Evaluation de profils d’expression d’ARNm en …...Evaluation de profils d’expression d’ARNm en sécurité du médicament 5 I – LE GROUPE SERVIER I.1. SERVIER, un groupe

Licence Professionnelle Métiers de la Biotechnologie

Evaluation de profils d’expression

d’ARNm en sécurité du médicament.

Emeline MAUTEMPS

Année 2012 - 2013

Maître de Stage: Marie-Pierre RENAUD

Enseignant Tuteur: Bruno COLLINET

Laboratoire de Toxicogénomique

BIOLOGIE SERVIER 905 Route de Saran

45520 Gidy

Evaluation de profils d’expression d’ARNm en sécurité du médicament

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Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Nancy CLAUDE, Directrice de la Toxicologie, Pierre

GOT et Jean-Luc DELONGEAS, respectivement Directeur actuel et ancien Directeur du

Centre de Toxicologie. Je remercie également Richard WEAVER, directeur de la division

Bio-Analyse et Nouvelles Technologies, Michel Delandines Directeur des Ressources

humaines et Florence Mallein Responsable des Ressources Humaines pour m’avoir permis de

réaliser mon année d’apprentissage au sein de Biologie SERVIER.

Je souhaite également remercier Marie Pierre RENAUD, Béatrice CHACHAY et

Nicolas SAJOT pour m’avoir formé aux différentes techniques au sein du laboratoire de

Toxicogénomique et pour leur aide dans la réalisation de mon projet. Merci à eux pour leur

soutien et leur écoute, qu’elle soit professionnelle ou personnelle.

Je tiens particulièrement à remercier Marie Pierre RENAUD, mon maître

d’apprentissage pour sa quotidienne bonne humeur, sa patience, ses conseils, sa disponibilité

et son envie de partager ses connaissances.

Je remercie Catherine SPIRE, directrice d’étude pour son aide dans la prise en main

des logiciels d’analyses de résultats ainsi que pour le temps qu’elle m’a consacré.

Un grand merci à Sébastien ANTHERIEU et Christophe CHALINE pour toutes leurs

précieuses explications au sujet de la lignée HepaRG ainsi que pour leur disponibilité, leur

organisation sans faille et leur aide.

J’aimerais également remercier Hélène JULIEN et Anne MARCHAU sans qui je

n’aurais pas pu travailler sur des cellules d’hépatocytes primaire de rat. Merci pour votre

temps et pour vos explications.

Je voudrais enfin remercier tous les collaborateurs de Biologie SERVIER pour tous

ces bons moments passés ensemble. Merci aux « jeunes », Pauline, Romain, Muriel, Thomas,

Vincent, Clément, Laura, Hélène, Maxime, Majd, Axel, Fatima, Cécile, Vanessa, Sébastien et

Idris pour ces repas et cafés partagés ensemble.


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Table des abréviations

TGN : Toxicogénomique

DMSO : Diméthylsulfoxyde

AMM : Autorisation de Mise sur le Marché

BPL : Bonnes Pratiques deLaboratoires

ARNm : Acide RiboNucléique messager

RT-qPCR : Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction

RNase : RiboNucléase

CYP : Cytochrome P

ATP : Adénosine TriPhosphate

DNase I : DésoxyRiboNucléase I

RIN: Integrity Number

Cy3: Cyanine 3

ACP: Analyse en Composante Principale

IPA: Ingenuity Pathway Analysis

ADN: Acide DésoxyriboNucléique

ARNc : Acide RiboNucléique complémentaire à l’ADNc

MMLV_RT : Moloney Murine Leukemia Virus_Reverse Transcriptase

rpm : rotation par minute

ARNtot : Acide RiboNucléique totaux (ARNc + ARNt…)

Amendement : modifications par rapport au protocole d’étude initial

QC : Control Quality


3

Sommaire

Résumé de la période en entreprise…….……………………………………………..………4

Introduction…………………………………………………………………………….………4

I – LE GROUPE SERVIER……………………………………………………………………5

I.1. SERVIER, un groupe pharmaceutique………………………………….…………5

I.2. SERVIER en France…………………………………………………………..…...5

I.3. Biologie SERVIER, un centre de Sécurité du médicament…………………..……6

I.4. Le laboratoire de Toxicogénomique……………………………………………….6

II – Matériels et méthodes……………………………………………………………………...7

II.1. La lignée cellulaire HepaRG……………………………………………………...7

II.1.1 La culture cellulaire d’HepaRG……………………………….…7

II.1.2 Le traitement……………………………………………………..8

II.2. Le test ATP ou test CellTiter-GloTM

………………………………………………8

II.3. Extraction d’ARN total et quantification..………………………………………9

II.4. Contrôle qualité des ARN extraits ………….…………………………………...9

II.5. Ampli- Marquage au CY3……………………………………………………….10

II.6. Hybridation………………………………………………………………………11

III – Résultats…………………………………………………………………………………12

III.1. Etude n°1………………………………………………………………………..12

III.2. Etude n°1 amendement n°1……………………………………………………..15

III.3. Analyse des résultats …………………………………………………………...18

III.4. Suite du projet…………………………………………………………………. 26

IV – Conclusion et Discussion………………………………………………………………..26


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Résumé de la période en entreprise

Le centre de sécurité du Médicament du groupe Servier, Biologie Servier a pour

mission d’évaluer la toxicité des molécules en développement issues de la recherche du

groupe ainsi que leurs effets secondaires. Le laboratoire de toxicogénomique au sein duquel

j’ai réalisé ma période en entreprise analyse la modulation de l’expression du génome suite à

l’exposition des différentes cellules à un xénobiotique. L’objectif de mon apprentissage a été d’évaluer la toxicité de plusieurs molécules sur

des cultures de cellules humaines, les HepaRG et des hépatocytes primaires de Rat à

différentes concentrations, permettant ainsi de définir la concentration cytotoxique de chaque

produit testé. L'ensemble du travail s'est déroulé en deux parties. Une partie très technique

avec la culture cellulaire in vitro, dans la mise en place des cultures, les tests ATP et la

réalisation des microarrays comprenant l’extraction d’ARN, l’amplification-marquage et

l'hybridation des lames. Et enfin, une partie bio-analyse avec l’utilisation de logiciels tels que

Array Studio d’Omicsoft et Ingenuity Pathway, permettant de mettre en avant les voies

métaboliques et les voies de signalisations affectées.

Introduction

Biologie Servier, centre de sécurité du médicament du groupe Servier est chargé

d’évaluer les effets secondaires et la toxicité des molécules et principes actifs développés dans

le groupe Servier.

La toxicogénomique (TGN), née du développement rapide des techniques de pointe en

biologie moléculaire est une discipline de la toxicologie. Elle permet d’étudier à un temps

donné, une concentration donnée et sur un type cellulaire précis, les profils transcriptomiques,

en réponse à la modulation de l’expression de gènes, suite à l’exposition à un xénobiotique.

Cette discipline vient compléter les études réalisées sur l’animal par ses aspects mécanistique

et prédictif.

L’hépatotoxicité est la principale cause d’arrêt de développement et de retrait du

marché des principes actifs. En effet, des études montrent que la toxicité est majoritairement

présente au niveau du foie en raison de son rôle dans l’élimination des xénobiotiques.

La lignée cellulaire HepaRG est une lignée brevetée et commercialisée par la société

Biopredic (8-18 Rue Jean Pecker - 35000 Rennes, France), à différents passages et nombres

de jours de différenciation. Celle-ci a été isolée à partir d’un hépatocarcinome de femme

souffrant également d’une infection chronique au virus de l’hépatite C. Les cellules HepaRG

cultivées à forte densité et en présence de DMSO à 2% se différencient pour former un

système de co-culture composée d’hépatocytes d’un part et de cellules biliaires d’autre part.

Les cellules primaires d’Hépatocytes de rat sont obtenus par perfusion enzymatique de

l’animal à la collagénase de type IV. Les hépatocytes ainsi obtenus sont mis en culture en

présence de sérum de veau fœtal dans une enceinte de culture coatée au collagène de typeI,

après un temps d’attachement de 4heures, les cellules sont « prêtes » à être utilisées.

L’objectif de l’étude est de comparer la toxicité évaluée sur les cellules d’Hépatocytes

Primaire de rat et sur les cellules HepaRG à celle obtenue lors de précédentes études. Cette

comparaison permettra ainsi d’étudier et de valider le modèle HepaRG en transcriptomique.


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I – LE GROUPE SERVIER

I.1. SERVIER, un groupe pharmaceutique

L’entreprise SERVIER fut fondée par le Dr Jacques SERVIER en 1954 à Orléans. A

sa création le groupe comptait 9 collaborateurs, aujourd’hui celui-ci en comptabilise 22 000

au niveau international. SERVIER est le premier laboratoire indépendant français, ce qui

signifie que ni l’Etat ni aucune entreprise privée n’ont de participation dans le capital du

groupe.

SERVIER est également le 2ème

groupe pharmaceutique français au niveau mondial

avec un chiffre d’affaire pour l’année 2012 de 3.9 milliards d’euros, 25% de ce chiffre

d’affaire est directement consacré à la recherche et au développement composé de près de

3000 chercheurs.

Les principaux axes de recherches du groupe sont les maladies cardio-vasculaire, les maladies

métaboliques comme le diabète ou encore l’obésité, les pathologies du système nerveux

central telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou encore la dépression, la

cancérologie et la rhumatologie.

Les laboratoires SERVIER assurent toutes les étapes du développement de ses

médicaments, de la recherche de ses principes actifs à la production de la forme galénique.

Depuis 1996, l’entreprise possède une activité dans le domaine des médicaments génériques

grâce à la société BIOGARAN.

I.2. SERVIER en France

Les laboratoires SERVIER en France sont présents sur cinq sites différents. Chaque

site est caractéristique d’une étape de la R&D (Recherche et développement) du médicament.

Les centres de recherches sont localisés à Suresnes, Croissy-sur-Seine, Orléans et Gidy, le

centre de développement clinique est situé à Suresnes, ceux de production chimique à Bolbec

et Baclair. Enfin le centre de production pharmaceutique est lui implanté à Gidy.

Figure 1: Sites Français SERVIER


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I.3. Biologie SERVIER, un centre de Sécurité du médicament

Biologie SERVIER (BS) construit en 1969 à Gidy, près d’Orléans est un centre de

sécurité du médicament. Il a pour objectif de rechercher et d’évaluer la toxicité des candidats

médicaments par le biais d'études réglementaires demandées par la réglementation

européenne et mondiale. Ces études réglementaires permettent d’évaluer les éventuels effets

secondaires et le profil toxicologique avant le dépôt du dossier à l’AMM et par conséquent

avant l’administration à l’Homme.

Ce centre comptabilisant 110 salariés est régit par les Bonnes Pratiques de

Laboratoire (BPL). Il est divisé en plusieurs secteurs expérimentaux, encadrés par des

directeurs d’études.

I.4. Le laboratoire de Toxicogénomique

Le laboratoire de Toxicogénomique (TGN) étudie les niveaux d’expression des

ARNm, reflets de la modulation de l’expression des gènes dans un tissu ou dans des cellules,

suite à l’exposition d’une molécule.

Le laboratoire de Toxicogénomique de Biologie SERVIER crée en 2002, est un

secteur non réglementaire du centre, qui développe l’application de la transcriptomique.

C’est-à-dire l'étude de la quantité d’ARNm à un temps donné, dans n’importe quels tissus ou

cellules, à l’étude de l’hépatotoxicité de molécules. La toxicogénomique facilite

l’identification, la prédiction et la compréhension des mécanismes de toxicité. En effet, les

autres services de Biologie Servier observent la toxicité de la molécule au niveau

métabolique, protéique ou encore tissulaire. Avec la toxicogénomique, les changements au

niveau des ARNm, ARNt... permettent de prédire toutes ces modifications.

Les deux principales méthodes d’analyse utilisées afin de déterminer les profils

transcriptomiques des molécules testées sont :

Les puces à ADN, également appelées microarrays, qui permettent de visualiser

les modifications d’expression des gènes

La RT-qPCR (Real time Quantitative Polymerase Chain Reaction) qui permet de

quantifier l’expression d’un nombre défini de gènes d’intérêts, sélectionnés à partir

des résultats des microarrays ou d’après la littérature.

Ce service compte actuellement deux cadres, Mr Weaver Richard et Mr Sajot Nicolas ainsi

qu'une cadre techniciennes Me Renaud Marie-Pierre et une technicienne Me Chachay

Béatrice.

Les études réalisées en toxicogénomique nécessitent un maximum de précautions. Pour ne pas

fausser nos études le port de gants, blouse, charlotte et sur-chaussure sont obligatoires dans

les laboratoires ainsi que l'utilisation de consommables Rnase free et PCR clean. En effet en

toxicogénomique, les manipulations sont principalement centrées sur l’ARN, or des RNases

sont présentes sur notre peau, il est donc nécessaire de porter des gants et d’appliquer sur

ceux-ci un produit contre les RNase, le RNase Zap®, pour ne pas contaminer machines,

supports, pipettes et autres instruments utiles lors des manipulations, susceptibles de degrader

par la suite notre réaction. Ces indications seront donc respectées lors de toutes les

manipulations de laboratoire.


7

II – Matériels et méthodes

II.1. La lignée cellulaire HepaRG

La lignée HepaRG est issue d’un hépatocarcinome humain. Son atout est qu'elle

exprime les diverses fonctions d'hépatocytes humain matures. Les cellules sont capables de se

différencier in vitro vers deux phénotypes cellulaires: hépatocytes et cellules biliaires. En

effet, lors de la culture cellulaire, l’ajout de Diméthyl sulfoxyde (DMSO) à 2% et

d’hydrocortisone hemisuccianate à 50µM favorisent la différentiation de la culture en

hépatocytes (~50%) ou en cellules biliaires (~50%).

Les cellules HepaRG, possèdent à la fois les capacités fonctionnelles des hépatocytes

normaux en culture primaire et le potentiel de prolifération des lignées d’hépatome. Elles

arrivent à confluence en 15 jours et après deux semaines de culture supplémentaires en

présence de DMSO et d'hydrocortisone, elles expriment les principaux CYP, les enzymes de

phase 2, les transporteurs membranaires ainsi que des facteurs nucléaires. Ces cellules restent

stables pendant plusieurs semaines et peuvent être « repiquées » (ou réensemencées)

permettant ainsi de nouvelles études toxicologiques.

Figure 2: culture, différenciation et repiquage des HepaRG

II.1.1 La culture cellulaire d’HepaRG

La culture des cellules HepaRG se déroule en 2 phases : une phase de prolifération et

une phase de différentiation. Les cellules HepaRG sont tout d’abord ensemencées à faible

densité (26 000 cellules / cm²) dans des flasks et incubées pendant 14 jours à 37°C et 5%

CO2. Le milieu de prolifération est renouvelé tous les 2-3 jours, les cellules atteignent la

confluence au bout de 14 jours. A partir du 14ème jour de culture, le milieu de culture est

supplémenté avec 2% de DMSO. Le milieu de différentiation et renouvelé tous les 2-3 jours

et ce pendant 14 jours. Après ces 4 semaines de culture, les cellules ont atteint un une

différentiation optimale avec 2 types cellulaires, hépatocytes et cellules biliaires.


8

Figure 3: différenciation des HepaRG

Les HepaRG utilisés pour cette étude sont de passage P17 c’est-à-dire qu’ils ont été repiqués

17 fois depuis leur découverte. Les cellules sont observées au microscope avant le début des

traitements.

II.1.2 Le traitement

Les HepaRG de passage P17 sont traités pendant 24 heures avec 500µL de milieu de

traitement contenant 2% de DMSO et les produits à tester. La toxicité in vivo a été étudiée

lors de précédentes études sur des animaux de laboratoires. Chaque produit est déposé aux

doses de 0, 10, 50, 100 et 300µM, ces doses sont déposées en quintuplicat. 5 plaques 24 puits

sont réalisées, dont une plaque est utilisée pour réaliser un test de cytotoxicité cellulaire (test

ATP) avec le kit CellTiter-GloTM

(Promega, Réf. G7571). Les 4 autres plaques sont destinées

à l’analyse transcriptomique des cellules. Les doses de 0µM sont utilisées comme contrôles

lors des Analyses.

II.2. Le test ATP ou test CellTiter-GloTM

Le test ATP est un test de cytotoxicité. Il permet de déterminer le nombre de cellules

viables dans chaque puits sur la base de la quantification de l’ATP. En effet, les cellules

métaboliquement actives, donc viables, produisent de l’ATP. La concentration en ATP

diminue rapidement lorsque les cellules entrent en nécrose ou en apoptose. L’ATP est détecté

par luminescence à l’aide du kit CellTiter-GloTM

. Ce système est basé sur la production de

lumière due à la réaction produite lors d’ajout de luciferase et de D-luciferine.

ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light

(LUCIFERASE, Mg2+)

L’émission de lumière est proportionnelle à la concentration en ATP.


9

A la suite des 24 heures de traitement, 500µL de substrat du kit

sont ajoutés dans chaque puits de la plaque ATP. Celle-ci est alors agitée pendant 2 min à 700

rpm à température ambiante pour induire la lyse des cellules. La plaque est ensuite placée

pendant 10min à l'obscurité. Des triplicats techniques sont ensuite réalisés et déposés dans une

plaque 96 puits noir. La luminescence est ensuite mesurée grâce à un lecteur de luminescence

à plaque (Varioskan ou Victor).

Ce test ATP nous permet alors d’évaluer un pourcentage de cytotoxicité pour chaque produit

à chaque dose.

II.3. Extraction d’ARN total et quantification

A la fin des 24 heures de traitement, les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit

RNeasy Mini kit de QIAGEN (Qiagen Ref 74 904). Dans un premier temps, les cellules de

chaques puits sont scrappées dans 350µL/puits de tampon de lyse reconstitué (RLT + β-

mercaptoethanol). Les puits sont poolés 2 à 2 par condition et l'ensemble est déposée sur

colonne QIAshredder + tube de recueil. La colonne est ensuite centrifugée 2min à environ

16000g. Cette centrifugation permet une séparation entre les ARN et les composants de haut

poids moléculaire comme les protéines, l’ADN ou encore les membranes cellulaires. On

ajoute ensuite 600µL d’éthanol à 70% à l’éluat que l’on place une nouvelle fois sur colonne +

tube de recueil et que l’on centrifuge à 8000g pendant 15sec. Des lavages successifs sont

ensuite réalisés avec les tampons, RW1 et RPE. Un traitement par la DNase I est également

réalisé pour éliminer les restes possibles d’ADN génomique dans notre éluat. L’ARN total est

élué avec 30µL d’eau RNase Free, le volume final récupéré est ensuite mesuré par

prélèvement à la micropipette. On mesure ensuite l’absorbance à 260 230 et 280nm avec le

Nanodrop_ND1000® (NYXOR Biotech) dans le but de quantifier nos ARN. Les rapports,

260 / 280 et 260 / 230 sont calculés et utilisés comme indicateurs de pureté de nos

échantillons. Le premier de ces rapports permet de contrôler la contamination protéique, le

second nous informe sur la contamination de l’échantillon par des phénols ou acides aminés

contenant des noyaux aromatiques. Les échantillons sont ensuite normalisés à 100ng

ARNtot/µL.

II.4. Contrôle qualité des ARN extraits

Les ARN extraits sont controlés au bioanalyser 2100 (G2938B, Agilent Technologie).

Les puces de laboratoire, labchip RNA 6000 Nano (Agilent Nano RNA kit, 5067-1511)

utilisées permettent de contrôler la distribution en taille des fragments d’ARNtot et ainsi

l’intégrité de l’ARN dans les échantillons (ou la qualité d’incorporation des cyanines). Les

échantillons déposés dans les puits migrent à l’intérieur de micro canaux. L’échantillon passe

ensuite dans un canal de « séparation ». Les composants sont séparés

« électrophorétiquement » par différence de potentiel. Ils sont ensuite détectés par leur niveau

de fluorescence induit à l’aide d’un laser et le profil de séparation est traduit à l’aide du

logiciel :

-en une image présentant des bandes comme sur un gel.

-en électrophorégramme représentant la fluorescence en fonction du temps.


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Figure 4: caractéristiques d’un électrophoregramme d’échantillon

Pour être exploité, l’échantillon d’ARNtot doit avoir un RIN minimal de 7 (le RIN étant

compris entre 1 et 10).

II.5. Ampli- Marquage au CY3

L'ARNm ne représentant que 1 à 3% de l'ARN total, l’étape d’Amplification permet

de multiplier la quantité d’ARNm par reverse transcription, les ARNc produits lors de cette

amplification sont marqués avec la Cyanine 3, un ribonucléotide fluorescent. La Cy3 est

excitée de façon maximale à 550 nm et émet de façon maximale à 570 nm.

L’amplification-marquage est automatisée sur Robot Hamilton Starlet® lorsque tous

les échantillons ont pu être normalisés à 100ng/µL d’ARN. Les échantillons d’ARNtot sont

déposés en plaque 96 puits. L’amplification-marquage est réalisée avec le kit Agilent Low

Input Quick Amp Labeling Kit, one-color (Agilent, Réf: 5190-2305). Dès le début du

marquage, on introduit dans chaque échantillon des spikes qui sont constitués d'un ensemble

d'ARNm ciblés qui vont servir de contrôle qualité au cours des étapes ultérieures.


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Figure 5: Protocole de l’Amplification-Marquage

On mesure le volume final de chaque échantillon. Après purification sur colonne du kit

Rneasy Mini Kit Qiagen, on réalise un nouveau contrôle qualité des échantillons avec le

Nanodrop et le Bioanalyseur. La concentration en ARN obtenue nous permet de normaliser

nos échantillons à 100ng/µL.

II.6. Hybridation sur Microarrays

Les lames microarrays sont des lames de verres traitées chimiquement sur lesquelles

sont spotés des milliers d’oligonucléotides. Ceux-ci sont utilisés en tant que sondes et fixent

de façon très spécifique les séquences complémentaires des gènes cibles provenant des

échantillons biologiques. Les lames utilisées sont spécifiques du génome Humain, SurePrint

G3 Human GE 8*60K V2 MicroArray Kit. Chaque lame est composée de 8 microarrays

contenant 60000 gènes cibles.

Avant de déposer les échantillons sur les lames, suivant un plan de randomisation, il est

nécessaire d’ajouter 5µL de 10X Blocking Agent et 1µL de Fragmentation Buffer(Acétate de

Zinc). Le Blocking Agent a pour but de minimiser les liaisons non spécifiques et le

Fragmentation Buffer fragmente l’ARNc en ARNc 60 nucléotides pour optimiser

l’hybridation sur les sondes. Cette réaction est incubée 30min à 60°C. Ce délai passé, on

ajoute 25µL de GEX Hybridation Buffer qui va stopper l’action de fragmentation du


12

Fragmentation Buffer. Les échantillons sont ensuite déposés suivant le

plan d’hybridation et incubés 17heures dans un four à hybridation à 65°C avec une rotation de

10rpm.

Au bout des 17h et après démontage et lavages des lames, chaque spot de la puce va être

analysé individuellement par un scanner AGILENT à très haute résolution, et ce à la longueur

d'onde d'excitation de la Cyanine 3. L'image scannée va être traduite en niveaux d'intensité.

On va ensuite comparer l'intensité à des signaux verts avec le logiciel Feature Extraction. À

chaque spot est attribué une valeur d'intensité normalisée par le logiciel. Les gènes

surexprimés sont analysés par une abondance de pixels, ils apparaitront alors en vert foncé au

moment de l’analyse, les gènes exprimés normalement seront verts clair et les gènes non

exprimés en noir.

Figure 6: Interprétation des résultats du microarray

La lecture des lames effectuée, les résultats sont transférés dans les logiciels de bio-

informatique: ArrayStudio d’Omicsoft et Ingenuity Pathways pour déterminer les effets

éventuels des traitements sur l’expression des gènes dans les cellules d’HepaRG.

III – Résultats

III.1. Etude n°1

Culture cellulaire:

Les HepaRG montrent un état normal, au microscope avant traitement. Après les

24heures de traitements, certaines doses semblent avoir un effet cytotoxique. Il apparait

également quelques fois des précipités.

Tableau 1 : Résumé des observations au microscope


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Figure 7: Photographie au microscope d’HepaRG avant et après traitement des cellules

avec le produit 5 à la dose de 100µM

De nombreuses cellules semblent détachées ou encore vacuolisées, ces signes révèlent que les

cellules sont en souffrance, les produits ont donc un effet cytotoxique plus ou moins

important.

Test ATP :

Le test ATP donne des indications sur la toxicité des produits. A chaque dose (10, 50,

100 et 300µM) la cytotoxicité avoisine les 30% pour les produits 1, 3 et 5. Les produits 2 et 4

révèlent une cytotoxicité de 67 % et 52% pour la dose de 300. 3 produits sur 5 ne semblent

donc pas avoir de gros effets cytotoxiques sur les HepaRG.

Extraction des ARNtotaux :

Les puits des 4 plaques 24 puits destinées à la TGN sont poolés 2 à 2 par condition, on

obtient donc 44 échantillons au total. Sur ces 44 échantillons, 3 sont invalidés, car leur

concentration en ARNt est trop faible (inferieure à 100ng d’ARN/µL), pour la suite de

l’étude. Les 41 échantillons restant ont des ratios 260/280, 230/260 et 28S/18S et un RIN

corrects, ils sont donc sélectionnés pour continuer l’analyse transcriptomique.

Amplification Marquage au Cy3 :

Les profils obtenus sur le bioanalyseur montrent que l’incorporation de la cyanine3 est

bonne, en effet pour être valides les échantillons doivent incorporer un minimum de

1pmol/100ng de cyanine3. Les 43 échantillons seront donc hybridés sur microarrays.

Hybridation :

Au total, 4 lames sont nécessaires pour hybrider tous les échantillons. Pour optimiser

l’analyse des hybridations il nécessaire d’avoir au moins 1 témoin par lame et de réaliser un

plan d’hybridation pour randomiser au mieux les produits et doses. Dans ce but, on réalise un

duplicate technique du témoin n°1, le témoin n°3 n’ayant pas une quantité suffisante

d’ARNtotaux pour être hybridée. L’hybridation est réalisée suivant le plan ci-dessous

(figure).


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Figure 8: Plan d’hybridation sur microarray 8*60k humain

Après analyse des résultats d’hybridation, le témoin n°2 et les échantillons 43, 8, 18, 42, 12

sont hors normes pour certains paramètres.

Figure 9: Exemple de rapport d’analyse qualité de Feature Extraction entre 1

échantillon correct (droite) et un échantillon non correct (gauche)

Ces échantillons seront quand même importés dans le logiciel d’analyse « Array Studio ».

Analyse sur Array Studio:

Une fois les lames importées, on réalise dans un premier temps un Kernel Density,

cette analyse nous permet de voir les « points aberrants » c’est-à-dire les points qui semblent

sortir du lot et susceptible de créer un biais lors de l’analyse des lames. Le Kernel Density est

ensuite confirmé par une ACP, Analyse en Composante Principale. Si les « points aberrants »

observés semblent avoir un impact sur l’ACP et sur l’analyse en générale, ils sont supprimés.

C’est le cas des échantillons n°2 et n°20. L’observation des résultats se fera donc avec 39

échantillons.


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Figure 10: Kernel Density et ACP de l’hybridation 1

Pour réduire le bruit de fond présent sur les lames, les échantillons sont dans un premier

temps normalisés (Normalisation Quantile) on réalise ensuite un Fold Change (FC ≥2), c’est-

à-dire que le logiciel réalise un rapport entre témoin et traité (traité/témoin). Après ces étapes,

les points apparaissent plus proches sur l’ACP.

Figure 11: ACP des échantillons après normalisation Quantile et Fold Change ≥2

(échantillon 2 et 20 exclus)

Après constatation du nombre insuffisant de données lors de l’analyse sur Array Studio

(manque de témoin et à l’arrêt des échantillons 2 et 20), les données ne sont pas exportées sur

Ingenuity Pathway Analysis, logiciel d’analyse des gènes.

Un amendement à l’étude a été écrit pour réitérer les hybridations. La principale modification

apportée est l’ajout d’un même pool témoin sur chaque lame permettant de réduire « l’effet

lame » entre les échantillons.

III.2. Etude n°1 amendement n°1

Un pool des témoins est hybridé sur chaque lame en plus du témoin seul. L’échantillon

n°20 est déposé en duplicate technique car, suite à un incident technique lors de l’extraction,

l’échantillon n°19 (même produit même dose) n’a pas pu être retenu pour la suite de l’étude.


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Toutes les doses de 50, 100 et 300µM sont donc déposés en duplicate

technique pour chaque produit.

Hybridation:

Cinq microarrays sont cette fois ci nécessaires. Un problème technique est survenu

lors de l’hybridation des lames : les systèmes de fermeture des chambres n’ont pas été assez

serrés. Ainsi, lors du lavage des lames, les microarrays ont été exposés quelques secondes à

l’air libre. Malgré tout, ce problème technique ne semble pas avoir affecté la manipulation car

les résultats de QC des microarrays sont corrects. Quelques échantillons ne sont pas parfaits

au niveau des QC comme les échantillons 27, 7, 11 les témoins 1a, 2a, et les pools de témoins

b, c et d. Tous les échantillons sont importés sur Array Studio.

témoin

POOL_a

Produit 4 [100]

34

Produit 2 [50]

16(1)

Produit 1 [100]

10

Produit 5 [100]

42

témoin

1(2)

Produit 5 [300]

44

Produit 3 [50]

23

Produit 3 [100]

26

Produit 4[300]

36

Produit 5 [50]

40

témoin

1(1)

Produit 1 [300]

11

Produit 3 [100]

25

Produit 4 [50]

31

témoin

POOL_d

Produit 1 [50]

7

Produit 2 [50]

16 (2)

témoin

POOL_b

Produit 3 [300]

27

Produit 5 [300]

43

Produit 3 [50]

24

Produit 1 [50]

8

témoin

2(2)

témoin

2(1)

Produit 5 [50]

39

Produit 4 [100]

33

Produit 1 [300]

12

Produit 2 [100]

18

Produit 4 [300]

35

témoin

POOL_e

Produit 2 [300]

20(2)

Produit 2 [300]

20(1)

Produit 4 [50]

32

Produit 3 [300]

28

témoin

POOL_c

Produit 5 [100]

41

témoin

4

Produit 1 [100]

9

Produit 2 [100]

17

2

5

3

9

4

9

4

1

1

2

8

3

2

5

3

9

4

9

4

1

1

2

4

7

2

5

3

9

4

9

4

1

1

2

8

4

2

5

3

9

4

9

4

1

1

2

4

8

2

5

3

9

4

9

4

1

1

2

4

6 Figure 12: Plan d’hybridation de l’amendement n°1

Analyse sur Array Studio:

Le Kernel Density et l’ACP ne révèlent pas de « points aberrants » cette fois ci, tous les

échantillons seront donc analysés.

Figure 13: Kernel Density et ACP de l’hybridation 2


17

On réalise donc les Fold Change (FC≥2) sur les échantillons

normalisés (Normalisation Quantile). Les ACP semblent se rapprocher de ceux de l’étude n°1.

Comparaison des résultats :

Les tableaux d’ACP des deux études sont combinés. L’ACP issue de cette

combinaison montre la reproductibilité des hybridations. Les mêmes points, même produit

même dose, se positionnent presque identiquement sur les deux hybridations.

Figure 14: ACP de la combinaison des deux hybridations sous 2 angles de vue

différents.

Le tableau de la combinaison est ensuite exporté vers Ingenuity pour une analyse plus précise

des gènes.

Ingenuity:

Le logiciel, Ingenuity Pathway Analysis™ (IPA) permet de comprendre, modéliser et

observer les systèmes biologiques et biochimiques engagés. Il permet également d’avoir un

aperçu des interactions moléculaires et chimiques, des phénotypes cellulaires et des processus

pathologiques du système étudié.

Ce traitement des données nous renseigne sur l’impact de chaque produit en fonction

des cytotoxicités, des organes cibles et des gènes atteints.

A la fin de chaque analyse de produit, une fiche résumé du produit est créé renseignant toutes

les données concernant le produit, cytotoxicité, principaux gènes modifiés, effets remarqués

lors des tests in vivo, voies engagées lors de la réponse, etc. Cette fiche nous permet de

comparer les réponses vivo et vitro.

Pour l’analyse des données avec IPA, il est important de tenir compte de la p-value

fournie par le logiciel. Plus celle-ci est faible plus l’interaction entre gènes est robuste et

indique une voie métabolique toxique ou biochimique.


18

III.3. Analyse des résultats

Produit 1 :

301 -7,87 1033 -10,89 1169 -27,9

1117 22,67 563 17,27 989 11,98

PCK1

G6PC

GRIN2D

C2orf54

GNMT

AKR1D1

RTP3

ADH1B

CYP7A1

C3P1

NOV

KCNQ1

CCL3

HDAC9

Q6TXI9

TAC1

TRIM63

MMP10

LOXHD1

KLK1

représsion du gène ≤ -2

Gènes

Total par dose

-14,62

-15,89

-20,94

7,51

8,12

8,70

8,97

9,52

induction du gène ≥ 2

3,34

-21,44

-22,53

-27,91

-6,60

-10,89

11,48

1,15

1,15

2,37

3,84

4,04

1,13

Doses

ATP cytotox

down

up

-2,58

-7,15

-4,88

-3,05

5,43

3,92

Top 10

gènes par

dose

down

up

8,10

-1,04

4,59

5,44

1,12

32 35

-6,35

-6,36

-9,88

-4,83

Produit 1

50µM 100µM 300µM

31

1418 1596 2158

-3,57

-5,20

-4,84

-3,03

-4,89

-7,87

-1,01

-1,05

1,86

4,59

4,97

-1,14

3,58

-7,45

-3,33

-4,08

-10,54

7,70

10,48

11,98

-11,82

-12,51

-12,53

-13,90

Tableau 2: Principales modifications transcriptionnelles avec le Produit 1(Array Studio)

L’analyse du tableau ci-dessus montre que le nombre de gènes modulés varie en

fonction de la concentration du produit. La modulation des gènes est donc dose-reliée pour le

produit 1. En effet, plus la dose de Produit 1 est élevé plus le nombre de gènes modifiés au

total est important. Les gènes modulés nous renseignent sur les effets transcriptomiques du

Produit sur les cellules. Les gènes modulés sont impliqués dans des phénomènes de stéatose.

Le gène G6PC (Glucose-6-Phosphate, catalytic subunit) code pour une enzyme

nécessaire à l’utilisation des graisses pour fournir de l’énergie. La répression de ce gène

empêche cette transformation, les graisses sont alors accumulées au niveau du foie et des

reins, caractéristique de la stéatose.

Le gène ARK1D1 (Aldo-keto reductase family1, member D1 (delta 4-3

ketoseroid-5-bêta-reductase)) code pour une enzyme dont la carence contribue à un

disfonctionnement hépatique. Les gènes CCL3 (chemokine (C-C motif) liguand3), TAC1

(Tachykinin, precursor1) et DEFB103B (defensin, béta103B) sont des gènes impliqués dans

la réponse immunitaire, inflammatoire. Ils reflètent donc la toxicité du produit.

Doses

nombre de gènes p-value nombre de gènes p-value nombre de gènes p-value

lipid metabolims 115 1,01E-15 139 6,39E-16 242 2,90E-14

small molecular biochemistry 64 1,01E-15 65 6,30E-16 90 2,90E-14

vitamin and mineral metabolism 103 1,16E-06 184 2,25E-08 293 1,22E-10

molecular transport 103 1,16E-06 184 2,25E-08 293 1,22E-10

liver cholestasis 13 8,10E-04 18 6,70E-07 29 4,46E-10

liver cirrhosis 10 2,26E-02 13 4,41E-02 26 1,29E-04

liver steatosis 18 3,50E-02 23 4,60E-03 35 1,18E-03

liver inflammation / Hepatisis 18 3,62E-02 23 4,81E-03 34 2,41E-03

superpathways of cholesterol biosynthesis 17 7,90E-19 17 6,20E-18 15 1,10E-11

cholesterol biosynthesis I 11 1,01E-13 11 3,80E-13 9 8,12E-08

cholesterol biosynthesis II 11 1,01E-13 11 3,80E-13 9 8,12E-08

cholesterol biosynthesis II 11 1,01E-13 11 3,80E-13 9 8,12E-08

Canonical

Pathways

Tox Function

Produit 1

Bio Function

50µM 100µM 300µM

Tableau 3 : Principales modifications en nombre de gènes avec le Produit 1 (IPA)


19

Les informations fournies par IPA confirment les premières

analyses quantitatives. Le Produit 1 engendre bien une stéatose, en effet, le nombre de gènes

dans la catégorie « liver steatosis » double entre la dose de 50µM et celle de 300µM ,18

gènes contre 35 à 300µM. Le métabolisme des lipides notamment du cholestérol, est

également fortement induit, le nombre de gènes modulés passe de 115 à 242 entre

respectivement 50 et 100µM. Le caractère hépatotoxique est lui aussi confirmé par le nombre

de gènes entrant dans la catégorie « liver inflammation / hepatisis » qui double à la forte dose.

Ces résultats sont cohérents avec les résultats des études in vivo réalisées chez le rat

lors des études préclinique de toxicologie. En effet, les paramètres évalués dans ces études

avaient mis en évidence de la stéatose et une hypercholestérolémie.

Produit 2 :

183 -5,66 721 -13,84 3709 -873

1344 98,83 1438 61,21 4654 687,7

ABCG8

CYP8B1

ARG1

G6PC

GLYAT

SLC2A2

SLC17A4

HMGCS2

PRR15L

ADH1B

MMP10

IL1RL1

ICAM4

GFPT2

OLAH

IGFBP1

MMP1

DEFB103B

RSAD2

PTX3


Gènes

Total par dose

-270,85

-276,08

-276,58

81,58

98,98

128,05

160,92

179,29


3,58

-280,95

-614,26

-872,51

-2,01

-3,21

544,38

6,55

1,87

4,78

1,59

1,52

2,07

Doses

ATP cytotox

down

up

-1,63

-1,00

-1,57

-1,19

-1,19

1,82

Top 10

gènes par

dose

down

up

96,76

8,59

6,03

5,53

-1,83

36 67

-8,00

-4,68

-2,24

-2,83

Produit 2

50µM 100µM 300µM

30

1527 2159 8363

-1,39

-2,24

-1,62

-1,19

-1,15

-1,36

5,95

31,98

10,59

1,43

9,09

1,18

8,96

-1,72

-4,66

-2,67

-3,17

91,22

182,93

687,74

-201,49

-203,74

-211,52

-219,22

Tableau 4 : Principales modifications transcriptionnelles avec le produit 2(Array Studio)

Le nombre de gènes modulés par le Produit 2 est dose-reliée, il y a 5,5 fois plus de

gènes modulés à la dose de 300µM qu’à celle de 50µM. Le Produit 2 a un effet sur la réponse

transcriptomique des cellules HepaRG.

Les gènes inscrits dans le tableau sont principalement représentatifs d’une hyperplasie,

d’une cholestase, d’une dégradation de la matrice extracellulaire et d’une stéatose qui révèlent

l’hépatotoxicité du Produit 2.

Le gène IGFBP1 (Insulin-like growth factor binding protein 1) code pour une

protéine qui stimule la prolifération et la différenciation cellulaire. L’induction de ce gène

augmente la prolifération cellulaire ce qui explique l’hyperplasie, l’augmentation de la taille

d'un tissu ou d'un organe due à une augmentation du nombre de ses cellules.

L’ensemble de la modulation des gènes G6PC (Glucose-6-Phosphate, catalytic

subunit), SLC2A2 (Solute Carrier family 2 (facilitated glucose transporteur), member2),

HMGSS2 (3 hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (mitochondrial)), ADH1B (Alcohol


20

dehydrogenase 1B (class1), béta polypeptide) et GFPT2 (Glutamine-

Fructose-6-Phosphate transaminase 2) sont signature d’un effet stéatosant. Le gène G6PC

code pour une enzyme nécessaire pour utiliser les graisses comme source d’énergie, la

répression de celui-ci va induire un stockage des graisses dans le foie et les reins. Le gène

SLC2A2 code pour un transporteur du glucose, qui exporte le glucose du foie vers le sang, la

répression de ce gène provoque également une accumulation de glucose dans le foie

(néoglucogénèse).

Les gènes MMP10 (MMP10 (Matrix metallopeptidase 10(stromelysin2)) et MMP1

(Matrix Metallopeptidase 1 (intersticial collagénase)) sont responsables de la dégradation de

la matrice extracellulaire.

Les gènes ABCG8 (ATP Binding Cassette, sub-family G (white), member 8) et

CYP8B1 (Cytochrome P450, family 8, subfamily B, polypeptide 1) ont un rôle dans la

concentration et l’excrétion des acides biliaires, leur dérégulation peut entraîner de la

choléstase. Celle-ci correspond à un défaut de transport des acides biliaires dans le foie.

Les gènes ICAM4 (Intercellular Adhesion Molecule 4 (landsteiner-wiener blood

group), DEFB103B (defensin, béta103B), RSAD2 (Radical S-Adenosyl methionine Domain

containing 2) et PTX3 (Pentroxin 3, long) codent pour des protéines inflammatoires

hépatiques. L’induction de ceux-ci révèle un effet toxique du Produit 2 sur les cellules

d’HepaRG.

Doses


cellular movement 62 3,50E-03 254 1,04E-06 956 1,50E-23

cell death and survival 58 9,60E-04 345 2,04E-05 1422 2,28E-16

lipid metabolism 114 4,43E-06 208 3,74E-09 665 4,75E-12


liver necrosis / cell death 18 5,50E-02 38 6,34E-05 123 2,60E-09

liver proliferation 9 5,37E-01 22 1,36E-01 97 9,06E-08

liver damage 13 4,90E-02 29 9,60E-04 89 1,30E-06


LXR / RXR Activation 11 2,60E-02 20 1,55E-03 74 2,04E-12

FXR / RXR Activation 5 3,39E-01 20 5,40E-06 53 1,35E-10

superpathway of melatonin degradation 3 4,23E-01 17 1,86E-07 37 2,73E-10

acute phase response signaling 17 2,07E-01 90 6,28E-10

Tox Function

Canonical

Pathways

Bio Function

Produit 2

100µM50µM 300µM


Les données d’IPA confirment la première analyse des résultats faite avec

ArrayStudio. En effet, les principaux gènes modulés entrent dans les voies de signalisation de

la stéatose et de l’hyperplasie caractérisées dans IPA par « liver proliferation », de la

cholestase avec « liver cholestasis », et de la dégradation des membranes extracellulaires avec

« cell death » ainsi que l’inflammation avec « acute phase response signaling ».

L’augmentation de chacune des voies représentées est dose-reliée ce qui explique que la

toxicité du Produit 2 augmente proportionnellement avec la concentration.

Ces résultats ne semblent pas totalement concordants avec ceux obtenus lors de

précédentes études in vivo. En effet, l’étude de Dose Ranging (DR) réalisée sur rat n’a mis en

évidence qu’une hyperplasie et l’apparition de lésions cutanées. Cela peut être dû à une

exposition in vivo inférieure aux concentrations étudiées in vitro.


21

Produit 3 :

112 -6,14 377 -9,69 1561 -54,7

1020 87,65 497 70,1 1636 45,25

CYP7A1

HAO2

TMEM120A

IGFBP5

PRSS23

LINC00087

HMGCS2

MRC1

ARIH2

SLC14A1

CHAC1

FUT1

HDGFRP3

SLC7A5

FGF21

SLC6A9

CHAC1

GFPT2

FAM129A

S100P


Gènes

Total par dose

-21,02

-21,46

-22,78

22,58

28,57

36,81

36,92

36,97


1,69

-23,70

-32,46

-54,67

-2,08

-9,69

42,41

1,20

1,64

1,95

1,91

2,20

1,20

Doses

ATP cytotox

down

up

1,05

-1,96

-1,39

1,12

2,16

1,32

Top 10

gènes par

dose

down

up

25,63

-1,17

2,55

4,26

1,40

35 33

-2,24

-3,01

-1,33

-1,25

Produit 3

50µM 100µM 300µM

34

1132 874 3197

-1,13

-1,42

-2,19

-1,03

-1,40

-6,14

2,05

2,94

4,28

3,90

5,08

2,77

4,62

-2,44

-1,26

-1,54

-2,23

22,75

37,28

45,25

-19,33

-19,95

-20,54

-20,72

Tableau 6 : Principales modifications transcriptionnelles avec le Produit 3(Array Studio)

Le Produit 3 n’entraine pas de modulation génétique dose-reliée, en effet il y a plus de

gènes modulés à la faible concentration (1132 gènes) qu’à la concentration intermédiaire (874

gènes).

Les gènes les plus modulés sont ceux intervenants dans l’hyperplasie et la stéatose à la

forte dose du Produit 3.

Les gènes induits, représentatifs de l’hyperplasie sont HDGFRP3 (Hepatoma-

derived growth factor, related protein 3), SLC7A5 (Amino Acid Transporter light Chain, L

system) et S100P (S100 Calcium binding protein P). Le gène HDGFRP3 active la synthèse

d’ADN et joue un rôle important dans la prolifération cellulaire. SLC7A5 participe à la

différenciation et la reprogrammation métabolique des cellules. S100P est un des gènes

responsables du cycle cellulaire et de leur différenciation.

La stéatose peut s’expliquer par la répression des gènes HAO2 (Hydroxyacid

oxidase 2) et HMGCS2 (3-hydroxy-3méthyl-glutaryl-CoA-Synthetase 2) qui codent tous deux

pour des enzymes et protéines qui interviennent dans le métabolisme des acides-gras.

Doses




small molecular biochemistry 69 3,50E-05 113 1,67E-07 482 1,03E-11

amino acid metabolism 22 3,15E-02 31 7,34E-05 95 9,96E-11



liver hyperplasia 13 6,50E-02 19 3,36E-01 98 4,58E-03

glutathione depletion in liver 2 1,54E-01 4 5,96E-02 9 5,34E-03

LPS/IL-1 inhibition of RXR function 0 12 1,25E-02 57 9,23E-11

nicotine degradation II 6 4,12E-03 5 1,46E-02 24 2,80E-10

bupoprion degradation 4 6,15E-03 5 5,89E-04 15 7,19E-09

acetone degradation I 4 6,15E-03 5 5,89E-04 15 7,19E-09

300µM

Produit 3

Tox Function

Canonical

Pathways

Bio Function

50µM 100µM



22

Les renseignements fournis par IPA corroborent les

observations réalisées avec les données d’ArrayStudio. Les gènes modulés par le Produit 3

appartiennent aux voies de signalisation cellulaires de la stéatose, de l’hyperplaise et de la

cholestase hépatique.

La stéatose et l’hyperplasie sont également renseignées dans les rapports des études in

vivo, alors qu’aucune cholestase n’y est mentionnée. La comparaison des études met en avant

la similarité des résultats. Cependant les fold change des modulations in vivo sont beaucoup

plus importants que ceux in vitro. Ces variations peuvent s’expliquer par la différence de

temps de traitement, car in vivo la durée de traitement de l’étude comparative est de 14 jours

contre 24heures de traitement pour l’étude sur HepaRG.

Produit 4 :

195 -6,69 274 -6,77 2317 -571

521 19,18 534 21,11 3328 444,7

G6PC

ABCG8

ARG1

AGXT2

CYP8B1

ADH1B

CLDN14

GLYAT

PLA2G12B

ADH1A

DEFB103B

MMP10

PTX3

TAC1

GFPT2

SLC7A5

IL1RL1

IGFBP1

IFITM10

KYNU


Gènes

Total par dose

-245,88

-268,89

-345,38

31,72

41,38

47,98

59,35

67,86


1,68

-428,58

-444,64

-570,88

-1,55

-1,65

171,67

1,55

1,60

-1,13

1,47

1,77

1,15

Doses

ATP cytotox

down

up

1,05

1,07

-1,15

1,13

1,49

1,35

Top 10

gènes par

dose

down

up

36,03

1,76

1,16

2,23

2,56

31 52

-1,09

-1,18

-1,35

-1,40

Produit 4

50µM 100µM 300µM

32

716 808 5645

-1,04

1,01

-1,03

-1,07

-1,10

-1,02

3,17

2,32

-1,26

1,23

1,14

2,91

1,71

1,09

-1,24

-1,23

-1,22

34,02

68,77

444,66

-147,75

-152,38

-159,99

-206,89

Tableau 8 : Principales modifications transcriptionnelles avec le Produit 4(Array Studio)

Le Produit 4 induit une réponse dose-reliée. En effet, plus la concentration du produit

est élevée plus la réponse est importante. Cependant, il n’y a pas de grosse différence dans le

nombre de gènes modulés pour les concentrations de 50µM (716) et 100µM (808). Les gènes

mis en avant dans le tableau 8, pour la forte dose sont signe d’hyperplasie, de cholestase, de

stéatose, de dégradation des membranes extracellulaire et d’une toxicité du produit.

Le gène IGFBP1 (Insulin-like growth factor binding protein 1) code pour une

protéine stimulant la prolifération et la différenciation cellulaire. Son induction favorise donc

l’hyperplasie.

Le gène MMP10 (MMP10 (Matrix metallopeptidase 10(stromelysin2)) est

responsable de la dégradation de la matrice extracellulaire.


23

Les gènes : G6PC (Glucose-6-Phosphate, catalytic

subunit), ADH1B (Alcohol dehydrogenase 1B (class1), béta polypeptide),

GFPT2 (Glutamine-Fructose-6-Phosphate transaminase 2), AGXT2 (Alanine-glycoxylate

aminotransférase2), PLA2G12B (Phospholipase A2, group XIIB) et ADH1A (Alcohol

dehydrogenase 1A c (classe I), beta polypeptide) sont des gènes signatures d’une stéatose. Ce

dernier code pour une enzyme qui catalyse les produits lipidiques, sa répression provoque

donc une accumulation de lipides entrainant une stéatose.

Les gènes ABCG8 (ATP Binding Cassette, sub-family G (white), member 8) et

CYP8B1 (Cytochrome P450, family 8, subfamily B, polypeptide 1) régulent la concentration

et l’excrétion des acides biliaires, leur répression peut provoquer une cholestase.

Les gènes DEFB103B (defensin, béta103B), PTX3 (Pentroxin 3, long), TAC1

(Tachykinin, precursor1) et SLC7A5 (Amino Acid Transporter light Chain, L system) codent

pour des signaux inflammatoires, hépatiques.

Doses




small molecule 29 6,60E-03 25 6,17E-03 658 2,60E-13

vitamin and mineral 3 8,70E-03 7 1,30E-02 168 8,00E-13


liver hyperplasia / 6 8,80E-02 8 3,20E-01 197 4,37E-08

hepatocellular carcinome 2 2,40E-01 7 3,20E-01 137 6,40E-06

liver cirrhosis 6 8,17E-02 3 5,70E-01 56 9,30E-04

FXR / RXR Activation 49 8,60E-14

LXR / RXR Activation 63 2,29E-13

LPS/IL-1 Mediated 84 2,05E-14

nicotine degradation II 32 7,90E-11

50µM 100µM 300µM

Produit 4

Canonical

Pathways

Tox Function

Bio Function


Identiquement à la modulation des gènes, le nombre de gènes engagés dans les voies

métaboliques est équivalent pour les doses de 50µM et 100µM. Le nombre de gènes engagées

suite au traitement des HepaRG avec le Produit 4 à la dose de 300µM est très important

reflétant ainsi sa toxicité à la forte dose. Le Produit 4 engendre de la cholestase et de

l’hyperplasie. On note la présence d’une cirrhose, cette maladie peut résulter de

l’accumulation de graisses dans le foie, tout comme la stéatose.

Ces analyses sont cohérentes avec les études in vivo. En effet, les rapports désignent la

présence d’hyperplasie, de cellules inflammatoires de lésions cutanées et d’une augmentation

de la concentration en Triglycéride. Il n’y a cependant aucune observation de cholestase.

/wiki/St%C3%A9atose_h%C3%A9patique


24

Produit 5 :

207 -4,91 359 -6,03 208 -8,42

479 16,36 545 19,81 1234 35,84

CYP7A1

ARG1

C3P1

PCK1

NR0B2

GNMT

THRSP

ADH4

C2orf54

AKR1D1

FAM107A

MMP10

ASPN

GLP2R

C8orf48

C6orf220

LRRC1

STMN4

FAM123C

OR1L3


Gènes

Total par dose

-6,38

-6,49

-6,62

11,82

14,00

14,23

14,38

14,44


1,84

-7,53

-7,60

-8,42

-2,47

-3,21

20,43

-1,01

-1,05

1,39

2,22

-1,18

-2,18

Doses

ATP cytotox

down

up

-1,51

-1,67

-2,30

-1,70

-1,03

1,82

Top 10

gènes par

dose

down

up

13,93

1,08

1,84

4,89

1,00

28 28

-3,19

-3,43

-2,95

-3,47

Produit 5

50µM 100µM 300µM

26

686 904 1442

-1,96

-2,41

-2,20

-2,07

-1,62

-2,20

-1,28

1,02

4,48

1,49

-1,04

1,04

1,06

-2,77

-2,37

-2,47

-3,65

12,51

15,84

35,84

-4,57

-4,88

-4,95

-5,05

Tableau10 : Principales modifications transcriptionnelles avec le Produit 5(ArrayStudio)

Le Produit 5 induit une réponse dose-reliée. Les gènes présents dans le tableau ci-

dessus (tableau 10) révèlent un début de cholestase ainsi qu’une dégradation de la matrice

extracellulaire.

Le gène AKR1D1 (aldo-keto reductase family 1, member D1 (delta 4-3

ketosteroid-5-bêta reductase) faiblement réprimé, présume une légère cholestase et un début

de dysfonctionnement hépatique.

Le gène MMP10 (MMP10 (Matrix metallopeptidase 10(stromelysin2)) est quant à

lui responsable de la dégradation de la matrice extracellulaire.

Doses


Energy Production 1 1,70E-02 4 1,18E-02 24 3,49E-06

Small molecule chemistry 22 1,60E-04 55 4,40E-04 142 3,49E-06

Amino Acid Metabolism 6 1,68E-02 11 4,40E-04 39 5,84E-05

Cell-to-cell signaling and interaction 36 3,30E-03 97 8,22E-04 160 1,59E-04


liver damage 4 2,90E-01 10 1,31E-02 16 5,55E-03

liver inflammation / Hepatisis 4 1,29E-01 9 5,66E-02 17 1,01E,2


FXR / RXR Activation 2 3,80E-01 5 7,30E-02 14 8,20E-06

Citruline Byosynthesis 2 1,57E-02 4 1,26E-04

Superpathways of citruline metabolism 1 2,00E-01 2 5,20E-02 5 1,70E-04

retinoate biosynthesis I 1 3,38E-01 2 1,50E-01 6 5,36E-04

Canonical

Pathways

Tox Function

Bio Function

Produit 5

50µM 100µM 300µM


Les informations provenant d’IPA confirment que le Produit 5 ne déclenche pas

d’importante toxicité pour les cellules. En effet, les fonctions toxicologiques modifiées

représentées dans le tableau comme la cholestase, la séatose ou encore l’inflammation du foie

ne sont que très peu modifiées, et ce pour les trois doses. Même à la forte dose, au maximum


25

17 gènes sont engagés dans les fonctions toxicologiques contre une

cinquantaine de molécules pour le Produit 3.

Les principales observations recueillies lors des études in vivo concernent l’aspect des

organes cibles comme le foie ou encore les poumons. Ces études sont cohérentes, elles ne

révèlent pas d’effet toxicologique important du Produit 5.

Comparaison de la toxicité des 5 produits SERVIER testés :

Figure 15 : Diagrammes des principales catégories de toxicité hépatique modulées (IPA)

L’observation des résultats pour chaque produit permet de mettre en évidence que le

Produit 2 est le plus toxique des 5. Par ordre de toxicité on trouve ensuite le Produit 4 puis le

3, le 1 et pour finir le Produit 5.

Figure 16: Graphique illustrant la relation entre cytotoxicité et modulation des gènes,

pour chaque produit et à chaque dose sur les cellules HepaRG


26

Les résultats des tests ATP de la figure 16 confirment l’analyse

de la figure 15, les Produits 2 et 4 sont les plus cytotoxiques à la forte dose. Les doses de

50µM et 100µM sont équivalentes en terme de cytotoxicité pour les 5 produits, celle-ci ne

varie que de 10% au maximum entre les différents Produits. De plus, ce graphique met en

évidence que la cytotoxicité n’influe pas sur le nombre de gènes modulés. En effet, la

cytotoxicité du Produit 3 dimunue de 2% entre la forte dose et la dose intermédiaire alors que

le nombre de gènes est lui triplé entre ces mêmes doses. Il n’y a donc pas de cause à effet

entre cytotoxicité et nombre de gènes modulés.

III.4. Suite du projet

A la suite du premier travail sur HepaRG frais (Amendement 1), de nouvelles études

ont été réalisées dans le but de comparer les réponses de modèles cellulaires différents

(HepaRG frais, congelés, Hépatocytes primaires de rat) ainsi que les réponses de 3 autres

produits Servier.

Le critère congélation décongélation des HepaRG a été analysé. En effet, nous avons

analysé la réponse transcriptomique de cellules « fraiches » et de cellules « congelées »

traitées avec le même produit aux mêmes doses. Le but final était de vérifier que la

congélation des HepaRG n’empêche pas la modification de leur réponse transcriptomique à

un xénobiotique.

Il a également été proposé de comparer les réponses de deux modèles cellulaires, les

HepaRG et les Hépatocytes primaire de rat. Les Hépatocytes primaires de rat ont été obtenus

après perfusion de foie de rat à la collagénase de type IV. Les deux modèles ont été traités

dans les mêmes conditions avec les mêmes produits, mêmes doses et mêmes temps de

traitement.

IV – Conclusion et Discussion

L’objectif de mon apprentissage était d’évaluer et de comparer la toxicité de produits

SERVIER sur des cellules humaines, HepaRG et sur des hépatocytes primaires de rat à

différentes concentrations.

A l’issue de cette année d’apprentissage, le projet a bien été réalisé mais de nombreux points

ont été soulignés à propos des techniques et du déroulement des études.

Les conclusions des comparaisons effectuées se sont avérées encourageantes. En

effet, les résultats des tests vivo et des tests sur cellules HepaRG coïncident. Les HepaRG

semblent être un bon modèle de prédiction des effets toxique ou non toxique d’un produit. A

la vue de ces analyses, il serait intéressant de proposer ce modèle cellulaire comme premier

test de « screening ». C’est-à-dire de tester les produits à différentes doses sur HepaRG pour

établir un premier rapport sur les doses critiques et ainsi avoir un ordre de grandeur des doses

possible à administrer aux animaux.

La technique des microarrays est délicate, le moindre détail influence les résultats.

L’opérateur, les lots de réactifs, les lavages, les tampons ou encore les lots de lames sont

autant de critères qui influencent les résultats obtenus lors des hybridations. Les biais causés

rendent l’analyse difficile, parfois même impossible et nécessitent de réitérer des

hybridations.


27

Les étapes de cultures cellulaires et de traitement apportent

également un biais dans l’analyse. En effet, l’utilisation de cellules HepaRG de passages

différents, l’usage d’un produit dont les dates de préparation varient en fonction du jour de

traitement ou encore, les multiples dates d’extractions de l’ARN influencent les analyses. Il

est donc parfois délicat d’évaluer si la réponse obtenue est une réponse causée par le produit

ou si celle-ci est due, par exemple, à une culture cellulaire en moins bon état lors d’un

traitement.

Malgré les options de « correction » des logiciels, il n’existe pas de méthodes

permettant de mettre en évidence et de supprimer les biais techniques pouvant impacter

l’analyse. Le meilleur moyen d’obtenir des résultats les plus fiables possibles reste de

réfléchir aux études souhaitées et d’organiser au mieux les différentes étapes de celles-ci, de

la manipulation à l’analyse pour avoir le moins de biais possible.


28

Webographie / Bibliographie

http://www.em-consulte.com/en/article/156154

Hepatocytes Methods and protocols edited by Patrick Maurel (Methods in Molecular Biology

640)

Biologie moléculaire de la cellule 3e Edition, de Boeck

http://www.nature.com/ni/journal/v14/n5/full/ni.2594.html

http://www.jimmunol.org/content/182/1/466.long


Expression and Transport Function of Drug Uptake Transporters in Differentiated HepaRG

cells (Molecular Pharmaceutics, 2012 Nov 6, Kotani N et al)

Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the

mRNA and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of

human hepatotoxins (Cell Biol Toxicol 2012, Gerets HH et al)

Three-Dimensional HepaRG Model as an Attractive Tool for Toxicity Testing (Toxicological

science 2012, Leite S B. et al)

The HepaRG cell line: a unique in vitro tool for understanding drug metabolism and

toxicology in human (INSERM 06/21/12, informa healthcare, Anderson T B et al)

Drug metabolism and disposition (American Society for Pharmacology and Experiments

Therapeutics)

The human hepatoma HepaRG cells: a highly differenciated model for studies of liver

metabolism and toxicity of xenobiotics (ELSEVIER, 2007, Guillouzo A et al)

Evaluation of HepaRG Cells as an in Vitro Model for Human Drug Metabolism Studies (The

American Society for Pharmacology and Experiments Therapeutics, 2008, Kajsa P et al)

http://www.nature.com/ni/journal/v14/n5/full/ni.2594.html

http://www.jimmunol.org/content/182/1/466.long


/pubmed?term=Kotani%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22897388

/pubmed?term=Gerets%20HH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22258563

/search?author1=Sofia+B.+Leite&sortspec=date&submit=Submit

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