enolase
2 NAD+
2[Acide pyruvique]
2ADP
2ATP
SUBSTRATS ENZYMES
Synthèse bibliographique
24
Ce schéma fait apparaitre que le pyruvate n’est pas oxydé par la voie du cycle des acides tri-
carboxyliques. La voie d’EMBDEN MEYRHOFF en bilan énergétique équivaut à 2ATP lors
de la conversion du glucose en éthanol.
III-3. Les facteurs affectant la fermentation
Pour le bon fonctionnement de la fermentation, quelques paramètres sont mis en cause et
doivent être vérifiés. Ce sont :
III-3.1. Le substrat
Le substrat constitue la principale source d’énergie pour les microorganismes. Par conséquent,
il peut exercer une inhibition sous certaines conditions. Avec une concentration supérieure ou
égale à 5% de glucose dans le milieu, les enzymes respiratoires sont inhibées et le
métabolisme devient fermentaire quelque soit le niveau d’aération. C’est l’effet "Crabtree" ou
"effet glucose" (AKBAR et al., 1994) (MOSS et al., 1971).
Au delà d’une concentration de 150g/l en glucose, les métabolismes respiratoire et
fermentaire sont inhibés et influent à la fois sur la croissance cellulaire et sur la production de
l’éthanol (RAHERIMANDIMBY, 1991). L’inhibition par le sucre s’explique par le
phénomène d’osmose car une concentration très forte en sucre avec une pression osmotique
plus élevée que le contenu vacuolaire de la levure provoque une plasmolyse des cellules. La
membrane plasmique constitue une barrière de perméabilité et le sucre à métaboliser doit
pénétrer à l’intérieur de la cellule. Des cellules plasmolysées sont incapables de fonctionner
normalement et par conséquent freinent la fermentation (ARNAUD et al, 1999).
III-3.2. Les besoin en oligoéléments
La production d’alcool pendant la fermentation est définie par le comportement des levures
dans le milieu. Ainsi, l’apport des éléments minéraux est indispensable au cours de la
fermentation car ils permettent aux levures leur développement et leur survie.
Les oligo-éléments sont essentiels tant sur le plan structural que catalytique. Les apports
minimaux en oligo-éléments nécessaires à la croissance et à la production d'éthanol par
Saccharomyces cerevisiae sont importants (SUZUKI et al. 1985).
Synthèse bibliographique
25
III-3.3. L’aération
La fermentation alcoolique, qui suit la voie d’EMBDEN MEYRHOFF, est effectuée en
anaérobiose stricte par Saccharomyces, selon Pasteur en 1876, mais depuis quelques années,
une microaération de l’ordre de 5mmHg s’avère utile pour une bonne fermentation
(COWLAND et al., 1996). Elle est utilisée pour la croissance, ainsi que pour la survie des
cellules (BOUIX et LEVEAUX, 1991).
III-3.4. La température
Une température supérieure à 35°C réduit l’activité métabolique, favorise l’autolyse
cellulaire, la prolifération des bactéries thermophiles et accroit ainsi la formation des produits
secondaires tel que l’acide lactique, l’acide acétique, etc..., d’où la diminution du rendement
alcoolique.
En général, en conditions fermentaires, la température optimale pour la croissance de
Saccharomyces cerevisiae varie de 25°C à 30°C (BUNTE, 2009).
III-3.5. Le pH
Les levures sont acidophiles avec un pH optimum se situant au dessous de 5,5 (ARNAUD et
al., 1999).
III-3.6. L’éthanol
L’accumulation d’éthanol dans le milieu provoque une inhibition de la fermentation. Au
dessus d’une concentration de 40g/l en éthanol, la viabilité et le taux de croissance des levures
baissent fortement. A 100g/l, les levures dans le milieu meurent et laissent une quantité
importante de sucre dans le milieu (RAHERIMANDIMBY, 1991).
III-3.7. Le gaz carbonique
Une pression élevée en gaz carbonique inhibe la croissance des levures. Des pressions en gaz
carbonique supérieures à 1 bar déclenchent cette inhibition.
III-3.8. La souche utilisée
La souche de levure utilisée dans la fermentation est Saccharomyces cerevisiae. Elle a une
forte capacité de fermentation, une tolérance aux faibles pH et à un haut niveau d’alcool.
Les fermentations alcooliques se font sur des milieux riches en sucres. Saccharomyces
cerevisiae peut fermenter : le glucose, le maltose, le maltotriose, le tréhalose, le galactose, le
mannose, le fructose, le saccharose, le raffinose (DUBOIS A., 2014).
Synthèse bibliographique
26
Classification de la souche (LARPENT, 1991)
Règne : VEGETAL
Embranchement : THALLOPHYTES
Sous-embranchement : EUMYCETTES
Classe : ASCOMYCETTES
Sous classe : HEMIASCOMYCETTES
Famille : SACHHAROMYCETACEES
Genre : Saccharomyces
Espèce : cerevisiae
III-4. La fermentation dans l’industrie (MANIL P, 1968)
Mis a part que l’alcool issu de la fermentation est commercialisé sous forme de boisson
alcoolisée, il est aussi utilisé en tant que : solvant, carburant, agent précipitant, antiseptique,
produit de base pour la préparation d’esters, de dérivés halogénés, constituant de certains
antigels, usages médicaux et pharmaceutiques, etc…
L’alcool peut aussi être produit par synthèse chimique. Ce dernier est un puissant concurrent
de l’alcool de fermentation, pour usage industriel ou technique. En 1949 par exemple, 48%
déjà de la production totale d’alcool provenaient de la synthèse. Aux Etats-Unis, la production
relative d’alcool de synthèse a augmenté mais, par contre, il existe des pays où, pour diverses
raisons, l’alcool de fermentation demeure le plus avantageux. Cela tient notamment au coût
des matières premières et celui de la main d’œuvre.
Le substrat de départ pour la fermentation alcoolique industrielle, mis à part les boissons
alcoolisées, est très varié : sucre, mélasse de canne ou de betterave, produits amylacés
provenant de graines, de racines ou de tubercules ; matières cellulosiques hydrolysées :
liqueurs sulfitiques de papeterie, etc.
Les sucres complexes, les amidons et les celluloses, doivent au préalable être hydrolysés par
action enzymatique ou chimique.
MATERIELS
ET
METHODES
Matériels et méthodes
27
I- Matériel végétal
I-1. Le lieu de la cueillette
Le milieu où se trouve les figuiers de barbarie doit être un endroit peu fréquenté, loin des
habitations et loin des activités humaine d’après de nombreuse études (SABART, 2009), il
influe sur les activités métaboliques des levures et favorisent l’apparition de nouvelles
souches spécifiques à ce milieu. La récolté a été effectuée dans le fokontany d’Ambohitsoa,
commune d’Andranomanelatra du district Antsirabe II qui est l’un des six districts de la
région de Vakinankaratra.
GPS: S19°49’11.60’ E047°04’76.00’’
Photo 1 : Géolocalisation du lieu de récolte (source : Google earth, 2014)
I-2. Les fruits
Les figues de barbarie récoltées sont plus ou moins grosses (30 à 150 g), bacciformes ou
piriformes (4 à 9 cm), verdâtres et deviennent jaune à orange à maturité, à pulpe molle
juteuse, sucrée, contenant dans un mucilage de nombreuses petites graines.
Photo 2 : Figue de barbarie
Matériels et méthodes
28
I-3. Méthode
Les fruits récoltés sont des fruits de saison et cette contrainte de récolte ne nous a pas permis
de faire un échantillonnage des fruits car seul un pied de figuier de barbarie se trouvait sur le
lieu de récolte et le peu de fruits mûrs qu’il portait a été l’objet de l’étude.
La cueillette du fruit est faite de façon aseptique pour éviter l’apport d’autres
microorganismes que ceux qui sont présents naturellement sur le fruit.
Pour ce faire, on a :
repéré le fruit à cueillir,
désinfecté les mains avec de l’alcool 90° et stérilisé par flambage le couteau avec un
bec portable,
ouvert le sachet stérile aux alentours de la flamme du bec de manière à assurer
l’asepsie,
cueilli le fruit à l’aide d’un sachet stérile sans le tenir par la main,
fermé le sachet contenant le fruit avec de la bande adhésive et codé l’échantillon,
transporté l’échantillon dans une glacière jusqu’au laboratoire où il a été conservé au
congélateur.
II- Isolement des levures de la figue de barbarie
Les germes se trouvent souvent dans la nature sous forme de mélange de plusieurs espèces.
II-1. But
Le but de cette manipulation est d’isoler les souches pures des levures de la figue de
barbarie.
II-2. Principe
L’isolement des levures s’est fait en plusieurs étapes consistant à préparer l’échantillon à
ensemencer, à isoler les colonies obtenues afin de purifier les souches présentes qui seront
ensuite conservées.
II-3. Matériels
L’étude d’identification nécessite certains matériels, on citera ci-dessous les matériels usuels
d’identification.
II-3.1. Les verreries
Les différents récipients de laboratoire utilisés sont tous stérilisés avant leur utilisation. Nous
verrons chacun de ces matériels, en insistant sur leurs utilités respectives à l’annexe 2.
Matériels et méthodes
29
II-3.2. Le milieu d’isolement
Les milieux d’isolement sont généralement des milieux solides de composition simple sur
lesquels la grande majorité des microorganismes peuvent se développer.
Ainsi, les milieux solides présentent un grand intérêt en microbiologie car ils permettent,
lorsque la technique d'ensemencement est convenable, le développement des germes en
colonies apparentes, isolées les unes des autres, provenant en principe de la multiplication
d'un seul germe (clone) et à partir desquelles colonies peuvent être obtenues des cultures
pures. Le milieu d’isolement le plus courant est la gélose nutritive préparée à partir d’un
bouillon nutritif. Dans le cas de la levure, le milieu d’isolement que nous avons utilisé est le
milieu Sabouraud additionné de chloramphénicol (composition en annexe 3), pour éviter le
développement des bactéries qui peuvent aussi être présentes.
II-4. Technique d’isolement
L’isolement permet de séparer les divers microorganismes contenus dans le prélèvement
initial.
Un isolement peut être envisagé pour :
Séparer des microorganismes différents au sein d'un mélange.
Purifier une souche contaminée ou contrôler la pureté d’une souche.
II-4.1. Préparation de l’échantillon
La préparation du fruit s’est déroulée suivant la norme NFV 08002 qui est la règle générale
pour la préparation d’une suspension mère en vue d’un examen microbiologique.
Mode opératoire
La préparation de la solution mère s’est déroulée de la manière suivante :
Vingt cinq gramme de figue de barbarie, une partie représentative de tout le fruit, sont
coupés longitudinalement.
Les morceaux de fruit obtenus sont additionnés de 225g d’eau peptonée stérile.
La préparation est laissée reposer quelques minutes et agitée de temps en temps.
II-4.2. Inoculation de l’échantillon dans le milieu
La solution mère est la solution (partie liquide) issue de la préparation citée ci-dessus :
le milieu Sabouraud-chloramphénicol est chauffé jusqu’à liquéfaction puis refroidi à
45°C,
le milieu en surfusion est réparti dans des boites de Pétri puis laissé complètement
refroidir,
Matériels et méthodes
30
une dilution 10-1
est préparée à partir de la solution mère,
un ml de chaque solution à inoculer (solution mère et solution 10-1
) est prélevé avec
une pipette, déposé au centre de la boîte de Pétri puis réparti à l’aide d’une racloire
sur la surface du milieu. Chaque culture est répétée deux fois,
les boîtes de Pétri retournées sont ensuite incubées pendant 48h à 29°C.
La croissance des levures sur la surface du milieu se traduit soit par une nappe confluente,
lorsque les levures sont déposées en grand nombre, soit par l'apparition de colonies lorsque
les cellules sont ensemencées de manière isolée.
II-4.3. Isolement des colonies (HURST, C.J., et al., 1997)
Sur la surface du milieu ensemencée par la solution mère ou par la préparation diluée au
dixième, après incubation, l’observation des résultats permet de choisir les colonies plus
visibles à partir desquelles l’isolement est entrepris à l’aide de l’anse d’ensemencement
stérilisée, sur un nouveau milieu Sabouraud-chloramphénicol. L’ensemencement est fait
suivant la technique de quadrant ou de quadrillage dans la boite de Pétri et la boite retournée
est incubée pendant 48h à 29°C.
II-4.4. Purification des souches
La purification d’une souche nécessite au préalable la caractérisation précise des colonies
isolées, afin de déterminer les différents types de colonies qui seront purifiés.
La caractérisation consiste à observer à l’œil nu ou à la loupe les caractères morphologiques
des microorganismes c’est à dire l’aspect macroscopique de chaque colonie isolée (taille,
contour, relief, consistance, couleur,…) sur le milieu solide. Les colonies de même type
présentent les mêmes caractères.
Chaque type de colonies est purifié par quatre cycles successifs de repiquage sur milieu
Sabouraud-chloramphénicol.
Après incubation, on obtient des cultures pures. La pureté des souches est montrée par le
développement de colonies identiques à la surface du milieu. Une souche pure ne comporte
qu’une et seule espèce de levure.
II-4.5. Conservation des souches
Les techniques d’étude des microorganismes exigent toujours l’utilisation de souche pure.
Ainsi, on conserve dans les laboratoires de microbiologie des cultures pures. Les cultures
pures servent de souches de référence ou de souches d’étude, donc elles sont d’un intérêt
capital et doivent être maintenues et conservées pures au fils du temps.
Matériels et méthodes
31
A partir de la boite de Pétri contenant la souche pure, un prélèvement est effectué à partir
d’une colonie à l’aide de l’anse d’ensemencement stérile. L’inoculum est ensemencé dans un
tube à essai contenant un milieu Sabouraud-chloramphénicol en pente. L’ensemencement est
fait sur la pente du fond vers l’ouverture par des stries serrées.
Le tube à essai est bouché hermétiquement avec du coton cardé et du parafilm pour éviter
toute contamination puis la culture est conservée au réfrigérateur à +4°C. Cette conservation
réalisée sur milieu Sabouraud-chloramphénicol en tube est à durée relativement courte et la
souche doit être repiquée tout les trois mois pour garder toutes ses propriétés biologiques
(BOUSMAHA ,2007).
III- Identification des souches de levures isolées à partir de la figue de barbarie
III-1. Etude des caractères culturaux
L'examen macroscopique est le premier examen effectué à partir des cultures pures : c’est
l'étude de l'aspect des colonies.
Une colonie est un amas, visible à l’œil nu, constitué par les descendants d'une seule cellule
dont la taille, la forme, la couleur et la consistance sont caractéristiques de chaque espèce.
L'étude de l'aspect des colonies nécessite l'observation à l’œil nu, en lumière naturelle et
artificielle, par éclairage direct et par transparence des colonies.
La colonie apparaît à la surface du milieu de culture. Pendant l’observation, il faut noter la
densité de la colonie dans les différentes parties de la boite de Pétri. Il faut aussi voir l’aspect
de la colonie, c'est-à-dire :
la taille pour voir si les colonies sont grandes, moyennes ou petites,
l’allure du contour des colonies s’il est régulier, irrégulier (déchiqueté, dentelé,…),
la précision de la forme du relief précisant si les colonies sont bombées, semi
bombées, plates, ombiliquées ou à centre surélevé,
l’aspect de la surface si elle est lisse ou rugueuse, brillante ou mate,
la consistance pour déterminer si la colonie est sèche, crémeuse ou grasse,
la coloration si la souche présente une pigmentation ou pas.
Matériels et méthodes
32
III-2. Etude des caractères morphologiques
III-2.1. Examen à l’état frais
L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules.
Principe
L’examen à l’état frais permet d’observer entre lame et lamelle les levures vivantes en
l’absence de toute fixation ou coloration. Cette méthode renseigne sur la morphologie des
levures, c'est-à-dire la forme, la taille, le mode de groupement et le mode de division des
cellules.
Mode opératoire
A l’aide de l’anse d’ensemencement stérilisée, un prélèvement de chaque souche est déposé
sur une lame bien propre. Le dépôt est homogénéisé avec une goutte d’eau distillée stérile et
la préparation est recouverte d’une lamelle.
Lecture
La préparation est observée au microscope pour confirmer la pureté de la souche et pour noter
les caractères morphologiques des cellules.
III-2.2. Test de viabilité ou coloration au bleu de méthylène
La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations complémentaires
concernant la morphologie des germes. On peut aussi calculer le pourcentage de cellules
vivantes par rapport à toutes les cellules présentes dans une préparation.
Principe
La viabilité des cellules est représentée par le pourcentage des cellules vivantes par rapport au
nombre total de cellules.
Elle peut être déterminée après coloration de la préparation au bleu de méthylène
(composition à l’annexe 4).
Mode opératoire
Un prélèvement d’une souche est déposé sur une lame bien propre à l’aide d’une anse
stérilisée en traçant des cercles concentriques allant du centre vers l’extérieur, puis de
l’extérieur vers le centre. Le frottis obtenu est fixé en déposant au-dessus quelques gouttes
d’alcool méthylique qu’on laisse agir pendant 30s à 3min.
La préparation est ensuite séchée par passage rapide à la flamme du bec bunsen. Le frottis sec
est recouvert de bleu de méthylène pendant quelques minutes puis lavé abondamment à l’eau
courante.
Matériels et méthodes
33
Le frottis est séché délicatement entre deux papiers filtre ou du papier Joseph et observé sous
microscope.
Lecture
Dans le champ du microscope, le nombre de cellules est compté. L’opération est répétée dans
trois champs différents et la somme totale des cellules est effectuée. Les cellules viables
apparaissent incolores tandis que les cellules mortes se colorent en bleu. La viabilité est
calculée en faisant le rapport entre le nombre de cellules viables dans les trois champs et le
nombre total de cellules.
III-3. Etude des caractères physiologiques
La croissance des microorganismes est influencée par la nature chimique et physique de leur
environnement.
Un certain nombre de facteurs physiques externes peuvent intervenir dans le développement
des microorganismes. La variation de certains d’entre eux dont le pH, la température et la
pression osmotique du milieu, peut accélérer, ralentir, ou arrêter la croissance microbienne.
L’étude suivante permet de connaître le comportement des levures vis-à-vis de certains
facteurs du milieu.
III-3.1. Test catalase
Le test catalase permet de connaitre la présence de cette enzyme dans une souche de levure.
La catalase est une enzyme qui catalyse la décomposition d’un produit très toxique, le
peroxyde d’oxygène (composition à l’annexe 4), lors de certaines réactions cellulaires et
libère de l’oxygène, selon la réaction suivante :
2H2O2 2H2O + O2
Mode opératoire
Un échantillon d’une colonie de levure est transféré au moyen d’une anse d’ensemencement
dans une goutte d’eau distillée stérile puis déposé sur une lame porte-objet. Une goutte de
peroxyde d’hydrogène est ensuite ajoutée.
𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡é (%) =𝑠𝑜𝑚𝑚𝑒 𝑑𝑒𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑠𝑜𝑚𝑚𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 + 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑒𝑠 × 100
Matériels et méthodes
34
Lecture
Les souches qui réagissent positivement au test et forment une effervescence après l’ajout du
peroxyde d’hydrogène sont dites catalase positive.
En absence de bulle, la réaction est dite négative.
III-3.2.Type respiratoire
La détermination du type respiratoire des levures étudiées se fait sur milieu solide viande foie
(composition à l’annexe 3).
Mode opératoire
On verse le milieu viande foie dans des tubes à essai de façon à ce qu’il ne forme qu’un culot.
On fait ensuite une piqûre jusqu’au fond du milieu encore en surfusion (environ 40°C), à
l’aide d’une anse chargée par la souche à tester. Le tube est fermé hermétiquement et la
culture est incubée pendant 48h à une température de 29°C.
Lecture
Suivant la zone de croissance dans la colonne de gélose, le type respiratoire de la levure est
déduite de la façon suivante :
les levures aérobies strictes se développent en surface du milieu,
les levures anaérobies strictes croissent uniquement au fond du tube,
les aéro-anaérobies facultatives se développent dans tout le tube,
les micro-aérophiles croissent dans la zone intermédiaire.
Ce test peut-être confirmé par la recherche d’enzyme impliquée dans le métabolisme
respiratoire des levures, en particulier la catalase ou l’oxydase.
III-3.3. Facteurs physico-chimique
III-3.3.1. Influence de la température
Les microorganismes, selon les espèces, peuvent se développer dans un intervalle de
température plus ou moins large. La température influence la multiplication et le métabolisme
de chaque souche, ainsi chaque espèce possède son optimum thermique de développement.
Dans notre étude, nous avons effectué 5 séries d’expériences sur bouillon nutritif pour la
recherche de la température optimale de développement de chaque souche de levure. L’étude
a été réalisée en faisant varier la température d’incubation des cultures, les autres paramètres
étant maintenus constants.
Matériels et méthodes
35
Mode opératoire
Les températures d’incubation testées pour la croissance des levures sont respectivement:
15°C, 25°C, 30°C, 45°C et 60°C.
Les souches à étudier ont été prélevées à partir des souches pures et les prélèvements sont
introduits dans les tubes contenant du bouillon nutritif (composition en annexe 3).
Les préparations sont ensuite portées à l’étuve préchauffée à la température désirée.
Lecture
Pour chaque souche, la croissance à chaque température est observée tous les jours et est
appréciée par la turbidité du milieu.
L’étude de la croissance des levures à ces températures permet de préciser le caractère
mésophile ou thermophile des souches étudiées.
III-3.3.2. Influence de la pression osmotique
La pression osmotique est proportionnelle à la concentration des molécules et des ions
contenus dans le milieu. La tolérance de chaque souche à la pression osmotique du milieu
peut varier d’une souche à une autre.
Mode opératoire
Pour déterminer le comportement des souches de levure envers la pression osmotique du
milieu dans lequel elles se trouvent, un test sur bouillon hypersalé est effectué. Quatre
bouillons, de différentes concentrations en NaCl (2%, 4%, 6,5% ,8%), ont été utilisés pour
chaque souche. Les bouillons ensemencés sont ensuite incubés à 29°C pendant 48h.
Lecture
Les bouillons étant limpides au début de la culture, l’observation de trouble traduit la
croissance de la souche de levure dans le milieu (hypotonique, isotonique ou hypertonique).
Selon la concentration en NaCl du milieu dont l’opacité est la plus intense, donc dans lequel
la souche a un développement optimal, la tolérance à la pression osmotique de chaque souche
est déterminée.
III-3.3.3. Influence du pH
Le pH affecte considérablement la croissance des microorganismes. Chaque espèce se
développe dans un intervalle défini de pH et présente un pH optimum de croissance.
Mode opératoire
Même que celui décrit ci-dessus mais au lieu du taux de NaCl, c’est la valeur du pH du milieu
qui varie.
Matériels et méthodes
36
Lecture
La lecture se fait de la même façon que précédemment mais ici on établi le caractère
acidophile, basophile ou neutrophile de la souche à étudier.
III-4. Etude des caractères biochimiques
L’identification des souches microbiennes repose beaucoup sur leurs caractères biochimiques
dont la mise en évidence constitue une partie importante de la série d’études nécessaires à
l’identification. Ces caractères sont la traduction du métabolisme microbien. La détection des
caractères biochimiques spécifiques permet d’identifier un genre microbien ou une espèce
microbienne.
III-4.1. Principe
Pour déterminer les caractères biochimiques, les souches à identifier sont cultivées dans des
milieux spécifiques qui permettent de mettre en évidence, par des indicateurs colorés,
l’existence ou l’absence d’une ou de plusieurs réactions métaboliques caractéristiques d’une
espèce ou d’un genre microbien.
Les quatre milieux spécifiques utilisés (ci-dessous) constituent le portoir réduit de "Le
Minor". L'ensemble des renseignements obtenus grâce à ces quatre milieux permettent
souvent une identification biochimique précise si les conditions pratiques ne permettent pas
l'utilisation d'une galerie API 20C AUX.
III-4.2. Méthodes
La dissolution parfaite du milieu spécifique à utiliser nécessite un chauffage et sa répartition
dans des tubes à essai est de 8ml par tube. Les tubes à essai sont fermés et incliner de façon à
obtenir un culot et/ou une pente selon le besoin. L’ensemencement se fait en stries sur la pente
et en piqûre dans le culot (LAMBIN S., 1961).
Les résultats sont observés après 48h d’incubation à une température de 29°C.
III-4.3. Matériels
Pour la réalisation de cette étude, plusieurs milieux d’identification sont utilisés:
(compositions dans la partie annexe 3)
Milieu mannitol-mobilité
C’est un milieu qui permet d’étudier le métabolisme glucidique en mettant en évidence
l’utilisation du mannitol par la souche cultivée.
Matériels et méthodes
37
Le mannitol est un polyalcool issu de la réduction du D-fructose et sa dégradation conduit à la
formation du fructose qui est ensuite métabolisé par la souche en donnant des acides à chaînes
courtes (acide méthanoïque, acide éthanoïque,…).
Les acides, produits par l’utilisation du mannitol par la souche de levure, diminuent le pH du
milieu qui se traduit par le virage de la coloration rouge au jaune de l’indicateur coloré.
La mobilité des levures est montrée par l’apparition, dans le milieu mi-solide, de poussées de
germes en dehors de la ligne d’ensemencement.
Milieu HAJNA-KLIGLER
C’est aussi un milieu d’étude du métabolisme glucidique. Il est à base de glucose et de
lactose mais contient aussi des protéines. Le fond du milieu est très pauvre en O2 et favorise la
fermentation du glucose (fermentation alcoolique) alors que la surface du milieu est riche en
O2 et favorise la fermentation du lactose (fermentation lactique).
La zone de production de la souche cultivée indique le type de fermentation effectuée.
L’absence de production montre que la souche est incapable de métaboliser les glucides dans
le milieu. La présence de production est visualisée par le virage de la coloration du milieu du
rouge au jaune.
Ce milieu permet aussi de déceler la dégradation de la lysine issues des protéines et la
production de H2S (hydrogène sulfuré) qui provient de la désulfuration des acides aminés
soufrés. L’existence de H2S dans le milieu se matérialise par des trainées noires.
Milieu de SIMMONS : citrate
C’est un milieu d’étude du métabolisme énergétique. Ce type de milieu permet de déterminer
la nature des substrats utilisés par les souches comme source d’énergie et de carbone
(éventuellement la source d’azote). Une souche qui métabolise le substrat l’utilise comme
source de carbone et d’énergie et se multiplie donc sur le milieu.
Le milieu Citrate de Simmons contient du citrate de sodium comme substrat. Une souche qui
se multiplie sur ce milieu (test positif) métabolise le substrat et la coloration du milieu vire du
vert au bleu.
Milieu lysine-fer
C’est un milieu solide conditionné en tubes inclinés (milieu en pente), riche en fer et en
lysine, qui permet de mettre en évidence la présence simultanée de deux enzymes : la lysine
décarboxylase (LDC), la lysine désaminase (LDA) pour les microorganismes capables de
fermenter le glucose et de former de l’hydrogène sulfuré.
En fonction de la coloration, les résultats sont interprétés comme suit :
Matériels et méthodes
38
- culot jaune : glucose fermenté donc LDC –
-culot violet : glucose probablement fermenté mais masqué par la LDC+
-pente violette : LDA-
-pente rouge vineuse : LDA +
-précipité noire : H2S +
III-5. L’auxanogramme du carbone
L'auxanogramme est l'étude, en milieu aérobie, de l'utilisation des glucides, par les
microorganismes, comme seule source de carbone, dans un milieu de culture contenant tous
les autres éléments essentiels indispensables à la croissance de la souche: les ions minéraux,
les coenzymes (vitamines), les bases azotées et acides aminés.
III-5.1. Principe
L’étude de l’auxanogramme permet d’identifier une souche de levure par l’assimilation du
seul sucre présent dans le milieu qui est donc un facteur limitant de la croissance.
III-5.2. Matériels
Le milieu de culture est un milieu liquide composé d’eau physiologique au rouge de méthyle
additionné du sucre à étudier.
Les sucres à étudier sont : saccharose, fructose, xylose, ribose, maltose, sorbitol et galactose.
III-5.3. Méthode
Le milieu est mis dans un tube essai. La souche de levure à étudier est ensuite ensemencée
dans le milieu.
Le tube est bouché et la culture est incubée pendant 48h à 29°C.
III-5.4. Lecture
L’assimilation du sucre par la levure se traduit par le virage du couleur du milieu du rouge au
rose. Ce virage de couleur est dû à l’acidification du milieu par les produits de dégradation du
sucre. S’il n’y a pas assimilation, la couleur du milieu reste comme celui du départ (rouge).
IV- Etude de la fermentation
La fermentation alcoolique est une réaction de transformation de sucres simples (souvent du
glucose et du fructose), lorsqu’il n’y pas ou peu d’oxygène dans le milieu, par des
microorganismes en alcool (éthanol) et anhydride carbonique (JOURET, 1989).
Matériels et méthodes
39
Des espèces de levure, telle Saccharomyces cerevisiae, se distinguent par leur grand pouvoir
fermentaire en anaérobiose. De nombreuses souches de Saccharomyces cerevisiae sont
actuellement utilisées dans l’industrie agro-alimentaire à des fins utiles à l’Homme.
L’étude du pouvoir fermentaire et de la cinétique de fermentation sont des méthodes qui
permettent de confirmer l’identité des souches de Saccharomyces cerevisiae.
IV-1. Etude avec la cloche de Durham
La mise en évidence du pouvoir fermentaire, donc la capacité à réaliser la fermentation
alcoolique, repose sur la présence d’un dégagement gazeux (CO2) dans le milieu.
IV-1.1. Milieu de culture
Le milieu est composé de bouillon nutritif (composition à l’annexe 3) et de solution de
glucose à 3%.
IV-1.2. Mode opératoire
Le milieu est versé dans un tube à bouchon vissé et la quantité est au environ de 2/3 du tube.
Après inoculation de la souche de levure (Saccharomyces cerevisiae) à étudier dans le milieu,
la cloche de Durham est introduite dans le tube en veillant à ce qu’elle soit complètement
immergée.
La température de l’incubation est de 29°C et dure au moins 48h mais peut aussi allez, selon
les souches de levure, jusqu’à 15 jours.
Photo 3 : Schéma du test de pouvoir fermentaire
IV-1.3. Lecture
S’il y a production de gaz, il est collecté dans la cloche de Durham qui remonte alors vers la
surface du milieu.
Bouillon nutritif + milieu glucosé à
3% + souche de levure
Cloche de Durham
Matériels et méthodes
40
IV-2. Fermentation en batch avec un bioréacteur
Un bioréacteur, appelé également fermenteur ou propagateur, est un appareil dans lequel on
multiplie des microorganismes pour la production de biomasse, ou pour la production
d'un métabolite ou encore la bioconversion d'une molécule d'intérêt. Ainsi, la souche étant
déterminer apte à fermenter, après l’étude avec la cloche de Durham, est cultivée dans un
bioréacteur pour étudier la cinétique de la fermentation induite.
IV-2.1. Préculture
Une préculture de la souche de Saccharomyces cerevisiae est d’abord effectuée pour que la
densité des levures soit suffisante pour amorcer efficacement la fermentation alcoolique. Elle
permet de revivifier et de produire de la biomasse qui s’adapte facilement au milieu de
culture. La préculture servira d’inoculum lors de la culture proprement dite.
Les levures de la préculture sont en phase exponentielle de croissance au moment de
l’inoculation pour la culture. Dans ce cas, la culture entre directement dans la phase
exponentielle.
Pour ce faire, un milieu à 30g/l de glucose et trois ansées du germe fermentaire sont mis dans
un Erlenmeyer bouché. L’ensemble est incubé à une température fixe de 29°C pendant
48heures.
IV-2.2. Culture discontinue
IV-2.2.1. Principe
Une fermentation discontinue est définie comme une culture qui se déroule dans un système
clos. La réaction se déroule jusqu’à l’épuisement total du substrat ou jusqu’à l’arrêt spontané
de la réaction.
IV-2.2.2. Mode opératoire
Le milieu de culture est préparé à partir d’une solution glucosé de 30g/l. Il constitue la source
de carbone pour le métabolisme microbien. Dans ce milieu, les sels suivant sont ajoutés
(RAHERIMANDIMBY, 1991) :
Sulfate de magnésium : MgSO4 à 1g/l
Sulfate d’ammonium : (NH4)2SO4 à 2g/l
Phosphate de potassium : KH2PO4 à 5g/l
Matériels et méthodes
41
Le milieu de culture préparé ci-dessus est inoculé par le volume total de la préculture de 48h.
La fermentation est menée en culture discontinue dans le bioréacteur qui est un bain
thermostaté agité, à 29°C et sous agitation de 150rpm (RANDRIAMAHEFA, 2000).
IV-2.2.3. Lecture
Pour suivre l’évolution de la fermentation, en fonction du temps, toutes les 2heures, 10ml du
milieu réactionnel sont prélevés pour déterminer la croissance de la biomasse, la formation de
produit (alcool) et la concentration en substrat résiduel (BAOARIMANDIMBY, 2004).
IV-3. Méthodes analytiques
IV-3.1. Mesure de la croissance de la levure
La croissance cellulaire est suivie par mesure de la densité cellulaire par spectrophotométrie à
620 nm.
IV-3.1.1. Turbidité
Principe
La fermentation entraine une augmentation de la quantité de la biomasse (levures) dans le
milieu. L’évolution de la production de biomasse se traduit par la turbidité de plus en plus
forte du milieu réactionnel. La cinétique de la production de biomasse dans le milieu peut
donc être suivie en évaluant, durant la culture, cette turbidité qui est proportionnelle à la
concentration de cellules de levure dans le milieu.
La mesure de la turbidité est basée sur la propriété que possède toute solution d’absorber une
partie de l’intensité lumineuse qui la traverse en ligne droite.
Au spectrophotomètre, le pourcentage de la lumière I (transmise) par rapport à l’intensité du
faisceau de lumière Io (incident) traduit l’absorbance A ou la densité optique (BOURDANT,
1994) d’un échantillon du milieu réactionnel.
Io : intensité de la lumière incidente
I : intensité de la lumière transmise
A : absorbance lue à 620nm
𝑨 = 𝒍𝒐𝒈𝑰𝒐
𝑰
Matériels et méthodes
42
Mode opératoire
Cinq ml d’échantillon sont prélevés toutes les quatre heures pour la lecture de la densité
optique à 620nm.
IV-3.1.2. Détermination de la concentration en biomasse
La détermination de la concentration en biomasse est donnée par le coefficient de
correspondance biomasse-absorbance noté "a" (DENEUVILLE, 1991).
La valeur de "a" est de l’ordre de 0,7g/1UA
X (g/l): concentration de la biomasse en grammes par litre
DO620nm : densité optique lue à 620nm.
MONOD en 1942 à déjà confirmé que ce coefficient ne varie pas en fonction de la croissance,
c’est-à-dire, les variations de la taille n’entrainent pas de modification de ce coefficient de
correspondance "a". Des études similaires ont montré que la concentration en
microorganismes a très peu d’influence sur la valeur de ce coefficient de correspondance
(RASOANARIVO, 2004).
IV-3.2. Mesure de la consommation du substrat
IV-3.2.1. Dosage à la liqueur de Fehling
La consommation du substrat est suivie par dosage des sucres résiduels toutes les 4h.
Principe
Sous l’action de la chaleur, les sucres réducteurs réduisent la liqueur de Fehling grâce à leur
fonction carbonyle (aldéhydique ou cétonique) libre.
La solution à analyser est titrée, au point d’ébullition, par rapport à un volume déterminé de
liqueur de Fehling.
Mode opératoire
La liqueur de Fehling est préparée en mélangeant, en quantité équivalente (en volume), deux
solutions notées A et B (composition en annexe 4).
Deux ml et demi de liqueur de Fehling, dans un bécher sont portés à ébullition.
Dès que celle-ci est atteinte, 2ml de l’échantillon sont versés goutte à goutte dans le bécher
jusqu’au virage au jaune-orangé de la couleur bleu de la liqueur de Fehling.
𝑿 𝒈 𝒍 = 𝟎, 𝟕 × 𝑫𝑶𝟔𝟐𝟎𝒏𝒎
Matériels et méthodes
43
Il faut maintenir l’ébullition pendant cette opération et agiter légèrement le bécher en le
tenant par une pince en bois.
IV-3.2.2. Détermination de la concentration en substrat
La quantité de sucres réducteurs nécessaires pour réduire 2,5 ml de liqueur de Fehling est
constante et égale à N moles.
Afin de déterminer la concentration inconnue (en sucres réducteurs) d’une solution, le volume
V (contenant N moles) nécessaire pour réduire 2,5ml de liqueur de Fehling est noté.
La concentration C de sucres, dans chaque volume V, se calcule à partir de N trouvé
expérimentalement.
N étant une constante, on peut la calculer connaissant la valeur du volume V nécessaire juste
au début de la réaction, c'est-à-dire, à la concentration initiale en glucose du milieu (3%).
N : nombre de moles de sucre réducteur dans la solution
𝒞 : concentration molaire en glucose en moles par litre
V : volume de la solution (en ml) qui réduit 2,5ml de liqueur de Fehling
Connaissant N et le volume de milieu réactionnel nécessaire pour réduire 2,5 ml de liqueur de
Fehling, on peut donc trouver la concentration molaire du glucose (moles par litre) à chaque
prélèvement selon la formule :
N : nombre de moles de sucre réducteur dans la solution
𝒞 : concentration molaire en glucose en moles par litre
V : volume de la solution, en ml, réduisant 2,5ml de liqueur de Fehling
Cette concentration étant exprimée en moles par litre, afin de pouvoir calculer la quantité de
substrat consommé, il est nécessaire de la convertir en grammes par litre pour connaitre la
quantité de sucre résiduel.
Connaissant les formules suivantes :
𝑵(𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔) = 𝓒 × 𝑽
𝓒{𝒎𝒐𝒍𝒆/𝒍} =𝑵
𝑽
Matériels et méthodes
44
Concentration massique d’une solution :
C : concentration massique de la solution de glucose (substrat) en grammes par litre
m : masse du substrat en grammes
V : volume de la solution, en ml, réduisant 2,5ml de liqueur de Fehling
Concentration molaire 𝒞:
𝒞: concentration molaire de la solution de glucose en moles par litre
N : nombre de moles de sucre réducteur dans la solution
V : volume de la solution, en ml, réduisant 2,5ml de liqueur de Fehling
On peut tirer de la relation entre 𝒞 et C la formule suivante :
𝐶 = 𝑚
𝑉 et 𝓒 =
𝑁
𝑉 , avec 𝑁 =
𝑚
𝑀
On a
𝑚 = 𝑁 × 𝑀
𝑚 = (𝓒.𝑉) × 𝑀
𝑁 = 𝓒 × 𝑉
𝑚 = (𝓒. 𝑉) × 𝑀
𝐶 × 𝑉 = 𝓒. 𝑉 × 𝑀 avec 𝓒.𝑉 = 𝑁
𝑚 = 𝐶 × 𝑉
𝐶(𝑔 𝑙) =𝑚
𝑉
𝓒(𝑚𝑜𝑙𝑒 𝑙) = 𝑵
𝑽
𝑪(𝒈 𝒍 ) =𝐍(𝐦𝐨𝐥) × 𝐌(𝐠 𝐦𝐨𝐥)
𝐕(𝐥)
Matériels et méthodes
45
Avec :
C : concentration massique de la solution de glucose (substrat) en grammes par litre
N : nombre de moles de sucre réducteur dans la solution
M : masse molaire du glucose en grammes par mole
V : volume de la solution, en ml, réduisant 2,5ml de liqueur de Fehling
𝒞 : concentration molaire en glucose en moles par litre
m : masse du substrat en grammes
IV-3.3. Mesure de la production en éthanol
Suite à un manque de produits, on n’a pas pu mesurer la quantité d’éthanol produit au cours
de la fermentation. Cependant, cette production peut être calculée théoriquement.
Connaissant la réaction de la transformation du glucose en éthanol, on peut écrire :
C6H12O6 2CH3CH20H + 2CO2
180g 92g
Sachant la quantité de glucose consommé pendant la culture, la valeur de la production en
éthanol peut donc être déterminée.
IV-3.4. Traitement des résultats de la fermentation discontinue
IV-3.4.1. Expression des vitesses
IV-3.4.1.1. Formation de biomasse
La vitesse de formation de la biomasse est exprimée par:
Rx : vitesse de la formation de la biomasse (g/l/h)
dX : variation de la concentration en biomasse (g/l)
dt : variation du temps de culture en heures
La vitesse spécifique de croissance en biomasse
Elle est donnée par la formule ci-dessous :
𝑹𝒙 = 𝒅𝑿
𝒅𝒕 (𝒈 𝒍/𝒉)
𝝁 = 𝑹𝒙 ×𝟏
𝑿(𝒉−𝟏)
Matériels et méthodes
46
μ : vitesse spécifique de la croissance en biomasse en h-1
Rx : vitesse de la formation de la biomasse (g/l/h)
X : concentration en biomasse en gramme par litre
IV-3.4.1.2. Consommation de substrat
La vitesse de consommation du substrat
Rs : vitesse de la consommation de substrat en (g/l/h)
dS : variation de la concentration en substrat en gramme par litre
dt : variation de temps de culture
La vitesse spécifique de consommation du substrat
qs : vitesse spécifique de consommation du substrat en h-1
X : concentration en biomasse en gramme par litre
Rs : vitesse de la consommation de substrat en (g/l/h)
IV-3.4.1.3. Formation de produit
La vitesse de formation d’alcool est donnée par la relation:
Rp : vitesse de la formation de l’alcool en g/l/h.
dP : variation de la concentration en alcool en gramme par litre
dt : variation de temps de culture
𝑹𝒔 =𝒅𝑺
𝒅𝒕(𝒈 𝒍/𝒉)
𝒒𝒔 = 𝑹𝒔 ×𝟏
𝑿 (𝒉−𝟏)
𝑹𝒑 =𝒅𝑷
𝒅𝒕 (𝒈/𝒍/𝒉)
Matériels et méthodes
47
La vitesse spécifique de formation de produit (alcool) est donnée par la formule
suivante :
vP : vitesse spécifique de formation de produit en h-1
Rp : vitesse de formation de l’alcool en g/l/h.
X : concentration en biomasse en gramme par litre
IV-3.5. Les rendements de conversion
IV-3.5.1. Rendement de conversion du substrat en biomasse
Yx/s : rendement de conversion du substrat en biomasse
𝝙X : variation de la concentration en biomasse en gramme par litre
𝝙S : variation de la concentration en substrat en gramme par litre
Xo : concentration initiale en biomasse en gramme par litre
Xf : concentration finale en biomasse en gramme par litre
So : concentration initiale en substrat en gramme par litre
Sf : concentration en substrat résiduel en gramme par litre
dX : variation de la concentration en biomasse en gramme par litre
dS : variation de la concentration en substrat en gramme par litre
dt : variation de temps de culture
Rx : vitesse de la formation de la biomasse (g/l/h)
Rs : vitesse de la consommation de substrat en (g/l/h)
𝒗𝒑 = 𝑹𝒑 ×𝟏
𝑿 (𝒉−𝟏)
𝒀𝑿𝑺
=
𝜟𝑿
𝜟𝑺=
𝑿𝒇 − 𝑿𝒐
𝑺𝒐 − 𝑺𝒇=
𝒅𝑿𝒅𝒕𝒅𝑺𝒅𝒕
= 𝑹𝒙
𝑹𝒔
Matériels et méthodes
48
IV-3.5.2. Rendement théorique
IV-3.5.2.1. Rendement en produit
YP/S : rendement de conversion du substrat en produit
Po : concentration initiale en produit en g/l
Pf : concentration finale en produit en g/l
So : concentration initiale en substrat en g/l
Sf : concentration en substrat résiduel en g/l
𝝙P : variation de la concentration en produit en g/l
𝝙S : variation de la concentration en substrat en g/l
dP : variation de la concentration en produit en g/l
dt : variation de temps de culture
Rp : vitesse de la formation du produit en g/l/h
Rs : vitesse de la consommation de substrat
IV-3.5.2.2. Rendement théorique total
Le rendement total de la fermentation est la somme du rendement de conversion du substrat
en biomasse et du rendement de la conversion du substrat en produit :
Rtt : rendement théorique total
Yx/s : rendement de conversion du substrat en biomasse
YP/S : rendement de conversion du substrat en produit
IV-3.5.2.3. Rendement théorique de maintenance
Le rendement de maintenance correspond à la quantité de substrat consommé qui n’a servi ni
à la production de biomasse ni à celle du produit, mais utile pour les réactions qui conduisent
à l’oxydation totale du substrat:
𝒀𝑷𝑺
=
𝜟𝑷
𝜟𝑺=
𝑷𝒔 − 𝑷𝒐
𝑺𝒐 − 𝑺𝒇=
𝒅𝑷𝒅𝒕𝒅𝑺𝒅𝒕
= 𝑹𝒑
𝑹𝒔
𝑹𝒕𝒕 = 𝒚𝑿
𝑺 + 𝒚𝑷
𝑺
Matériels et méthodes
49
Rtm : rendement théorique de maintenance
Rtt : rendement théorique total
De par la valeur de ce rendement de maintenance, on peut déduire si la production est rentable
ou non. Dans ce dernier cas, la réaction pourrait être optimisée par rapport au substrat utilisé
afin d’améliorer le rendement de maintenance (diminuer sa valeur).
IV-3.5.3. Rendement réel
IV-3.5.3.1. Rendement en produit
Puisqu’on connait la réaction de la transformation du glucose en éthanol et la quantité de
glucose (substrat) au départ, on peut écrire :
C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH20H
180g (dans une mole) 92g d’alcool 100%
30g (dans la solution de glucose 3%) 15,33g d’alcool 100%
A partir de ces valeurs, on peut trouver le rendement en produit noter Rpr,
30g 15,33g d’alcool 100%
Pf Rpr
RPr : rendement réel en éthanol
Pf : masse d’éthanol produit en grammes
IV-3.5.3.2. Rendement réel total
𝑹𝒕𝒎 = 𝟏𝟎𝟎% − 𝑹𝒕𝒕
𝑹𝒑𝒓 =𝑷𝒇 × 𝟏𝑶𝑶
𝟏𝟓, 𝟑𝟑𝒈
𝑹𝒓𝒕 = 𝑹𝑷𝒓 + 𝒀𝑿𝑺
Matériels et méthodes
50
Rrt : rendement total réel de la réaction
Rpr : rendement réel en éthanol
YX/S : rendement de conversion du substrat en biomasse
IV-3.5.3.3. Rendement réel de maintenance
Rmr : rendement réel de la réaction de maintenance
Rtr : rendement réel total de la réaction
On compare la valeur de RTr et Rtt et c’est par cette valeur que l’on peut apprécier la qualité
du rendement réel.
𝑹𝒓𝒎 = 𝟏𝑶𝑶% − 𝑹𝒕𝒓
Resultats
et
Discussion
Résultats et discussion
51
I- Isolement des souches de levure de la figue de barbarie
Sur milieu Sabouraud-chloramphénicol, d’après les procédés annoncés dans la partie
matériels et méthodes (page 28), neuf souches de levure ont été isolées à partir de la figue de
barbarie récoltée dans le fokontany d’Ambohitsoa, commune d’Andranomanelatra, région
Vakinankaratra. Ces souches sont codées, de manière à ce que la première lettre corresponde
à l’initiale du nom du manipulateur suivie de l’initiale du nom du fruit et enfin du numéro
attribué à la souche.
La purification des souches s’est déroulée, après leur isolement, avec quatre cycles successifs
de repiquage et la pureté de ces souches était vérifiée par examen microscopique à l’état frais.
Les souches pures sont ensuite conservées à +4°C et sont utilisées pour d’autres études
ultérieures qui sont l’identification et la fermentation.
II- Identification des souches de levure
L’identification des souches de levures isolées a été déduite d’après les études des caractères
culturaux, morphologiques, physiologiques, biochimiques et l’auxanogramme.
II-1. Etude des caractères culturaux
Après examen à l’œil nu, le tableau 2 récapitule les résultats de l’étude des caractères
culturaux:
Tableau 2 : Récapitulatif des caractères macroscopiques des souches de levure isolées
SOUCHES
CARACTERES MACROSCOPIQUES DES COLONIES
Taille Couleur Contour Relief Aspect Consistance
MiaVo1 grand beige crème irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo2 petit rose saumon irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo3 grand beige crème irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo4 petit rose saumon irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo5 moyen blanc crème irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo6 petit rose saumon irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo7 moyen rose orangé irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo8 petite rose saumon irrégulier bombé lisse crémeux
MiaVo9 moyen rose orangé irrégulier bombé lisse crémeux
Résultats et discussion
52
D’après les résultats obtenus, les 9 souches obtenues forment des colonies qui possèdent
macroscopiquement des caractères communs (contour, relief, aspect et consistance) et des
caractères distinctifs (taille et couleur).
Le tableau 2 récapitulatif des résultats des caractères macroscopiques des colonies montre
que quelques colonies présentent les mêmes caractères macroscopiques (MiaVo1 et MiaVo3 ;
MiaVo2, MiaVo4, MiaVo6 et MiaVo8 ; MiaVo7 et MiaVo9), d’où le nombre de souches est
réduit à 4 dans les tests d’identification. Les souches retenues sont figurées dans la photo 4.
MiaVo1 MiaVo 2
MiaVo 5 MiaVo 7
Photo 4 : Photo des 4 souches retenues pour l’identification (Auteur, 2014).
Les 4 souches pures de levure retenues et qui sont étudiées dans la suite de nos travaux sont
donc : MiaVo1, MiaVo4, MiaVo5 et MiaVo7.
II-2. Etude des caractères morphologiques
Les caractères morphologiques des cellules constitutives des quatre souches pures de levure
sont étudiés respectivement par deux types de manipulation :
II-2.1. Examen à l’état frais
Un échantillon de chaque souche pure de levure est observé sous microscope, entre lame et
lamelle avec l’objectif× 40, pour déterminer la morphologie des cellules (forme, taille), leur
mode de groupement et leur mode de division.
Résultats et discussion
53
Photo 5: Morphologie des souches de levure, sous microscope (Auteur, 2014).
Les souches étudiées à l’état frais sont des jeunes souches (en phase exponentielle après 48h
de culture). Les caractères microscopiques des levures sont énoncés dans le tableau 3 :
Tableau 3: Caractères microscopiques des quatre souches de levure
SOUCHES
CARACTERES MICROSCOPIQUES
Forme Taille Mode de
groupement
Mode de
division
MiaVo1 arrondie grande isolé bourgeonnement
multipolaire
MiaVo2 arrondie moyenne isolé bourgeonnement
multipolaire
MiaVo5 ovalaire moyenne isolé bourgeonnement
multipolaire
MiaVo7 ovalaire petite isolé bourgeonnement
unipolaire
Mia Vo 1 Mia Vo 2
Cellules bourgeonnantes
Mia Vo 5 Mia Vo 7
Résultats et discussion
54
II-2.2. Test de viabilité
En contact avec le bleu de méthylène, certaines cellules se colorent en bleu, d’autres restent
incolores ou "blanches". Les cellules blanches sont dites viables, alors que les cellules bleues
sont dites non viables.
Photo 6: Exemple de souche de levure colorée au bleu de méthylène
D’après les observations et les calculs selon la méthode expliquée (page 32), la viabilité de
chaque souche est rapportée dans le tableau 4 :
Tableau 4: Viabilité des quatre souches de levure
D’après le nombre de cellules vivantes (incolores) et de cellules mortes (en bleu), pour toutes
les souches à identifier, la viabilité est supérieure à 75% c’est-à-dire que la majorité des
cellules sont vivantes. Le milieu Sabouraud-chloramphénicol est donc un milieu favorable à la
croissance des levures.
La coloration au bleu de méthylène a aussi apporté des informations qui confirment les
caractères morphologiques (tableau 4) relevés lors de l’examen à l’état frais.
SOUCHES
MiaVo1 MiaVo2 MiaVo5 MiaVo7
M V M V M V M V
1er
comptage 24 76 26 74 16 84 22 78
2e comptage 27 73 21 79 14 86 19 81
3e comptage 17 83 27 73 17 83 28 72
Somme 68 232 74 226 47 253 69 231
Viabilité 77,33 75,36 84,33 77
M : cellule mortes V : cellules vivantes
Résultats et discussion
55
II-3. Etude des caractères physiologiques
Les résultats obtenus, après l’étude des caractères physiologiques ont permis d’établir le
récapitulatif dressé sur le tableau 5 :
Tableau 5: Caractères physiologiques des quatre souches pures de levure
( - ) : réaction négative ++ : croissance moyenne
- : croissance nulle +++ : croissance abondante
+ : croissance faible
SOUCHES
PARAMETRES
MiaVo1
MiaVo2
MiaVo5
MiaVo7
RESPIRATION
Catalase ( - ) ( - ) ( - ) ( - )
Type
respiraoire
Aero-
anaerobie
facultatif
Aero-
anaerobie
facultatif
Aero-
anaerobie
facultatif
Aero-
anaerobie
facultatif
NaCl (%)
2 +++ +++ +++ +++
4 +++ ++ ++ ++
6 +++ + ++ +
8 ++ - + -
TEMPÉRATURE
(°C)
15 ++ + + +
25 +++ +++ +++ +++
30 +++ +++ +++ +++
45 ++ + + +
60 + - - -
pH
4 +++ +++ +++ +++
6,2 +++ +++ +++ +++
7 ++ ++ ++ ++
8,5 + + + +
Résultats et discussion
56
Ces résultats permettent de tirer les interprétations suivantes :
II-3.1. Type de respiration
Les résultats confirment qu’il n’y a pas de levure anaérobie stricte et que le développement
et/ou la survie des microorganismes dépend de la proportion de gaz dans l'atmosphère
d'incubation.
Les souches de levures étudiées sont sensibles à des conditions d’atmosphère aérobie car le
développement a surtout lieu dans des zones aérobies.
Après incubation, il y a formation de colonies suivant la ligne d’ensemencement et leur
densité diminue au fur et à mesure que l’on s’éloigne de la surface du milieu.
II-3.2. Influence de la pression osmotique
L’influence de la pression osmotique du milieu de développent, sur la croissance et la survie
des souches de levures a été analysée en fonction de différentes concentrations en chlorure de
sodium, en utilisant comme substrat le bouillon nutritif. Bien que la croissance des levures a
été observée entre 2 à 8% de chlorure de sodium, la croissance est surtout abondante à une
concentration de 2% de NaCl pour toute les souches et diminue au fur et à mesure que cette
concentration augmente, à l’exception de la souche MiaVo1 qui semble peu affectée par cette
variation de concentration.
A partir des résultats obtenus, on peut dire que la tolérance des levures envers la pression
osmotique du milieu (concentration en NaCl) varie suivant les souches.
II-3.3. Influence de la température
D’après les résultats, l’observation de la croissance des souches de levure a montré qu’elles
peuvent se développer dans une large gamme de température allant de 15° à 60°C.
Pour notre étude, l’optimum de croissance des levures se situe entre 25 à 30°C. A 15°C et à
45°C, la croissance est faible pour les souches MiaVo4, MiaVo5 et MiaVo7 et elle devient
nulle à 60°C. La souche MiaVo1, se développe à toutes les températures même si sa
croissance est faible à 60°C.
II-3.4. Influence du pH
Les résultats montrent aussi que les souches de levure peuvent se développer dans une large
gamme de pH allant de 4 à 7. Dans notre cas, le pH optimum de croissance des levures se
situe entre 4 à 6,2. Pour un pH allant de 7 à 8,5, la croissance est faible pour toutes les
souches de levure.
Résultats et discussion
57
II-4. Tests biochimiques
L’étude sur les milieux d’identification a donné les résultats sur le tableau 6 :
Tableau 6: Caractères biochimiques des quatre souches pures de levure
Pour le milieu mannitol mobilité
Après incubation à 29°C pendant 48h, les résultats suivant sont relevés :
Les levures des quatre souches sont toutes immobiles. Les souches MiaVo1 et MiaVo3 se
développent dans le milieu puisque le milieu initialement rouge vire au jaune. Ces deux
souches fermentent donc le mannitol tandis que pour les deux autres souches la réaction est
négative.
Pour le milieu Hajna-Kligler
Les résultats montrent que toutes les souches de levure possèdent des caractères communs :
absence de fermentation du lactose, absence de formation de H2S et aucune production de
gaz. Cependant, la fermentation du glucose est variable selon les souches : MiaVo1 et
MiaVo5 fermentent le glucose tandis que MiaVo2 et MiaVo7 ne le font pas.
SOUCHES
Mia Vo1
Mia Vo2
Mia Vo5
Mia Vo7
MILIEUX REACTIONS
Mannitol
mobilité
Mobilité - - - -
Mannitol + - + -
Hajna-
Kligler
Glucose + - + -
Lactose - - - -
H2S - - - -
Gaz - - - -
Lysine
fer
H2S - - - -
LDA - - - -
LDC - - - -
Simmons-
citrate
Citrate - - + -
Résultats et discussion
58
Pour le milieu Lysine-fer
Pour toutes les souches, l’étude sur le milieu Lysine-fer donne une réaction négative. Les
enzymes LDA et LDC sont donc absentes dans ces quatre souches de levure.
Pour le milieu Simmons-Citrate
Seule la souche MiaVo5 assimile le citrate comme seule source de carbone parmi les quatre
souches étudiées puisqu’elle seule s’est développée sur ce milieu.
II-5. Auxanogramme
L’étude de la croissance des souches de levure sur différents milieux composés
respectivement d’un seul sucre bien défini a donné les résultats récapitulés dans le tableau 7 :
Tableau 7: Auxanogramme des quatre souches pures de levure
- : réaction négative (aucune assimilation du sucre)
+ : réaction positive (assimilation du sucre)
L’assimilation des différents sucres par les souches de levure étudiées varie ; en effet :
MiaVo1 n’assimile aucun des sucres utilisés
MiaVo2 assimile presque la totalité des sucres, mis à part le maltose et l’inositol ;
MiaVo5 dégrade le galactose, maltose, saccharose, tréhalose et sorbitol ;
MiaVo7 n’assimile pas l’inositol et le sorbitol.
Les tests d’assimilation des sucres montrent certains caractères spécifiques des enzymes
présentes dans les levures, cette spécificité peut révéler le nom de genre et d’espèce de ces
souches de levure.
SOUCHES
SUCRES
MiaVo1
MiaVo2
MiaVo5
MiaVo7
Arabinose - + - +
Xylose - + - +
Galactose - + + +
Maltose - - + +
Saccharose - + + +
Tréhalose - + + +
Inositol - - - -
Sorbitol - + + -
Résultats et discussion
59
La détermination du nom du genre et de l’espèce a été effectuée suivant le catalogue API 20C
AUX (annexe 5), après les différents tests d’assimilation d’hydrate de carbone. Ces espèces
sont :
MiaVo1: Trichosporon capitatum
MiaVo2: Rhodotorula glutinis
MiaVo5: Saccharomyces cerevisiae
MiaVo7: Rhodotorula minuta
III- Fermentation
La souche MiaVo5, identifiée comme Saccharomyces cerevisiae, a été l’objet d’une étude
fermentaire pour confirmer son identité.
III-1. Etude avec la cloche de Durham
Après incubation à 29°C pendant 48h, on a eu le résultat représenté dans la photo 7 :
Photo 7: La montée de la cloche de Durham (Auteur, 2014).
La montée de la cloche de Durham démontre qu’il y a un dégagement de CO2 dans le milieu,
ainsi la souche MiaVo5 a fermenté le sucre simple (glucose) et l’expérience prouve que cette
souche est bien une souche de Saccharomyces cerevisiae.
La souche MiaVo5, comme toutes les souches de Saccharomyces cerevisiae (JOURET,
1989), possède un pouvoir fermentaire et cela nous a amené à faire un essai de fermentation
pour étudier ses comportements fermentaires.
Cloche de Durham qui
monte à la surface du
milieu
Résultats et discussion
60
III-2. Culture discontinue ou fermentation en Batch
Après une incubation de 48h, la préculture comporte un trouble au fond de l’Erlenmeyer. Ce
qui prouve le développement de la souche MiaVo5 et marque son adaptation dans le milieu.
L’étude de la culture en discontinue avec la souche Saccharomyces cerevisiae, dans un milieu
glucosé à 3%, a permis de constater l’existence d’une fermentation alcoolique dans le milieu.
Après calculs, l’évaluation de la biomasse, la consommation du substrat et la production
d’éthanol sont récapitulées dans le tableau n°8. Durant la fermentation, les cinétiques de la
concentration en substrat, en biomasse et en éthanol (figure 5) ont été suivies.
Le tableau n°9 et la figure n°6 représentent les cinétiques de la vitesse spécifique
correspondant à la formation de biomasse, à la consommation de substrat et à la production
d’éthanol.
Tableau 8 : La concentration en biomasse, la consommation en substrat et la production
d’éthanol pendant la culture de la souche de Saccharomyces cerevisiae.
X(g/l) : concentration en biomasse
𝒞 (mole/l) : concentration molaire du glucose résiduel
C(g/l) : concentration massique en glucose résiduel
P(g/l) : concentration en éthanol formé
Temps en
heures
0
2
4
8
12
16
20
24
DO lue à
620nm
0,285 0,357 0,6 1,64 2 2,28 2,357 2,4
X (g/l) 0,2 0,25 0,42 1,15 1,4 1,6 1,65 1,68
𝒞 (mole/l) 0,16 0,157 0,144 0,092 0,07 0,055 0,047 0,044
C(g/l) 30 28,4 26 16,71 12,64 10 8,56 8
P (g/l) 0 0,80 2,04 6,79 8,87 10,22 10,95 11,24
Résultats et discussion
61
Figure 5 : Courbes des cinétiques de la concentration en biomasse X, en substrat S et en
produit P, lors de la culture en discontinue sur milieu glucosé 3% de la souche de
Saccharomyces cerevisiae.
Figure 6 : courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat qS et
à l’éthanol vP, lors de la culture en discontinue sur milieu glucosé à 3% de la souche de
Saccharomyces cerevisiae.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
X(g
/l)
S(g/
l), P
(g/l
)
Temps en heure
S(g/l) P(g/l) X(g/l)
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
µ(h
-1)
qS(
h-1
), v
P(h
-1)
Temps en heure
Qs Vp µx
Résultats et discussion
62
III-2.1. Evolution de la concentration en biomasse dans le milieu
D’après la figure 5, de 0 à 9h, après une phase d’accélération de la croissance cellulaire, on
observe nettement la phase exponentielle de la cinétique de croissance de la souche. Durant
cette phase, les levures se développent et leur nombre augmente proportionnellement au
temps de culture. La vitesse de croissance est alors maximum et constante.
Un fléchissement de la courbe est remarqué à partir de 9 à 16h, c’est la phase de
ralentissement de la croissance. La concentration en nutriments dans le milieu est devenue
faible et devient un facteur limitant de la croissance. Cette dernière ralentit et la vitesse
spécifique diminue. Tous les individus de la population levurienne sont encore vivants, leur
nombre augmente mais faiblement car certains s’arrêtent de se multiplier.
La courbe forme un plateau au-delà de 16h, c’est la phase stationnaire de croissance.
Dans cette phase, le milieu contient le maximum d’individus et devient de moins en moins
favorable à la croissance. Leur nombre reste constant car il y a équilibre entre la formation et
la disparition des cellules. Cette constance est maintenue jusqu’à l’arrêt de la culture.
L’absence de la phase de latence est due à l’adaptation immédiate des cellules de levure,
issues de la préculture, au milieu de culture. La phase de déclin est aussi absente car la culture
a été arrêtée.
III-2.2. Evolution de la consommation de substrat dans le milieu
Les douze premières heures de la culture est marquée par une diminution de la concentration
du substrat montrant la consommation du substrat par les levures. Une forte consommation du
substrat est donc observée simultanément avec la phase exponentielle de croissance des
levures. Dans cette phase, la quantité de substrat dans le milieu est inversement
proportionnelle à l’augmentation de la biomasse. Vers 10heures, le substrat est à moitié
épuisé.
Au-delà de 12h, jusqu’à la fin de la fermentation, une consommation plus faible de substrat
résiduel par rapport aux 12 premières heures est notée.
Le substrat n’est pas consommé en totalité durant la culture donc une partie des sucres n’a pas
été utilisée.
III-2.3. Evolution de la production d’éthanol dans le milieu
De 0 à 4h, il y a formation de produit mais en petite quantité puisque le nombre de levures qui
métabolisent le substrat est encore faible.
De 4 à 16h, la production d’éthanol se traduit par une montée progressive de sa concentration
jusqu’à 12h. Cette production est inversement proportionnelle à la consommation du substrat.
Résultats et discussion
63
La production de l’éthanol se fait simultanément avec celle de la biomasse, cette cohérence
nous indique que la réaction est couplée.
Ainsi, du début jusqu’à la fin de notre culture (phase stationnaire), la quantité de produit
formé est proportionnelle au nombre de germes dans le milieu.
III-3. Les rendements de conversion de la fermentation
Les rendements obtenus sont regroupés dans le tableau 9.
Tableau 9: Evolution de la vitesse spécifique en biomasse et en produit
Rx : vitesse de la formation de la biomasse (g/l/h)
Rs : vitesse de la consommation de substrat en (g/l/h)
Rp : vitesse de la formation de l’alcool en g/l/h.
μX : vitesse spécifique de la croissance en biomasse en h-1
Qs : vitesse spécifique de consommation du substrat en h-1
vP : vitesse spécifique de formation de produit en h-1
Temps Rx Rs Rp μ Qs vP
0
2 0,025 0,8 0,40 0,016 0,54 0,27
4 0,055 1 0,51 0,037 0,67 0,34
8 0,118 1,661 0,848 0,080 1,12 0,57
12 0,1 1,446 0,739 0,067 0,97 0,49
16 0,087 1,25 0,638 0,059 0,84 0,43
20 0,07 1,072 0,547 0,048 0,72 0,36
24 0,061 0,91 0,468 0,041 0,61 0,31
Résultats et discussion
64
III-3.1. Rendement de conversion du substrat en biomasse
A la fin de la culture, après incubation à 29°C pendant 24 heures, le rendement de conversion
du substrat en biomasse a été calculé selon la formule (page 47) :
Généralement, dans les conditions d’anaérobiose, le rendement en biomasse est de 5% à 10%
(OURA, 1974).
III-3.2. Rendement de conversion du substrat en produit
Tableau 10 : Tableau récapitulatif des rendements
Rendements Produit (éthanol) Maintenance Total (produit + biomasse)
Théoriques 51,4% 42,6% 57,4%
Réels 78, 05% 15,95% 84,05%
La différence entre la valeur du rendement théorique en produit et celui de la maintenance est
très faible : égale à 8,8%. Ce qui signifie que la maintenance consomme presque autant de
substrat que la production d’alcool.
La valeur du rendement réel total en produit est très supérieure au rendement réel de
maintenance, la différence entre ces valeurs est 62,1%.
Les valeurs du rendement réel total (Rrt) calculées, selon la formule (page 49), est largement
supérieur de celles du rendement théorique total (Rtt),
Rrt >> Rtt
84,05% >> 57,4%
La valeur du rendement réel total en produit, égal à 84,05% montre qu’il y a une grande
production d’alcool au cours de la fermentation.
Les valeurs des rendements réels montrent que les conditions du milieu, de notre
manipulation, sont favorables à la fermentation alcoolique.
Yx/s = 6%
Résultats et discussion
65
DISCUSSION
L’isolement et l’identification des levures de l’Opuntia ficus-indica ou figue de barbarie,
récoltée à Antsirabe dans le fokontany d’Ambohitsoa, sont les principaux objectifs de notre
travail.
L’isolement sur milieu Sabouraud-chloramphénicol des extraits de la plante a donné 9
colonies distinctes : MiaVo1, MiaVo2, MiaVo3, MiaVo4, MiaVo5, MiaVo6, MiaVo7,
MiaVo8 et MiaVo9. Cependant, l’étude des caractères culturaux de ces 9 colonies n’a permis
de distinguer que quatre souches différentes de levures car quelques souches présentent les
mêmes types de colonies à savoir:
- MiaVo1 et MiaVo3,
- MiaVo2, MiaVo4, MiaVo6 et MiaVo8,
- et enfin MiaVo7 et MiaVo9.
Les souches retenues pour l’identification sont donc : MiaVo1 MiaVo2 Mia Vo5 et MiaVo7
Après purification, l’étude des caractères morphologiques des quatre souches pures a montré
que :
- les cellules des souches MiaVo1et MiaVo2 sont arrondies tandis que celles de MiaVo5 et
MiaVo7 sont ovalaires.
- les cellules de la souche MiaVo1sont de grande taille, celles des souches MiaVo2 et MiaVo5
de taille moyenne et celles de MiaVo7 de petite taille.
- toutes les souches sont formées par des cellules isolées les unes des autres.
- toutes les souches présentent des cellules à mode de division par bourgeonnement.
Ces observations confirment la définition proposée par Guiraud en 1998 qui distingue les
levures, faisant partie du groupe des champignons, par leur caractère unicellulaire et celle de
Bonaly en 1991 qui proposait dans son livre que généralement les levures présentent une
reproduction asexuée par bourgeonnement et que c’est le principal mode de multiplication
pour la majorité.
L’étude des caractères physiologiques des quatre souches pures a prouvé que :
- elles ont toutes un type respiratoire aéro- anaérobie facultatif. Ce qui corrobore l’énoncé de
Bouix et Leveaux, en 1991, disant que les levures sont aérobies strictes ou aéro-anaérobies
facultatives.
- l’influence de la température varie suivant les souches. Cependant, toutes les souches se
développent mieux à une température de 25°C.
Résultats et discussion
66
En effet, les températures d’incubation sont généralement proches de celles, qui permettent la
propagation des levures dans leur environnement naturel, se situant donc entre 25°C et 30°C
(Rose, 1987). La capacité des levures à se multiplier dans une variation de température allant
de 25 à 30°C révèle le caractère mésophile de ces microorganismes.
- la croissance se fait dans un intervalle de pH allant de 4 à 6,2. En effet, les levures tolèrent
une large gamme de pH pour son milieu extracellulaire, et entre ces valeurs, le pH
intracellulaire est compris entre 5,8 et 6,8 (Bouix et Leveau, 1991). Les résultats confirment le
caractère acidophile des levures. La pression osmotique exercée par le milieu extracellulaire
peut être très variable selon l’environnement et l’étude à permis de déterminer la tolérance
des souches de levures vis-à-vis de la concentration de son milieu extérieur.
Les tests biochimiques ont permis de déceler le métabolisme respectif des souches selon leur
croissance ou non sur différents milieux d’étude. L’auxanogramme a montré que l’aptitude à
assimiler différents sucres simples, comme sources de carbone, diffère selon les souches.
Les résultats des études effectuées ont été reportés sur le catalogue API 20C AUX (voir
annexe 5) et ont permis de déterminer, parmi les quatre souches pures isolées de l’Opuntia
ficus-indica :
- trois genres de levure dont deux souches appartenant au genre Rhodotorula, une souche au
genre Trichosporon et une autre souche au genre Saccharomyces ont été identifiées.
- quatre espèces de levure ont été trouvées :
MiaVo1: Trichosporon capitatum
MiaVo2: Rhodotorula glutinis
MiaVo5: Saccharomyces cerevisiae
MiaVo7: Rhodotorula minuta
L’essai de fermentation par la souche MiaVo5, identifiée comme Saccharomyces cerevisiae,
dans un milieu glucosé à 30g/l, a montré la production de biomasse et a donné un rendement
réel en éthanol de 84,05% soit 11,24g/l. Ce rendement se rapproche du rendement en alcool
(17g/l de glucose donnent environ 8g/l d’alcool) obtenu dans les industries de fermentation
alcoolique (RAHERIMANDIMBY, 1991). Ce qui confirme que la souche MiaVo5, isolée de
l’Opuntia ficus-indica, est bien une souche de Saccharomyces cerevisiae.
Conclusion
Et
Perspectives
67
Cette étude concernant l’isolement et l’identification des levures de la figue de barbarie ou
Opuntia ficus-indica, un fruit tropical cueilli dans la région de Vakinankaratra, nous a permis
de déterminer les souches colonisant le fruit.
Au terme de notre travail, l’étude a permis : d’identifier les souches sauvages de levure du
fruit. D’après les résultats, quatre souches de levures appartenant à quatre espèces différentes
ont été isolées au cours de l’étude à savoir :
- Trichosporon capitatum
- Rhodotorula glutinis
- Saccharomyces cerevisiae
- Rhodotorula minuta
L’étude de la fermentation alcoolique du sirop de glucose à 3% a confirmé l’identité de la
souche de Saccharomyces cerevisiae et a montré que cette souche a un pouvoir fermentaire
notable puisqu’elle a induit un rendement en alcool (78,05%) et un rendement réel total
(84,05%) élevés. De plus, le rendement de maintenance de la fermentation n’est que de
15,95%.
Par les diverses méthodes de travail utilisées, nous avons pu nous familiariser avec les
matériels de laboratoire, acquérir et maîtriser les techniques de manipulations
microbiologiques notamment celles relatives à l’isolement et l’identification des germes.
Les levures jouent un rôle très important en biotechnologie et particulièrement dans
l’amélioration de la vie de l’Homme surtout dans le domaine agro-alimentaire.
Ce travail n’est qu’un début dans le cadre de l’étude des levures endogènes de Madagascar.
Aussi, dans l’avenir, nous envisageons de poursuivre l’étude par :
- la confirmation de l’identité des souches isolées en utilisant des approches moléculaires;
- la recherche d’éventuelles caractéristiques valorisables des souches isolées telle la
production de métabolites secondaires intéressants ou les propriétés antimicrobiennes ;
- l’étude d’autre figue de barbarie cueillis dans d’autres régions de Madagascar pour des
comparaisons.
Annexes
Annexes
68
ANNEXE 1: Classification générale des levures
REGNE EMBRANCHEMENT CLASSE ORDRE FAMILLE SOUS FAMILLE
P
R
O
T
I
S
T
E
T
H
A
L
L
O
P
H
Y
T
E
S
ASCOMYCETES
(reproduction séxuée
dans un asque)
Endomycétale Saccharomycetaceae
Speronophthoraceae
Schizosaccharomycetoideae
Nadsonioideae
Lipomycetoideae
Saccharomycetoideae
BASIDIOMYCETES
(reproduction avec
basidiospore)
Ustilaginale
Tremellales
Filobasidiaceae :
Levure à téliospores
Sirobasidiaceae
Tremellaceae
DEUTEROMYCETES Blastomycetales Cryptococeaceae
Sporobolomycetaceae
Cryptococcoideae
Rhodotorutoideae
Trichospororoideae
Annexes
69
ANNEXE 2 : Les verreries en laboratoire
Tube à essais
Le tube à essais est utilisé pour les réactions faisant intervenir de petites quantités de réactifs.
Un tube à essais peu recevoir un bouchon.
Boite de Pétri
Une boîte de Pétri est une boîte cylindrique transparente peu profonde, en verre ou
en plastique, munie d'un couvercle, elle est utilisée en microbiologie pour la mise
en culture de micro-organismes.
Erlenmeyer
L'erlenmeyer remplit à peu près les mêmes fonctions que le bécher à la différence que sa
forme évite les projections. Il est donc utilisé pour :
- stoker provisoirement une solution,
- réaliser des réactions chimiques avec des composés volatils ou lorsque la réaction peut se
révéler fortement exothermique,
- faire certains dosages (volumétriques notamment).
Ballon à fond rond ou plat
Le ballon est utilisé lorsqu’il est nécessaire de faire chauffer un milieu réactionnel pendant
une certaine durée (le ballon est alors placé dans une chauffe ballon électrique).
Eprouvette graduée
L'éprouvette graduée permet de mesurer le volume d’un liquide avec une précision moyenne
(environ 0,5 ml). Il faut choisir une éprouvette dont le volume est le plus proche du volume à
mesurer. La lecture d’un volume nécessite des précautions particulières.
Pipette graduée
La pipette graduée permet de mesurer de petits volumes de liquide avec une précision
moyenne. On l’utilise dans la préparation des solutions.
Annexes
70
ANNEXE 3 : Composition des milieux de culture
Milieu Sabouraud –chloramphénicol (usage: isolement non sélectif des champignons)
Composition pour 1000ml :
Peptone ...................................................................................................................... 10,0g
Glucose ...................................................................................................................... 20,0g
Chloramphénicol .......................................................................................................... 5,0g
Agar ........................................................................................................................... 15,0g
pH= 7
Composition du milieu viande foie
Composition pour 1000ml de solution
Base viande foie ............................................................................................................ 30g
Glucose ............................................................................................................................ 2g
Agar ................................................................................................................................ 6 g
pH = 7,4
Composition du bouillon nutritif
Composition pour 1000ml de solution
Extrait de viande ............................................................................................................. 5g
Peptone tamponnée ......................................................................................................... 5g
Glucose ........................................................................................................................... 5g
Na Cl ............................................................................................................................. 9g
pH = 7,2
Composition des milieux d’identification biochimique pour 1000ml de solution :
Milieu Citrate de Simmons
Citrate de sodium ........................................................................................................ 1,0g
Bleu de bromothymol ................................................................................................ 0,08g
Chlorure de sodium .................................................................................................... 5,0g
Sulfate de magnésium ................................................................................................. 0,2g
Hydrogénophosphate de potassium, ............................................................................. 1,0g
Dihydrogénophosphate d’ammonium .......................................................................... 1,0g
Agar .......................................................................................................................... 15,0g
pH= 7,3
Annexes
71
Préparation : 23g par litre de solution
Milieu Hajna Kligler
Peptone ...................................................................................................................... 15,0g
Extrait de viande .......................................................................................................... 3,0g
Extrait de levures ......................................................................................................... 3,0g
Peptone pepsique de viande ........................................................................................ 5,0g
Glucose ........................................................................................................................ 1,0g
Lactose ...................................................................................................................... 10,0g
Rouge de phénol ...................................................................................................... 0,024g
Chlorure de sodium ..................................................................................................... 5,0g
Sulfate de fer II (Pasteur) ............................................................................................ 0,2g
Thiosulfate de sodium ................................................................................................. 0,3g
Agar ........................................................................................................................... 11,0g
pH= 7,5
Préparation: 53,5g par litre de solution
Milieu lysine fer
Peptone de gélatine ...................................................................................................... 5,0g
Extrait de levure ........................................................................................................... 3,0g
L-lysine ...................................................................................................................... 10,0g
Glucose ........................................................................................................................ 1,0g
Citrate de fer III ammoniacal ...................................................................................... 0,5g
Bromocrésol pourpre .............................................................................................. 20,0mg
Thiosulfate de sodium ............................................................................................ 40,0mg
Agar ........................................................................................................................... 13,5g
pH= 6,7
Préparation : 34g par litre de solution
Milieu Mannitol mobilité Nitrate
Hydrolysat trypsique de caséine ................................................................................ 10,0g
Mannitol ...................................................................................................................... 7,5g
Rouge de phénol ....................................................................................................... 0,4mg
Nitrate de potassium .................................................................................................... 1,0g
Agar ............................................................................................................................. 3,5g
pH= 7,6
Préparation : 22g par litre de solution
Annexes
72
ANNEXE 4 : Composition des réactifs
Peroxyde d’oxygène
Eau oxygénée 35% ...................................................................................................... 10ml
H2O distillée stérile .................................................................................................... 90ml
Composition de la solution de liqueur de Fehling
Solution A : sulfate de cuivre pur (Cu SO4) ................................................................. 35g
Acide sulfirique pur (H2SO4) : ........................................................................................ 5g
Eau distillée stérilisée .............................................................................................. 1000ml
Solution B : sel de tartrate double de sodium et potassium : ...................................... 150g
Soude (NaOH) ............................................................................................................. 300g
Eau distillée stérilisée .............................................................................................. 1000ml
Solution C : bleu de méthylène ...................................................................................... 1%
Ou ferrocyanure de potassium (Fe(CN) 6K4) ................................................................ 50g
Annexes
73
ANNEXE 5 : Catalogue
API 20 C Aux
API 20 AUX V2.0 GLU
GLY
2KG
AR
A
XY
L
AD
O
XLT
GA
L
INO
SO
R
MD
G
NA
G
CE
L
LAC
MA
L
SA
C
TR
E
MLZ
RA
F
HY
PH
P(taxo
n/
profil)
P(ta
xon/
prof
il)
P(plus
typiqu
e)
S
profiil + + - - - - - - - - - - - - - - - - - +
1,00E-05
Candida albicans 1 100 14 99 2 95 94 96 100 0 94 85 99 0 0 100 97 97 4 0 100 1,28E+22 0,0% 5,11E+39 -2,52
Candida albicans 2 100 0 100 0 90 1 75 100 0 70 0 100 0 0 90 0 5 0 0 90 6,35E+28 0,0% 3,60E+39 -1,15
Candida ciferrii 100 80 80 100 100 70 60 100 100 50 0 100 60 0 95 100 100 0 100 100 1,92E+20 0,0% 7,66E+38 -2,72
Candida colliculosa 100 60 100 0 0 0 20 1 0 90 0 0 0 0 0 100 85 0 75 0 1,78E+31 0,0% 2,73E+39 -0,64
Candida farmata 100 98 100 60 80 100 90 100 0 100 99 99 98 70 100 100 99 80 95 1 4,70E+13 0,0% 2,12E+39 -4,13
Candida glabrata 100 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 94 0 0 1 9,50E+35 0,0% 7,74E+39 0,22
Candida guilliermondii 100 100 88 90 93 94 99 99 0 97 96 99 99 0 94 100 99 94 95 46 5,01E+16 0,0% 2,78E+39 -3,55
Candida humicola 100 82 100 100 100 36 64 100 100 95 100 100 91 100 100 82 99 95 100 100 7,65E+12 0,0% 2,24E+39 -4,29
Candida inconspicua 100 77 57 0 0 0 0 2 0 0 0 43 0 0 0 0 0 0 0 3 5,55E+37 0,3% 2,38E+39 0,67
Candida kefyr 1 100 69 0 31 91 4 47 10 0 39 0 0 8 99 0 100 1 0 100 89 9,70E+31 0,0% 9,71E+38 -0,40
Candida kefyr 2 100 86 7 0 7 0 71 100 0 100 86 0 71 84 100 100 93 100 84 40 6,28E+24 0,0% 1,27E+39 -1,86
Candida kruzei 100 87 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 0 0 0 0 0 95
5,29E+39 29,1
% 5,29E+39 1,00
Candida lambica 100 70 0 0 95 0 0 0 0 0 0 90 0 0 0 0 0 0 0 100 3,50E+37 0,2% 5,99E+39 0,55
Candida lipolytica 100 100 0 0 0 0 0 0 0 28 0 49 0 0 0 0 0 0 0 93
3,41E+39 18,8
% 3,41E+39 1,00
Candida lusitaniae 100 95 95 1 80 95 40 40 0 99 60 95 80 0 100 99 100 99 0 100 6,77E+23 0,0% 1,08E+39 -2,04
Candida magnoliae 100 100 50 0 0 0 33 0 0 99 0 0 0 0 0 100 0 0 84 0 5,36E+32 0,0% 2,79E+39 -0,34
Candida maris 100 66 0 0 66 16 83 100 0 83 0 16 0 0 0 0 0 0 0 16 7,32E+34 0,0% 1,78E+39 0,12
Candida norvegensis 100 75 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 95 0 0 0 0 0 0 100 3,68E+38 2,0% 6,98E+39 0,74
Candida parapsilosis 100 95 91 96 96 95 3 99 0 99 93 99 0 0 100 100 97 99 3 99 1,34E+20 0,0% 6,11E+39 -2,93
Annexes
74
Candida pelliculosa 100 100 0 0 67 2 9 56 0 89 100 2 78 0 93 100 97 98 48 86 5,77E+28 0,0% 9,00E+38 -1,04
Candida rugosa 100 74 0 5 79 5 44 100 0 99 0 55 0 0 0 0 0 0 0 100 3,53E+34 0,0% 1,61E+39 0,07
Candida tropicalis 1 100 2 99 0 98 99 23 99 1 100 96 99 24 0 100 100 99 99 1 99 9,09E+16 0,0% 4,93E+39 -3,55
Candida tropicalis 2 100 6 10 0 100 99 4 100 0 100 0 100 0 0 48 4 100 0 0 100 2,59E+26 0,0% 4,01E+39 -1,64
Candida zeylanoides 100 100 95 0 0 5 0 1 0 100 0 100 0 0 0 0 74 0 0 100 1,22E+34 0,0% 6,61E+39 -0,15
Cryptococcus albidus 1 100 0 98 96 100 6 12 18 81 93 81 18 100 43 100 100 82 98 43 0 1,32E+19 0,0% 8,34E+38 -2,96
Cryptococcus albidus 2 100 0 97 96 100 0 6 0 68 75 50 0 100 0 100 100 93 93 68 0 7,07E+20 0,0% 1,31E+39 -2,65
Cryptococcus laurentii 100 15 92 100 100 69 76 100 84 53 76 92 96 99 92 99 92 96 99 0 1,32E+15 0,0% 9,66E+38 -3,77
Cryptococcus neoformans 100 1 100 24 95 71 1 97 97 100 99 88 40 0 100 100 75 97 88 0 6,36E+16 0,0% 1,58E+39 -3,48
Cryptococcus terreus 100 0 100 76 100 0 0 45 36 100 0 90 95 36 9 9 54 0 0 0 1,03E+26 0,0% 6,55E+38 -1,56
Cryptococcus uniguttulatus 100 12 100 100 100 12 0 1 99 50 87 95 0 0 100 100 62 10 25 0 8,72E+21 0,0% 1,31E+39 -2,44
Geotrichum candidum 100 10 0 0 100 0 0 100 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 3,40E+34 0,0% 5,94E+39 -0,05
Geotrichum penicillatum 100 100 0 0 100 0 0 83 0 88 0 5 0 0 0 0 0 0 0 100 1,94E+36 0,0% 6,94E+39 0,29
Kloeckera apis/apiculata 100 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 66 6,60E+33 0,0% 6,60E+39 -0,20
Kloeckera japonica 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 66 6,60E+35 0,0% 6,60E+39 0,20
Rhodotorula glutinis 100 50 12 87 87 50 37 62 0 37 25 0 0 0 87 100 87 87 100 4 3,70E+28 0,0% 1,94E+38 -0,94
Rhodotorula minuta 100 100 100 99 95 15 1 0 0 40 0 95 60 0 0 95 95 95 0 0 6,31E+26 0,0% 2,32E+39 -1,51
Rhodotorula rubra 1 100 50 0 66 87 58 41 78 0 29 1 0 1 0 99 100 98 95 95 8 3,35E+27 0,0% 4,30E+38 -1,22
Rhodotorula rubra 2 100 50 1 90 100 80 50 30 0 30 0 0 0 0 0 100 75 0 100 0 6,06E+28 0,0% 6,55E+38 -1,01
Saccharomyces cerevisiae 1 100 15 0 0 0 0 0 92 0 6 30 0 0 0 92 100 61 30 92 15 2,07E+32 0,0% 1,58E+39 -0,38
Saccharomyces cerevisiae 2 100 75 0 0 0 0 0 100 0 99 75 0 0 0 100 100 33 66 100 12 5,13E+27 0,0% 2,17E+39 -1,33
Sporobolomyces
salmonicolor 100 5 0 0 0 33 0 5 0 92 0 0 0 0 0 100 100 0 95 100 1,27E+32 0,0% 5,28E+39 -0,52
Trichosporon cutaneum 100 46 98 95 100 32 35 93 53 26 76 95 98 99 93 80 76 63 46 100 7,98E+23 0,0% 1,09E+38 -1,83
Trichosporon capitatum 100 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100
9,00E+39 49,5
% 9,00E+39 1,00
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RESUME
NOM : RANDRIANANTOANDRO
PRENOMS :Miary Hobitiana
Titre : Isolement et identification des levures du fruit du figuier de barbarie : "Opuntia
ficus-indica" de la région de Vakinankaratra.
L’objectif de notre travail est l’isolement et l’identification des levures d’un fruit tropical de
Madagascar : la figue de barbarie Opuntia ficus-indica, de la région de Vakinankaratra.
L’ensemencement, sur milieu Sabouraud-chloramphénicol, de l’extrait du fruit, et l’étude des
caractères culturaux des colonies de levure isolées ont permis de déterminer quatre souches
différentes. Après l’étude des caractères physiologiques et biochimiques des quatre souches
pures de levure obtenue, le genre et l’espèce ont été déterminés par la méthode Galerie API
AUX. Les quatre souches de levure ont été identifiées et classifiées dans 3 genres et quatre
espèces différents :
• Trichosporon capitatum
• Rhodotorula glutinis
• Saccharomyces cerevisiae
• Rhodotorula minuta
L’identité de la souche MiaVo5, déterminée comme Saccharomyces cerevisiae, a été
confirmée par son pouvoir fermentaire positif et par un essai de fermentation alcoolique
satisfaisant. L’étude cinétique de l’évolution des concentrations en biomasse, en substrat et en
produit a montré que la fermentation alcoolique par la souche MiaVo5 induit un rendement
réel de production en éthanol élevé (78,05%). Cette souche de Saccharomyces cerevisiae est
d’autant plus intéressante car le rendement réel de maintenance n’est que de 15,95%.
Mots clés : levures, identification, figue de barbarie, Opuntia ficus-indica, Saccharomyces
cerevisiae, fermentation alcoolique.
Encadreurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando
Professeur RAHERIMANDIMBY Marson
ABSTRACT
Name: RANDRIANANTOANDRO
First name: Miary Hobitiana
Title: Isolation and identification of yeasts from the fruit of the prickly pear "Opuntia
ficus-indica" the Vakinankaratra.
The aim of our work is the isolation and identification of yeasts of an exotic fruit Madagascar:
prickly pear (Opuntia ficus- indica), harvested from the Central Highlands of Madagascar, in
the region of Vakinankaratra .
The inoculation of the fruit extract on Sabouraud - chloramphenicol medium and the study of
cultural characteristics of the yeast colonies isolated have determined four different strains.
After the study of physiological and biochemical characteristics of the four pure strains of
yeasts obtained, their genus name and species were determined by the method API Gallery
AUX. The four yeast strains were identified and classified into three genera and four different
species:
• Trichosporon capitatum
• Rhodotorula glutinis
• Saccharomyces cerevisiae
• Rhodotorula minuta
The identity of the MiaVo5 strain, determined as Saccharomyces cerevisiae, has been
confirmed by its positive fermentative power and a satisfactory test alcoholic fermentation.
The study of the kinetics of the biomass concentration, of substrate and product showed that
the alcoholic fermentation by strain MiaVo5 induced a high real production yield of 78.05 %
ethanol. This strain of Saccharomyces cerevisiae is particularly interesting because the real
yield maintenance is only 15,95%.
Keywords: yeasts, identification, prickly pear, Opuntia ficus-indica, Saccharomyces
cerevisiae, alcoholic fermentation
Advisors: Docteur RANDRIANIERENANA Ando
Professeur RAHERIMANDIMBY Marson
