Sciences fondamentals

DOI of or1Service d’

de Berlin, cam2Institut de

campus Benja

Correspondsiologie, ChariFranklin, Arnzakrzewicz@ch

Ann Vasc SurDOI: 10.1016/� Annals of V�Edit�e par ELS

258

L’Angiopo€ı�etine-1, contrairement au Facteurde Croissance de D�eriv�e Plaquettaire-AB,potentialise le Facteur de CroissanceEndoth�elial Vasculaire-A d’acc�el�eration de lacicatrisation endoth�eliale dans un mod�ele deplaie par �eraflure de cellules endoth�eliales

Alexandre Alter,1 Dorothee Schmiedeck,2 Markus R. Fussnegger,1 Axel R. Pries,2

Wolfgang B. Freesmeyer,1 Andreas Zakrzewicz,2 Berlin, Allemagne

La cicatrisation et le bourgeonnement des lambeaux libres de tissu d�ependent principalement dud�eveloppement de vaisseaux sanguins, autrement dit de l’invasion angiog�enique par les cellulesendoth�eliales, qui est surtout r�eduite chez les fumeurs, les patients souffrant de microangiopathies(par exemple diab�etique), ou ceux trait�es par immunosuppresseurs. Bien que plusieurs facteursangiog�eniques aient �et�e �evalu�es pour acc�el�erer la cicatrisation chez ces patients en particuliers,leurs combinaisons n’ont pas encore �et�e �etudi�ees de facon syst�ematique. Cette �etude a �et�er�ealis�ee pour indiquer quelle combinaison de proangiogeniques et de facteurs promaturants estla plus efficace dans un mod�ele de cicatrisation endoth�eliale. Des cellules endoth�eliales humainesde veine ombilicale ont �et�e isol�ees, cultiv�ees �a confluence, et soumises �a un mod�ele de plaie par�eraflure, avec l’addition de facteur de croissance endoth�elial vasculaire (VEGF-A165), de facteurde croissance de d�eriv�es plaquettaires (PDGF-AB), d’angiopo€ı�etine-1 (ANG1), ou ANG2, ainsi quel’ensemble de leurs 16 combinaisons possibles. VEGF-A165 et ANG1 �etait la combinaison la plusefficace pour acc�el�erer la cicatrisation endoth�eliale de la plaie. De plus, VEGF-A165 a stimul�e lacicatrisation dans toutes les combinaisons examin�ees, alors qu’elle a �et�e att�enu�ee par PDGF-AB. Ainsi, en ce qui concerne leurs effets sur les cellules endoth�eliales, la combinaison deVEGF-A avec ANG1 est la plus prometteuse et est sup�erieure aux combinaisons avec PDGF-AB.

INTRODUCTION

La cicatrisation d’une plaie d�epend principalement

de la germination des vaisseaux capillaires sanguins,

iginal article: 10.1016/j.avsg.2008.07.010.

art dentaire proth�etique, Charit�eeUniversit�e de M�edecinepus Benjamin Franklin, Berlin, Allemagne.

physiologie, Charit�eeUniversit�e de M�edecine de Berlin,min Franklin, Berlin, Allemagne.

ance: Andreas Zakrzewicz, MD, PhD, institut de phy-t�ee niversit�e de M�edecine de Berlin, campus Benjaminimallee 22, 14195 Berlin, Allemagne, E-mail: andreas.arite.de

g 2009; 23: 239-245j.acvfr.2009.06.007ascular Surgery Inc.EVIER MASSON SAS

qui n�ecessite la prolif�eration et la migration de cellu-

les endoth�eliales.1, 2 De meme, la croissance des

greffes est consid�erablement favoris�ee par l’angio-

gen�ese.3,4 Cependant, la r�eponse angiog�enique est

r�eduite chez les patients souffrant de diab�ete et chez

les fumeurs, induisant des p�eriode de cicatrisation

prolong�ees, voire meme l’�echec de cicatrisation.5-8

L’angiogen�ese est r�egul�ee par des facteurs

angiog�eniques, dont le facteur de croissance

endoth�elial vasculaire-A (VEGF-A) est le principal.9,

10 L’expression de VEGF-A est induite par une baisse

de la pression en oxyg�ene en raison d’une con-

sommation accrue par les tissus, d’une diminution

de la densit�e capillaire, ou d’une r�eaction inflam-

matoire.9,10 Une fois s�ecr�et�e par les cellules non

endoth�eliales tissulaires (c.-�a-d., les fibroblastes ou

Fig. 1. Combinaisons des facteurs test�es par groupes et

facteurs correspondants.

Vol. 23, No. 2, 2009 Effet coop�eratif du VEGF et d’ANG1 259

les cellules �epith�eliales), VEGF-A agit sur les cellules

endoth�eliales par des r�ecepteurs sp�ecifiques, VEGF-

R2 principalement, 10 selon un mode paracrine. Il

active alors beaucoup de fonctions endoth�eliales,

qui causent �a leur tour la germination capillaire. 9,10

En plus du VEGF-A et en cons�equence du sai-

gnement, il existe toujours des plaquettes sanguines

qui s�ecr�etent du facteur de croissance de d�eriv�eplaquettaire (PDGF).11 PDGF est �egalement bien

connu pour ses capacit�es angiog�eniques, 12 qui

augmentent ainsi l’angiogen�ese induite par VEGF.

En outre, le r�ecepteur endoth�elial de tyrosine kinase

TIE2 contribue �a la maturation capillaires.13

L’activit�e de TIE2 est augment�ee par l’angio-

po€ı�etine-1 (ANG1) et (aux concentrations physio-

logiques) diminu�ee par ANG2.14, 15 Cependant, les

vaisseaux sanguins d�evelopp�es grace �a la pr�edomi-

nance de VEGF-A restent peu �etanches.16-20 Par

cons�equent, VEGF-A a �et�e �etudi�e en association

avec PDGF 21,22 ou ANG1.23-26 C’est deux combi-

naisons ont pu induire la croissance de capillaires

plus fonctionnels avec une perm�eabilit�e presque

normale. Cette �etude a �et�e r�ealis�ee pour r�ev�eler plus

syst�ematiquement, en les comparant directement

sur le meme mod�ele, laquelle des 16 combinaisons

possibles de VEGF-A, PDGF, ANG1, et ANG2, est la

plus efficace pour induire la croissance et la migra-

tion de cellules endoth�eliales n�ecessaires �a la

germination capillaire.

MAT�ERIAUX ET M�ETHODES

Isolement et culture cellulaires

Des cellules endoth�eliales humaines de veine ombili-

cale (HUVECs) �etaient isol�ees et cultiv�ees comme

d�ecris pr�ec�edemment.27 Bri�evement, les HUVECs�etaient pr�elev�ees des veines de cordons ombilicaux

avec 0,2 % de collag�enase type II de Clostridium his-

tolyticum (Biochrom, Berlin, Allemagne) pendant

15 minutes �a 37 �C. Apr�es incubation, la veine

ombilicale �etait rinc�ee par une solution saline�equilibr�ee selon Hanks (HBSS). La suspension de

cellules �etait centrifug�ee, d�ebarrass�ee du surnageant,

et les cellules �etaient cultiv�ees �a confluence dans un

milieu basal pour cellules endoth�eliales MV� avec

un pack de croissance cellulaire MV� (tous les deux

de PromoCell, Heidelberg, d’Allemagne) �a 37 �C,

dans une atmosph�ere humidifi�ee avec 5% de CO2.

Traitement des cellules avec les r�eactifs

test�es

Les cellules �etaient sem�ees sur les 24 puits d’essai

(TPP, Trasadingen, Suisse), et chacun des 16 puits

(except�es les controles non trait�ees) �etaient trait�es

avec un r�eactif diff�erent ou l’une de leur combinai-

son (fig. 1). Les r�eactifs test�es utilis�es �etaient VEGF-

A165 (solution �a 2,4 mg/ml dans un tampon de

s�erum phosphat�e [PBS] avec de l’albumine de

s�erum bovin �a 1% [BSA], pour une concentration

finale �a 24 ng/ml), ANG1 (solution �a 16 mg/ml dans

du PBS avec du BSA �a 1%, pour une concentration

finale �a 16 ng/ml), ANG2 (solution �a 16 mg/ml dans

du PBS avec du BSA �a 1%, pour une concentration

finale �a 16 ng/ml), et PDGF (principalement des

h�et�erodim�eres de PDGF-AB, solution �a 2 mg/ml dans

du PBS avec du BSA �a 1%, pour une concentration

finale �a 20 ng/ml) (tous achet�es chez R&D Systems,

Minneapolis, MN, Etats-Unis). Pour obtenir des

effets significatifs, tous les r�eactifs test�es �etaient

employ�es approximativement quatre fois au-dessus

de leur concentration m�ediane efficace (EC50) de la

mani�ere pr�evue par la fiche technique du fabricant.

Toutes les combinaisons possibles des quatre sub-

stances, et du milieu de culture cellulaire complet

avec du BSA �a 1% comme controle n�egatif �etaient�etudi�es. Les 16 combinaisons sont list�ees figure 1.

Mod�eles de plaies par �eraflure

Les HUVECs �etaient d�evelopp�es dans des puits

d’essai �a 100% de confluence. La monocouche �etait

alors ray�ee selon une ligne au moyen d’un embout

de pipette de 200 ml. L’�eraflure initiale a �et�e photo-

graphi�ee �a l’aide d’un microscope Diaphot d’inver-

sion Nikon (Melville, NY, Etats-Unis) �equip�e d’une

modulation de contraste de Hoffman (syst�eme

optique de modulation, Greenvale, NY, Etats-Unis)

et d’un objectif correspondant (plan 4/0.13 DL,

Fig. 2. Influence des diff�erentes combi-

naisons de facteurs angiog�eniques sur la

cicatrisation de l’�eraflure. Les mono-cou-

ches du premier-passage d’HUVEC �etaient

ray�ees avec un embout de pipette, et la

cicatrisation de l’�eraflure �etait mesur�ee 5

heures plus tard dans un groupe controle

(milieu de culture cellulaire seul) ou en

pr�esence de VEGF-A165 avec ANG1, PDGF

avec ANG2, ou VEGF-A165 avec PDGF.

Les donn�ees sont exprim�ees en moyenne ±

�ecart-type pour n¼ 7, *p� 0,05.

260 Alter et al. Annales de chirurgie vasculaire

160/-, Phl ; Nikon, Tokyo, Japon). Les photos �etaient

prises avec un Canon EOS 10D (Lake succes, NY,

Etats-Unis). Les cellules �etaient alors incub�ees pen-

dant 5 heures �a 37 �C dans une atmosph�ere

humidifi�ee avec 5% de CO2.

La migration cellulaire �etait mesur�ee en compa-

rant la photo initiale �a une photo suivant l’incuba-

tion de 5 heures. La largeur de l’�eraflure a �et�emesur�ee en diff�er�e en employant le programme

d’ImageJ 1.34s pour histom�etrie (NIH, Bethesda,

MD, Etats-Unis). La largeur de la fissure mesur�ee

d’un bord �a l’autre de la plaie �etait compar�ee entre

les bancs d’essai et les controles non trait�es.

Marquage en immunofluorescence

Les cellules �etaient fix�ees avec du m�ethanol �a�20 �C pendant 10 minutes, lav�ees dans du PBS

contenant du BSA �a 1%, incub�ees avec de l’ anti-

corps anti-facteur von-Willebrand (vWF) (F-3520 ;

Sigma, Deisenhofen, Allemagne) 1 :100 dans la

solution de PBS/BSA pendant 30 minutes �atemp�erature ambiante dans une chambre humide,

lav�ees deux fois dans la solution de PBS/BSA, puis

incub�ees avec de l’isothiocyanate de fluoresc�eine

(FITC) emarqu�e monoclonal anti-lapin (F-4890,

sigma) 1 :20 dans la solution PBS/BSA pendant

encore 30 minutes, et lav�ees encore deux fois avec

du PBS. Les controles n�egatifs ont �et�e incub�ees avec

de l’anticorps secondaire FITC-marqu�e seul. Les�echantillons ont �et�e directement analys�es �a l’aide

d’un microscope d’Ortholux� avec un objectif

d’immersion aquatique (25/0.60 W Fluoreszenz) et

un filtre I 2/3 pour epifluorescence (Leitz, Wetzlar,

Allemagne) ou par trans-illumination. Les photos�etaient prises avec un Canon EOS 10D.

Analyse statistique

Les cellules endoth�eliales ont �et�e ind�ependamment

isol�ees de sept cordons ombilicaux diff�erents.

Chaque combinaison de r�eactif test�e des groupes 1

�a 16 (fig. 1) �etait �etudi�ee avec les HUVECs de

chacun de ces cordons ombilicaux. Ainsi, dans

chaque groupe sept mesures ind�ependantes �etaient

effectu�ees. (Trois de ces groupes sont montr�es en

comparaison au groupe controle, Figure 2.) Pour

mettre en �evidence les effets de VEGF-A par exem-

ple, les �echantillons provenant de tous les groupes

sans VEGF-A (groupes 16, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 14) ou

avec VEGF-A (groupes 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, 15)�etaient appareill�es. Les �echantillons �etaient

appareill�es selon les cordons ombilicaux et les fac-

teurs qui �etaient pr�esents pendant le temps d’incu-

bation. Par exemple, les HUVECs du cordon

ombilical n� 1 du groupe 16 ont �et�e appareill�es avec

ceux du cordon ombilical n�1 du groupe 1, et ainsi

de suite. Ainsi, seule une variable diff�erait entre les�echantillons appareill�es, le r�eactif test�e analys�e. Les

donn�ees sont rapport�ees en moyenne ± �ecart type

(SD), et la significativit�e statistique �etait consid�er�ee

pour un p� 0,05 dans le Test-T de Student des�echantillons appareill�es.

R�ESULTATS

L’origine endoth�eliale des cellules cultiv�ees �aconfluence �etait confirm�ee par l’immunomarquage

positif �a vWF (fig. 2A, B). Une plaie par �eraflure

dans ces mono-couches se fermait spontan�ement

dans un d�elai de 24 heures (fig. 2C-H).

Meme avec l’addition des facteurs de croissance

et l’augmentation induite de la vitesse de cicatrisa-

tion de la plaie, il persistait un d�elai mesurable

d’au moins 5 heures. Ainsi, les mesures �etaient

r�ealis�ees �a 0 et 5 heures suivant l’�eraflure. Les quatre

facteurs de croissance endoth�eliaux et toutes leurs

combinaisons �etaient examin�es, et leurs effets�etaient �evalu�es en mesurant la vitesse de cicatrisa-

tion de la plaie, consid�er�ee comme une mesure asso-

ciant migration et prolif�eration cellulaire. Tous les

groupes sans un facteur simple �etaient compar�es

aux autres groupes avec ce meme facteur. Cette

Fig. 3. Marquage de vWF (A-D) et cicatrisation

d’�eraflure (E-J). Les HUVECs de premier-passage

visualis�es au microscope par trans-illumination (a) et au

microscope de fluorescence suivant l’immunomarquage

de vWF (b). Un controle n�egatif (anticorps anti FITC

secondaire seul) et son image correspondante par trans-

illumination sont montr�es dans D et C, respectivement.

La microscopie de trans-illumination employant le con-

traste de modulation de Hoffmann montre une �eraflure

fraıchement dessin�ee typique (E, H) et suivi �a 5 heures

(F, I) et �a 16 heures (G, J) dans des conditions de con-

trole (E,G) ou en pr�esence de VEGF-A165 (H-J).

Echelle¼ 500 mm.

Vol. 23, No. 2, 2009 Effet coop�eratif du VEGF et d’ANG1 261

Fig. 4. Influence des diff�erentes combinaisons de quatre

facteurs angiog�eniques sur la cicatrisation d’�eraflure. Les

mono-couches d’HUVEC de premier-passage ont �et�e ray-

�ees avec un embout de pipette, et la cicatrisation de

l’�eraflure a �et�e mesur�ee 5 heures plus tard avec l’addition

ou pas de VEGF-A165, d’ANG1, de PDGF, et d’ANG2.

Toutes les combinaisons sans un de ces facteurs ont �et�eanalys�ees en comparaison avec toutes les combinaisons

dans lesquelles ce facteur a �et�e ajout�e. Les donn�ees sont

exprim�ees en moyenne ± �ecart-type, de n¼ 56, *p� 0.05.

262 Alter et al. Annales de chirurgie vasculaire

analyse indiquait qu’une croissance statistiquement

significative de la vitesse de cicatrisation de la plaie

(fig. 3) �etait observ�ee avec VEGF-A165 et ANG1,

alors que PDGF-AB en causait une diminution en

association avec ces deux r�eactifs, sans que cette

diminution n’atteigne la significativit�e statistique.

Compar�e aux cultures de controle en milieu de

culture cellulaire complet, l’augmentation de la

vitesse de cicatrisation de la plaie (fig. 4) �etait la

plus forte avec l’addition de VEGF-A165 et ANG1.

En revanche, avec l’addition de PDGF-AB et ANG2,

la cicatrisation de la plaie stagnait (fig. 4).

DISCUSSION

Cette �etude a prouv�e que sur les 16 combinaisons

possibles des quatre facteurs angiog�eniques test�es,

la combinaison de VEGF-A165 et d’ANG1 �etait la

plus efficace pour acc�el�erer la migration et la pro-

lif�eration endoth�eliales, sur un mod�ele de plaie par�eraflure utilisant des HUVECs. De plus, VEGF-

A165 a stimul�e la cicatrisation de la plaie dans toutes

les combinaisons examin�ees, alors qu’elle �etait

att�enu�ee par PDGF-AB.

La cicatrisation sur un mod�ele de plaie par�eraflure, mesur�ee par la diminution de la largeur

de l’�eraflure sur une mono-couche de cellules

endoth�eliales, r�esulte de la combinaison de la pro-

lif�eration et de la migration cellulaire. Puisque ces

deux fonctions cellulaires sont fondamentales pour

la germination capillaire, cette analyse porte sur

les deux aspects principaux de l’angiogen�ese.

Bien que les diff�erences entre les facteurs

examin�es aient �et�e davantage prononc�ees dans un

milieu de culture de cellules sans s�erum ou sans fac-

teurs de croissance, les essais pr�esent�es ici ont �et�er�ealis�es en pr�esence d’un milieu normal de crois-

sance cellulaire, afin de simuler au mieux les condi-

tions in vivo, dans lesquelles le traitement par des

facteurs angiog�eniques s’ajouterait juste aux fac-

teurs d�ej�a pr�esents autour de la plaie. En outre, les

quatre facteurs ont �et�e analys�es dans toutes les 16

combinaisons possibles. Ainsi le VEGF-A165 a

stimul�e la cicatrisation de la plaie dans toutes les

combinaisons examin�ees.

VEGF-A est le facteur angiog�enique le plus inten-

sivement �etudi�e.9, 28 Il est bien connu pour stimuler

la prolif�eration et la migration endoth�eliale 29,

autant que d’autres fonctions des cellules

endoth�eliales jouant un role dans la germination

capillaire ou l’entretien des vaisseaux sanguins

matures.30 Ainsi les donn�ees pr�esent�ees ici sont en

accord avec la litt�erature. Cependant VEGF-A utilis�epour induire l’angiogen�ese in vivo augmente non

seulement la densit�e capillaire, mais associe aussi

malheureusement une augmentation de la per-

m�eabilit�e capillaire, rendant les r�eseaux capillaires

r�ecemment form�es peu fonctionnels.31 Par con-

s�equent, il existait un int�eret croissant �a combiner le

Vol. 23, No. 2, 2009 Effet coop�eratif du VEGF et d’ANG1 263

VEGF-A avec d’autres facteurs, qui favorisent le

recrutement des cellules p�erivasculaires et la

maturation des vaisseaux sanguins, scellant de ce

fait les capillaires, comme par exemple le PDGF et

l’ANG1. Le PDGF-AB se lie �a diff�erents r�ecepteurs

endoth�eliaux.12 La d�el�etion de PDGF chez les souris

knock-out a comme cons�equence un d�efaut de

maturation du vaisseau sanguin.32 En cons�equence,

une combinaison de VEGF avec PDGF pouvaient

induire une meilleure maturation des vaisseaux

sanguins.33 Par ailleurs, VEGF-A a �et�e analys�e en

combinaison avec ANG1.23, 24 ANG1 active le

r�ecepteur endoth�elial tyrosine kinaseTIE2 et la voie

du phosphatidyl-inositol 3-kinase.34, 35 Cette com-

binaison pourrait �egalement induire une meilleure

maturation des vaisseaux sanguins.23, 24

Les donn�ees pr�esent�ees ici permettent la compa-

raison directe des combinaisons de VEGF-A et de

PDGF-AB avec ceux de VEGF-A et d’ANG1. Cette

comparaison a prouv�e que les effets du VEGF-A165

sur la cicatrisation d’�eraflure sont augment�es en

combinaison avec ANG1. Ainsi, la combinaison de

VEGF avec ANG1 a pu avoir les deux effets d�esir�es,

une augmentation de la perm�eabilit�e vasculaire, 36

et une augmentation additionnelle de la prolif�era-

tion et de la migration des cellules endoth�eliales.

Puisqu’ANG1 s’av�ere etre un chemo-attractant pour

les cellules endoth�eliales, 37 l’augmentation de la

cicatrisation endoth�eliale est en accord avec la

litt�erature. Les effets de VEGF-A et d’ANG1 sont

principalement limit�es aux cellules endoth�eliales,

parce que leurs r�ecepteurs sont s�electivement

exprim�es sur ces cellules. Ceci pourrait aider �a limiter

les effets secondaires in vivo, et pourrait etre un

avantage suppl�ementaire en pratique clinique.

Toutefois, l’expression de VEGF-A a �et�e d�ecrite au

cours des r�eactions inflammatoires qui, par exemple,

ont men�e �a l’�echec d’implants dentaire.38 L’�echec de

ces implants �etait probablement une cons�equence de

la r�eaction inflammatoire en g�en�eral, et pas du VEGF

seul. D’ailleurs, en combinaison avec ANG1, l’aug-

mentation induite par VEGF-A de la perm�eabilit�evasculaire �etait ainsi limit�ee.39 Ainsi, au mieux dans

une situation non inflammatoire et en combinaison

avec ANG1, VEGF induirait l’angiogen�ese par une

augmentation de la prolif�eration et de la migration

cellulaire endoth�eliale et acc�el�ererait la cicatrisation

des plaies, empechant de ce fait l’�echec des implants

et am�eliorant le bourgeonnement des greffes de tissu

en lambeau libre.

De plus, VEGF-A stimule l’expression d’ANG2, 40

qui a montr�e un effet pro-inflammatoire de n�ecrose

tumorale induite par le facteur a.41 En revanche,

l’activation de TIE2 par l’interm�ediaire d’ANG1 sti-

mule la voie du phosphatidyl-inositol 3-kinase, 42

d�esactivant ainsi FoxO1, un facteur connu de

transcription d’ANG2.43 ANG1 empecherait donc

probablement les r�eactions inflammatoires

d�ependantes de VEGF-A et m�edi�ees par ANG2.

Bien que connu comme facteur angiog�enique,

PDGF-AB a r�eduit la cicatrisation d’�eraflures dans

notre �etude. Ceci peut etre expliqu�e par une diminu-

tion de la densit�e capillaire avec le PDGF une fois

combin�e avec VEGF, 33 ou par l’augmentation de la

densit�e capillaire lorsque que les effets de PDGF �etaient

bloqu�es.44 L’effet principal de PDGF dans le processus

angiog�enique est vraisemblablement la maturation

des vaisseaux sanguins r�ecemment form�es.33

On a r�ecemment rapport�e qu’ANG2, pr�esent�e au

d�epart comme un antagoniste endog�ene de TIE2, 15

active en fait TIE2.42 De facon inattendue, la com-

binaison de PDGF-AB et ANG2 a r�eduit la cica-

trisation de l’�eraflure. Cependant, aucune autre�etude des effets combin�es de PDGF-AB et d’ANG2

n’a pu etre trouv�ee dans la litt�erature. Nos donn�ees

pr�evoient enfin une sup�eriorit�e de VEGF avec

ANG1, par rapport �a PDGF-AB avec ANG2.

Une application clinique des facteurs pro-

angiog�eniques visant �a favoriser et �a acc�el�erer la

cicatrisation des plaies, pourrait etre le traitement

des patients pr�esentant des retards de cicatrisation,

ainsi que ceux consid�er�es �a haut risque d’�echec de

greffe. Cette �etude pr�ealable �a un tel traitement a

pour but d’indiquer les combinaisons optimales de

facteurs angiog�eniques, afin d’en am�eliorer les

effets. Notre �etude sugg�ere que VEGF avec ANG1

serait la combinaison la plus prometteuse des quatre

facteurs et des 16 combinaisons analys�ees.

Avec nos remerciements �a G. Beyer pour son assistance technique

experte.

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