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Laboratoire National de Référence

Nématodes phytoparasites sur toutes matrices

Rapport annuel d'activité, année 2013

A. Introduction

Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de

l'existence du mandat de LNR

De nombreux nématodes sont réglementés de quarantaine dans de le cadre de la

directive européenne 2000/29/CE.

Les faits marquants de l'année

Plusieurs événements ont marqué l’année 2013. On retiendra en particulier l’inflexion

des activités de l’unité pour le développement de la recherche en partenariat avec

l’INRA de Rennes (projet de recherche soutenu par le département SPE de l’INRA).

Cette inflexion s’est traduite aussi par l’initiation d’une dynamique de publication

récompensée par l’acceptation de deux publications d’articles de recherche dans des

revues internationales à comité de lecture. La mise en délégation d’analyses

officielles a également évoluée cette année avec la délégation des analyses relatives

à l'identification des nématodes de quarantaine G. pallida et G. rostochiensis

(constitution d’un réseau de 2 laboratoires agréés). L’unité a poursuivi le

développement de son rayonnement à l’international notamment par l’organisation

d’EILA portant sur le genre Globodera (près de 20 laboratoires étrangers

participants) et d’une formation dispensée dans le cadre d’une mission de

coopération avec le Maroc. Elle a aussi participé au panel de nématologie de l’OEPP

à Poznan (Pologne), au congrès « Pine Wilt Disease » (Allemagne), à un jumelage

avec l’Ukraine et au projet Euphresco « Meloidogyne enterolobii ». Parmi les autres

événements marquants, on notera aussi la réalisation de la première campagne de

détection du nématode du pin dans son insecte vecteur. Une méthode de semi-

quantification des niveaux de populations de Meloidogyne chitwoodi et M. fallax a été

2

mise au point et utilisée dans le cadre d’expérimentations officielles conduites en

champs. On relèvera enfin, le dépôt du dossier de demande d'agrément 2008-61 de

l’unité auprès du SRAl de Bretagne et les aménagements de trois nouvelles zones

de laboratoire initiées fin 2013.

B. Activités de développement, d'analyse et d'EST

1. Méthodes disponibles au LNR

1.1. INDICATEUR COP Référence n°1

Indicateur COP Référence n°1-i) Précisez ici le nombre de méthodes

développées ou révisées que vous avez proposées à l’autorité compétente au

cours de l’année N

0

Indicateur COP Référence n°1-ii) Précisez ici le nombre de méthodes

développées ou révisées qui sont susceptibles d’être prêtes pour être

proposées à l’autorité compétente au cours de l’année N+1

1

Donner le nom et une brève description de chacune de ces méthodes

Identification de Meloidogyne chitwoodi et M. fallax

1.2. Matériels biologiques ou chimiques, matériaux de référence et échantillons

et souches d'intérêt

Décrire ici les collections d'échantillons biologiques ou d'autre nature

(environnement, aliment...) conservés par le LNR; indiquer les méthodes de

conservation, la température, le nombre de "repositories", le nombre

d'échantillons par souche, l'enregistrement associé...).

Les nématodes à galles, parasites obligatoires, ne peuvent être conservés que sur

plantes hôtes. Le LSV- nématologie entretient une collection de 13 11 espèces de

Meloidogyne (33 populations) et 5 populations de Nacobbus aberrans multipliées sur

une douzaine d’espèces végétales, en serres tempérées (15 – 30°C). Deux espèces

du genre Ditylenchus (D.dipsaci et D.destructor) et quelques populations d’autres

espèces endoparasites obligatoires, sont également maintenues en collection

(Pratylenchus, Paratylenchus, Tylenchorhynchus, et Criconematidae).

3

Les nématodes à kystes (Globodera et Heterodera) sont multipliés en serre

tempérée sur plusieurs espèces végétales puis conservés au frais (2-9°C) sous

forme de kystes. Le LSV-nématologie possède une collection de 16 espèces de

nématodes à kystes (52 populations).

D’autres espèces sont maintenues in vitro : elles sont inoculées sur mycelium de

Botrytis cinerea sur milieu gélosé en boite de Pétri incubées en étuve entre 15 et

22°C. 5 espèces de Bursaphelenchus, 2 Ditylenchus, et 1 Aphelenchoides

(représentant 34 populations) sont ainsi maintenues en collection.

Tous ces élevages de collection font l’objet d’un enregistrement décrit dans le SMQ

du laboratoire (code unique identification, origine, suivi). Les opérations importantes

(repiquage, transplantation, récolte et analyses) font l’objet d’une traçabilité dans le

dossier de l’élevage

Nombre de souches/échantillons reçu(e)s et mises en collection dans l'année

7

Nombre de souches/échantillons maintenus au total

132

2. Activités d'analyses de première intention pour l'année N

Nombre d'analyses de première intention réalisées dans l'année, de biotypie,

sérotypie, caractérisation moléculaire...

2697

Détaillez ici par type d'analyse de première intention

Les principales analyses de première intention concernent :

La détection de Bursaphelenchus xylophilus par analyse morphobiométrique et PCR

conventionnelle (MOA020 partie B) avec 618 analyses

la semi-quantification de Meloidogyne chitwoodi et détection de M. fallax par PCR

temps réel dans le sol avec 609 analyses (réalisées principalement dans le cadre

d’expérimentaion en plein champ)

la détection et l’identification spécifique de nématodes phytoparasites du sol ou de

produits végétaux par morphologie et PCR conventionnelle avec 560 analyses

la détection de Bursaphelenchus xylophilus par PCR temps réel sur l’insecte vecteur

avec 309 analyses

4

L’identification de Globodera pallida et G. rostochiensis à partir de kystes isolés, par

morphologie et par technique moléculaire (selon MOA 019 partie B) avec 241

analyses.

3. Activités de confirmation et activités de laboratoire expert

3.1. Analyses de seconde intention

Nombre d'analyses de seconde intention réalisées dans l'année, de biotypie,

sérotypie, caractérisation moléculaire...

19

Détaillez ici par type d'analyse de confirmation

Confirmation d'identification de Ditylenchus dipsacii et confirmation de détection de

Meloidogyne chitwoodi et M. fallax

Taux de confirmations par type d’analyse (= nombre d’analyses confirmées /

nombre d’analyses de seconde intention réalisées)

94,7

3.2. Activités de production et de contrôle de matériaux de référence et de

réactifs biologiques, contribution à l’inspection, AMM

Le LNR produit-il et fournit-il des réactifs ?

Non

Le LNR fournit-il des matériaux de référence ?

Oui

Quelles sont les bases réglementaires, normatives ou infra-réglementaires

(notes de service) ?

Note de service DGAL/SDQPV/N2012-8074 du 27 mars 2012

Quels sont les types de matériaux de référence (MRE, MRI, contrôles positifs

5

ou négatifs, autre) produits et fournis ?

Matériel biologique, contrôles positifs ou de spécificité de PCR, contrôles positifs de

processus et témoins internes d'amplification.

Quel est le format (sérum, souche, produit chimique, autre) de ces matériaux

de référence ?

Tubercules contaminés, kystes, microtubes de lyophilisats, de solution

matrice/nématode cible ou de solution d’ADN génomique ou cloné.

Quel est le nombre de lots produits et fournis par an ?

(moyenne sur les 5 dernières années)

14

Quelles sont les quantités produites/fournies par lot ?

(moyenne sur les 5 dernières années)

200

Estimez le temps consacré à la production/mise à disposition ? (moyenne sur

les 5 dernières années)

12 jours de production, 5 de validation

Quels contrôles internes réalisez-vous sur ces matériaux de référence?

Vérification de l'identité et de la qualité des contrôles

A quels clients fournissez-vous ces matériaux de référence ?

Dans le cadre de l’animation du réseau de laboratoires agréés, un certain nombre de

témoins et de contrôles sont préparés, validés et envoyés aux laboratoires agréés.

MOA020 partie A (détection de Bursaphelenchus xylophilus) : 2 laboratoires

Données 2013 : Fourniture de témoins à un seul laboratoire : témoin de process

positifs élaborés et validés à partir d’échantillons de bois sains et de nématodes

issus des élevages de la collection : 100 microtubes d’extrait inoculé produits , 40

envoyés/ laboratoire

6

MOA024 partie A (détection de Meloidogyne chitwoodi et M.fallax par PCR

temps réel dans le sol) : 3 laboratoires

Contrôles positifs de process et Témoins Internes Amplification (TIA) ; 2 lots en

moyenne/an ; 300 unités par lot en moyenne; le matériel de référence est validé en

interne avant expédition. Le matériel est fourni au réseau des labos agréés (3

laboratoires) ; conditions de fourniture à la demande et gracieux pour la première

demande de l’année N.

NS/04/06 (détection de femelles de Meloidogyne dans des végétaux) : Fourniture

de 5 tubercules de pommes de terre contaminés par Meloidogyne incognita

(fourniture gratuite à la demande d’Eurofins). Validation en interne avant expédition.

MOA019 partie A (Détection de Globodera sp.) : 1 laboratoire

Pour référence, envoi d’éléments autres que des kystes de nématodes pouvant être

confondus avec des kystes de Globodera sp.

NS/01/05 ou MOA019 partie B (Identification Globodera pallida et G.

rostochiensis) : 1 laboratoire (1 envoi)

échantillons contenant 3 kystes d’un organisme cible ou non cible : 16 échantillons.

témoins positifs de PCR obtenus à partir d’ADN de Globodera pallida, G.

rostochiensis et G. tabacum

Validation du matériel d’extraction et/ou suivi de compétences des opérateurs :

3 laboratoires

En fonction des besoins (3 envois soit un total de 1350 kystes de Globodera sp.

stérilisés transmis)

MOA12 (Identification des groupes d’espèces du genre Heterodera) : 1

laboratoire

-3 échantillons contenant des kystes d’Heterodera appartenant respectivement aux

groupes d’espèces avenae, goettingiana et schachtii.

Sous quelles conditions fournissez-vous ces matériaux de référence (à la

demande, à titre gracieux, autres) ?

A la demande et à titre gracieux pour ce qui concerne les témoins relatifs aux MOA

dans la limite des besoins annuels liés aux analyses officielles (dans la limite d’un

envoi par an/laboratoire agréé).

Le LNR réalise-t-il des contrôles de réactifs commerciaux ?

Non

7

4. Analyse de l'évolution des tendances en termes d'activité

Détaillez ici l'analyse de l'évolution des tendances en termes d'activité

(augmentation, diminution... sur les 5 dernières années)

Ces 5 dernières années les mises en délégation des analyses officielles ont été

nourries puisque le nombre d’échantillons reçus a diminué pour passer de 2994 en

2009 à 1937 en 2013. A ce jour le volume analytique de l’unité est stabilisé et ne

devrait plus évoluer de manière très significative dans les années à venir. En effet,

les expérimentations réglementaires ou l’utilisation de nouveaux outils de détection

du nématode du pin dans son insecte vecteur ou la recrudescence d’analyses

réalisées pour le SIVEP compensent ces délégations.

5. Activités d'expertise scientifique et technique

5.1. Demandes d’expertise scientifique et technique du ministère (chargé de

l’agriculture, santé, etc…) ou d’instances communautaires et internationales

qui concernent votre domaine de compétence

Nombre de rapports d'EST rendus dans l'année

0

Détaillez ici les demandes d'EST et les noms des mandataires

Une note d’alerte a été émise en 2013 dans le cadre de l’activité de veille du

laboratoire et a concerné Meloidogyne fallax.

L’unité a apporté son expertise pour l’examen de 7 documents régionaux ou

internationaux (OEPP/IPPC).

5.2. Autres expertises

Les membres de l'équipe du LNR peuvent avoir des activités d'expertise

(internes: CES, GT ou externe: EFSA...) ou des activités auprès de

commissions de normalisation (Afnor...). Détaillez ici ces activités et estimez le

temps qui y est consacré.

Le laboratoire participe aussi à d’autres activités d’expertise en tant que membre de

groupe de travail pour la réalisation d’une Analyse de Risque Phytosanitaire sur le

nématode des tiges et bulbes (Ditylenchus dipsaci) sur luzerne (Medicago sativa) (4

8

jours), du groupe de travail pour le développement de protocoles de diagnostic à

l’échelon international –topic leader pour la nématologie (10 jours) et en tant que

membre du panel pour le diagnostic de nématodes de quarantaine (7 jours). Le

laboratoire a aussi participé au « workshop on the Management of Globodera

rostochiensis and G. pallida » associé au Panel on Phytosanitary Measures for

Potato de l’OEPP (3 jours).

5.3. Dossiers de demande d'agrément

Nombre de dossiers de demande d'agrément étudiés dans l'année

5

Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré.

En nématologie, l’unité a donné son avis sur la compétence des laboratoires

candidats aux agréments suivants :

Identification de Globodera pallida et G. rostochiensis pour les LDA 22 et LDA 67 (5

jours – mise en place de la délégation);

Détection de M. chitwoodi et M. fallax à partir de sol pour le LDA 67 et le Comité

Nord (10 jours – accompagnement des laboratoires);

Détection de Bursaphelenchus xylophilus pour le LDA 33- suivi modification/

MOA020 partie A (3 jours).

C. Animation du réseau de laboratoires officiels

5.4 Organisation d'EILA

INDICATEUR COP Référence n°2

Indicateur COP Référence n°2-a. Précisez ici le nombre d'EILA organisés par le

LNR au cours de l’année N

4

Ces EILA ont-ils été réalisés selon la norme 17043 (avec ou sans accréditation)

?

Non

9

Si vous n'êtes pas accrédité 17043, avez-vous bénéficié d'un audit interne ?

Non

Détaillez ici le nombre de laboratoires ayant participé pour chaque EILA; le

nombre de laboratoires ayant obtenu des résultats défavorables pour chaque

EILA; les actions mises en œuvre pour l'identification des causes et des

mesures correctives

1) détection de Bursaphelenchus xylophilus : 3 participants, aucun n'a obtenu de

résultats défavorables

2) Détection Globodera : 27 laboratoires ont participé dont 19 laboratoires étrangers

(Royaume Uni, Serbie, Belgique, Roumanie, République Tchèque, Slovénie,

Ukraine, Allemagne, Espagne, Lettonie, Irlande, Russie, Autriche et Suède). 1

laboratoire a obtenu des résultats défavorables et a nécessité la mise en place

d'actions correctives : amélioration des dispositions techniques pour éviter les

contaminations croisées au cours du processus d’analyse)

3) Détection de M. chitwoodi et M. fallax dans sol : 4 participants, analyse des

résultats en cours

4) Identification Globodera pallida et rostochiensis : 20 laboratoires ont participé dont

17 laboratoires étrangers (Pays Bas, Lituanie, Royaume Uni, Danemark, Croatie,

Roumanie, République Tchèque, Slovénie, Allemagne, Espagne, Lettonie, Irlande,

Russie, Autriche et Suède). aucun laboratoire français n'a obtenu de résultats

défavorables

Indicateur COP Référence n°2-a. Précisez ici le nombre d'EILA que vous

prévoyez d'organiser au cours de l’année N+1

3

Indicateur COP Référence n°2-a. Ces EILA sont-ils réalisés selon la norme

17043 avec ou sans accréditation ?

Non

Indicateur COP Référence n°2-b. Précisez ici le nombre d'EIL (hors EILA - dont

EILV en lien avec méthodes en cours de validation telles que précisées dans le

paragraphe 1.1) organisés par le LNR au cours de l’année N

0

10

Indicateur COP Référence n°2-b. Précisez ici le nombre d'EIL (hors EILA) que

vous prévoyez d'organiser au cours de l’année N+1

0

Indicateur COP Référence n°3. Le cas échéant, indiquez que le système qualité

en référence à la norme NF EN ISO/CEI 17043 est en place

En cours

Précisez s'il a été évalué par audit interne

Non

5.6. Formation, organisation d'ateliers, accueil de stagiaires

Nombre de journées d'échange et de restitution rassemblant les laboratoires

agréés du réseau organisées dans l'année

1

Détaillez ici ces activités et indiquez le nombre de participants par atelier

40 participants

Journées d’échange et de restitution rassemblant les laboratoires agréés du réseau

que le LNR a animé.

Nombre de sessions de formation des personnels des laboratoires agréés aux

méthodes utilisées pour les contrôles officiels que le LNR a organisées dans

l'année

2

Détaillez ici ces activités et indiquez la durée moyenne des sessions et le

nombre de participants par atelier

«Détection des nématodes du genre Globodera» – 2 jours / 3 participants

11

Formation «Détection Ditylenchus sp et identification Ditylenchus dipsaci et

destructor » – 2 jours / 2 participants

5.7. Activités de conseil aux professionnels

Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré

En 2013, l’unité a été ponctuellement source de conseils aux professionnels

lorsqu’elle a été sollicitée. L’unité a procuré par ailleurs une action de formation

auprès de laboratoires privés souhaitant développer et/ou approfondir leur savoir-

faire pour les analyses nématologiques. Ces activités ont représenté en moyenne

une journée de travail par mois.

5.8. EILA auxquels le LNR a participé dans l'année

Détaillez les EILA auxquels vous, en tant que LNR, vous avez participé dans

l'année

Le laboratoire a participé aux EILA qu’il a organisés, à savoir détection

Bursaphelenchus xylophilus, détection Globodera, identification Globodera pallida et

rostochiensis et détection Meloidogyne chitwoodi et fallax par PCR temps réel dans

le sol)

D. Participation aux activités de surveillance

6. Existence et gestion d'un réseau

6.1. Indiquer si le LNR est intégré à un (ou des) dispositif(s) de surveillance ?

Oui, plusieurs

A combien de dispositifs de surveillance le LNR est-il intégré ?

22

6.2. Indiquer qui est le gestionnaire de ce dispositif

12

DGAL/SDQPV

6.3. Préciser si d'autres unités/entités de l'agence sont intégrées dans ce

dispositif à vos cotés

Non

7. Les partenaires et acteurs de ce dispositif de surveillance

Sont acteurs ou partenaires de ce dispositif (plusieurs réponses possibles) :

Le réseau de laboratoire du LNR

8. Modalités de surveillance

Préciser si ce dispositif repose (plusieurs réponses possibles) :

Sur des modalités de surveillance événementielles (notification de cas par des

acteurs de terrain)

Sur des modalités de surveillance programmées (active)

9. Autres activités du LNR en matière de surveillance

En dehors des aspects analytiques, quelles sont les autres activités auxquelles

le LNR (avec éventuellement les autres unités de l'agence impliquées) participe

dans le cadre de la surveillance ? (plusieurs réponses possibles)

Définition des modalités de surveillance (protocoles)

Appui scientifique et technique

E. Activités de recherche en lien avec l’activité de référence

10.1. Recherches méthodologiques pour la référence

Détaillez ici les recherches méthodologiques que vous avez réalisées dans

l'année : objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre

d'appels à projets...

13

Les travaux de recherche méthodologiques ont porté sur :

L’évaluation de la détection de Meloidogyne chitwoodi et M. fallax et M. minor par

PCR temps réel

La validation de clés d'identification morphologique pour Meloidogyne chitwoodi et M.

fallax (Rapport de validation)

L’évaluation d'outils de PCR conventionnelle pour l'identification spécifique de

Heterodera schachtii, H. glycines (Rapport de validation)

La validation de la détection de B. xylophilus dans des insectes du genre

Monochamus morts et conservés (validée)

Le développement d’une méthode détection de Meloidogyne chitwoodi et M. fallax

sur bulbes, tubercules et rhizomes (en cours de développement)

L’optimisation de la méthode extraction ADN sur extrait avec formes renflées de

Meloidogyne (Rapport de validation)

Le développement d’une méthode de quantification des niveaux de population des

espèces M. chitwoodi et M. fallax par PCR temps réel (Rapport de validation)

D’autres projets à vocation méthodologique étaient aussi en cours en 2013 :

EUPHRESCO MELOID ; MELOPOP ; Heterodera microsatellites (en partenariat

avec l’INRA de Rennes)

10.2. Recherches associées pour la référence

Détaillez ici les recherches associées auxquelles vous avez participé dans

l'année (participations à des études cliniques, études d'incidences, modèles

d'infections expérimentales, études toxicologiques, essais vaccinaux...):

objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels

à projets...

Le laboratoire est engagé dans différents projets :

un partenariat engagé dans un projet CTPS avec la FNAMS (projet NEMALUZ) et

portant sur l’acquisition d’outils méthodologiques pour le contrôle du nématode des

tiges, Ditylenchus dipsaci, en production de semences de luzerne (Medicago sativa

L.).

des essais en serres pour tester et identifier des variétés de plantes peu

multiplicatrices des nématodes quarantaine Meloidogyne chitwoodi et M. fallax ,

faisant l’objet de rapports annuels communiqués et présentés au demandeur. Ce

travail permet de mettre en évidence l’effet de la plante (espèce, variété) sur la

pénétration des larves infectieuses et sur leur capacité à produire une descendance,

il contribue aussi à préciser la gamme d’hôtes des nématodes du genre

Meloidogyne.

un projet de recherche soutenu par le département SPE-INRA visant à acquérir des

données de base pour la réalisation d'un projet de thèse à finalité appliquée aux

nématodes de quarantaine M. chitwoodi et M. fallax. Intitulé du projet :

14

"Echantillonnages spatialisés et étude du poids relatif des pratiques agricoles et des

phénomènes de dispersion passive sur la structuration et le fonctionnement de

communautés de nématodes phytoparasites" (projet 2013-2015)

F. Liste des publications et communications dans le cadre du mandat

Publications scientifiques internationales de l'année (Les publications qui

figureront dans le rapport doivent être sous presse ou publiées.)

Buisson, A., A. Chabert, L. Ruck, and S. Fournet. (2013). Nematodes associated

with damage in oilseed rape: new data on the biology and geographical distribution

of Meloidogyne artiellia. Nematology : 1-6.

Gamel S., E. Huchet, A-C Le Roux-Nio, G. Anthoine (2013) Assessment of PCR-

based tools for the specific identification of some temperate Meloidogyne species

including M. chitwoodi, M. fallax and M. minor. European Journal of Plant Pathology,

10.1007/s10658-013-0355-8

Rulliat, E., R. Ioos, and L. Folcher. (2013). Organisation of Inter-Laboratory

Proficiency Tests: feedback from the Plant Health Laboratory's Nematology Unit after

almost 10 years. Euroreference : 28-31.

Sarniguet, C., A. Buisson, and G. Anthoine. (2013). Validation of morphological keys

for identification of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda, Parasitaphelenchidae)

to group and species level. Bulletin OEPP 43 : 255-261.

Communications nationales de l'année (Les publications qui figureront dans le

rapport doivent être sous presse ou publiées.)

Buisson, A. (2013). Méthodes officielles: les méthodes morphobiométriques en

nématologie. Tours-France. Journées nématodes INRA - 10-12 septembre 2013.

Communications internationales de l'année (Les publications qui figureront

dans le rapport doivent être sous presse ou publiées.)

Anthoine, G. and A. M. Chappé. (2013). Validation of a real time PCR assay for the

detection of Bursaphelenchus xylophilus in targeted matrices in the framework of

national survey. Braunschweig - Germany. IUFRO International Conference on Pine

Wilt Disease - 15-18 Octobre 2013.

15

Sarniguet, C., A. Buisson, and G. Anthoine. (2013). Bursaphelenchus xylophilus

identification, from literature to routine analysis: how to make morphological analysis

reliable. Braunschweig - Germany.

G. Activités du LR-UE

Avez-vous également des activités de LR-UE ?

Non

H. Détention d'autres mandats de référence

Le LNR détient-il d'autres mandats de référence dans le même domaine de

compétences

Non