Contrôle génétique du métabolisme du ferJean-Yves Le Gall, Paris

Les coLLoques de L’InstItut servIer

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Jean-Yves Le Gall — Contrôle génétique du métabolisme du fer

Les notes renvoient aux pages des références correspondantes.

RÉSUMÉ

Le cadre des maladies héréditaires du fer, en même temps que la compréhension de son métabolisme, s’est considérablement élargi au cours des vingt cinq dernières années, en particulier depuis la découverte de l’hepcidine véritable hormone régulatrice de ce métabolisme. Sous le tableau clinique d’hémochromatose sont regroupées cinq entités génétiques : à l’hémochromatose classique HFE, dont l’expression correspond à l’homozygotie pour la mutation C282Y, sont venues s’ajouter deux autres formes à expression dite « tardive » par anomalie du gène du deuxième récepteur de la transferrine TfR2 ou par mutation de SLC40A1 codant la ferroportine, et deux formes dites juvéniles par anomalie du gène de l’hepcidine (HAMP) ou du gène de l’hémojuvénile (HJV). Ces affections ont une transmission autosomique récessive, sauf dans le cas des anomalies de la ferroportine.

D’autres surcharges martiales généralisées sont rarement observées : atransferrinémie, acéruloplasminémie par mutation du gène CP, syndrome « Gracile » par mutation du gène BCS1L (codant pour une protéine chape-ronne de la membrane des mitochondries). Ces surcharges ont une hérédité mendélienne récessive.

Certaines affections génétiques sont responsables de surcharges martiales localisées : ataxie de Friedreich par extension de triplets dans le gène de la frataxine, à transmission récessive ; anémies sidéroblastiques par mutations du gène de la δ aminolévulinate synthétase (ALAS2), du gène ABC7 (appartenant à la famille des protéines ABC liant l’ATP), toutes deux à transmission liée au chromosome X, et des gènes SLC25A38 et GLRX5 à transmission récessive ; syndrome hyperferritinémie/cataracte par mutation du gène L-ferritine (FTL) à transmission dominante.

Un vaste groupe, qualifié d’affections neurodégénératives, est caractérisé par une accumulation de fer dans le système nerveux central : une des ces entités pathologiques héréditaires est à transmission liée au sexe (gène WDR45 de la protéine en hélice bêta) ; une est à transmission dominante (gène FTL des neuroferritinopathies) ; les autres à transmission récessive : déficit en pantothénate kinase (gène PANK2), déficit en phospholipase 2 (PLA2G6), anomalie d’une protéine membranaire mitochondriale (gène C19orf12), déficit en acide gras hydroxylase (gène FA2H), déficit en coenzyme A synthase (gène COASY), syndrome de Kufor-Raked (gène ATP13A2) et syndrome de Woodhouse-Sakati ( (gène DCAF17). La plupart correspondent à des accumulations cytosoliques de fer sous forme de ferritine, mais certaines sont des anomalies du métabolisme mitochondrial avec accumulation du métal dans ces organites subcellulaires.

Enfin, la situation inverse plus récemment décrite est celle de l’anémie par mutation du gène SLC11A2 encodant le transporteur de fer divalent DMT1 et celle de l’anémie congénitale hypochrome sidéropénique (IRIDA pour « iron-refractory iron-deficiency anemia ») par mutation du gène TMPRSS6, codant la protéine transmembranaire sérine 6 ou matriptase-2 qui inhibe la voie activant l’hepcidine.

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En termes de santé publique, la quasi-totalité de ces entités pathologiques est rare et seule la mutation C282Y du gène HFE est fréquente dans les populations du Nord-Ouest de l’Europe ; la pénétrance de l’homozygotie C282Y est faible, sous la dépendance de nombreux variants des autres gènes du métabolisme martial et des conditions dites environnementales. Cette faible pénétrance et l’apparition tardive de la symptomatologie biologique puis clinique ont fait renoncer à son dépistage systématique à la naissance, mais le développement des nouvelles techniques rapides de séquençage de l’ADN et les nouvelles possibilités qu’elles offrent remet cette question en discussion.

Les anomalies du métabolisme du fer sont connues depuis la fin du 19ème siècle puisque l’hémochromatose d’abord décrite sous le terme de cirrhose bronzée par Trousseau, a ensuite été rattachée à une surcharge tissulaire martiale par Recklinghausen en 1889. La survenue tardive de la symptomatologie et sa relative non spécificité, expliquent qu’il ait fallu attendre les années 70 pour que soit démontré son caractère héréditaire et son mode de transmission génétique1, 2. Par contre elle a été l’une des premières maladies mendéliennes autosomiques dont le gène a bénéficié d’une assignation chromosomique (en 6p21), et ceci grâce a une très forte association avec l’antigène sérologique HLA-A3. L’identification de son gène (HFE1) en 19963, époque correspondant au développement exponentiel de la génétique moléculaire, a depuis conduit à un accroissement important du nombre des anomalies héréditaires du métabolisme du fer et à une complexification de leurs physiopathologies.

MÉTABOLISME GÉNÉRAL DU FER4

Ce métal est présent sous forme héminique dans l’hémoglobine, la myoglobine (85% du fer total) et les enzymes respiratoires comme les cytochromes mitochondriaux, les cytochromes P450, les catalases, les peroxydases…et sous forme de groupements [2Fe-2S] et [3Fe-4S] dans de nombreux systèmes enzymatiques comme des enzymes des complexes I et II de la chaîne respiratoire, des enzymes du cycle citrique telles que l’aconitase et la succinodeshydrogénase, la ferrochélatase, ou dans le cytoplasme comme les IRP et le noyau comme l’endo-nucléase III impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN par excision de bases.

En absence de voie spécifique d’élimination, ce métabolisme du fer repose sur un recyclage endogène du capital ferrique (environ 50 mg/kg chez l’homme et 40 mg/kg chez la femme) par le système réticulo-endo-thélial et une régulation étroite de la voie intestinale d’absorption, essentiellement duodénale. Il s’agit donc d’un métabolisme d’épargne, les pertes quotidiennes étant limitées à 1 à 2 mg par jour (desquamation cellu-laire, pertes de phanères, hémorragies physiologiques….), alors que 20 à 25 mg sont utilisés pendant cette période pour la biosynthèse principalement de l’hémoglobine des nouveaux globules rouges.

Le fer alimentaire se présente sous deux formes : le fer héminique, provenant essentiellement de la dégra-dation de l’hémoglobine et de la myoglobine, et le fer non-héminique, généralement sous formes de sels de fer ferreux (Fe++) . Le fer Fe++ est absorbé à la face apicale des cellules endothéliales intestinales par le trans-porteur DMT1 (Divalent Metal Transporter 1) codé par le gène SLC11A2 ; il est exporté à la membrane basale par un autre transporteur, la ferroportine (SLC40A1), associé à l’hephastine, ferroxydase membranaire, qui le transforme en Fe+++ avant sa prise en charge par la transferrine circulante, à raison de un ou deux atomes par molécule. La transcription de DMT1 est entre autre régulée par le facteur HIF2α (hypoxia inductible factor) qui coordonne ainsi la réponse à l’hypoxie et un déficit en fer. Les structures héminiques sont absorbées par une « heme carrier protein » (HCP), puis sans doute dégradées, libérant le fer qui rejoint la voie précédente. La régulation de cette absorption est assurée par la fixation sur la ferroportine de l’hepcidine, véritable hormone du métabolisme du fer, provoquant l’internalisation du complexe, son ubiquitination et sa dégradation par les lysosomes, entravant ainsi l’absorption martiale. La ferroportine est également présente à la membrane des hépatocytes et des macrophages, c’est-à-dire des systèmes de stockage et de recyclage du fer (provenant pour l’essentiel de la dégradation des hématies) et son fonctionnement est régulé de la même façon par l’hepcidine.

L’hepcidine (codée par le gène HAMP) est secrétée principalement par les hépatocytes et en petite quantité par les adipocytes et les macrophages; elle est synthétisée sous forme d’un prépropeptide de 84 acides aminés,

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ensuite maturé en un peptide final de 25 AA caractérisé par une forme compacte assurée par quatre ponts disulfures5. Cette molécule a d’abord été caractérisée comme un peptide antibactérien, appartenant au système de défense immunitaire innée, fortement exprimée sous l’influence de divers signaux inflammatoires en parti-culier l’interleukine 6 qui active sa transcription via la voie JAK/STAT3 et la voie BMP/ SMA, et entraînant en définitive une réduction du fer indispensable à la prolifération bactérienne. Elle a secondairement été reconnue comme la molécule régulatrice clef du métabolisme du fer.

Au niveau de la membrane hépatocytaire un complexe formé par HFE, les récepteurs de transferrine 1 et 2, l’hémojuvénile HJV, la sérine protéase matriptase 2 TMPRSS6 (régulateur négatif de l’hepcidine par clivage de l’hémojuvénile), et les récepteurs BMPR I et II (« Bone morphogenic protein receptor ») joue le rôle de « sensor » du capital martial de l’organisme par interaction avec la transferrine circulante et son degré de saturation, déclenchant ou réprimant la transcription du gène HAMP. Une non réponse de ce système (par mutation des gènes HFE, TFR2, HJV ou HAMP lui-même) se traduit par un déficit en hepcidine ayant pour conséquence une absence de régulation de la ferroportine et en définitive une augmentation de l’absorption intestinale du fer et de son « relarguage » par les macrophages.

Deux catégories de mutations peuvent affecter la ferroportine : les unes (type A) entraînent une perte d’activité de la protéine avec pour conséquence majeure une rétention du fer dans les macrophages ; les autres (type B) la rendent insensibles à l’hepcidine et donc également non régulée.

MÉTABOLISME INTRACELLULAIRE6

La plupart des cellules (au premier rang desquelles les précurseurs érythropoïetiques…) possèdent des récep-teurs membranaires de transferrine (Tfr1) sur lesquels se fixent les molécules d’holotransferrine , suivie de la formation d’une vésicule d’endocytose du complexe transferrine/Fe+++/récepteur. La baisse du pH de cette vésicule entraîne la libération du fer, ensuite réduit de Fe+++ en Fe++ par la métalloréductase STEAP3, puis transporté dans le cytosol par DMT1.

Le fer libéré contrôle la régulation de la traduction de la ferritine et du récepteur de la transferrine ; les ARN messagers de deux chaînes (H et L) de la ferritine possèdent chacun dans leur partie 5’ non traduite deux motifs IRE (« Iron Responsive Element »), c’est-à-dire des structures en boucle susceptible de fixer un des deux types de protéine régulatrice IRP1 et IRP2 (« Iron Regulatory RNA Binding Protein ») ; l’ARN messager du récepteur de la transferrine possède 5 motifs IRP localisés dans son extrémité 3’. Lorsque la concen-tration intra-cellulaire en fer est très faible, les protéines IRP se fixent sur les motifs IRE, ce qui a pour effet d’empêcher la traduction des ARN ferritine et de stabiliser l’ARN transferrine en permettant sa traduction; lorsque cette concentration intra-cellulaire augmente, le fer se fixe sur les IRP qui libèrent les messagers : ceux des chaînes de la ferritine sont traduits, ceux du récepteur de la transferrine sont déstabilisés et lysés. Ce système de régulation traductionnelle permet à la cellule de réagir très rapidement aux variations de concen-trations en fer. Les molécules de ferritine sont constituées de 24 chaînes H et L, en proportions variables suivant les tissus, et assemblées en une structure sphéroïde pouvant stocker à l’intérieur 4 500 atomes de fer. Ce fer stocké par la ferritine peut être relâché après dégradation par les lysosomes, ou conduire éventuellement à la formation de dépôts inorganisés d’hémosidérine.

Les mitochondries jouent un rôle déterminant dans le métabolisme du fer : après y avoir été transporté par les mitoferrines 1 ou 2, il est utilisé pour la biosynthèse des groupements Fer/soufre et des structures héminiques. Rappelons que la biosynthèse de l’hème débute dans les mitochondries par condensation de la glycine avec le succinyl-CoA en acide δ aminolévulinique (ALA) sous l’action de l’ALA synthase ; elle se poursuit par trois étapes cytoplasmiques, avant les réactions finales à nouveau mitochondriales, dont la dernière est l’incorpo-ration de fer ferreux dans la protoporphyrine IX catalysée par la ferrochélatase.

Les mitochondries ont la capacité de stocker le fer dans une forme particulière de ferritine (MtFT), codée par un gène sans intron, localisé en 5q23, adressé grâce à un peptide signal de 60 acides aminés. Ce peptide signal est ensuite clivé pour donner des chaînes de 22kDa s’associant en homopolymères sphériques.

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MÉTABOLISME DU SYSTÈME NERVEUX CENTRAL7

Le fer est impliqué dans de nombreux processus biologiques du cerveau : transport de l’oxygène, respiration mitochondriale, synthèse de l’ADN, biosynthèse des neurotransmetteurs…Mais les cellules du système nerveux central n’ont pas un accès direct aux nutriments en raison de la barrière hémato encéphalique.

Sur les cellules des capillaires cérébraux, des récepteurs de transferrine internalisent les complexes Fe/Tf/TFR, puis la ferroportine exporte ce fer dans le liquide interstitiel où il est repris en charge par une transferrine synthétisée par les oligodendrocytes. Les neurones et les cellules gliales captent par des récepteurs Tfr la transferrine présente dans le liquide interstitiel ou le LCR.

Par ailleurs les astrocytes synthétisent la céruloplasmine, ferroxydase liée aux membranes par un bras glycosyl phosphatidyl inositol (GPI). Céruloplasmine et hephastine sont deux ferroxydases apparentées mais exprimées dans des types cellulaires différents du cerveau. A l’intérieur des neurones, le métabolisme du fer est régulé également par les protéines IRP1 et IRP2, via les motifs IRE des ARN messagers du récepteur de transferrine et des chaînes H et L ferritine.

LES HÉMOCHROMATOSES GÉNÉTIQUES8, 9

Les hémochromatoses sont donc globalement dues à une dysrégulation de l’absorption intestinale du fer et de son relarguage par les macrophages, entraînant une lente et progressive accumulation du métal dans les tissus (foie, peau, glandes endocrines, cœur, articulation..) responsable de la symptomatologie clinique de ces maladies.

Tableau 1 : Principales anomalies du métabolisme du fer

SURCHARGE LOCUS GENE TRANSMISSION

Hemochromatose HFE1 6p21 HFE autosomique récessive

Hemochromatose HFE2A 1q21 HJV “ “

Hemochromatose HFE2B 19q13 HAMP “ “

Hemochromatose HFE3 7q22 TFR2 “ “

HFE4 2q32 SLC11A3 “ dominante

Atransferrinémie 3q21 TF autosomique récessive

Syndrome « Gracile » 2q33-37 BCS1L autosomique récessive

Ataxie de Friedreich 9q13 FRDA autosomique récessive

Anémie sidéroblastique Xq11-21 ALAS2 Liée à l’X

“ “ Xq13 ABCB7 “

“ “ 3p22.1 SLC25A38 autosomique récessive

“ “ 14q32.13 GLRX5 autosomique récessive

Anémie dysérythropoïétique

Type I 15p7 CDAN1 autosomique récessive

Type II 20p11 SEC23B autosomique récessive

Type III 15q23 KIF23 autosomique dominant

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HÉMOCHROMATOSE-HFE (TYPE 1)

L’hémochromatose HFE-1 est la forme la plus commune des surcharges en fer. Sa traduction biologique est l’augmentation de la sidérémie, du pourcentage de saturation de la transferrine, de la ferritinémie et de la concentration tissulaire hépatique en fer (à prédominance hépatocytaire et péricentrolobulaire). Avant que ne soit recommandé un traitement précoce par saignées, la conséquence de cette absorption martiale exagérée était le développement d’une symptomatologie variée, habituellement vers 35-45 ans chez l’homme, plus tardi-vement chez la femme pour des raisons physiologiques. Le résultat du traitement dépendait étroitement de la précocité du diagnostic : au stade d’hémochromatose cliniquement exprimée, seule la cardiomyopathie était régressive alors que la plupart des autres atteintes tissulaires (cirrhose, diabète, arthropathies, endocrinopa-thies) ne l’étaient pas. Ainsi s’est rapidement justifiée l’idée d’un traitement précoce, quasiment préventif, avant l’apparition des signes cliniques, reposant sur le diagnostic biologique de la maladie, avec au premier rang la saturation de la transferrine et depuis 1996 le diagnostic moléculaire. Une telle stratégie a quasiment fait disparaître le tableau classique de la maladie.

Le gène HFE-1, cloné en 19963, est localisé à environ 4,5 mégabases télomériques à HLA-A. D’une longueur de 12 kB, formé de 7 exons, il code pour une protéine présentant une très forte homologie avec les molécules de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité ; il s’agit en effet d’une glycoprotéine de 343 acides aminés comportant un domaine transmembranaire, une extrémité carboxyterminale intracytoplasmique et trois domaines extra cellulaires α1, α2 et α3 ; le domaine α3 « immunoglobuline like » se lie à la β2 microglo-buline. L’intégrité structurale de cette protéine est indispensable au bon fonctionnement du complexe « sensor » et à la transmission du signal régulant la transcription de l’hepcidine, mais son rôle exact est encore mal compris.

L’hémochromatose HFE-1 est le résultat de l’homozygotie pour la mutation p.Cys282Tyr (C282Y). Cette mutation entraîne la disparition du pont disulfure configurant le domaine α3 et empêche son association à la β2 microglobuline. Elle présente un gradient de fréquence Nord-Ouest/Sud-Est dans la population européenne, les fréquences les plus élevées d’hétérozygotes s’observant en Irlande et en Bretagne (10 à 15%). Elle est par contre absente dans les populations africaines ou asiatiques. Elle est probablement apparue chez un ancêtre celte ou viking de façon récente (une centaine de générations) ; sa diffusion rapide à partir du nord de l’Europe ne peut que résulter d’un avantage sélectif important comme une plus grande résistance aux nombreuses pandémies qui ont ravagé le continent au moyen-âge.

D’autres polymorphismes comme H63D ou S65C à l’état homozygote ou hétérozygote composite avec C282Y ont été évoqués dans le déterminisme de l’hémochromatose. En fait il est maintenant bien admis que ces génotypes ne sont pas suffisant à eux seuls pour déterminer une surcharge martiale primitive, en l’absence de facteurs favorisants comme l’alcoolisme ou le syndrome dit métabolique. Plus récemment une délétion ponctuelle (Y231del) à été décrite dans une famille japonaise atteinte d’hémochromatose. Dans le nord de l’Europe, 5 à 6 sujets sur mille sont donc C282Y homozygotes. Sur la base de ce génotype l’hémochromatose HFE-1 apparaissait donc comme la plus fréquente des maladies héréditaires et ses carac-téristiques, en particulier l’existence d’un traitement simple, efficace et peu couteux (les saignées) était susceptible de justifier un dépistage systématique. Cette idée, qui justifierait aujourd’hui d’être réexaminée au vu des développements technologiques majeurs en matière de séquençage du génome, avait été très rapidement abandonnée pour différentes raisons, en particulier celle de la faible pénétrance de l’ homozygotie C282Y. Les données en faveur de cette faible expressivité se sont en effet très rapidement accumulées : disproportion à Jersey entre le petit nombre de cas d’hémochromatose inscrit au registre consacré à cette maladie et la fréquence élevée de la mutation dans cette population ; fréquence d’homozygotes aussi élevée chez les personnes âgées se présentant aux urgences de l’hôpital de Norwitch (UK) pour divers motifs, que dans la population générale ; ces observations, rapidement suivies d’études de population en Bretagne, Australie, Canada, Nouvelle Zélande et Angleterre, aboutissent toutes à des conclusions semblables : l’expression clinique est peu fréquente, certains auteurs l’évaluant même à 1% chez la femme et à moins de 20% chez l’homme. Quant à l’expression biolo-

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gique, indication du traitement préventif, elle est évaluée entre 40 et 50%, plus élevée chez les hommes que chez les femmes, en partie protégées par les pertes menstruelles, les grossesses et les lactations. En outre il a été montré que la testostérone diminuait la transcription du gène HAMP et avait donc un effet stimulant sur l’absorption du fer.

Les facteurs déterminants de l’expressivité clinique de l’homozygotie C282Y sont à la fois acquis (alcool, nutrition, pathologies hépatiques…) et génétiques. Les variants polymorphiques des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme martial (BMP2,4,6, BMPR I et II, HFE, FPN, Tf, Tfr1, Tfr2, TMPRSS6, SMAD1,4,5), c’est-à-dire ceux du complexe « senseur » membranaire, ceux assurant la transmission intra-cytoplasmique du signal et ceux contrôlant la transcription de l’hepcidine, associés sous forme de différentes combinaisons génétiques, jouent sans aucun doute un rôle déterminant dans cette pénétrance ….Les études GWAS « Genome Wide Association Studies » ont identifié également, et de façon plus surprenante, des variants de gènes n’ayant a priori pas de lien connu avec le métabolisme du fer comme GNPAT (glycéronephosphate o-acyl-transférase), PNPLA3 (patatin-like phospholipase domain containing-3) ou PCSK7 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 7). L’inventaire de ces facteurs génétiques contrôlant la pénétrance du gène HFE et de leurs rôles respectifs est encore loin d’être terminé.

HÉMOCHROMATOSE JUVENILE

Caractérisée depuis 1951 par la rapidité d’apparition et la sévérité de son phénotype avec au premier plan cardiomyopathie et hypogonadisme hypogonadotrope, cette entité clinique englobe en fait deux affections génétiques différentes à transmission autosomique récessive : le type 2A dû à des mutations du gène de l’hémojuvéline (HJV) localisé sur le chromosome 1, et le type 2B correspondant à des mutations du gène de l’hepcidine (HAMP) lui-même localisé sur le chromosome 19. Le concept d’hémochromatose juvénile a ensuite été étendu au tableau clinique présenté par quelques patients caractérisés par des mutations combinées des gènes HFE et TFR2.

HÉMOCHROMATOSE TYPE 3

L’hémochromatose type 3 est également une maladie à transmission autosomique récessive, identifiée dans des familles avec un haut degré de consanguinité et appartenant à différentes ethnies y compris des popula-tions asiatiques. Le tableau clinique est semblable à celui de l’hémochromatose classique mais avec un âge d’apparition un peu plus jeune et une sévérité un peu accrue. Le gène en cause est celui du deuxième récepteur de la transferrine (TFR2) localisé en 7q22 ; la protéine est transmembranaire avec un domaine extra-cytoplas-mique homologue à celui du premier récepteur de la transferrine.

HÉMOCHROMATOSE TYPE 4 (« FERROPORTIN DISEASE »)

L’hémochromatose type 4 est provoquée par des anomalies du gène d’un transporteur transmembranaire du fer (SLC40A1) encodant la ferroportine et localisé en q32 sur le chromosome 2. Ce gène, d’abord identifié chez le poisson Zebrafish comme responsable d’une variété d’anémie génétique, code une protéine transmembra-naire exprimée fortement dans le syncytiotrophoblaste puis le placenta, les macrophages et les entérocytes où elle a une localisation baso-latérale. L’affection rare, mais néanmoins plus fréquente que les hémochromatoses types 2 ou 3, présente la particularité d’être à transmission autosomique dominante. Identifiée dans un premier temps dans une famille hollandaise, elle a ensuite été rapidement décrite dans d’autres pays et continents. Sur le plan physiopathologique, la ferroportine est la seule protéine connue pour exporter le fer hors du milieu cellulaire. Elle est le point d’impact de l’hepcidine, messager hormonal signalant un taux de fer suffisant, provoquant sa dégradation. Les anomalies génétiques sont responsables de deux formes différentes :• Le type A où les mutations entraînent une diminution ou une perte de la fonction d’export, avec accumu-

lation du fer dans les macrophages, la rate, les cellules « Kupffériennes » du foie ; ce type est caractérisé par une ferritinémie élevée contrastant avec une saturation de la transferrine normale ou basse, expliquant sans

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doute une moindre tolérance aux saignées. Son expressivité clinique est faible, habituellement limitée à une atteinte hépatique.

• Le type B est plus rare ; les mutations du gène rendent la ferroportine insensible à l’action de l’hepcidine et son absence de contrôle est responsable d’un efflux extracellulaire et donc d’une absorption intestinale augmentée du fer. De ce fait la symptomatologie est semblable à celle des hémochromatoses 1 et 3.

SYNDROME « GRACILE »10

Il s’agit d’une affection autosomale récessive diagnostiquée dans des familles en majorité finlandaises. L’essentiel du tableau clinique est regroupé sous le terme de « Gracile », acronyme de « Growth Retardation, Amino-aciduria type Fanconi, Cholestasis, Iron overload, Lactacidosis and Early death » . Ce tableau s’accom-pagne sur le plan biologique d’une hypersidérémie avec augmentation du pourcentage de saturation de la transferrine et d’une surcharge martiale hépatique. Le gène responsable de ce syndrome est BCS1L (2q32-34) ; il encode une ATPase de la membrane interne des mitochondries, protéine chaperonne nécessaire au bon assemblage du complexe III de la chaîne respiratoire. Une mutation unique (S78G) à l’état homozygote est retrouvée chez l’ensemble des malades finlandais. D’autres mutations du gène BCS1L ont ensuite été impli-quées dans des tableaux de déficit de la chaîne respiratoire et dans le syndrome de Björnstad (caractérisé par une atteinte auditive et une implantation pileuse anormale).

Les relations entre BCS1L et métabolisme du fer sont à ce jour incomplètement connues.

ATRANSFERRINÉMIE HÉRÉDITAIRE (HAT)

Très rare, ce syndrome correspond à des mutations du gène de la transferrine localisé sur le chromosome 3. En l’absence de transferrine fonctionnelle, le fer est difficilement utilisable pour l’érythropoïèse avec au premier plan une anémie hypochrome microcytaire sévère, nécessitant des transfusions de plasma ou de transferrine purifiée. Par ailleurs une surcharge martiale touchant en particulier le foie, le pancréas, les reins, le myocarde et la glande thyroïde se constitue progressivement en raison des concentrations élevées en fer circulant non lié à la transferrine (FNTL ou non-transferrin bound iron NTBI).

SYNDROMES DE NEURODÉGÉNÉRATION AVEC SURCHARGES CÉRÉBRALES EN FER (« NEURODEGENERATION WITH BRAIN IRON ACCUMULATION » OU « NBIA »)11, 12

Les progrès technologiques et méthodologiques récents en génétique moléculaire ont conduit à l’identifi-cation de nombreux gènes responsables de maladies mendéliennes rares, dont un groupe de dix phénotypes regroupés sous le terme NBIA (Tableau 2). Huit de ces syndromes sont à transmission autosomale récessive, un à transmission dominante et un à transmission liée à l’X. Ces processus neuro-dégénératifs sont globa-lement caractérisés par une symptomatologie de mouvements anormaux d’origine extra pyramidale et le dépôt anormal de fer dans le cerveau, principalement les ganglions basaux dont le globus pallidus. La prévalence de ces syndromes est extrêmement faible (moins d’un cas pour un million), mais quatre d’entre eux sont néanmoins prédominants : les déficits en pantothénate kinase (PKAN) et en phospholipase 2 (PLAN), les anomalies de protéine membranaire mitochondriale (MPAN) et de la protéine « beta propeller » (BPAN). L’intérêt de ces syndromes est bien entendu essentiellement fondamental, celui de faire progresser nos connaissances sur le métabolisme cérébral.

Le syndrome neurodégénératif PKAN a d’abord été rapporté dans la littérature médicale sous le terme de maladie de « Hallervorden-Spatz », ensuite abandonné car il s’agissait des patronymes de deux neuropatholo-gistes allemands compromis avec le régime nazi. Il est dû au déficit d’activité de la pantothénate kinase 2 (gène PANK2) qui catalyse la première des cinq étapes de la biosynthèse du Coenzyme A, le phospho- pantothénate obtenu se condensant ensuite avec la cystéine. La physiopathologie exacte reste inconnue : il a été suggéré que le déficit d’activité de la pantothénate kinase était responsable d’une accumulation de cystéine chélatant le fer et provoquant son accumulation dans les mitochondries.

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Le syndrome neurodégénératif associé au déficit de la phospholipase A2 (PLAN) est dû à des mutations du gène PLA2G6 qui joue un rôle fondamental dans la synthèse des acides gras et des lysophospholipides et de ce fait dans le métabolisme des phospholipides membranaires, dans les phénomènes de transduction du signal, de prolifération cellulaire et d’apoptose.

Le syndrome neuro-dégénératif associé à une protéine membranaire mitochondriale (MPNA) est dû à des mutations du gène c19orf12 (localisé en 19q12). La fonction de la protéine est inconnue mais sa localisation dans la membrane mitochondriale suggère un rôle dans le métabolisme énergétique et celui des acides gras.

Le syndrome neuro-dégénératif associé à la protéine « beta propeller » (BPAN), est provoqué par des mutations du gène WDR45 localisé sur le chromosome X et encodant une protéine jouant probablement un rôle critique dans les processus d’autophagie.

La neuroferritinopathie a été décrite en 2001 chez des patients du Nord de l’Angleterre13. Tous les malades étaient hétérozygotes pour l’insertion d’une adénine en position 460 (460insA) dans le gène de la L ferritine et entraînant un décalage du cadre de lecture dans la partie C terminale de la chaîne ; quelques autres mutations « privées » ont été ensuite décrites dans d’autres régions du monde.

SYNDRÔME LOCUS GENE TRANSMISSION

Déficit en pantothénateKinase 2 (PANK2) 20q13 PANK2 autosomique récessive

S. associé au déficit enPhospholipase A2(PLAN) 22q12 PLA2G6 autosomique récessive

S. associé à une protéineMembranaire mitochondriale

(MPAN) 19q12 C19orf12 autosomique récessive

S. associé à la proteineΒ propeller (BPAN) X WDR45 liée à l’X (dominant)

S. associé au déficit en acidegras hydroxylase (FAHN) 16q23 FA2H autosomique récessive

S. associé à la Coenzyme Asynthase (CoPAN) 17q21.2 COASY autosomique récessive

S. Kufor-Rakeb 1q36 ATP13A2 autosomique récessive

S. Woodhouse-Sakati 2q31.1 DCAF17 autosomique récessive

Neuroferritinopathy 19q13 FTL autosomique dominant

Aceruleoplasmie 3q23 CP autosomique récessif

Tableau 2 : Syndrômes neurodégénératifs avec surcharge en fer

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Jean-Yves Le Gall — Contrôle génétique du métabolisme du fer

L’acéruloplasminémie, à transmission autosomale récessive, est surtout observée dans la population japonaise. Diverses mutations du gène CP (3q21-24) ont été décrites : elles font disparaître son activité oxydase (poten-tiellement en empêchant l’association de la chaîne polypeptidique avec les atomes de cuivre) entraînant pour l’essentiel un défaut de recyclage du fer provenant principalement du catabolisme de l’hémoglobine, ainsi qu’un défaut de l’absorption intestinale par absence d’oxydation du fer Fe++ en Fe+++. Le tableau clinique est riche, la surcharge martiale est généralisée : aux signes neurologiques se rajoutent anémie hypochrome, rétinopatopathie, diabète et, sur le plan biologique, hyposidérémie, anémie et hyperferritinémie.

Le syndrome neurodégénératif associé au déficit en acide gras hydroxylase (FAHN) est dû à des mutations du gène FA2H dont le produit est responsable de l’hydroxylation des acides gras à longue chaîne ; ce système enzymatique joue ainsi un rôle fondamental dans la synthèse de la myéline du système nerveux central et possiblement dans la régulation du cycle cellulaire. D’autres mutations de ce gène sont responsables de leuco-dystrophies et de certaines formes de paraplégies spastiques héréditaires (HSP35) .

ATAXIE DE FRIEDREICH14

L’ataxie de Friedreich est une maladie à transmission autosomique récessive. Le gène localisé en 9q13 appar-tient donc à l’ADN nucléaire, mais code pour une protéine mitochondriale, la frataxine. Dans l’immense majorité des cas, l’anomalie est une expansion du triplet GAA dans l’intron 1, responsable d’une réduction de la transcription du gène. La diminution globale d’activité de la frataxine entraîne une accumulation de fer dans les mitochondries ; l’atteinte des cellules les plus sensibles explique la symptomatologie spino-cérébelleuse et la cardiomyopathie. La compréhension du rôle de la frataxine a été facilitée par le modèle de la levure Saccharomyces Cerevisiae. L’orthologue du gène de la frataxine est YFH1, dont les mutants déficitaires sont également caractérisés par une accumulation martiale dans les mitochondries. La frataxine est considérée aujourd’hui comme une protéine mitochondriale du métabolisme du fer impliquée dans la biosynthèse des noyaux Fer/soufre, et de l’hème par interaction avec la ferrochélatase .

ANÉMIES CONGÉNITALES MICROCYTAIRES

Deux anémies hypochromes héréditaires rares sont connues en pathologie humaine15, 16:• par mutation de DMT1 (N-RAMP2/SLC11A2) (chromosome 12), transporteur de métal divalent (Fe++),

localisé au pôle apical des membranes de l’entérocyte, il est indispensable à l’absorption du fer ; localisé également à la membrane des endosomes, il est indispensable au recyclage du fer. Cette double localisation explique le tableau clinique paradoxal associant une anémie ferriprive sévère et une surcharge martiale tissulaire, en particulier hépatique. Préalablement à cette description, des modéles animaux étaient connus et étudiés : les souris « mk/mk » et les rats Belgrade.

• par mutation de TMPRSS6 (chromosome 22q12-13), encodant la matriptase-2, protéase de la membrane hépatocytaire et appartenant au complexe « senseur » de régulation d’expression de l’hepcidine. Son rôle biologique est de lyser une protéine de ce complexe, l’hémojuvénile, et d’être ainsi un régulateur négatif de l’hepcidine. Le tableau, qualifiée de IRIDA (« Iron Refractory Iron Deficiency Anemia »), associe une anémie hypochrome hyposidérémique sévère résistante au traitement oral, avec des taux circulants élevés d’hepcidine.

ANOMALIES DE L’ÉRYTHROPOIÈSE17

Il s’agit de différentes formes d’anomalies congénitales de la biosynthèse de l’hème caractérisées par une érythropoïèse inefficace, une surcharge secondaire en fer en particulier dans les mitochondries, aggravées éventuellement par les transfusions et une régulation négative de l’hepcidine.

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Jean-Yves Le Gall — Contrôle génétique du métabolisme du fer

Un premier groupe est celui des anémies congénitales sidéroblastiques. Deux d’entre elles sont à transmission liées à l’X : la forme sans ataxie due à des mutations de la δ aminolévulinate synthétase (ALAS2)(Xq11-21) premier enzyme et enzyme clef de la voie de biosynthèse des porphyrines et de l’hème (un certain nombre de patients répondent à des doses pharmacologiques de pyrodoxine, co-facteur de l’ALAS2) ; la forme avec ataxie correspond à des anomalies de ABCB7, appartenant à la grande famille des protéines ABC, liant l’ATP et dont le gène est localisé en Xq13.1-13.3. Le lien entre ABCB7, métabolisme du fer et biosynthèse de l’hème, est son implication dans le transport des groupements « fer-soufre » depuis leur site de biosynthèse dans la mitochondrie vers le cytoplasme, et dans la régulation de l’expression de la ferrochélatase, également protéine à « cluster fer-soufre ».

Deux autres types d’anémie congénitales sidéroblastiques sont à transmission autosomale récessive : l’une par déficit en SLC25A38 codant pour une protéine mitochondriale transporteur du glycocolle indispensable à la première étape de la biosynthèse des porphyrines et de l’hème ; l’autre par déficit en glutaredoxine 5 (gène GLRX5) impliqué dans la biosynthèse des protéines à groupements Fer/Soufre.

Un deuxième groupe est celui des anémies congénitales dysérythropoïétiques. Le type I correspond à des mutations du gène CDAN1 dont la protéine (codanine1) joue un rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine ; le type II est dû à des anomalies du gène SEC23B encodant une protéine des vésicules de transport entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi ; le type III, qui présente la particularité d’être à transmission autosomique dominante, est provoqué par des mutations du gène KIF23 encodant une protéine (MKLP1 « Mitotic Kinesin-Like Protein 1 ») jouant un rôle crucial dans la cytophérèse.

Enfin le troisième est celui des thalassémies α et β : la surcharge martiale est une complication importante dans les formes de sévérité majeure.

SYNDROME HYPERFERRITINÉMIE-CATARACTE18

Le rare syndrome hyperferritinémie-cataracte, à transmission dominante, est caractérisé par l’apparition précoce d’une cataracte bilatérale associée à une hyperferritinémie isolée, sans anomalie du fer sérique et de la transferrine, et sans surcharge tissulaire. Il est provoqué par des mutations (une quarantaine décrites) dans le motif IRE localisé dans la région 5’ non traduite du messager de la L-ferritine. Ces mutations ont pour conséquence de réduire l’affinité de ce messager pour les protéines IRP, entraînant sa non régulation par le taux intracellulaire du fer et sa traduction exagérée. La cataracte est due au dépôt de ferritine sous forme de cristaux dans le cristallin.

CONCLUSION

Les mutations géniques rapportées précédemment sont dans l’ensemble rares, voire très rares. Une seule d’entre elles, la mutation C282Y du gène HFE, est fréquente tout au moins dans les populations originaires du Nord-Ouest de l’Europe. La pénétrance de l’homozygotie C282Y est faible, modulée par les conditions « environnementales » et le polymorphisme des nombreux gènes impliqués directement ou indirectement dans le métabolisme du fer ; l’inventaire de ces variants génétiques est encore aujourd’hui incomplet. Lors du clonage du gène HFE, la fréquence élevée de C282Y avait semblé justifier dans un premier temps l’instauration d’un dépistage systématique, idée rapidement abandonnée en raison de sa faible pénétrance. L’identification de l’ensemble des variants géniques contrôlant cette pénétrance et le développement exponentiel des nouvelles techniques de séquençage du génome humain sont susceptibles de remettre cette question à l’ordre du jour. Le nombre croissant d’affections neuro-dégénératives caractérisées comme maladies génétiques martiales, démontre, au-delà de ses particularités, l’importance du métabolisme du fer dans le système nerveux central. Cette importance est également soulignée par le constat de dépôts de fer, sous forme de ferritine et de neuro-mélanine, dans différentes régions du cerveau, au cours des maladies neuro-dégénératives communes, sans qu’il soit encore possible de préciser s’il s’agit de phénomènes primitifs ou secondaires.

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Jean-Yves Le Gall — Contrôle génétique du métabolisme du fer

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Genetic control of iron metabolismJean-Yves Le Gall, Paris

Les coLLoques de L’InstItut servIer

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

Notes are linked to the references page.

ABSTRACT

The number of hereditary iron-related diseases and our understanding of how iron is metabolised in the body have both considerably expanded over the last 25 years, especially since the discovery of hepcidin, a genuine endocrine regulator of iron metabolism. The clinical picture of haemochromatosis corresponds to five genetic entities: classic haemochromatosis HFE due to homozygosity for the C282Y mutation; two other ‘late-onset’ forms due to mutation of the gene encoding the second transferrin receptor (TfR2) or the SLC40A1 mutation in the gene that codes for ferroportin; and two so-called juvenile forms due to abnormalities in the genes for hepcidin (HAMP) or haemojuvelin (HJV). These are autosomal recessive disorders apart from the ferroportin abnormalities.

Other forms of generalised iron overload are rare: atransferrinaemia, aceruloplasminaemia due to mutation of the CP gene, GRACILE syndrome due to mutation of the BCS1L gene (that encodes a chaperone protein in the mitochondrial membrane). These overload disorders are transmitted as recessive Mendelian traits.

Some genetic changes cause localised iron overload: Friedreich ataxia results from replication of triplets in the frataxin gene, a recessive trait; sideroblastic forms of anaemia due to mutation of the gene for δ aminole-vulinate synthetase (ALAS2), of the ABC7 gene (which belongs to the family of ATP-binding ABC proteins), both X-linked conditions, and the SLC25A38 and GLRX5 genes (recessive traits); hyperferritinaemia/cataract due to mutation of the L-ferritin (FTL) gene (dominant transmission).

A very broad group of neurodegenerative conditions is characterised by iron build-up in the central nervous system: transmission of one of these hereditary diseases is gender-linked (WDR45 gene for the beta helix protein); one is a dominant trait (FTL gene for neuroferritinopathy); others are recessive: pantothenate kinase deficiency (PANK2 gene), phospholipase 2 deficiency (PLA2G6), abnormality in a protein in the mitochondrial membrane (C19orf12 gene), fatty acid hydroxylase deficiency (FA2H gene), coenzyme A synthase deficiency (COASY gene), Kufor–Raked syndrome (ATP13A2 gene) and Woodhouse–Sakati syndrome (DCAF17 gene). Most involve build-up of iron in the form of ferritin in the cytosol but some are problems with mitochondrial metabolism leading to accumulation in subcellular organelles.

Finally, the inverse situation reported more recently is that of anaemia resulting from mutation in the SLC11A2 gene which codes for the divalent iron transporter (divalent metal transporter 1; DMT1) and that of iron-re-fractory iron-deficiency anaemia (IRIDA) resulting from mutation of the TMPRSS6 gene that encodes the serine 6 transmembrane protein or matriptase-2, which inactivates the hepcidin activation pathway.

In terms of public health, almost all of these diseases are rare with only the C282Y mutation in the HFE gene being common (at least in people originating in north-western Europe): penetrance of the homozygous C282Y

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

is weak and depends on variants at many other loci associated with iron metabolism as well as so-called environmental factors. The weak penetrance coupled with the late onset of signs (changes in test parameters and later symptoms) led to the abandonment of mass screening at birth, although the new possibilities opened up by the development of high-throughput DNA sequencing mean that perhaps this issue could be reviewed.

Problems with iron metabolism have been recognised since the end of the 19th century when haemochromatosis was first described reported by Trousseau. This was then related to iron overload in tissues by Recklinghausen in 1889. The late onset of symptoms coupled with its relative lack of specificity explain why it was not until the 1970s that it was shown to be genetic and its method of transmission was elucidated.1,2 On the other hand, it was one of the first Mendelian disorders whose gene was assigned a chromosomal locus (6p21); this was caused by strong linkage to the HLA-A3 serological antigen. The gene itself (HFE1) was identified in 1996,3 a time at which the field of molecular genetics was expanding exponentially. This has since led to the identifi-cation of many more hereditary disorders related to iron metabolism and recognition of the complexity of all the different pathogenic processes involved.

GENERAL IRON METABOLISM

Iron is found in haem form in haemoglobin, myoglobin (85% of all the iron in the body) and respiratory enzymes like the mitochondrial cytochromes, cytochrome P450, catalases and peroxidases.4 It is also found as [2Fe-2S] and [3Fe-4S] groups in many enzyme systems, including complex I and II enzymes in the respi-ration chain, citric cycle enzymes such as aconitase and succinate dehydrogenase, ferrochelatase, cytoplasmic enzymes such as the iron regulatory RNA binding proteins (IRPs) and nuclear enzymes such as endonuclease III (which is responsible for removing bases in DNA repair).

In the absence of any specific clearance pathway, iron metabolism depends on recycling the body’s endogenous stock (about 50 mg/kg in men and 40 mg/kg in women) via the reticulo-endothelial system coupled with tight regulation of intestinal—essentially duodenal—absorption. Its metabolism is therefore conservative with only 1–2 mg lost each day (through the shedding of cells, hair, nails, physiological bleeding, etc.), a time frame in which 20–25 mg are required, mainly for the synthesis of haemoglobin for new red blood cells.

Dietary iron comes in two forms, namely haem iron from the breakdown of haemoglobin and myoglobin, and non-haem iron, mostly in the form of ferrous (Fe2+) ions. Ferrous ions are absorbed on the apical side of endothelial cells in the gut via DMT1, which is encoded by the SLC11A2 gene. It is carried to the basement membrane on another protein, ferroportin (SLCA40A1) associated with hephastin, a membrane-bound ferroxidase that converts it to Fe3+ which then binds to transferrin in the circulation (one or two ions per protein molecule). One of the regulators of the transcription of DMT1 is hypoxia-inducible factor (HIF2α), which coordinates the response to both hypoxia and iron deficiency. Haem is assimilated via haem carrier protein (HCP) and then broken down to release iron that then goes into the above pathway. Iron absorption is regulated by the binding to ferroportin of hepcidin, which acts like a hormone in iron metabolism to stimulate internalisation of the complex, its ubiquitination and its breakdown in lysosomes. Ferroportin is also found on the membrane of liver cells and macrophages, i.e. storage and recycling systems for iron (mainly coming from red cell breakdown) where its activity is similarly controlled by hepcidin.

Most hepcidin (encoded by the HAMP gene) is secreted by liver cells although both adipose cells and macro-phages produce some. It is synthesised as an 84 amino acid (AA) prepropeptide before final maturation to a 25 AA peptide with a compact conformation due to four disulphide bridges.5 This was first characterised as an antimicrobial peptide associated with the innate defence system and expressed in response to various inflam-matory signals, in particular interleukin 6 which stimulates its transcription via the JAK/STAT3 and BMP/SMA pathways. Initially its effects on iron levels were believed to be incidental; it was later recognised that it is a key regulator of iron metabolism.

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

At the liver cell membrane, a complex formed by HFE, transferrin receptors 1 and 2, haemojuvelin (HJV), the serine protease matriptase 2 TMPRSS6 (a hepcidin inhibitor via the cleavage of haemojuvelin), and bone morphogenic protein receptors (BMPRs), ‘senses’ the amount of iron in the body by assessing the extent of loading on circulating transferrin. This leads to either the stimulation or downregulation of HAMP trans-cription. If this system is non-functional (due to mutation of the genes for HFE, TFR2, HJV or HAMP), hepcidin is deficient, ferroportin goes unregulated and iron is excessively absorbed in the gut and released by macrophages.

Ferroportin can be compromised by two types of mutation: type A mutations result in loss of activity and iron retention in macrophages; type B mutations make it non-responsive to hepcidin.

INTRACELLULAR METABOLISM

Most cells (notably erythropoietic precursors) carry membrane-bound transferrin receptors (Tfr1) which can bind holotransferrin.6 Binding stimulates formation of an endocytic vesicle containing the receptor/Fe3+/trans-ferrin complex. A drop in pH inside this vesicle results in release of the Fe3+ ion which is reduced to Fe2+ by metalloreductase STEAP3 and then shunted into the cytosol on DMT1.

Released iron regulates the translation of ferritin and the transferrin receptor. The untranslated 5’ ends of the messenger RNA molecules for both chains (H and L) of ferritin contain iron responsive elements (IREs), i.e. looped structures that can bind one of two types of regulatory protein, namely IRP1 or IRP2. The transferrin messenger RNA contains five IRP sequences at its 3’ end. When the intracellular iron concentration is very low, IRPs bind to these IREs to block the translation of ferritin RNA and stabilise transferrin RNA, thereby allowing its translation. When the intracellular iron concentration rises, iron binds to the IRPs to release the messenger RNA molecules; those of ferritin are translated whereas those of transferrin are destabilised and destroyed. This post-transcriptional regulatory system lets the cell react quickly to changing iron concen-tration. Ferritin consists of 24 H and L chains in variable proportions depending on the tissue. These assemble to form a spheroid structure that can hold 4500 iron ions, which are released after breakdown of the ferritin in a lysosome—or which form unorganised haemosiderin deposits.

Mitochondria play a central role in iron metabolism. After transportation on mitoferrin 1 or 2, it is used to make iron–sulphur groups and haem. Haem synthesis begins in mitochondria by the condensation of glycine with succinyl-CoA to form δ aminolevulinic acid (ALA) catalysed by ALA synthase. This is followed by three cytoplasmic steps before return to the mitochondria for the final reactions, the last being the incorporation of a ferrous ion into protoporphyrin IX, which is catalysed by ferrochelatase.Iron can be stored in mitochondria in a special form of ferritin (MtFT), which is encoded by a gene without any introns at chromosomal locus 5q23. The transcript contains a 60 AA signal peptide which is subsequently cleaved to yield 22 kDa chains that come together to form spherical homopolymers.

IRON METABOLISM IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

Iron is involved in many physiological processes in the brain, including oxygen transport, mitochondrial respi-ration, DNA synthesis and neurotransmitter synthesis.7 However, cells in the central nervous system do not have direct access to nutrients because of the blood–brain barrier.

Transferrin receptors on cells of the cerebral capillaries internalise Fe/Tf/TFR, complexes and the ferroportin exports the iron into the interstitial fluid where it is bound by transferrin made by oligodendrocytes. Trans-ferrin in interstitial fluid or cerebrospinal fluid (CSF) is captured by Tfr receptors on neurones and glial cells.

In addition, astrocytes synthesise ceruloplasmin, a ferroxidase bound to the membrane through a glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) arm. Ceruloplasmin and hephastin are two related ferroxidase enzymes expressed in different cell types in the brain.

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

In neurones, iron metabolism is also regulated by IRP1 and IRP2 through IRE sequences on the messenger RNA molecules for transferrin receptor and ferritin H and L chains.

HEREDITARY HAEMOCHROMATOSIS

Haemochromatosis is caused by dysregulation of iron absorption in the gut and its release by macrophages, leading to slow, progressive build-up of the metal in the tissues (liver, skin, endocrine glands, heart, joints, etc.) and clinical symptoms.8,9

Table 1: Major iron metabolism abnormalities

OVERLOAD LOCUS GENE TRANSMISSION

Haemochromatosis HFE1 6p21 HFE Autosomal recessive

Haemochromatosis HFE2A 1q21 HJV “ “

Haemochromatosis HFE2B 19q13 HAMP “ “

Haemochromatosis HFE3 7q22 TFR2 “ “

Haemochromatosis HFE4 2q32 SLC11A3 Autosomal dominant

Atransferrinaemia 3q21 TF autosomique récessive

GRACILE syndrome 2q33-37 BCS1L autosomique récessive

Friedreich ataxia 9q13 FRDA autosomique récessive

Sideroblastic anaemia Xq11-21 ALAS2 X-linked

Sideroblastic anaemia Xq13 ABCB7 “

Sideroblastic anaemia 3p22.1 SLC25A38 Autosomal recessive

Sideroblastic anaemia 14q32.13 GLRX5 Autosomal recessive

Dyserythropoietic anaemia

Type I 15p7 CDAN1 Autosomal recessive

Type II 20p11 SEC23B Autosomal recessive

Type III 15q23 KIF23 Autosomal dominant

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

HAEMOCHROMATOSIS-HFE (TYPE 1)

Haemochromatosis HFE1 is the most common form of iron overload. It results in increases in iron concen-tration, transferrin saturation and ferritin in the blood, and high iron concentration in liver tissue (especially hepatocytes and around the central lobule). Before therapeutic bloodletting was developed, the consequence of excessive iron absorption resulted in a range of symptoms, usually with an onset at 35–45 years of age in men but later in women (for physiological reasons). Treatment outcome was closely related to the timeliness of diagnosis: by the stage of clinical haemochromatosis, only the cardiomyopathy could be cured, not the damage to other tissues (cirrhosis, diabetes, joint and endocrine involvement). Thus, the idea of early treatment soon emerged—quasi-preventive before the onset of any symptoms—on the basis of laboratory diagnosis of the disease, especially transferrin saturation and, since 1996, molecular diagnosis. This approach virtually got rid of the classic picture of this disease.

The HFE1 gene, cloned in 1996,3 is located about 4.5 megabases telomeric to HLA-A. Spanning 12 kB and containing 7 exons, it encodes a protein with strong homology to class I major histocompatibility complex molecules, specifically a 343 AA glycoprotein with a transmembrane domain, a cytoplasmic carboxy terminal and three extracellular domains, α1, α2 and α3. The last is an immunoglobulin-like domain that binds β2 microglobulin. The structural integrity of this protein is indispensable to proper functioning of the ‘sensor’ complex and transmission of the signal that regulates hepcidin transcription, although its exact role is poorly understood.

Haemochromatosis HFE1 is the result of homozygous p.Cys282Tyr (C282Y) mutation. This mutation abolishes the disulphide bridge that underlies conformation of the α3 domain, thereby preventing binding to β2 micro-globulin. Its prevalence follows a gradient running from the north-west to the south-east in Europe, with heterozygotes most common in Ireland and Brittany (10–15%). It is unknown in Africans and Asians. It probably first appeared in the Celtic or Viking population relatively recently (a hundred generations). Its rapid spread southwards can only be explained by the fact that it conferred significant selective advantage, perhaps resistance to any of the various pandemics that ravaged the continent in the Middle Ages.

Other polymorphisms such as H63D and S65C, when homozygous or composite heterozygous with C282Y, have been implicated in haemochromatosis, but it is generally accepted that these genotypes are not suffi-cient in isolation to cause primary iron overload in the absence of exacerbating factors such as alcoholism or metabolic syndrome. More recently, a deletion (Y231del) has been reported in a Japanese family affected by haemochromatosis. In northern Europe, five to sixpeople per 1000 are homozygous for C282Y. Therefore, haemochromatosis HFE1 would be the most common hereditary disease and its particularities—in particular the fact that treatment is simple, effective and cheap (bloodletting)—justified systematic screening. This idea (which warrants re-exa-mination now given all the progress in genome sequencing) was soon abandoned for various reasons, especially the weak penetrance of the homozygous C282Y mutation. Data supporting this silence soon built up: in Jersey, poor concordance between the small number of cases of haemochromatosis recorded in the relevant registry and the high incidence of the mutation in the population; the frequency of homozygotes being the same in elderly patients attending Norwich hospital in the UK for all reasons as in the general population. Subsequent population surveys in Brittany, Australia, Canada, New Zealand and England all drew the same conclusion, i.e. clinical expression is rare, with some experts assessing it as low as 1% in women and under 20% in men, whereas laboratory diagnosis—the indication for preventive treatment—identifies 40–50%. It is higher in men than women because of the protective effect of menstrual bleeding, pregnancy and lactation; moreover, testosterone has been shown to inhibit transcription of the HAMP gene and thereby stimulates iron absorption.

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

Both acquired factors (alcohol, nutrition, liver disease) and genetic factors affect expression of homozygosity for C282Y. Different combinations of polymorphic variants of genes involved in iron metabolism (BMP2,4,6, BMPR I and II, HFE, FPN, Tf, Tfr1, Tfr2, TMPRSS6, SMAD1,4,5), i.e. those encoding proteins making up the membrane-bound ‘sensor’ complex, transmitting the signal in the cytoplasm and regulating hepcidin transcription, are probably important determinants of penetrance. Genome wide association studies have also identified—surprisingly—variants of genes that are not known to have anything to do with iron metabolism, such as GNPAT (glyceronephosphate o-acyltransferase), PNPLA3 (patatin-like phospholipase domain-containing protein 3) and PCSK7 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 7). The inventory of all the genetic factors that control penetrance of the HFE gene as well as their various functions is far from complete.

JUVENILE HEMOCHROMATOSIS

Characterised since 1951 by the rapidity of onset and phenotype of its severity—especially in terms of cardiomyopathy and hypogonadotropic hypogonadism—this clinical entity covers two distinct autosomal recessive genetic conditions, namely type 2A due to mutation of the haemojuvelin (HJV) gene on chromosome 1, and type 2B corresponding to mutation of the hepcidin (HAMP) gene on chromosome 19. The idea of juvenile haemochromatosis was then extended to the clinical picture caused by dual mutation of the HFE and TFR2 genes.

TYPE 3 HEMOCHROMATOSIS

Type 3 haemochromatosis is also an autosomal recessive trait, identified in families with a high degree of consanguinity; these have various ethnic origins and include Asian families. The clinical picture resembles that of classic haemochromatosis but its onset is much earlier and is somewhat more severe. The guilty gene is that of the second transferrin receptor (TFR2) at the 7q22 locus; this is a transmembrane protein with an extracytoplasmic domain homologous to that of the first transferrin receptor.

TYPE 4 HAEMOCHROMATOSIS (FERROPORTIN DISEASE)

Type 4 haemochromatosis is caused by abnormalities in the gene for a transmembrane iron transport protein (SLC40A1), ferroportin, at the q32 locus on chromosome 2. This gene was first identified in the zebrafish as causing a genetic form of anaemia. It encodes a transmembrane protein that is strongly expressed in syncy-tiotrophoblasts and then the placenta, macrophages and enterocytes (where it has a basolateral location). It is rare but nevertheless more common than types 2 and 3, and is transmitted as an autosomal dominant trait. First identified in a Dutch family, it was subsequently reported in other countries and on other continents. Ferroportin is the only protein that is known to be able to export iron out of cells. It is the target of hepcidin, the endocrine messenger that signals that there is enough iron in the body and triggers its breakdown. Different genetic abnormalities cause two different forms: type A in which mutation compromises export function leading to iron build-up in macrophages, the spleen and Kupffer cells in the liver. This type is characterised by high blood ferritin levels in parallel to normal or low transferrin, which might well explain why bloodletting is poorly tolerated. Symptoms are usually limited, just some impairment of liver function. Type B is rarer; mutation abolishes the responsiveness of ferroportin to hepcidin and the absence of control leads to extra-cellular efflux and increased iron absorption in the gut. For this reason, the symptoms are similar to those of types 1 and 3.

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Jean-Yves Le Gall — Genetic control of iron metabolism

GRACILE SYNDROME

GRACILE syndrome is an autosomal recessive disorder predominantly found in Finland.10 The clinical picture is described by the acronym GRACILE for growth retardation, amino aciduria, cholestasis, iron overload, lactic acidosis and early death. Laboratory tests show hypersideraemia with high percentage transferrin saturation and iron overload in the liver. The gene responsible for this syndrome is BCS1L (2q32-34), which encodes an ATPase on the inner mitochondrial membrane that acts as a chaperone and is required for the assembly of respiratory chain complex III. All the Finnish patients are homozygotes for a single mutation (S78G). Other mutations in the BCS1L gene have been implicated in forms of respiratory chain deficiency and Björnstad syndrome (characterised by hearing problems and twisted hair shafts).The relationship between BCS1L and iron metabolism are as yet poorly understood.

HEREDITARY ATRANSFERRINAEMIA (HAT)

This very rare syndrome is caused by mutation of the transferrin gene on chromosome 3. In the absence of functional transferrin, iron is difficult to find for erythropoiesis leading initially to severe hypochromic micro-cytic anaemia requiring transfusions of either plasma or purified transferrin. Otherwise, iron steadily builds up in the liver, pancreas, kidneys, myocardium and thyroid gland due to high levels of non-transferrin-bound iron in the circulation.

NEURODEGENERATION WITH BRAIN IRON ACCUMULATION (NBIA)

Recent technological and methodological progress in molecular genetics has led to the identification of a series of genes responsible for rare Mendelian diseases, including a group of ten phenotypes grouped together under the term NBIA (Table 2.).11,12 Eight of these are autosomal recessive traits, one is dominant and the last is X-linked. The symptoms of these neurodegenerative processes are globally characterised by abnormal movements due to extrapyramidal disruption and abnormal iron deposition in the brain, especially the globus pallida and other basal ganglia. These syndromes are extremely rare (less than one case per million) but four are more common than the others, namely deficiencies in pantothenate kinase (PKAN) and phospholipase 2 (PLAN), abnormalities in a mitochondrial membrane protein (MPAN) and the beta propeller protein (BPAN). Interest in these syndromes is of course essentially fundamental — to advance our knowledge about brain metabolism.

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Table 2: Neurodegenerative syndromes with iron overload

SYNDROME LOCUS GENE TRANSMISSION

Pantothenate deficiency kinase 2 (PANK2) 20q13 PANK2 Autosomal recessive

Phospholipase A2 (PLAN)deficiency 22q12 PLA2G6 Autosomal recessive

Mitochondrial membrane protein (MPAN) syndrome 19q12 C19orf12 Autosomal recessive

Β propeller (BPAN) proteinsyndrome X WDR45 X-linked (dominant)

Fatty acid hydroxylase (FAHN) deficiency 16q23 FA2H Autosomal recessive

Coenzyme A synthase (CoPAN) syndrome 17q21.2 COASY Autosomal recessive

Kufor–Raked syndrome 1q36 ATP13A2 Autosomal recessive

Woodhouse–Sakati syndrome 2q31.1 DCAF17 Autosomal recessive

Neuroferritinopathy 19q13 FTL Autosomal dominant

Aceruloplasminaemia 3q23 CP Autosomal recessive

The neurodegenerative syndrome PKAN was first reported in the medical literature as Hallervorden–Spatz disease but this term was abandoned because the names refer to two German neuropathologists who worked with the Nazi regime. The disease is caused by deficient pantothenate kinase 2 (gene PANK2) activity. This enzyme catalyses the first five steps of coenzyme A synthesis with the resultant phosphopantothenate next condensing with cysteine. Its pathogenesis remains poorly understood but it has been suggested that deficiency in pantothenate kinase activity causes the build-up of iron-chelating cysteine and accumulation in the mitochondria.

The neurodegenerative syndrome associated with phospholipase A2 (PLAN) deficiency is due to mutation of the PLA2G6 gene, which encodes a protein that plays a fundamental role in the synthesis of fatty acids and lysophospholipids and therefore the metabolism of membrane phospholipids in phenomena such as signal transduction, cell proliferation and apoptosis.

The neurodegenerative syndrome associated with a mitochondrial membrane protein (MPNA) is due to mutations in the c19orf12 gene (located at 19q12). The function of this protein is unknown but its localisation in the mitochondrial membrane points to a role in energy and fatty acid metabolism.

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The neurodegenerative syndrome associated with the beta propeller protein (BPAN) is caused by mutations in the WDR45 gene on the X chromosome that encodes a protein that is probably important in the process of autophagy.

Neuroferritinopathy was reported in 2001 in patients in northern England.13 All sufferers were heterozygous for an adenine insertion at position 460 (460insA) in the L ferritin gene that causes a frameshift at the C-ter-minal end of the chain. Other ‘private’ mutations were subsequently reported in other parts of the world.

Aceruloplasminaemia, an autosomal recessive disorder, is mainly seen in Japan. Various different mutations of the CP (3q21-24) gene have been reported that compromise the protein’s oxidase activity (potentially preventing the binding of copper ions by the polypeptide chain) that leads to defective recycling of the iron recovered from haemoglobin catabolism as well as defective absorption in the gut due to failure to oxidise Fe2+ to Fe3+. Symptoms are wide ranging with generalised iron overload; in addition to the neurological signs, there is hypochromic anaemia, retinopathy and diabetes as well as test parameters indicating hyposideraemia, anaemia and hyperferritinaemia.

The neurodegenerative syndrome associated with fatty acid hydroxylase (FAHN) deficiency is due to mutation of the FA2H gene, the product of which is responsible for the hydroxylation of long-chain fatty acids. This enzyme system plays a key role in myelin synthesis in the central nervous system and possibly in regulation of the cell cycle. Other mutations in this gene cause leukodystrophy and some forms of hereditary spastic paraplegia (HSP35).

FRIEDREICH ATAXIA

Friedreich ataxia is an autosomal recessive disorder caused by a nuclear gene at 9q13 that encodes a mitochon-drial protein, frataxin.14 In the vast majority of cases, the problem is expansion of a GAA triplet in intron 1, which leads to less transcription of the gene. A global reduction in frataxin activity leads to iron build-up in mitochondria and damage to the most susceptible cells accounts for the spinal, cerebellar symptoms as well as the cardiomyopathy.

Our understanding of what frataxin does has been helped by a model in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frataxin’s orthologous gene is YFH1 and mutations here also cause iron build-up in mitochondria. Frataxin is now considered to be a mitochondrial protein that is involved in the assembly of Fe:S nuclei and—through interaction with ferrochelatase—in haem synthesis.

CONGENITAL MICROCYTIC ANAEMIA

Two rare forms of hereditary hypochromic anaemia are recognised:15,16 one due to mutation of DMT1 (N-RAMP2/SLC11A2) (chromosome 12), a transporter of divalent metal ions (Fe2+). In the membrane at the apex of enterocytes, this protein is essential in iron absorption and in the endosome membrane, it plays a central role in the recycling of iron. This dual localisation explains the paradoxical symptomatology which combines severe iron-deficiency anaemia with iron overload in the tissues, especially the liver. Before this elucidation, animal models—mk/mk mice and Belgrade rats—were used for investigations.

Another form is due to mutation of TMPRSS6 (chromosome 22q12-13), which encodes matriptase-2, a protease found in the hepatocyte membrane belonging to the sensor complex that regulates hepcidin expression. Its physiological role is to lyse a protein in this complex, haemojuvelin, and thereby act as a negative regulator of hepcidin. The clinical picture of this iron refractory iron deficiency anaemia combines severe hyposideraemic, hypochromic anaemia that is refractory to oral treatment with high levels of hepcidin in the blood.

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ABNORMALITIES IN ERYTHROPOIESIS

Various different congenital abnormalities compromise haem synthesis leading to ineffective erythropoiesis, iron overload (particularly in mitochondria and potentially exacerbated by blood transfusion) and the downre-gulation of hepcidin.17

One group is that of the congenital sideroblastic anaemias. Two of these are X-linked disorders: a form without ataxia due to mutation of the gene for δ aminolevulinate synthetase (ALAS2) (Xq11-21), a key enzyme in the porphyrin and haem synthetic pathways (some patients respond to pharmacological doses of pyrodoxine, a co-factor for ALAS2); and a form without ataxia due to abnormalities in the ABCB7 (Xq13.1-13.3) gene, which encodes a member of the big family of ATP-binding ABC proteins. The link between ABCB7, iron metabolism and haem synthesis is its involvement in the transport of Fe:S groups from where they are synthesised in the mitochondrion into the cytoplasm, and in regulation of the expression of ferrochelatase (otherwise known as the Fe:S cluster protein).

Two other forms of congenital sideroblastic anaemia are autosomal recessive disorders: one is due to SLC25A38 deficiency, a gene that encodes a mitochondrial transporter protein for glycine which is key in the first step of porphyrin and haem synthesis; the other is due to deficient glutaredoxine 5 (encoded by GLRX5), which is involved in the synthesis of proteins containing Fe:S groups.

A second group is that of the congenital dyserythropoietic anaemias. Type I corresponds to mutations in the CDAN1 gene, the product of which (codanine 1) plays a key role in chromatin organisation. Type II is due to abnormalities in the SEC23B gene that codes for a protein in vesicles that mediate transport processes between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Type III—a dominant autosomal disorder—is due to mutation in KIF23, which encodes mitotic kinesin-like protein 1 (MKLP1), which is important in cytapheresis.Finally, the last group is that of the thalassaemias (α and β): iron overload is an important complication in severe forms.

HYPERFERRITINAEMIA-CATARACT

The rare dominant disorder hyperferritinaemia-cataract is characterised by early bilateral cataract associated with isolated hyperferritinaemia (with normal blood iron and transferrin levels, and without any overload in the tissues).18 It is caused by mutations (some 40 identified so far) in the untranslated IRE sequence at the 5’ end of the messenger RNA for L-ferritin. The results of these mutations are reduced affinity between the RNA molecule and IRPs, which disrupts regulation by the intracellular iron concentration and leads to excessive translation. The cataract is due to deposition of crystals of ferritin in the lens.

CONCLUSION

All the above-mentioned mutations are rare or very rare. Only one, the C282Y mutation in the HFE gene, is widespread, at least in populations originating from north-western Europe. The penetrance of homozygous C282Y is weak and modulated by ‘environmental’ conditions and polymorphism in many different genes involved directly or indirectly in iron metabolism; the inventory of these genetic variants is as yet incomplete.

Until the HFE gene was cloned, the high prevalence of C282Y seemed to justify mass screening but this was soon abandoned when the weakness of its penetrance was recognised. Identification of all the genetic variants that affect penetrance coupled with the exponential development of genomic sequencing methods may well incite re-examination of this question now. The growing number of neurodegenerative conditions characterised as genetic martial diseases points up—above and beyond its particularities—the importance of iron metabolism in the central nervous system. This is further highlighted by the observation of iron deposition in the form of ferritin and neuromelanin in different parts of the brain in the course of common neurodegenerative diseases, although it is as yet impossible to stipulate if such processes are primary or secondary.

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