ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LEVURES DESIX FRUITS

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE DE FIN D’ETUDES POUR L’OBTENTION DU

DIPLOME DE MASTER

Parcours : BIOTECHNOLOGIES

ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LEVURES DESIX

FRUITS TROPICAUX (Rubus phoenicolasius, Nephelium

lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica, Morus nigra, Rubis

rosifolius) RECOLTES DANS QUATRE REGIONS DE

MADAGASCAR(Atsinanana, Boeny, Analamanga,

Vakinankaratra).

Présenté par :FINIAVANA Arisoa Tinah Fleurette

Maître ès Sciences

Soutenu publiquement le 15 janvier 2016

Devant la commission d’examen composée de :

Président : Professeur ANDRIANARISOA Blandine

Encadreurs : DocteurRANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina

Professeur RAHERIMANDIMBY Marson

Examinateurs : Docteur TSIRINIRINDRAVO HerisetraLalaina

Docteur RAMAMONJISOA Daniel

REMERCIEMENTS

Le présent travail a été réalisé avec l’étroite collaboration entre le laboratoire de

Biotechnologie-Microbiologie du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée de

l’Université d’Antananarivo et le laboratoire de Microbiologie de l’Université Athénée Saint

Joseph Antsirabe (ASJA).

Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements :

A Dieu tout puissant qui nous a donné de la force, de la santé, du courage et du temps pendant

la préparation de ce mémoire.

Au Professeur RAHERIMANDIMBY Marson, Doyen de la Faculté des Sciences et Professeur

titulaire au Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée pour avoir accepté d’être

mon Co-encadreur, pour le temps qu’il m’a consacré tout au long de la réalisation de ce travail.

Au Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina, Chef du Département de Biochimie

Fondamentale et Appliquée qui a bien voulu nous encadrer et nous diriger, pour son aide

précieuse, ses conseils valeureux, vu ses multiples responsabilités.

Au Professeur ANDRIANARISOA Blandine pour l’honneur qu’elle nous a fait en acceptant de

présider le jury de ce mémoire.

Nous tenons également à remercier :

Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina, Responsable des laboratoires de l’Université

Athénée Saint Joseph Antsirabe et Maitre de conférences au Département de Biochimie

Fondamentale et Appliquée de l’Université d’Antananarivo, de nous avoir accueillie au sein du

laboratoire de l’ASJA.

Docteur RAMAMONJISOA Daniel, Maître de conférences au Département de Biochimie

Fondamentale et Appliquée, qui a pu se rendre disponible afin de faire partie de ce jury en tant

qu’examinateur.

Nous ne pouvons terminer sans adresser tous nos remerciements, toute notre connaissance et

tout notre amour :

A mes parents qui m’ont toujours soutenue financièrement et moralement durant toutes mes

années d’études.

A ma sœur Harisoa Nadia et mon beau frère.

A Ranto Harivony.

A tous mes collègues et à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à l’élaboration de ce

mémoire de fin d’étude.

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE………………………………………………………………………………………………………………….…i

GLOSSAIRE………………………………………………………………………………………………………………….…ii

LISTE DES ABREVIATIONS……………………………………………………………………………………………..iii

LISTE DES FIGURES ……………………………………………………………………………………………………..iv

LISTE DES TABLEAUX……………………………………………………………………………………………………..iv

INTRODUCTION…………………………………………………………………………………………………………….1

INTRODUCTION…………………………………………………………………………………………………………….2

Première partie : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I-Les levures……………………………………………………………………………………………………………....3

I-1-Généralités…………………………………………………………………………………………………………..….3

I-2-Caractéristiques……………………………………………………………………………………………………...3

I-2-1-Caractères morphologiques……………………..………………………………………………..3

I-2-2-Caractères physiologiques……….…………………………………………………………………4

I-2-2-1-Température…………………….……………………………………………………………4

I-2-2-2-Activité de l’eau…………………………………………….……………………………….5

I-2-2-3-Oxygène…………………………………………………………………………………………5

I-2-2-4-PH…………………………………………………………………………………………………..5

I-2-2-5-Source d’azote………………………………………………………………………………..5

I-2-2-6-Source de carbone………………………………………………………………………….5

I-2-3-Caractères biochimiques…………………………………………………………………………….5

I-3-Classification des levures………………………………………………………………………………………….6

I-4-Utilisation des levures………………………………………………………………………………………………8

II-Généralités sur les plantes………………………………………………………………………………………8

II-1-Rubus phoenicolasius(Ronce)......................................................................................8

II-1-1-Description botanique.…………………………………………………………………………………8

II-1-2-Position systématique……………………………………………..………………………………….9

II-1-3-Répartition géographique………………………………………………………..…………………9

II-2-Nephelium lappaceum(litchi chevelu).......................................................................10

II-2-1-Description botanique……………………………………………………………………………….10

II-2-2-Position systématique……………………………………………………………………………….10

II-2-3-Répartition géographique………………………………………………………………………….11

II-3-Litchi sinensis(litchi)..................................................................................................11

II-3-1-Description botanique……………………………………………………………………………...11


II-3-3-Répartition géographique…………………………………………………………………………11

II-4-Mangifera indica variété Zill(mangue)......................................................................12




II-5-Morus nigra(murier)………………………………………………………………………………………….…13




II-6-Rubis rosifolius(framboisier sauvage).......................................................................15

II-6-1-Description botanique…………………………………………………………………………..…..15

II-6-2-Position systématique…………………………………………………………………………..…..15

II-6-3-Répartition géographique………………………………………………………………………….16

Deuxième partie : MATERIELS ET METHODES

I-MATERIELS…………………………………...……………………………………………………………….…….….17

I-1-Matériels végétaux…………………………………………………………………………….…………..17

I-2-Matériel de laboratoire……………………………………………………………………………..…....17

II-METHODES……………………………………………………………………………………………………………..18

II-1-Récolte…………………………………………………………………………………………………………..18

II-2-Isolement……………………………………………………………………………………………………….19

II-2-1-Préparation de la suspension mère………………………………………………………19

II-2-2-Dilution…………………………………………………………………………………………….…..19

II-2-3-Ensemencement……………………………………………………………………………….....20

II-3-Purification……………………………………………………………………………………………………..20

II-4-Conservation……………………………………………………………………………………………….....20

II-5-Identification des levures…………………………………………………………………………….....21

II-5-1-Etude des caractères culturaux………………………………………………………......21

II-5-2-Etude des caractères morphologiques……………………………………………......21

II-5-2-1-Examen à l’état frais………………………………………………………………21

II-5-2-2-Coloration GRAM……………………………………………………………..……21

II-5-3-Etude des caractères physiologiques……………………………………………………22

II-5-4-Etude des caractères biochimiques……………………………………………………..23

II-5-4-a- Etude sur le milieu HAJNA-KLIGLER……………………………………….23

II-5-4-b- Etude sur le milieu CITRATE de SIMMONS…………………………….24

II-5-4-c- Etude sur le milieu LYSINE-FER………………………………………………24

II-5-4-d- Etude sur le milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE………………25

II-5-4-e- Auxanogramme du carbone………………………………………………….25

II-5-5-Technique d’identification de genre et d’espèce des levures………………25

Troisième partie : RESULTATS ET DISCUSSION

I-RESULTATS………………………………………………………………………………………………………….....27

I-1-Isolement…………………………………………………………………………………………………………..27

I-2-Purification………………………………………………………………………………………………………..27

I-3-Identification…………………………………………………………………………………………………….30

I-3-1-Etudes des caractères culturaux et morphologiques……………………………30

I-3-2- Etudes des caractères physiologiques………………………………………………….32

I-3-3- Etudes des caractères biochimiques……………………………………………………33

I-3-3-1-Galerie Pasteur et auxanogramme du carbone………………………..34

Sur le milieu HAJNA-KLIGLER……………………………………....34

Sur le milieu CITRATE de SIMMONS…………………………....34

Sur le milieu LYSINE-FER………………………………………….....34

Sur le milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE…………..….34

Auxanogramme du carbone…………………………………..……34

I-3-3-2-Galerie API 20 C AUX…………………………………………………………..…….34

I-4-Nomenclature………………………………………………………………………………………………..…….35

II-DISCUSSION……………………………………………………………………………………………………..……..36

CONCLUSION ET PERSPECTIVES……………………………………………………………………………..………38

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXES

ABSTRACT

RESUME

i

GLOSSAIRE

Activité de l’eau (Aw) : représente la pression de vapeur d’eau (P) d’un produit humide

divisée par la pression de vapeur saturante(Po) à la même température.

Arille : excroissance charnue ou membraneuse enveloppant une graine.

Ascomycètes(Ascomycota) : vaste embranchement(ou division) des champignons, caractérisés

par des spores formées à l’intérieur d’asques.

Asque : cellule reproductrice, caractéristique des champignons ascomycètes, à l’intérieur de

laquelle se forment en général huit spores (ascospores, endospores) résultant d’une méiose.

Assimilation : processus par lequel des substances et des matériaux extérieurs au corps sont

transformés en substances et matériaux intérieurs au corps.

Biotechnologie : ensemble des méthodes, des techniques et des procédés qui permettent de

tirer profit des organismes vivants et en particulier des microorganismes.

Catalase : enzyme qui catalyse la dismutation du peroxyde d’hydrogène en eau et dioxygène.

Colonie : groupement de cellules microbiennes de même espèce et de même caractéristique.

Ecosystème : ensemble formé par une association ou communauté d’êtres vivants et son

environnement biologique, géologique, édaphique, hydrologique, climatique, …

Enzyme : macromolécule d’origine protéique qui joue un rôle de catalyseur biologique c’est-à-

dire de composé qui facilite une réaction biochimique sans en modifier les produits

Endémique : espèces vivantes propres à un territoire bien délimité.

ii

Galerie API : ensemble des petits tubes prêts à l’emploi permettant l’identification de

microorganisme par la réalisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturisés.

Hétérotrophe : qualifie un être qui ne peut fabriquer lui-même tous ses constituants et doit, de

ce fait, utiliser des matières organiques exogènes.

Métabolisme : ensemble des réactions biochimiques qui se déroulent au sein d’un être vivant

pour lui permettre notamment de se maintenir en vie, de se reproduire, de se développer et de

répondre au stimulus de son environnement.

Probiotique : ensemble de microorganismes et de substances microbiennes qui contribuent au

maintien de l’équilibre de la flore intestinale.

Spore : forme végétative de résistance des microbes en condition de vie défavorable et qui peut

redonner par la germination une forme végétative normale quand les conditions redeviennent

favorables.

Syncarpe : des inflorescences formées de glomérules rapprochés comme celle du murier, de

l’ananas.

Ubiquitaire : terme qui désigne le fait de se trouver dans plusieurs endroits.

iii

LISTE DES ABREVIATIONS

LDA : Lysine désaminase

LDC : Lysine décarboxylase

Aw: Activity of water (activité de l’eau)

ASJA: Athénée Saint Joseph Antsirabe

pH: Potentiel d’hydrogène

H2S : Sulfure d’hydrogène

h : heure

°C : Dégré Celsius

CIRM : Centre International des Ressources Microbiennes

CO2 : Dioxyde de carbone

HK : Hajna-Kligler

CS : Citrate-Simmons

LF : Lysine-Fer

MMN : Mannitol-Mobilité-Nitrate

% : Pourcentage

SM : suspension mère

iv

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Classification des levures………………………………………………………..7

Tableau 2 : Répartition des matériels végétaux……………………………………………..17

Tableau 3 : Tableau montrant les codes des souches pures…………………………………27

Tableau 4 : Caractères culturaux des colonies de levure isolées……………………………30

Tableau 5 : Caractères morphologiques des cellules de levure……………………………..31

Tableau 6 : Caractères physiologiques des souches de levure……………………………...32

Tableau 7 : Caractères biochimiques des souches de levure………………………………..33

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique d’une cellule de levure……………………………..4

Figure 2 : Fruits de Rubus phoenicolasius…………………………………………………..9

Figure 3 : Fruits de Nephelium lappaceum…………………………………………………10

Figure 4 : Fruits de Litchi sinensis………………………………………………………….12

Figure 5 : Fruits de Mangifera indica variété zill…………………………………………..12

Figure 6 : Fruits de Morus nigra……………………………………………………………14

Figure 7 : Fruits de Rubis rosifolius………………………………………………………...16

Figure 8 : Carte topographique des régions de la récolte…………………………………...18

Figure 9 : Les 12 souches de levure isolées………………………………………………...28

Figure 9(suite) : Les 12 souches de levure isolées (suite)…………………………………..29

Figure 10 : Fiche de lecture des résultats de la galerie API 20 C AUX…………………….35

INTRODUCTION

Introduction

1

Les levures sont des microorganismes eucaryotes faisant partie des champignons

microscopiques unicellulaires (Encarta, encyclopédie, 2004). Elles sont utilisées depuis des

temps préhistoriques dans la fabrication du pain et du vin, mais les bases scientifiques qui

permirent leur culture et leur utilisation en grande quantité furent l’œuvre du microbiologiste

français Louis Pasteur au XIX e siècle (Encarta, encyclopédie, 2004).

De nos jours, des levures sont utilisées dans de nombreux domaines d’application aussi

bien dans les secteurs agro-alimentaires que non alimentaires (Mutsvangwa et al, 1992).

Le nombre d’espèce de levure actuellement identifié dans le monde n’est estimé qu’à

environ 1% de celui existant dans la nature (FELL et al., 2000). De plus, des études ont prouvé

que les conditions du milieu influent sur l’évolution de l’organisme qui vit dans ce milieu. Ainsi,

après évolution adaptative dans des conditions environnementales déterminées, la sélection

naturelle favorise la diversité génétique des microorganismes dans ce milieu et peut engendrer

l’apparition de nouvelles souches (Sabart, 2009).

Les levures sont des organismes capables de vivre dans presque tous les écosystèmes

existants, surtout ceux riches en sucres directement assimilables comme les fruits (Bouix et

Leveau, 1991).

Madagascar possède un climat qui favorise la production de fruits tropicaux ou exotiques.

De nombreux fruits sont produits dans différentes régions de l’île et ils peuvent constituer des

niches écologiques favorables au développement des levures.

Puisque Madagascar est un pays riche en fruits exotiques, que les levures occupent une

place primordiale dans divers domaines d’application et que les écosystèmes particuliers de l’île

pourraient favoriser l’existence de nouvelles souches de levures, pouvant être des ressources

potentiellement valorisables, nous nous sommes intéressés à l’étude des levures de fruits de

Madagascar.

Le présent travail consiste à isoler et identifier les souches de levure de six fruits (Rubus

phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica variété Zill, Morus

nigra et Rubis rosifolius) récoltés dans quatre régions de Madagascar : région Atsinanana

(Toamasina), région Boeny (Mahajanga), région Vakinankaratra (Andranomanelatra), et région

Analamanga (Ambohimalaza).

Introduction

2

Cette étude comporte 3 grandes parties :

-Premièrement, une synthèse bibliographique présentant des généralités sur les levures et

les fruits étudiés.

-Deuxièmement, les matériels et méthodes utilisés durant le travail.

-Troisièmement, les résultats obtenus suivis de la discussion.

Première partie :

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

3

I-LES LEVURES I-1-Généralités Les levures sont des champignons unicellulaires sur une partie ou sur l’ensemble de leur

cycle végétatif. Certaines peuvent former des associations cellulaires, ou se présenter sous forme

filamenteuse à certains stades de leur vie (Bouix et Leveau, 1991). Elles se reproduisent par

bourgeonnement ou par fission binaire (Kreger-Van, 1984). Leurs cellules sont généralement

ovoïdes et leur taille varie de quelques microns à 30 microns (Bouix et Leveau, 1991).

Les levures se différencient nettement des bactéries par leur structure cellulaire eucaryote, le

cytoplasme contient les organites habituels des végétaux supérieurs non photosynthétiques

(Guiraud, 1998).

Les levures sont des espèces ubiquitaires et sont largement distribuées dans la nature. Elles

peuvent se développer à l’intérieur d’autres êtres vivants mais prolifèrent aussi dans les eaux,

dans l’air et surtout dans le sol qui constitue un large réservoir assurant leur survie dans des

conditions défavorables (Leclerc, 1975).

I-2-Caractéristiques

I-2-1-Caractères morphologiques (LARONE, 2011)

Les cellules de levure peuvent être sphériques, ovoïdes, (parfois cylindriques,

triangulaires…) et leur taille varie de 2 à 50µm de long, et 1 à 10µm de large.

Une cellule levurienne possède un vrai noyau et est pourvu d’inclusions cytoplasmiques :

mitochondrie, appareil de golgi, réticulum endoplasmique, ribosomes, vacuoles et granules de

réserve (Guiraud, 1998).


4

La représentation schématique d’une cellule de levure est donnée par la figure 1 ci-dessous.

Figure 1 : Représentation schématique d’une cellule de levure (source : parasitoweb.free.fr)

I-2-2-Caractères physiologiques des levures

Un certain nombre de facteurs physiologiques du milieu influencent la croissance des

levures dont les principaux sont :

I-2-2-1) Température

La température optimale de culture des levures se situe en général entre 25°C et 30°C, mais

comme les autres microorganismes, les levures peuvent être classées en levures psychrophiles,

mésophiles et thermophiles. D’une façon générale, les levures ne sont pas thermorésistantes.

Les levures sont aussi sensibles à la congélation et à la lyophilisation avec une grande

variabilité selon les genres et espèces, et selon la phase de croissance (les cellules en phase

exponentielle résistent moins que les cellules en phase stationnaire) (ROSE, 1987).


5

I-2-2-2) Activité de l’eau

La plupart des souches ne peuvent pas se développer pour une activité de l’eau inférieure à

0,90 ; mais certaines tolèrent des pressions osmotiques plus élevées, correspondant à une activité

de l’eau de l’ordre de 0,60, en ralentissant leur métabolisme ; ces levures sont dites

xérotolérantes (Bouix et Leveau, 1979).

I-2-2-3) Oxygène

Toutes les levures sont capables de se développer en présence d’oxygène : il n’y a pas de

levure anaérobie stricte.

Certaines levures sont aérobie strictes (comme les Rhodotorula). Les autres sont aéro-

anaérobie facultatives (Bouix et Leveau, 1991).

I-2-2-4) pH

Les enveloppes cellulaires sont imperméables aux ions H30+ et OH-. Les levures tolèrent

donc des gammes de pH très larges, théoriquement de 2,4 à 8,6 (Bouix et Leveau, 1991).

I-2-2-5) Source d’azote

Beaucoup de champignons, dont les levures, peuvent utiliser l’azote sous forme minérale :

nitrate (NO3-) ou ammonium (NH4

+) ou les deux), pour synthétiser de nouvelles molécules

azotées comme les acides aminés ou les acides nucléiques. D’autres ne peuvent utiliser que de

l’azote organique, ce qui exige la présence d’acides aminés et nucléiques déjà synthétisés

(GUIRAUD, 1998).

I-2-2-6) Source de carbone

Le développement des champignons, donc des levures, exige une source de carbone

organique, puisqu’ils ne peuvent pas effectuer la photosynthèse. La plupart des champignons

utilisent des sucres simples comme le glucose ou le lévulose (ou fructose) mais, dans la nature,

ils se trouvent fréquemment en présence de polysaccharide, sucres complexes qu’ils doivent

d’abord dégrader avant de les absorber (POL, 1996).

I-2-3) Caractères biochimiques des levures

Les levures présentent une diversité métabolique à partir des substrats dégradés, à savoir :

-Métabolisme oxydatif : les levures utilisent le glucose en présence d’oxygène, par

conséquent, leur métabolisme est respiratoire et le pyruvate est oxydé par le cycle de Krebs.


6

Cette voie métabolique est très énergétique et permet aux levures une importante

multiplication. (LARPENT, 1991).

-Métabolisme fermentaire : certaines levures peuvent privilégier une dégradation des

glucides par un métabolisme fermentatif qui conduit à la formation d’éthanol et de CO2. Ce

métabolisme est moins énergétique que le métabolisme oxydatif (GUIRAUD et ROSEC, 2004).

Le rendement en alcool compte 16,83g de sucres pour que les levures produisent 1%

d’alcool.

La quantité d’alcool que peut tolérer une levure varie selon les espèces : par exemple,

Kloeckera apiculata meurt à partir de 6 % vol, alors que Saccharomyces cerevisiae supporte

14 % vol.

-L’assimilation des sucres : les levures vont assimiler les sucres ayant un nombre de

carbones en multiples de 3, comme les hexoses en C6. Le glucose est mieux assimilé que le

fructose, les levures ne fermentent pas tous les sucres à la même vitesse.

-La résistance au SO2 : par exemple, Kloeckera apiculata est très sensible au SO2, alors que

Zygosaccharomyces est très résistante.

-L’utilisation des facteurs de croissance : certaines levures peuvent utiliser des vitamines,

elles sont prototrophes, les autres sont auxotrophes

I-3-Classification

La classification de référence est actuellement celle de Kreger-Van (1984) qui présente des

changements sensibles par rapport à la précédente classification de Lodder (1971). En particulier,

de nouveaux critères taxonomiques sont pris en considération pour permettre des études plus

rigoureuses. Il s’agit d’un groupe hétérogène, qui, d’un point de vue taxonomique, comprend

une soixantaine de genres et près de 500 espèces (Kreger-Van, 1984).

Les levures se divisent en 3 grandes classes (tableau 1) :

-Les ascomycètes : genres sexués, où les produits de la méiose ou ascospores sont

endogènes et enfermés dans une structure issue du zygote : l’asque.

-Les basidiomycètes : genres sexués, où les produits de la méiose ou basidiospores (chez les

levures sont souvent appelés ballistospores) sont exogènes et émis à l’extérieur du zygote.

-Les deutéromycètes ou levures imparfaites : genres asexués ne se multipliant que par

reproduction végétative.


7

Tableau 1: Classification des levures (Kreger-Van, 1984).

Les levures ascomycètes Saccharomycetaceae 1. Schizosaccharomycetoidea Schizosaccharomyces 2. Saccharomycetoidea Ambrosiozyma Arthroascus Arxiozyma Citeromyces Clavispora Cyniclomyces Debaryomyces Dekkera Guilliermonedella Hansenula Issatchenkia Kluyveromyces Lodderromyces Pachysolen Pachytichospora Pichia Saccharomyces Saccharomycopsis Schwanniomyces Sporopachydermia Stephanoascus Torulaspora Wickerhamiella Wingea Yarrowia Zygosaccharomyces 3. Lipomycetoideae Lipomyces 4. Nadsonioideae Hanseniaspora Nadsonia Saccharomycodes Wickerhamia 5. Spermophthoraceae Coccidiascus Metschnikowia Nematospora

Les levures basidiomycètes Levures formant des teliospores Leucosporidium Rhodosporidium Sporidiobolus Filobasidiaceae Filobasidiella Filobasidium Levures non classées Sterigmatosporidium

Les levures imparfaites Sporobolomycetaceae Bullera Sporobolomyces Cryptococcaceae Aciculoconidium Brettanomyces Candida Cryptococcus Eeniella Fellomyces Kloeckera Malassezia Oosporidium Phaffia Rhodotorula Schizoblastosporion Sterigmatomyces Sympodiomyces Trichosporon Trigonopsis


8

I-4-Utilisations des levures

L’utilisation des levures pour la panification et la vinification est connue depuis l’époque

préhistorique. Toutefois, la compréhension des mécanismes microbiologiques mis en œuvre date

des travaux de Louis Pasteur au XIX e siècle. Les connaissances scientifiques et techniques ainsi

acquises ont permis de cultiver et d’utiliser de grandes quantités de levure dans les procédés de

fermentation industrielle, mais aussi pour la production de vitamine B, de thiamine, des

antibiotiques et des hormones stéroïdes (Berthelot. L et al, 2001).

Les levures participent à l’élaboration de nombreux produits alimentaires (fromagerie,

brasserie) et dans la production d’enzymes (invertase, lactase, lipase, et amylase) (Simon et

Meunier, 1970).

Une autre transformation majeure des levures est leur autolyse et concentration par divers

procédés pour produire des extraits de levure qui sont utilisés comme éléments nutritionnels ou

agent de sapidité en alimentation humaine .Ces extraits sont riches en glutamate, glycane,

nucléotide, etc (Scriban, 1984).

Les biotechnologies et la recherche biomédicale exploitent aussi les levures, pour la

production de molécules d’intérêt médical ou industriel (Mercier, 1997)

II-GENERALITES SUR LES PLANTES

II-1) Rubus phoenicolasius (Ronce)

II-1-1) Description botanique

C’est une plante vivace herbacée ou arbrisseau. Les racines sont souvent longuement

traçantes et émettant des rejets. Les tiges peuvent être soit herbacées et annuelles, soit ligneuses.

Les feuilles sont alternes, entières surtout chez les formes primitives sinon profondément lobées,

ou divisées en folioles pennées, à marge généralement dentée. Les fleurs sont généralement

organisées en grappe ou en panicules, rarement solitaires ; elles sont hermaphrodites, ou bien

dioïques chez certaines espèces. Le fruit est un syncarpe composé de drupéoles à une seule

graine et à endocarpe dur (noyau) pouvant être lisse à ridé.


9

II-1-2) Position systématique

La position systématique de la ronce est donnée comme suit :

Règne : PLANTAE

Sous-règne : TRACHEOBIONTA

Division : MAGNOLIOPHITA

Classe : MAGNOLIOPSIDA

Sous-classe : ROSIDAE

Ordre : ROSALES

Famille : ROSACEAE

Genre : Rubus

Espèce : phoenicolasius

Noms vernaculaires : Ronce(Français), Takoka(Malagasy)

Les fruits de Rubus phoenicolasius sont montrés par la figure 2 ci-dessous.

Figure 2 : Fruits de Rubus phoenicolasius

II-1-3) Répartition géographique

C’est une plante originaire de la France métropolitaine, Afrique du Nord, et Afrique

tropicale mais à large répartition eurosibérienne et méditerranéenne.


10

II-2) Nephelium lappaceum (Litchi chevelu)


C’est un petit arbre, parfois épineux ; à feuilles alternes, composées pennées à unifoliées, à

folioles entières et dentées. Les fleurs sont groupées en panicule terminale (parfois axillaire).

Les fruits, rouges à maturité, de forme plus ou moins ovale, possèdent une enveloppe munie

de multiples épines souples. La graine, entourée d’un arille, est agréable au goût.


La position systématique de litchi chevelu est donnée comme suit :

Règne: PLANTAE





Ordre : SAPINDALES

Famille : SAPINDACEAE

Genre : Nephelium

Espèce : lappaceum

Noms vernaculaires : Ramboutan, litchi chevelu(Français) ; Ledisia-tsinoa(Malagasy)

Les fruits de Nephelium lappaceum sont montrés par la figure 3 ci-dessous.

Figure 3 : Fruits de Nephelium lappaceum


11


Plante originaire de Chine, et de la forêt tropicale humide de l’Ouest de Malaisie, le litchi

chevelu est présent aujourd’hui dans l’ensemble de la zone intertropicale, ainsi que dans

certaines régions tempérées.

II-3) Litchi sinensis (Litchi) II-3-1) Description botanique

C’est un arbre qui peut atteindre 10 à 12 m de haut, avec une écorce colorée en gris brun et

rugueuse. Les feuilles sont persistantes et imparipennées. Ses nombreuses fleurs donnent des

petits fruits globuleux, rouge vif lorsqu’ils sont murs, à formes plus ou moins ovale, et dont les

graines sont entourées d’un arille comestible.


La position systématique de litchi est donnée comme suit :

Règne : PLANTAE





Ordre : SAPINDALES

Famille : SAPINDACEAE

Genre : Litchi

Espèce : sinensis

Noms vernaculaires : Litchi (Français), Ledisia(Malagasy)


Plante originaire du Sud de la Chine Subtropicale, le litchi est présent aujourd’hui dans

l’ensemble de la zone intertropicale et dans certaines régions tempérées.


12

Les fruits de Litchi sinensis sont montrés par la figure 4 ci-dessous.

Figure 4 : Fruits de Litchi sinensis

II-4) Mangifera indica variété Zill (Mangue)


C’est un arbre tropical, suffisamment grand, qui peut atteindre jusqu’à 30 m de hauteur,

caractérisé par un système racinaire pivotant et des racines de surface sur lesquelles naissent

d’autres racines verticales. Ses feuilles, vert foncé, sont simples et lancéolées. Ses fleurs

minuscules et hermaphrodites se regroupent au sein de grandes panicules terminales.

Les fruits pèsent de 50 g à plus de 2 kg. La peau du jeune fruit est verte et le fruit mur a une

chair jaune ou orangée, fondante, juteuse, non fibreuse et très parfumée. Il contient un noyau

aplati et fibreux.

Les fruits de Mangifera indica variété zill sont montrés par la figure 5 ci-dessous.

Figure 5 : Fruits de Mangifera indica variété Zill


13


La position systématique de la mangue est donnée comme suit :

Règne : PLANTAE





Ordre : SAPINDALES

Famille : ANACARDIACEAE

Genre : Mangifera

Espèce : indica

Variété : zill

Noms vernaculaires : Mangue(Français), manga(Malagasy)


Plante originaire de l’Inde orientale et de Birmanie, introduit au XVIème siècle en Afrique

par les Arabes et au Brésil par les Portugais. Aujourd’hui, elle pousse partout, surtout dans les

pays tropicaux, notamment en Afrique, à La Réunion et à l’ile Maurice, aux Seychelles, aux

Antilles et au Brésil.

A Madagascar, la principale zone de production est la partie Ouest de l’ile, de Toliary au

Sud, en passant par Morondava, Maintirano, le Nord Ouest (Mahajanga, Maevatanana,

Antsohihy) et se terminant au Nord (Ambanja, Ambilobe).

II-5) Morus nigra (Murier)


C’est un arbre plus ou moins grand, caractérisé par des feuilles en cœur à pétiole plus court

que le limbe, largement ovale, aigues, inégalement dentées. Ses fruits, noirs, à maturité, sont

acidulés et sucrés.


14


La position systématique du murier est donnée comme suit:

Règne : PLANTAE

Sous-règne: ANGIOSPERMES

Classe : DICOTYLEDONES

Sous-classe: ROSIDAE

Ordre : ROSALES

Famille : MORACEAE

Genre : Morus

Espèce : nigra

Noms vernaculaires : Murier (Français), voaroihazo (Malagasy)

Les fruits de Morus nigra sont montrés par la figure 6 ci-dessous.

Figure 6 : Fruits de Morus nigra


Plante originaire des bords maritimes de l’Italie. Elle pousse spontanément dans l’Asie

mineure, en particulier dans le Pont et l’Arménie. En général, au Sud-ouest de la mer Caspienne

et au midi du Caucase. Elle est cultivée aussi dans le midi de l’Europe depuis les temps les plus

reculés. A Madagascar, elle se rencontre partout, surtout dans la région centrale.


15

II-6) Rubis rosifolius (Framboisier sauvage)


C’est une plante pérenne buissonnante qui possède une racine en pivot avec un système

racinaire fibreux latéral. La tige s'accroche à la végétation environnante et est armée d'aiguillons

très acérés. Les feuilles aux deux faces légèrement pubescentes sont composées, alternes

imparipennées. Les inflorescences sont axillaires et terminales.

Les fleurs blanches sont solitaires ou en petits groupes terminaux. La fleur blanche

hermaphrodite donne un fruit de couleur rouge (plus petits que ceux de Morus nigra) formé de

l'assemblage de plusieurs petites drupéoles, environ 50. Il est globuleux, ovale ou oblong,

pulpeux, peu juteux et de saveur douce.


La position systématique du framboisier sauvage est donnée comme suit:

Règne : PLANTAE

Sous-règne: ANGIOSPERMES

Classe: DICOTYLEDONES

Sous-classe: ROSIDAE

Ordre : ROSALES

Famille : ROSACEAE

Genre : Rubis

Espèce : rosifolius

Noms vernaculaires : framboisier sauvage ou d’Asie (Français),

voarointsaka (Malagasy)


16


Plante originaire de l’Asie du sud-est, on le trouve couramment en Australie, en Nouvelle-

Calédonie et dans certaines îles du pacifique, de la Chine tropicale au sous continent indien. Il a

été acclimaté dans de nombreuses zones tropicales et tempérées chaudes, où il est parfois cultivé

à l’échelle commerciale.

On le trouve en abondance dans le sud du Brésil, en Californie.Il a été introduit également

dans les Antilles, où il préfère l’altitude et les versants montagneux humides. Il a été

classé plante invasive à Hawai, Puerto Rico et en Polynésie française.

Les fruits de Rubis rosifolius sont montrés par la figure 7 ci-dessous.

Figure 7 : Fruits de Rubis rosifolius

Deuxième partie :

MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

17

I-MATERIELS

I-1-Matériels végétaux

Les matériels végétaux sont des fruits tropicaux de Madagascar. Dans le tableau 2, ils

sont classés selon leur région de provenance.

Tableau 2 : Répartition des matériels végétaux

Régions Noms scientifiques Noms

vernaculaires

Coordonnées

GPS

Atsinanana

(Toamasina)

Nephelium lappaceum Ramboutan S 18° 11’ 811’’

E 049° 20’ 128’’ Rubus phoenicolasius Ronce

Analamanga

(Ambohimalaza)

Litchi sinensis Litchi -

Boeny

(Mahajanga)

Mangifera indica

var zill

Mangue zill -

Vakinankaratra

(Andranomanelatra)

Morus nigra Murier S 19° 46’ 821’’

E 047° 06’ 145’’

Rubis rosifolius Framboise d’Asie S 19° 46’ 464’’

E 047° 06’ 939’’

I-2-Matériels de laboratoire

Les matériels de laboratoire utilisés sont constitués par :

-Les verreries: ballon à fond plat, ballon à fond rond, bécher, boîte de Pétri, tube vissé,

tube à coton cardé, micropipette, pipette graduée, éprouvette graduée

-Les petits matériels: anse d’inoculation, spatule, couteau, bec bunsen, balance, vortex,

plaque chauffante, glacière.

-Les gros matériels: autoclave, étuve, hotte à flux laminaire, réfrigérateur.


18

II-METHODES

Toutes les manipulations (récolte, isolement, purification et identification) ont été

effectuées dans des conditions d’asepsie parfaite (15 cm autour de la flamme du bec Bunsen ;

tous les matériels utilisés sont stériles).

II-1- Récolte

La récolte des fruits a été effectuée au mois de janvier 2015 dans la région Atsinanana et

dans la région Analamanga, au mois de février 2015 dans la région Boeny, et au mois de mars

2015 dans la région Vakinankaratra.

Figure 8: Carte topographique des régions de la récolte (source : googlemap 2015)

Site de collecte de

Mangifera indica var zill

Site de collecte de

Litchi sinensis

Site de collecte de

Nephelium lappaceum

et Rubus phoenicolasius

Site de collecte de

Morus nigra et Rubis

rosifolius


19

Principe

La récolte des fruits doit être effectuée dans une zone éloignée de toutes activités

humaines et animales pour éviter les contaminations microbiennes et surtout pour trouver des

nouvelles souches de levure.

Mode opératoire

- Un bec Bunsen est allumé à environ 15cm du fruit à récolter.

- Les mains du manipulateur sont désinfectées à l’alcool.

- Un couteau est stérilisé par la flamme du bec Bunsen.

- Le fruit est récolté avec le couteau stérile et mis directement dans un sachet

stérile.

Les échantillons récoltés sont codés, placés dans une glacière et transportés au

laboratoire où ils sont conservés au réfrigérateur jusqu’à leur utilisation.

II-2-Isolement des levures

But : il s’agit d’isoler et ainsi d’obtenir le maximum de souches contenues dans

l’échantillon (fruit).

II-2-1) Préparation de la suspension mère

X g de l’échantillon de fruit à analyser sont mis en suspension dans du NaCl 9‰ jusqu’à

ce que le volume final soit égal à 10 × X g . La préparation est ensuite homogénéisée : c’est la

suspension mère.

II-2-2) Dilution

1ml de la suspension mère est introduit dans un tube stérile contenant 9ml d’eau distillée

stérile. Le mélange bien homogénéisé constitue la dilution 10-1.


20

II-2-3) Ensemencement

Méthode : A l’aide d’une pipette stérile, 1ml de la suspension mère (ou 1ml de la

dilution) a été prélevé et ensemencé sur toute la surface d’un milieu gélosé, milieu Sabouraud-

chloramphénicol 5%, coulé dans une boite de Pétri. La boite fermée est ensuite retournée et

incubée à 30°C pendant 24-48h.

Observation : Après incubation, les colonies isolées obtenues sont caractérisées :

description macroscopique de chaque colonie isolée (forme, taille, relief, contour, couleur).

II-3-Purification

Les différents types de colonies trouvés après isolement ont été respectivement purifiés par

des repiquages successifs dans des boites de Pétri sur milieu Sabouraud-chloramphénicol 5%

jusqu’à obtention de culture pure de levure.

Ainsi, un prélèvement de chaque type de colonie a été réalisé au moyen d’une anse stérile

puis ensemencé à la surface de la gélose en faisant des stries selon la méthode de quadrillage.

L’incubation se fait à 30°C pendant 24-48h.

Observation : la purification de chaque colonie a donné une souche pure de levure.

II-4-Conservation

Principe

Les souches pures de levure isolées doivent être conservées dans des bonnes conditions

pour qu’elles gardent toutes leurs propriétés biologiques intactes, au fil du temps, jusqu’à leur

utilisation (identification).

La méthode de conservation la plus couramment utilisée est la conservation à basse

température (+4°C au réfrigérateur).

Mode opératoire

La culture pure est repiquée, puis ensemencée dans un tube à essai contenant de la gélose

pente du milieu Sabouraud-chloramphénicol 5% en faisant des stries serrées du fond du tube vers

l’ouverture.


21

Le tube à essai est ensuite bouché hermétiquement pour éviter toute contamination, puis

incubé à 30°C pendant 24-48h, avant d’être conservée au réfrigérateur à +4°C.

II-5-Identification des levures

L’identification a pour but de déterminer le genre et l’espèce auxquels appartient chaque

souche pure de levure trouvée. Elle est basée sur l’étude des caractères culturaux,

morphologiques, physiologiques et biochimiques.

II-5-1) Etude des caractères culturaux

Les colonies qui constituent chaque souche pure de levure ont été observées à l’œil nu

afin de noter la taille (petite, moyenne ou grande), le relief (bombé ou plat ou surélevé,…), le

contour (régulier ou irrégulier), l’aspect de la surface (lisse ou rugueuse,…), la transparence

(translucide ou opaque,…), la couleur, la forme (arrondie ou non), et la consistance des colonies

(sèche ou crémeuse,...).

II-5-2) Etude des caractères morphologiques

II-5-2-a) Examen à l’état frais

L’observation microscopique de chaque souche pure à l’état frais permet de mettre en

évidence la forme, la mobilité, et le mode de groupement des cellules.

Une ansée de la souche pure à étudier est prélevée et additionnée avec une goutte d’eau

distillée stérile déposée sur une lame mince bien dégraissée. La préparation est recouverte d’une

lamelle en évitant de faire des bulles d’air et observée sous microscope au fort grossissement.

II-5-2-b)-Coloration GRAM (Marchal, 1985; Singleton, 2005)

C’est la coloration de base de la classification des espèces bactériennes.

Principe

La coloration GRAM est basée sur l’affinité tinctoriale des bactéries vis-à-vis du colorant

de base (violet de gentiane). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet après

décoloration par l’alcool, et les bactéries à Gram négatif décolorées par l’alcool sont recolorées

par la safranine (rose ou rouge).


22

Mode opératoire

Etalement et séchage

Une ansée d’une souche jeune est prélevée puis étalée sur une lame bien propre à l’aide

d’un oese stérile par un mouvement régulier et circulaire. La préparation (frottis) est ensuite

séchée en la maintenant à quelque cm de la flamme du bec bunsen.

Fixation

Quelques gouttes d’alcool sont versées sur le frottis sec pendant quelques secondes. La

lame est ensuite égouttée puis séchée par flambage.

Coloration

Le frottis est complètement recouvert du violet de gentiane en laissant agir pendant 10 à

60 secondes.

Mordançage

Le violet de gentiane est rejeté et du lugol est versé sur le frottis pendant quelques

secondes.

Décoloration

Le frottis est lavé avec de l’alcool pendant quelques secondes puis rincé abondamment à

l’eau.

Recoloration

Quelques gouttes de safranine diluée sont déposées à chaque extrémité de la lame

pendant 10 à 20 seconds suivis d’un rinçage à l’eau.

L’observation est effectuée sous microscope optique à fort grossissement.

II-5-3) Etude des caractères physiologiques

Type respiratoire

La souche à étudier est ensemencée dans un tube contenant un milieu viande-foie en

faisant une ligne verticale jusqu’au fond du milieu. Une incubation à 30°C pendant 24 à 48h a été

réalisée.


23

Le type respiratoire est caractérisé par la zone de la croissance dans la gélose :

-aérobie strict: quand le microorganisme se développe vers la surface du milieu.

-aéro-anaérobie facultatif: quand le microorganisme se développe sur toute la hauteur de

la gélose.

-micro-aérophile: quand le microorganisme croît dans la zone intermédiaire.

-anaérobie strict: quand le microorganisme croît uniquement au fond du tube.

Test de la catalase

Cette enzyme catalyse la dégradation de l’eau oxygénée, selon la réaction :

Catalase H2 O2 H2O + ½ O2

Eau oxygénée eau oxygène

Mode opératoire : Une ansée de la souche est déposée sur une lame propre, et une goutte

d’eau physiologique est versée au-dessus. La présence de l’enzyme catalase est caractérisée par

l’apparition d’une effervescence.

II-5-4) Etude des caractères biochimiques

II-5-4-a) Etude sur le milieu HAJNA-KLIGLER

Il s’agit d’un milieu solide, coulé en pente dans un tube, composé de 2 parties : le culot

contenant le glucose et la pente formée par le lactose.

Principe : l’utilisation du glucose comme source de carbone et d’énergie par la souche de

levure s’accompagne d’une production d’acide organique entrainant le virage de la couleur rouge

de phénol au jaune. La production éventuelle de H2S se traduit par un précipité noir dans la zone

entre la pente et le culot montrant l’utilisation de thiosulfate réductase par les levures pour

réduire les sulfates inorganiques constitués par la peptone du milieu.

Mode opératoire : L’ensemencement se fait par une piqûre centrale dans le culot, suivi

d’une striation en zigzag à la surface de la gélose inclinée. L’incubation se fait à 30°C pendant

24-48h.


24

II-5-4-b) Etude sur le milieu CITRATE DE SIMMONS

Il s’agit d’un milieu solide en pente de couleur verte.

Principe : Lorsque le microorganisme utilise le citrate comme source de carbone (souche

citrate positif), il provoque une alcalinisation du milieu. Ceci est indiqué par le changement de

couleur de l’indicateur de pH, le bleu de bromothymol qui devient bleu.

Mode opératoire : L’ensemencement se fait par une strie centrale du fond du milieu vers

l’ouverture du tube. Le virage éventuel de l’indicateur de pH est observé après 24-48h

d’incubation à 30°C.

II-5-4-c) Etude sur le milieu LYSINE-FER

Il s’agit d’un milieu solide de couleur violette, enrichi en lysine. Il comprend 2 parties : le

culot et la pente.

Principe : L’utilisation de la lysine par les microorganismes, comme source de carbone,

entraine un changement du pH se traduisant par le virage au jaune ; il peut y avoir production

d’H2S révélée par la formation de sulfure noir.

Mode opératoire : A l’aide d’une anse, l’inoculum est enfoncé dans le culot puis à la

surface de la pente. L’incubation se fait à 30°C pendant 24-48h, et l’interprétation se fait comme

suit :

- culot jaune : LDC –

-culot violet : LDC +

-pente violette : LDA –

-pente rouge vineuse : LDA +

-précipité noir : H2S+


25

II-5-4-d) Etude sur le milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE

Il s’agit d’un milieu semi-solide de couleur rouge.

Principe : Une acidification du milieu est entrainée par la fermentation du mannitol et

elle se manifeste par le virage au jaune du rouge de phénol qui est l’indicateur de pH.

Les microorganismes immobiles croissent uniquement le long de la ligne

d’ensemencement tandis que les microorganismes mobiles se développent hors de la ligne

d’ensemencement.

Mode opératoire : L’ensemencement se fait, à l’aide d’une anse stérile, par piqûre

centrale s’arrêtant à 1cm du fond du tube. L’incubation se fait à 30°C pendant 24-48h.

II-5-4-e) Auxanogramme du carbone

Principe

Il s’agit d’un système d’identification dont la technique repose sur l’utilisation d’un

glucide comme unique source de carbone, se traduisant par un virage de l’indicateur de pH.

Glucides utilisés : saccharose, galactose, xylose, sucrose, arabinose, rhamnose, fructose.

Mode opératoire

L’ensemencement se fait à l’aide d’une oese stérile, en une strie centrale du fond vers

l’ouverture du tube. Après 24h d’incubation à 30°C, le virage de l’indicateur de pH est observé.

II-5-5) Technique d’identification de genre et d’espèce des levures

-API 20 C AUX : il s’agit d’un système d’identification précise des levures le plus

couramment utilisé.

Principe :

La galerie API 20 C AUX est constituée de 20 cupules contenant des substrats

déshydratés qui permettent d'effectuer 19 tests d'assimilation. Les cupules sont inoculées avec un

milieu minimum semi-gélosé et les levures poussent seulement si elles sont capables d'utiliser le

substrat correspondant.


26

La lecture de ces réactions se fait par comparaison aux témoins de croissance et

l'identification est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'identification.

Mode opératoire

Préparation de la galerie

Les fonds et les couvercles de la boîte d’incubation ont été réunis et environ 5ml d’eau

distillée sont répartis dans les alvéoles du fond pour créer une atmosphère humide. Puis, la

référence de la souche est inscrite sur la languette latérale de la boîte. Ensuite, la galerie de son

emballage individuel a été retirée et déposée dans la boîte d’incubation.

Préparation de l’inoculum

Une fraction de colonie de la souche à étudier a été prélevée à l’aide d’une pipette et a

servi à la préparation d’une suspension de levure de turbidité égale à 2 de Mc Farland.

Une ampoule d’API C Medium (2 ml) est ouverte et y sont transférés environ 100µl de la

suspension précédente. L’homogénéisation du mélange se fait avec la pipette en évitant la

formation de bulles.

Inoculation de la galerie

Le remplissage des cupules avec la suspension obtenue dans l’ampoule d’API C Medium

est réalisée ; puis, la boite a été refermée et incubée à 29°C ± 2°C pendant 48-72heures.

Troisième partie :

RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats et discussion

27

I-RESULTATS

I-1-Isolement

Après 24-48h d’incubation à 30°C des cultures de la suspension mère d’extraits de fruit sur

milieu Sabouraud-chloramphénicol 5%, chaque échantillon présente 2 types de colonie : colonie

de type 1 (taille petite) et colonie de type 2 (taille grande).

Ces 2 types de colonie pour chaque échantillon de fruits ont été ciblés et isolés pour la

purification.

I-2-Purification

Après les repiquages successifs sur milieu Sabouraud-chloramphénicol 5%, les colonies

isolées ont donné 12 souches pures, dont les codes sont donnés dans le tableau suivant :

Tableau 3 : Tableau montrant les codes des souches pures.

T: représente l’initial du manipulateur.

MK1/MK2

LC1/LC2

L1/L2 représente l’initial du fruit en malgache suivi du numéro correspondant à

MZ1/MZ2 taille de la colonie.

VH1/VH2

VS1/VS2

FRUITS CODES

Rubus phoenicolasius T-MK1/ T-MK2

Nephelium lappaceum T-LC1/ T-LC2

Litchi sinensis T-L1/ T-L2

Mangifera indica var zill T-MZ1/ T-MZ2

Morus nigra T-VH1/ T-VH2

Rubis rosifolius T-VS1/ T-VS2


28

La figure 9 suivante montre les 12 souches pures obtenues :

T-MK1 T-MK2

T-LC1 T-LC2

T-L1 T-L2

Figure 9: Les 12 souches de levure isolées.


29

T-MZ1 T-MZ2

T-VH1 T-VH2

T-VS1 T-VS2

Figure 9 (suite): Les 12 souches de levure isolées.


30

I-3-Identification

I-3-1-Etude des caractères culturaux et morphologiques

Etude des caractères culturaux

Le tableau suivant récapitule les résultats obtenus après observation macroscopique des

colonies respectives à chaque souche pure de levure obtenue.

Tableau 4 : Caractères culturaux des colonies de levure isolées

Critères Souches

Taille

Forme du relief

Contour

Aspect

Transparence

Couleur

Forme

Consistance

T-MK1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Rose Arrondie Crémeuse

T-MK2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-LC1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-LC2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Jaunâtre Arrondie Crémeuse

T-L1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-L2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-MZ1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-MZ2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-VH1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-VH2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-VS1 Petit Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

T-VS2 Grand Bombé Lisse Régulier Translucide Blanchâtre Arrondie Crémeuse

Les caractéristiques communes des souches pures se situent au niveau de la forme du

relief, du contour, de l’aspect, de la transparence, de la forme, et de la consistance. La différence

se situe au niveau de la taille et de la couleur.

-Caractères communs : toutes les colonies ont une consistance crémeuse, forme arrondie,

translucide, bombé, aspect régulier, et contour lisse.


31

-Différence : La souche T-LC2 a une couleur jaunâtre, T-MK1 a une couleur rose, et les autres

ont une couleur blanchâtre.

- La taille des colonies varie selon la souche de levure.

Etude des caractères morphologiques

Après observation microscopique, les caractères morphologiques, à l’état frais et après

coloration Gram des cellules de levure, sont résumés dans le tableau 5 :

Tableau 5 : Caractères morphologiques des cellules de levure

Critères

Souches

Mode de groupement

Forme des

cellules

Mode de division

Mobilité

Coloration

Gram

T-MK1 Isolé Arrondie Bourgeonnement Immobile -

T-MK2 Isolé Arrondie / Immobile -

T-LC1 Isolé Arrondie / Immobile -

T-LC2 Isolé Arrondie / Immobile -

T-L1 Groupé en amas

Arrondie Bourgeonnement Immobile +

T-L2 Isolé Arrondie / Immobile -

T-MZ1 Isolé Ovale / Immobile +

T-MZ2 Groupé en amas

Ovale / Immobile -

T-VH1 Isolé Arrondie / Immobile -

T-VH2 Isolé Arrondie / Immobile -

T-VS1 Isolé Ovale / Immobile +

T-VS2 Groupé en amas

Ovale / Immobile -

+ : réaction positive (couleur violette)

- : réaction négative (couleur rose ou rouge)


32

Les résultats obtenus, après observation à l’état frais, montrent que les souches T-MK1;

T-MK2 ; T-LC1 ; T-LC2 ; T-L2 ; T-MZ1 ; T-VH1 ; T-VH2 ; T-VS1 ont des cellules isolées

alors que pour les souches T-L1 ; T-MZ2 ; T-VS2, les cellules sont groupées en amas. Les

cellules des souches T-MZ1, T-MZ2 et T-VS1, T-VS2 sont ovales tandis que celles des autres

souches sont arrondies. Seules les souches T-MK1 et T-L1 se multiplient par bourgeonnement.

Les 12 souches sont toutes immobiles.

Les résultats obtenus après la coloration Gram montrent que les cellules des 3 souches T-

L1 ; T-MZ1 ; T-VS1 sont à Gram positif, et celles des autres souches sont à Gram négatif.

I-3-2-Etude des caractères physiologiques

Test du type respiratoire

Les résultats du test du type respiratoire sont récapitulés dans le tableau 6 :

Tableau 6 : caractères physiologiques des souches de levure

Souches Type respiratoire Catalase

T-MK1 Aéro-anaérobie facultatif - T-MK2 Aéro-anaérobie facultatif - T-LC1 Aéro-anaérobie facultatif - T-LC2 Aéro-anaérobie facultatif - T-L1 Aéro-anaérobie facultatif - T-L2 Aéro-anaérobie facultatif -

T-MZ1 Aéro-anaérobie facultatif - T-MZ2 Aéro-anaérobie facultatif - T-VH1 Aéro-anaérobie facultatif - T-VH2 Aéro-anaérobie facultatif - T-VS1 Aéro-anaérobie facultatif - T-VS2 Aéro-anaérobie facultatif -

- : réaction négative

Toutes les souches ont un type respiratoire aéro-anaérobie facultatif car elles se développent sur

toute la hauteur de la gélose.


33

Test de catalase

Après avoir versé le réactif H2O2 sur le frottis déposé sur une lame, aucune des 12 souches

n’a présenté une réaction d’effervescence (réaction négative), donc aucune ne contienne

l’enzyme catalase.

I-3-3-Etude des caractères biochimiques

I-3-3-1-Galerie Pasteur et auxanogramme du carbone

Les résultats des tests biochimiques sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau 7 : Caractères biochimiques des souches de levure

HK : milieu Hajna-Kligler CS : milieu citrate de Simmons

LF : milieu lysine-fer MMN : milieu mannitol-mobilité-nitrate

Etudes

HK

CS

LF

MMN

Auxanogramme du carbone

Souches

Glu

cose

lact

ose

Gaz

H2S

citr

ate

LD

A

LD

C

man

nito

l

mob

ilit

é

Sac

char

ose

gala

ctos

e

Xyl

ose

Suc

ros e

arab

inos

e

Rha

mno

se

Fru

ctos

e

T-MK1 + - - - - - + + - + - + - - + -

T-MK2 + - - - + - + + - + - + + - + -

T-LC1 - - - - - - + - - + - - - - + -

T-LC2 + - - - - - + + - - - - - - - -

T-L1 + - - - - - + + - + - + - - + -

T-L2 + - - - - - - - - + - - - - - -

T-MZ1 + + - - - - + - - + - + - - - -

T-MZ2 + + - - - - + - - - - - + - - -

T-VH1 + + - - - - - + - + + + + + + +

T-VH2 + + - - + - + - - + - + - - + -

T-VS1 + + - - - - - + - - - - - - + -

T-VS2 + - - - + - - - - + - + - + + +


34

Sur le milieu HAJNA-KLIGLER

L’absence de formation de H2S et de gaz sont des caractères communs aux 12 souches.

Toutes les souches fermentent le glucose sauf la souche T-LC1.

Cinq(5) souches T-MZ1, T-MZ2, T-VH1, T-VH2, T-VS1 assimilent le lactose comme

source de carbone.

Sur le milieu CITRATE DE SIMMONS

Les souches T-MK2, T-VH2, T-VS2, utilisent le citrate comme source de carbone.

Par contre, les autres souches sont incapables de croître dans le milieu.

Sur le milieu LYSINE-FER

Les souches T-L2, T-VH1, T-VS1, T-VS2, ne possèdent ni LDA ni LDC ; ce qui montre

qu’elles n’utilisent pas le glucose comme source de carbone et par conséquent, il n’y a pas de

changement du pH du milieu.

Sur le milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE

Seules 6 souches (T-MK1, T-MK2, T-LC2, T-L1, T-VH1 et T-VS1) sont capables de

dégrader le Mannitol. Les 12 souches sont toutes immobiles car elles ne se développent que sur

la ligne d’ensemencement.

Auxanogramme du carbone

La souche T-VH1 assimile tous les sucres expérimentés tandis que la souche T-LC2

n’assimile aucun des sucres utilisés. Pour les 10 autres souches, la nature et le nombre de sucres

qu’elles sont capables ou incapables d’assimiler varie selon la souche.

I-3-3-2-Galerie API 20 C AUX

La lecture des résultats se fait après 48 h d’incubation des plaques à 29°C ± 2°C. La

cupule 0 (témoin négatif), reste transparente. Par contre, en comparant l’intérieur des autres

cupules au témoin, l’apparition d’un trouble indique une réaction positive, c’est-à-dire que la

souche de levure a métabolisé le sucre (le substrat) dans le milieu.


35

La figure suivante montre les résultats de la galerie API 20C AUX pour la souche T-VS2:

Figure 10 : Fiche de lecture des résultats de la galerie API 20 C AUX.

Pour chaque souche pure de levure : les résultats des tests (positifs ou négatifs), observés

sur la plaque d’incubation, sont groupés par 3 et à chaque test positif correspond une valeur (1 ou

2 ou 4). Après addition, dans chaque groupe, des valeurs correspondant aux tests positifs, le

profil numérique de la souche est représenté par les 7 chiffres déterminés d’après la fiche de

lecture de la galerie API 20C AUX.

Le profil numérique trouvé (les 7 chiffres) est reporté dans la liste des profils de la base

de données du Catalogue Analytique API 20C AUX qui est le logiciel d’identification de la

méthode.

I-4-Nomenclature

D’après les résultats obtenus lors de l’étude des caractères culturaux, des caractères

morphologiques, des caractères physiologiques et des caractères biochimiques puis en se référant

à la base de données du Centre International de Ressources Microbiennes sur les levures (CIRM-

levures) (voir annexe), le nom de genre et d’espèce, pour chaque souche pure de levure, ont été

déterminés.

D’après les résultats trouvés :

-7 souches (T-MK1, T-MK2, T-L1, T-MZ1, T-VH1, T-VH2, T-VS2) appartiennent à

l’espèce Clavispora lusitaniae.

-3 souches (T-L1, T-LC2, T-MZ2) appartiennent à l’espèce Candida boidinii.

- Une souche (T-L2) appartient à l’espèce Saccharomyces uvarum.

-Et une souche (T-VS1) appartient à l’espèce Candida railenensis.


36

II- DISCUSSION

Les objectifs principaux de notre travail ont été l’isolement et l’identification des souches

de levure de six fruits tropicaux (Rubus phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis,

Mangifera indica variété Zill, Morus nigra et Rubis rosifolius) récoltés dans quatre régions de

Madagascar : région Atsinanana (Toamasina), région Boeny (Mahajanga), région Analamanga

(Ambohimalaza), et région Vakinankaratra (Andranomanelatra).

Les résultats obtenus ont montré que, comme la plupart des fruits mûrs, les six fruits

tropicaux de notre étude abritaient des souches de levure (VIAL C., 1992; THUNBERG

RICHARD L., TRAN TONY T., BENNETT REGINALD W., 2002; AHVENAINEN R., 1996;

HEARD G., 1999). En effet, à partir de l’extrait de chacun des six(6) fruits, nous avons isolé

deux souches différentes de levure. L’identification des 12 souches pures isolées a permis de

déterminer qu’elles appartiennent à 3 genres et 4 espèces différentes dont 7 souches de

Clavispora lusitaniae, 3 souches de Candida boidinii, une souche de Saccharomyces uvarum et

une souche de Candida railenensis.

L’espèce Clavispora lusitaniae est l’espèce type de levure qui est caractérisée par la

présence d’ascospore claviforme (en forme de massue) (Rodrigues de Miranda L., 1979). Cette

espèce a déjà été isolée à partir de nombreux produits (extrait de citron, dattes, produits laitiers,

déchets industriels, échantillons cliniques) de nature très diverse (Chen et al., 2001 ; Lachance et

al., 2003 ; Gargeya et al., 1990). Elle participe à la maturation des fromages en améliorant leurs

propriétés organoleptiques et intervient aussi dans la qualité des boissons alcoolisées

(Mingorance-Cazola et al., 2003 ; Clemente-Jimenez et al., 2004 ; Baffi et al., 2011).

L’espèce Candida boidini est une espèce de levure qui a été isolée du cacao de la Guyane

française mais se rencontre aussi dans de nombreuses autres niches écologiques tels le sol, la

mer, les olives, etc… (Barnett et al., 1990). C’est une levure méthylotrophie (il peut se

développer sur le méthanol). Comme d'autres espèces méthylotrophes, elle est capable de

produire des protéines (métabolites secondaires) trouvant plusieurs domaines d’application telle

la protection de l’environnement (Hristozova et al., 1994).


37

L’espèce Saccharomyces uvarum est une levure considérée comme ayant une distribution à

l'échelle mondiale, principalement dans des milieux naturels mais aussi dans des déchets

industriels (Sampaio et Gonçalves, 2008; Libkind et al, 2011). C’est une espèce cryotolérante

et elle est principalement associée à la dégradation des sucres en alcool notamment dans la

production de vin, de bière et de cidre. Le cidre est produit sans addition de microorganismes

mais seulement à partir de la flore naturelle des pommes (Lopes et al., 2007).

L’espèce Candida railenensis, est une espèce de levure qui a été isolée de la prune en

Corée mais aussi d’autres sources végétales tel le chêne pédonculé ou Quercus robur L. (Hong et

al., 2002). Généralement associée aux arbres du genre Nothofagus (des hêtres), elle intervient

activement dans le système de miellat c’est-à-dire la fabrication de miel (Ramirez et Gonzalez,

1984 ; Barnett et al., 1990 ; Isaeva et al., 2009).

Les résultats de notre étude confortent ceux des études qui ont montré que plusieurs

souches de levure différentes peuvent coloniser la même niche écologique tel un fruit (Bouzegag

H., 2007). La grande distribution des levures donc leur caractère ubiquitaire (Hong S.G., 2003)

est aussi confirmée puisque les six fruits différents étudiés, de plus récoltés dans quatre régions

différentes de Madagascar, comportent tous des levures.

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives

38

Au terme de notre travail, il a été confirmé que les plantes riches en sucres directement

assimilables tels les fruits tropicaux sont des milieux favorables à la croissance des levures.

Notre étude portant sur l’isolement et l’identification des levures de six fruits tropicaux

(Rubus phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica var zill, Morus

nigra, Rubis rosifolius), récoltés dans quatre régions de Madagascar (région Atsinanana, région

Boeny, région Analamanga et région Vakinankaratra), a permis d’obtenir , à partir des extraits

des fruits, 12 souches pures de levure : T-MK1, T-MK2, T-LC1, T-LC2, T-L1, T-L2, T-MZ1, T-

MZ2, T-VH1, T-VH2, T-VS1, T-VS2.

Après identification, les 12 souches pures de levure ont été classifiées dans trois genres et

quatre espèces différents dont: 7 souches de Clavispora lusitaniae, 3 souches de Candida

boidinii, une souche de Candida railenensis et une souche de Saccharomyces uvarum.

Cette étude des levures des plantes de Madagascar nous a permis de nous familiariser avec

les matériels de laboratoire de microbiologie et surtout de maîtriser les techniques d’isolement et

d’identification des microorganismes et en particulier des levures.

A l’avenir, nous envisageons de :

- confirmer l’identité des souches isolées par des tests d’assimilation d’autres substrats et

par des méthodes moléculaires.

- améliorer les rendements de production en optimisant tous les paramètres de la culture.

- effectuer des études complémentaires sur les souches isolées.

- chercher des potentialités valorisables des souches identifiées.

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ANNEXES

CLASSIFICATION DES SOUCHES

Clavispora lusitaniae

Règne : FUNGI

Division : ASCOMYCOTA

Classe : SACCHAROMYCETES

Ordre : SACCHAROMYCETALES

Famille : METSHNIKOWIACEAE

Genre : Clavispora

Espèce : lusitaniae

Candida boidinii

Règne : FUNGI




Famille : CANDIDACEAE

Genre : Candida

Espèce : boidinii

Candida railenensis

Règne : FUNGI




Famille : CANDIDACEAE

Genre : Candida

Espèce : railenensis

Saccharomyces uvarum

Règne : FUNGI




Famille : SACCHAROMYCETACEAE

Genre : Sacharomyces

Espèce : uvarum

COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

Milieu Sabouraud-chloramphénicol (usage : isolement non sélectif des champignons)

Composition pour 1000ml :

Peptone…………………………….10, 0 g

Glucose…………………………….20, 0 g

Chloramphénicol……………………5, 0 g

Agar………………………………..15 , 0 g

pH=7

Milieu CITRATE- SIMMONS

Citrate de sodium……………………1, 0 g

Bleu de bromothymol………………..0, 08 g

Chlorure de sodium………………….5, 0 g

Sulfate de magnésium………………..0, 2 g

Hydrogénophosphate de potassium….1, 0 g

Dihydrogénophosphate d’ammonium..1, 0 g

Agar…………………………………..15, 0 g

pH=7, 3

Préparation : 23g par litre de solution

Milieu HAJNA-KLIGLER

Peptone………………………………..15, 0 g

Extrait de viande………………………3, 0 g

Extrait de levure……………………….3, 0 g

Peptone pepsique de viande…………...5, 0 g

Glucose………………………………...1, 0 g

Lactose………………………………...10, 0 g

Rouge de phénol……………………….0, 024 g

Chlorure de sodium…………………….5, 0 g

Sulfate de fer II(Pasteur)………………..0, 2 g

Thiosulfate de sodium………………….0, 3 g

Agar…………………………………….11, 0 g

pH=7, 5

Préparation: 53,5 g par litre de solution

Milieu LYSINE-FER

Peptone de gélatine……………………..5, 0 g

Extrait de levure………………………...3, 0 g

L-lysine…………………………………10, 0 g

Glucose………………………………….1, 0 g

Citrate de fer III ammoniacal…………....0, 5 g

Bromocrésol pourpre……………………20, 0 mg

Thiosulfate de sodium…………………...40, 0 mg

Agar…………………………………….13, 5 g

pH=6,7

Préparation : 34g par litre de solution

Milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE

Hydrolysat trypsique de caséine…………10, 0 g

Mannitol………………………………….7, 5 g

Rouge de phénol …………………………0, 4mg

Nitrate de potassium………………………1, 0 g

Agar………………………………………..3, 5 g

pH=7,6

Préparation : 22 g par litre de solution

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2015-08-10

Search the strain catalogue

CLIB 253

Species Saccharomyces uvarum Beijerinck 1898 (Synonyms)

(Synonyms Mycobank)

Genus Saccharomyces Type No Other strain denominations

Taxonomical history

Other collections CBS 1604 DBVPG 6259

Carbon source fermentation cellobiose - ; D-galactose + ; D-glucose + ;

maltose + ; melezitose - ; melibiose + ; raffinose + ; saccharose + ; trehalose - ; lactose -

Carbon source assimilation lactic acid + ; L-arabinose - ; arbutine - ; cellobiose + ; ketogluconate + ; erythritol - ; D-gluconate - ; D-glucosamine - ; D-glucuronate - ; D-galactose + ; D-glucose + ; glycerol + ; myo_inositol - ; maltose + ; melezitose - ; melibiose + ; raffinose + ; L-rhamnose - ; D-ribose - ; saccharose + ; D-sorbitol - ; L-sorbose - ; trehalose +/- ; D-xylose - ; lactose - ; D-mannitol + ; methyl-D-glucoside + ; citric acid -

Nitrogen source assimilation cadaverine - ; nitrate - ; nitrite - ; ethylamine - ; L-lysine - ; creatine - ; creatinine -

Strip test API ID32C


2015-08-10


Constructed by n/a

Carbon source fermentation cellobiose - ; D-galactose - ; D-glucose + ;

maltose - ; melezitose - ; melibiose - ; raffinose - ; saccharose - ; trehalose + ; lactose -

Carbon source assimilation lactic acid + ; L-arabinose - ; arbutine + ; cellobiose + ; ketogluconate + ; erythritol - ; D-gluconate + ; D-glucosamine + ; D-glucuronate - ; D-galactose + ; D-glucose + ; glycerol + ; myo_inositol - ; maltose + ; melezitose + ; melibiose - ; raffinose +/- ; L-rhamnose + ; D-ribose - ; saccharose + ; D-sorbitol + ; L-sorbose + ; trehalose + ; D-xylose + ; lactose - ; D-mannitol + ; methyl-D-glucoside + ; citric acid +

Nitrogen source assimilation cadaverine + ; nitrate - ; nitrite - ; ethylamine + ; L-lysine +/- ; creatine - ; creatinine -


CLIB 299

Species Clavispora lusitaniae Rodrigues de Miranda 1979 (Synonyms)

(Synonyms Mycobank)

Genus Clavispora Type Yes Other strain denominations

Taxonomical history


2015-08-10


CLIB 1423

Species Candida railenensis Ram�rez & Gonz�lez 1984 (Synonyms)

(Synonyms Mycobank)

Genus Candida Type No Other strain denominations G349A Taxonomical history

Other collections

Carbon source fermentation cellobiose - ; D-galactose + ; D-glucose + ;

maltose + ; melezitose - ; melibiose - ; raffinose - ; saccharose + ; trehalose + ; lactose -

Carbon source assimilation lactic acid - ; L-arabinose - ; cellobiose - ; ketogluconate + ; erythritol - ; D-gluconate - ; D-glucosamine +/- ; D-glucuronate - ; D-galactose + ; D-glucose + ; glycerol + ; myo_inositol - ; maltose +/- ; melezitose + ; melibiose - ; raffinose - ; L-rhamnose - ; D-ribose - ; saccharose + ; D-sorbitol + ; L-sorbose + ; trehalose + ; D-xylose + ; lactose - ; D-mannitol +

Nitrogen source assimilation cadaverine - ; nitrate + ; nitrite + ; ethylamine +/- ; L-lysine - ; creatine - ; creatinine -



2015-08-10


CLIB 1425

Species Candida boidinii Ram�rez 1953 (Synonyms)

(Synonyms Mycobank)

Genus Candida Type No Other strain denominations G324 Taxonomical history

Other collections

Carbon source fermentation cellobiose - ; D-galactose - ; D-glucose + ; maltose - ; melezitose - ; melibiose - ; raffinose - ; saccharose - ; trehalose - ; lactose -

Carbon source assimilation lactic acid - ; L-arabinose - ; cellobiose - ; ketogluconate - ; erythritol + ; D-gluconate - ; D-glucosamine - ; D-glucuronate - ; D-galactose - ; D-glucose + ; glycerol + ; myo_inositol - ; maltose - ; melezitose - ; melibiose - ; raffinose - ; L-rhamnose - ; D-ribose + ; saccharose - ; D-sorbitol + ; L-sorbose - ; trehalose - ; D-xylose + ; lactose - ; D-mannitol -

Nitrogen source assimilation cadaverine + ; nitrate + ; ethylamine +/- ; L-lysine +/- ; creatine - ; creatinine +


VIRAGE DES MILIEUX

CITRATE DE SIMMONS HAJNA-KLIGLER

LYSINE-FER MANNITOL-MOBILITE-NITRATE

AUXANOGRAMME DU CARBONE

LES MATERIELS DE LABORATOIRE

1-LES VERRERIES :

MATERIELS ROLES

Pipette graduée

Pour prélever une petite dose déterminée de liquide.

Tube à essai

Pour faire des cultures bactériennes.

Boite de pétri

Pour faire des cultures bactériennes.

Erlenmeyer

Pour préparer, pour contenir ou pour conserver les milieux de culture ou des produits liquides.

2-LES PETITS MATERIELS :

MATERIELS ROLES

Vortex

Appareil qui permet de bien mélanger le contenu d’un tube à essai.

Bec bunsen

Pour la stérilisation de matériel par flambage.

Eprouvette graduée

Sert à améliorer d’une manière précise le volume d’un liquide.

Ballon

Pour préparer le milieu de culture, pour conserver des produits liquides.

Anse d’inoculation

Matériel qui permet l’ensemencement des bactéries dans un milieu de culture.

Spatule

Pour prélever la poudre de milieu de culture.

Balance de précision

Appareil de mesure précise du poids d’une substance.

Plaque chauffante

Appareil qui sert à ébouillir le contenu d’un bécher ou d’un ballon.

Microscope optique

Instrument optique permettant d’observer les corps invisible à l’œil nu.

3-LES GROS MATERIELS :

MATERIELS ROLES

Autoclave

Pour stériliser le milieu de culture, l’eau distillée.

Etuve

Appareil qui sert à incuber les cultures microbiennes.

Hotte à flux laminaire

Assure le maintien de l’atmosphère stérile durant toute manipulation.

Réfrigérateur

Appareil qui sert à conserver les souches pendant une longue période.

Name: FINIAVANA

First Name: Arisoa Tinah Fleurette

Title: "Isolation and identification of yeasts of six tropical fruits (Rubus phoenicolasius,

Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica, Morus nigra, Rubis rosifolius)

harvested in four regions of Madagascar (Atsinanana, Boeny, Analamanga, Vakinankaratra)."

ABSTRACT

The purpose of our work is the isolation and identification of yeasts of six tropical fruits

(Rubus phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica var zill, Morus

nigra, Rubis rosifolius) harvested in four regions of Madagascar (Atsinanana, Boeny,

Analamanga, Vakinankaratra).

The seeding on Sabouraud-chloramphenicol 5% medium of fruit extracts and the study of

cultural characters of isolated yeast colonies have allowed to determine 12 strains of yeast.

After studying the physiological and biochemical characteristics, and by referring to the

CIRM database (Resources International Centre for Microbial), the results determined by the

Galerie API 20C AUX method, 12 yeast pure strains were identified and classified in different

three genera and four species, namely: 7 strains of Clavispora lusitaniae, 3 strains of Candida

boidinii, a strain of Candida railenensis and a strain of Saccharomyces uvarum.

Keywords: yeast, isolation, identification, Rubus phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi

sinensis, Mangifera indica var zill, Morus nigra, Rubis rosifolius.

Advisors: Doctor RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina

Professor RAHERIMANDIMBY Marson

Nom: FINIAVANA

Prénoms: ArisoaTinah Fleurette

Titre: « Isolement et identification des levures de six fruits tropicaux (Rubus

phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica, Morus nigra,

Rubis rosifolius) récoltés dans quatre régions de Madagascar (Atsinanana, Boeny,

Analamanga, Vakinankaratra) ».

RESUME

L’objectif de notre travail est l’isolement et identification des levures de six fruits

tropicaux (Rubus phoenicolasius, Nephelium lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera

indica var zill, Morus nigra, Rubis rosifolius) récoltés dans quatre régions de Madagascar

(région Atsinanana, région Boeny, région Analamanga, région Vakinankaratra).

L’ensemencement sur milieu Sabouraud-chloramphénicol 5%, des extraits de

fruits et l’étude des caractères culturaux des colonies de levure isolées ont permis de

déterminer 12 souches de levure.

Après étude des caractères physiologiques et biochimiques, et en se référant sur la

base des données du CIRM (Centre International de Ressources Microbiennes) et aux

résultats déterminés par la méthode Galerie API 20C AUX, les 12 souches pures de

levure ont été identifiées et classifiées dans trois genres et quatre espèces différents, à

savoir : 7 souches de Clavispora lusitaniae, 3 souches de Candida boidinii, une souche

de Candida railenensis et une souche de Saccharomyces uvarum.

Mots clés : levures, isolement, identification, Rubus phoenicolasius, Nephelium

lappaceum, Litchi sinensis, Mangifera indica var zill, Morus nigra, Rubis rosifolius.

Encadreurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina

Professeur RAHERIMANDIMBY Marson

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ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LEVURES DESIX FRUITS