1

LE CHAMPAGNE C’est le plus réputé des vins effervescents. Deux types de micro-organismes jouent un rôle déterminant dans l’élaboration des vins effervescents. Des souches soigneusement sélectionnées de Saccharomyces cerevisiae interviennent dans deux étapes déterminantes de la méthode champenoise : fermentation alcoolique puis prise de mousse. De plus, depuis quelques décennies, la fermentation malolactique, autrefois spontanée, est déclenchée dans la cuverie. Elle fait intervenir Oenococcus oeni. Un schéma général de l’élaboration du champagne figure dans le document 1. L’œnologue suit attentivement toutes ces étapes, tant dans les aspects microbiologiques que chimiques et biochimiques. La sécurité n’est pas non plus à négliger. En effet, la fermentation alcoolique dégage de grandes quantités de gaz, pouvant créer des risques d’asphyxie parmi le personnel de cuverie. Enfin, le champagne est une boisson alcoolisée et, à ce titre, il doit être consommé avec modération. 1. STRUCTURE ET IDENTIFICATION DES AGENTS BIOLOGIQUES 1.1. Les levures 1.1.1. Mycologie : généralités Les levures sont des mycètes.

1.1.1.1. Quel est le positionnement des levures dans la classification globale des êtres vivants ? Justifier ce positionnement.

1.1.1.2. Saccharomyces cerevisiae est un ascomycète. Schématiser la structure d’une asque de Saccharomyces. Les éléments représentés sont-ils haploïdes ou diploïdes ? Justifier.

1.1.2. Ultrastructure de Saccharomyces

Le document 2 représente une interprétation de l’ultrastructure de cette levure. Annoter ce document (à rendre avec la copie). 1.1.3. Les enveloppes de la levure (document 3)

1.1.3.1. La paroi a) Le glucane

• Définir la série D des oses. • Ecrire la formule développée du β-D glucopyrannose. • Repérer sur la formule précédente le carbone anomérique. • Indiquer les propriétés liées à ce carbone anomérique. • Ecrire la formule développée du fragment de glucane représenté

document 4.

2

b) La mannoprotéine (document 5) La mannoprotéine est constituée de :

- 10 % de protéine - 90% de polyoside

Le polyoside est relié à la protéine par une liaison N-osidique entre la N-acétyl glucosamine et la chaîne latérale de l’asparagine.

Ecrire la liaison N-osidique entre la N-acétyl glucosamine et l’asparagine.

1.1.3.2. La membrane plasmique (document 3) a) Porter les légendes A, B, C et D sur la copie. b) Indiquer la nature des liaisons reliant les différentes molécules constitutives de

la membrane plasmique. Justifier le terme de «mosaïque fluide» attribué à l’architecture de cette membrane .

1.1.3.3. Propriétés tinctoriales

Comment les levures sont-elles colorées par la technique de Gram ? Justifier cette coloration d’après le document 3, en reprenant les différentes étapes de cette technique.

1.2. Une bactérie malolactique : Oenococcus oeni Les agents de la fermentation malolactique (FML) appartiennent au groupe des bactéries lactiques. Ce groupe, extrêmement diversifié, se caractérise par la production d’acide lactique. Il comporte des coques (Gram positif et Gram négatif) ainsi que des bacilles Gram positif (Lactobacillus). Outre la morphologie microscopique, le type fermentaire (homofermentaire ou hétérofermentaire) est prépondérant dans la classification des bactéries lactiques. Différents micro-organismes participent à la FML, mais il est établi que l’agent le plus intéressant en œnologie est Oenococcus oeni, coque Gram positif hétérofermentaire. Cette bactérie très exigeante nécessite de nombreux facteurs de croissance (nombreux acides aminés et vitamines) qui doivent donc être présents dans le vin. 1.2.1. Effet du lysozyme sur les parois bactériennes

Le moment du déclenchement de la FML joue un rôle sur la qualité du vin obtenu : si elle se déclenche trop tôt, par prolifération de bactéries sauvages présentes dans le moût, des déviations organoleptiques du vin pourront avoir lieu. Le lysozyme peut être employé pour résoudre le problème : il élimine les bactéries sauvages, ce qui permettra ensuite une bonne implantation des bactéries sélectionnées (Oenococcus). Cette technique est couramment utilisée en Champagne.

Le lysozyme agit en détruisant certains composants des parois bactériennes, notamment chez les Gram positif. a) Réaliser un schéma annoté des enveloppes d’une bactérie Gram positif (différentes molécules à représenter symboliquement, sans formules chimiques). b) Expliquer comment agit le lysozyme sur ces enveloppes.

3

1.2.2. Structure de l’ADN bactérien

1.2.2.1. D’après le modèle de Watson et Crick (document 6) donner les caractéristiques structurales essentielles de la double hélice d’ADN.

1.2.2.2. L’ADN d’une souche d’Oenococcus oeni a une longueur de 1,5 mm.

a) Déterminer le nombre de paires de bases contenu dans cet ADN. b) Calculer la masse moléculaire de cet ADN en kDA (kilo Daltons)

Donnée : Masse molaire moyenne d’un nucléotide : 330 g.mol-1.

1.3. Identification des souches 1.3.1. Identification des levures

A la surface des grains de raisin abîmés peuvent proliférer des levures indésirables qui risquent de compromettre la qualité du moût. Les levures oxydatives, par exemple, sont responsables de la pourriture acide. On les trouve dans quelques genres très répandus, notamment dans le genre Candida. Il est donc utile de pouvoir identifier les différentes levures présentes à la surface du raisin ou dans le moût.

1.3.1.1. Proposer un milieu permettant d’isoler les différentes levures du moût tout en inhibant les bactéries associées. Comment agit l’agent sélectif ?

1.3.1.2. Identification morphologique Une souche de levure est ensemencée sur un milieu RAT (Riz Agar Tween 80). Après incubation, cette gélose est examinée directement au microscope (x400). Les éléments observés figurent sur le document 7. a) Décrire les conditions d’utilisation du milieu RAT (mode d’ensemencement, conditions d’incubation). b) Porter les légendes 1, 2 et 3 du document 7 sur la copie et réaliser une identification justifiée de cette levure.

1.3.1.3. Identification biochimique

Elle est effectuée sur une galerie API 20C AUX. Cette galerie comporte une cupule témoin ne contenant rien et 19 cupules contenant chacune un ose ou un dérivé d’ose bien précis (auxanogramme). La souche à identifier est mise en suspension dans un milieu spécial : le "C Medium". Toutes les cupules sont remplies avec cette suspension et la galerie est incubée.

a) Qu’est-ce qu’un auxanogramme, comment se lit-il ? b) Quelle doit être la composition qualitative de « C Medium » ? Justifier la réponse.

1.3.2. Identification des bactéries malolactiques La PCR (ou "Polymerase Chain Reaction") est une technique qui permet d’amplifier une partie d’un gène.

4

Cette technique utilise trois étapes thermiques définissant un cycle (document 8) : • Etape 1 : dénaturation à 95°C • Etape 2 : hybridation à 55°C des amorces délimitant la portion de gène à amplifier • Etape 3 : élongation des chaînes synthétisées à 77°C par la Taq polymérase Puis retour à l’étape 1 pour un second cycle et ainsi de suite. Les nombreuses copies obtenues sont séparées par électrophorèse sur gel d’agarose pour être visualisées.

1.3.2.1. Etude de la dénaturation

Une solution d’ADN d’Œnococcus est placée dans la cuve thermostatée d’un spectrophotomètre. L’absorbance à 260 nm de cette solution est mesurée à différentes températures. Les résultats figurent sur le document 9.

a) Analyser le graphe obtenu. b) Donner une interprétation moléculaire du phénomène observé. 1.3.2.2. Etude de l’hybridation des amorces Les amorces sont des petits désoxyribonucléotides. a) Qu’appelle-t-on hybridation des acides nucléiques ?

b) Une amorce a la séquence suivante : d AGTTGCGCAGTAGC

Ecrire la séquence du brin d’ADN auquel cet amorce s’hybridera.

1.3.2.3. Utilisation des résultats de la PCR pour l’identification des souches de Lactobacillus et d’Œnococcus Pour rechercher la présence éventuelle de souches indésirables dans le vin avant de procéder à la fermentation malolactique, deux gènes différents (R1 et R2) situés dans les opérons ribosomiques sont recherchés par PCR. Le document 10 montre les résultats obtenus par PCR pour les souches de Lactobacillus et d’Œnococcus ainsi que pour deux vins V1 et V2.

Analyser le document 10 et conclure quant à la présence éventuelle de souches indésirables dans les vins V1 et V2.

1.3.3. Détection de contaminants par immunofluorescence

Au cours de la fermentation alcoolique, le but des œnologues est de pouvoir contrôler rapidement la pureté du levain utilisé pour inoculer les moûts. Ensuite, les œnologues souhaitent détecter la présence des bactéries malolactiques mais également savoir si les bactéries présentes sont bénéfiques ou non pour obtenir une bonne fermentation malolactique. La détection des souches utilisées et des contaminants possibles peut être faite par une technique d'immunofluorescence.

1.3.3.1. Obtention des sérums

On peut utiliser deux types de sérums : - des sérums polyclonaux obtenus par immunisation de lapins (document 11) - des sérums monoclonaux obtenus par la technique des hybridomes

(document 12)

5

a) Définir les termes "polyclonaux" et "monoclonaux". b) Sérums polyclonaux

• Pourqoui les lapins s’immunisent-ils lors de l'injection d'une souche d'Oenococcus ?

• Quelle est la composition de l'adjuvant de Freund ? Pourquoi peut-il accroître le taux d'anticorps obtenus chez l'animal ?

• A l'aide d'un schéma, montrer l'évolution du taux des anticorps obtenus chez l'animal au cours des différentes injections.

c) L'obtention d'anticorps monoclonaux nécessite deux types cellulaires.

• Quelles sont les deux cellules impliquées ? • Pour chacune, indiquer ses principales caractéristiques et son rôle dans

l'hybridome. 1.3.3.2. La réaction d'immunofluorescence

Le document 13 indique le protocole utilisé. a) Schématiser l'immuncomplexe obtenu en cas de réaction positive. b) En déduire le type de réaction d'immunofluorescence utilisé.

2. LES AGENTS BIOLOGIQUES DANS LA MÉTHODE CHAMPENOISE 2.1. Les voies fermentaires 2.1.1. La fermentation alcoolique

Donner les bilans moléculaire et énergétique de la fermentation alcoolique à partir du glucose.

2.1.2. La fermentation malolactique

acide malique + NAD+ → uemalolactiqenzyme. acide L-lactique + NADH + H+

2.1.2.1. A partir du document 14, donner le nom et la formule développée du coenzyme pyridinique NAD+. 2.1.2.2. Présenter, en se limitant à la partie fonctionnelle de la molécule, les formules développées des formes oxydées et réduites de ce coenzyme pyridinique.

2.2. Cinétique enzymatique

2.2.1. Le document 15 présente le mode opératoire du dosage enzymatique de l’éthanol par l’alcool-déshydrogénase (ADH). • Justifier le choix de la longueur d’onde à 340 nm • Donner l’allure de la courbe A340nm = f (temps) pour l’essai • Justifier l’utilisation du tampon biphosphate de potassium • Justifier la durée d’incubation après addition de la solution 2 • A partir des données du document 15, établir la formule littérale permettant

d’exprimer la concentration en éthanol en g/L dans l’échantillon

6

2.2.2. Etude de l’ADH 2.2.2.1. Etude de l’activité de l’ADH en fonction de la concentration initiale en éthanol dans le milieu réactionnel La vitesse initiale (vi) de la réaction catalysée par l’ADH est déterminée pour différentes concentrations en éthanol. Le graphe vi = f (c éthanol) est représenté document 16 (fig 1). a) Définir la vitesse initiale d’une réaction, en précisant les conditions physico-chimiques de sa détermination. b) Ecrire l’équation de Michaelis et préciser la signification des constantes cinétiques Km et Vmax. c) Situer Km et Vmax sur le document 16 (fig 1). Joindre le document 16 à la copie.

2.2.2.2. Etude de l’activité de l’ADH en fonction de la concentration en NAD+ dans le milieu réactionnel La vitesse initiale (vi) de la réaction catalysée par l’ADH est déterminée pour différentes concentrations en NAD+. Le graphe vi = f (c NAD+) est représenté document 16 (fig 2). a) Analyser le graphe vi = f (c NAD+). b) Caractériser l’action du NAD+ sur l’activité de l’enzyme lorsque ce substrat est à forte concentration.

2.3. Croissance des bactéries malolactiques

2.3.1. Le document 17 montre l’évolution schématique de la population malolactique au cours d’une vinification spontanée (la FML suit alors rapidement la fermentation alcoolique). Justifier les différentes phases de la courbe (vinification spontanée). 2.3.2. Le document 18 correspond au suivi cytométrique d’une population de bactéries malolactiques au cours d’une vinification contrôlée. La croissance bactérienne est très lente car l’acidité du vin place les micro-organismes dans des conditions de pH défavorables. Lors de cette étude la population bactérienne peut être considérée comme une culture pure d’Oenococcus oeni.

2.3.2.1. Définir les deux paramètres de la croissance en milieu non renouvelé. 2.3.2.2. Déterminer le taux de croissance horaire de la souche.

2.3.3. Optimisation d’une FML en cuverie Une cuve de 600 m3 de vin ayant achevé sa fermentation alcoolique doit être ensemencée avec une préculture d’Oenococcus oeni, selon le protocole suivant :

1. Lancement d’une préculture dans 1 m3 de vin, avec un inoculum de 109 cellules bactériennes en phase de croissance exponentielle

2. Incubation pendant un temps t 3. Transfert de la totalité de la préculture dans la cuve de 600 m3 pour obtenir une

population de 105 bactéries par mL. Calculer le temps t d’incubation de la préculture. On utilisera pour ce calcul la valeur du taux de croissance calculé dans la question précédente et on considérera que les conditions de culture sont en tous points identiques.

7

3. SECURITE 3.1. Risques liés au dioxyde de carbone Au cours des fermentations, des quantités importantes de CO2 sont dégagées par les micro-organismes.

3.1.1. Les échanges gazeux pulmonaires s'effectuent au niveau des alvéoles pulmonaires. Le document 19 montre l'organisation de la paroi alvéolaire. Indiquer sur ce schéma la localisation des deux compartiments impliqués dans ces échanges (Joindre le document 19 à la copie).

3.1.2. Le transport du dioxyde de carbone. Citer les différentes formes du transport du CO2 dans le sang.

3.1.3. Les courbes des documents 20 et 21 montrent les effets du dioxyde de carbone sur la fixation du dioxygène sur l'hémoglobine et sur la ventilation. Commenter ces courbes et justifier la nécessité d'une bonne aération de la cuverie au moment des fermentations du moût.

3.2. Alcool et physiologie nerveuse Au cours des premières étapes, complexes, du développement neural, l'abus d'alcool par la mère peut avoir des conséquences néfastes sur le système nerveux fœtal. Celles-ci peuvent entraîner des dysfonctionnements des connexions nerveuses au moment de l'apprentissage. Les neurophysiologistes ont utilisé des modèles animaux pour étudier le fonctionnement des connexions nerveuses en rapport avec l'apprentissage. Ainsi, on peut utiliser l'Aplysie, mollusque marin schématisé en document 22a.

3.2.1. Les neurones du ganglion abdominal de l'Aplysie (document 22b) sont accessibles à l'expérimentation électrophysiologique après dissection. Les corps cellulaires de ces neurones sont situés à la périphérie du ganglion, les synapses s'effectuant à l'intérieur du ganglion. Les enregistrements intracellulaires sont réalisés à l'aide de micro-électrodes reliées aux bornes d'un oscilloscope.

La première exploration est réalisée sur un neurone présynaptique noté Pré sur le document 22b.

• Lorsque la micro-électrode E1 pénètre dans le corps cellulaire du neurone on enregistre la partie X du document 23.

• Lorsqu'il y a stimulation du neurone Pré par l'électrode S1 on obtient la partie Y du document 23.

Analyser successivement les deux parties de l'enregistrement et conclure quant à la nature des phénomènes observés.

8

3.2.2. Dans le cadre de l'étude des comportements de nombreux travaux tendent à montrer que de petits ensembles de neurones sont dotés de faculté d'apprentissage et de mémorisation.

L'Aplysie présente une réaction de défense simple qui consiste à rétracter les branchies sous l'effet d'un stimulus appliqué sur le siphon. Cette réaction cesse si on excite le siphon de manière répétée. C'est le phénomène d'habituation. Pour préciser ce phénomène, les neurophysiologistes ont travaillé sur le ganglion abdominal dans lequel ils ont mis en évidence les relations entre neurones sensoriels et neurones moteurs. On peut schématiser ces relations synaptiques par le document 24.

3.2.2.1. Une stimulation infraliminaire appliquée sur le neurone NS donne le tracé A1, document 25.

Une stimulation supraliminaire appliquée sur le même neurone donne le tracé A2, document 25.

Quelles conclusions peut-on tirer de l'étude de ces électroneurogrammes ?

3.2.2.2. Si on applique une stimulation supraliminaire au neurone NS toutes les 10 secondes, au cours de deux séances d'apprentissage consécutives de 15 stimulations chacune, on obtient les enregistrements B1, B2 du document 25. Comment se manifeste l'habituation d'un point de vue électrophysiologique et comportemental ?

3.3. Alcool et physiologie rénale La consommation d'alcool entraîne une augmentation du volume urinaire : le volume d'urine émis est bien supérieur au volume de boisson consommée. Pour étudier la régulation de l'intervention des reins dans le métabolisme hydrique, on fait absorber 1L d’eau à un homme sain.

3.3.1. Le document 26 montre l'évolution de la diurèse et de la pression osmotique du plasma après cette ingestion. Etudier ce document et conclure.

3.3.2. Afin de comprendre la relation ingestion et diurèse, on réalise des expériences sur un chien (document 27). Quels renseignements apporte l'examen de chacune de ces expériences ? A l'aide d'un schéma simple, montrer comment l'ingestion d'1L d'eau peut modifier la diurèse. 3.3.3. Proposer une explication de l'augmentation de la diurèse après absorption d'alcool.

"Le champagne est le produit de la fermentation du pur jus de raisin frais" (La Régie)

sans abus "la plus saine et la plus hygiénique des boissons" (Pasteur).

9

DOCUMENT 1

PROCEDE D’ELABORATION DU CHAMPAGNE VENDANGES Récolte manuelle du raisin ↓ PRESSURAGE (Obtention des moûts = jus non fermenté) 4000 kg de raisins donnent 2050 litres de jus de meilleure qualité. Sulfitage en continu (50 mg de SO2/L) sur le jus s’écoulant du pressoir pour limiter

l’oxydation et éviter le développement des bactéries et des levures indigènes.

↓ FERMENTATION ALCOOLIQUE (1 semaine) Regroupement des moûts clarifiés dans des cuves pouvant atteindre jusqu’à 600 m3. Fermentation à 20-22°C par ensemencement avec des levures sélectionnées. Le vin obtenu est généralement très acide et ses arômes ne sont pas aboutis (vin « vert »). Contrôles : densité, SO2 total, acidités totale et volatile, alcool, sucres restants. ↓ FERMENTATION MALOLACTIQUE Déclenchement par ensemencement avec des bactéries lactiques. L’acteur principal de cette fermentation est Oenococcus œni. L’acide malique est alors transformé en acide lactique, ce qui abaisse l’acidité du vin. Cette fermentation permet aussi d’affiner les arômes du vin. Il est donc intéressant de

travailler avec des bactéries sélectionnées.

↓ SOUTIRAGE ET ASSEMBLAGE Les vins sont soutirés et assemblés après dégustation. Nouveau sulfitage pour éviter l’oxydation pendant toute la durée du stockage. ↓ TIRAGE Filtration, addition de liqueur de tirage (vin sucré) et de levures sélectionnées. Mise en bouteille puis mise en cave pour la prise de mousse : le sucre est transformé en

alcool et en dioxyde de carbone qui se dissout et rend le champagne effervescent.

↓ VIEILLISSEMENT ET STOCKAGE (2 à 10 ans) Les levures vont s’autolyser et participer à l’élaboration des propriétés organoleptiques. ↓ REMUAGE ET DEGORGEMENT Concentration du dépôt dans le col de la bouteille puis élimination du dépôt. ↓ ADDITION DE LIQUEUR D’EXPEDITION ↓ HABILLAGE ET COMMERCIALISATION

10

1 µm

Schéma de l’ultrastructure de Saccharomyces cerevisiae

Document 2

( A RENDRE AVEC LA COPIE)

11

paroi

espace périplasmique

membrane plasmique

polyoside

mannoprotéine

protéine périplasmique

A

B

C

D

les enveloppes de la levure Saccharomyces cerevisiae

DOCUMENT 3

DOCUMENT 4

βGlc1 ↓ 6 βGlc 1→3βGlc 1→3βGlc

GLc = D-glucopyrannose

12

Protéine P

[αM→6αM→6αM→6αM→6αM→6αM]n →6αM→6αM→6αM→6αM→6βM→4βGNAc→4βGNAc→ASn ↑2 ↑2 ↑2 ↑2 ↑2 ↑3 ↑3 ↑3 αM αM αM αM ← αM αM αM αM ↑2 ↑2 ↑2 ↑ ↑2 ↑2 αM αM αM αM αM αM ↑3 ↑3 ↑3 ↑3 αM αM αM αM

Chaîne extérieure Core

M = MANNOSE GNAC = N ACÉTYL GLUCOSAMINE ASN = ASPARAGINE = PHOSPHATE

MANNOPROTÉINE D

OC

UM

EN

T 5

P

12

13

Structure en double hélice de l’ADN selon Watson et Crick

DOCUMENT 6

DOCUMENT 7

3,4 nm

1

2

3

14

DOCUMENT 8

Principe de la PCR

15

DOCUMENT 9

Variation de l’absorbance à 260 nm d’une solutiond’ADN en fonction de la température

16

DOCUMENT 10

Résultats de la PCR lors de la détection de souches indésirables sur le vin. (Électrophorèse sur gel d’agarose. Révélation au bromure d’éthidium)

ligne de dépôt

cathode -

anode +

R1

R2

17

DOCUMENT 11

OBTENTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX

La réaction biologique est obtenue par immunisation d'un animal entier (lapin). Le taux d'anticorps obtenu peut être accru par recours à l'adjuvant de Freund. Après un ou plusieurs rappels on réalise une saignée. La purification des anticorps obtenus se réalise par purification par chromatographie d'affinité : les anticorps en solution sont filtrés sur une colonne de résine, gel ou billes portant l'Ag fixé ; les Ig spécifiques de cet Ag sont retenues puis décrochées par des tampons.

4 injections d’une souche d’Oenococcus cultivée sur MRS : • injection 1 = t 0 • injection 2 = t 10 jours • injection 3 = t 20 jours • injection 4 = t 70 jours

antisérum polyclonal

recueil du sérum

immunisation

saignée

18

Basée sur des cultures cellulaires in vitro, elle suit les étapes suivantes : 1. Immunisation d'un sujet :

- injection de l’Ag à une souris, - prélèvement de la rate et dissociation de ses cellules (essentiellement LB) ;

2. Hybridation cellulaire (cellules de la rate / cellules de myélome) : - les cellules de myélome utilisées sont des cellules cancéreuses non productrices

d'anticorps et incapables d’utiliser la thymidine du milieu de culture HAT utilisé (Hypoxantine Aminoptérine Thymidine)

- les lymphocytes B de la rate ne peuvent se développer en culture car ils ne reçoivent pas d'interleukines

- fusion cellulaire en présence de PEG (PolyEthylèneGlycol) => obtention de cellules hybrides

3. Sélection des cellules hybrides par culture sur un milieu HAT : - seules les cellules hybrides peuvent se multiplier

4. Séparation des anticorps : - réalisation d'une dilution limite, permettant d'obtenir au maximum une seule cellule par

goutte de milieu - distribution d'une goutte de suspension dans les différents puits de la plaque contenant un

milieu de culture - mise en culture quelques jours - recherche des puits contenant un clone d'hybridome - sélection des clones produisant l'anticorps intéressant (screening) par différentes

techniques immunologiques (immunoprécipitation, Elisa...)

5. Amplification du clone par culture cellulaire : - injection du clone dans le péritoine de souris : les hybridomes s'accrochent au mésentère

et sécrètent beaucoup d'anticorps dans l'abdomen, générant une ascite ponctionnée tous les 3 jours.

Cette technique in vivo tend à être remplacée par des cultures in vitro en grandes quantités.

sélection des clones

intéressants

lignée de myélome murin

DOCUMENT 12Obtention d’anticorps monoclonaux

19

DOCUMENT 13

Technique d'immunofluorescence ( IF )

1.Dépôt des micro-organismes sur une lame pour IF : − 20 µL de suspension du micro-organisme testé sont déposés à la surface des

cercles d'une lame pour IF − séchage 1 heure puis fixation à l'éthanol

2.Dépôt du tampon PGT (Tween 20 + gélatine porcine + eau physiologique) − 20 µL de PGTsont déposés à la surface des cercles − incubation 5 minutes à 37°C en atmosphère humide

3.Dépôt du sérum testé − 20 µL du sérum testé (dilué ou non en PGT) sont déposés à la surface des

cercles − incubation 20 minutes à 37°C en atmosphère humide

4.Lavage de tous les cercles avec du PGT

5.Dépôt du conjugué − 20 µL de conjugué (Ac anti Lapin marqué à la fluorescéine pour les sérums

polyclonaux, Ac anti murin marqué à la fluorescéine pour les sérums monoclonaux) sont déposés à la surface des cercles

− incubation 20 minutes à 37°C en atmosphère humide

6.Lavage de tous les cercles avec du PGT

7.Addition d'un contre colorant − 20 µL d'une solution de Bleu Evans sont déposés à la surface des cercles − incubation 20 minutes à 37°C en atmosphère humide

8.Lavage de tous les cercles avec du PGT Séchage puis montage avec une goutte de tampon glycérol et observation des cercles au microscope à fluorescence.

DOCUMENT 14

20

Dosage enzymatique de l’éthanol par méthode en point final (d’après Boehringer Ref 176290)

Principe :

Ethanol + NAD+ →←ADH acétaldéhyde + NADH + H+

Acétaldéhyde + NAD+ + H2O →ALDH acide acétique + NADH + H+

ADH : alcool déshydrogénase ALDH : aldéhyde déshydrogénase Mode opératoire : Témoin (T) Essai (E) Mélange réactionnel 1 (mL) 3,00 3,00 Échantillon (vin dilué au 1/100) (mL) - 0,10

Eau bidistillée (mL) 0,10 - Mélanger. Après environ 3 minutes à température ambiante, lire les absorbances A1 des cuves T et E contre l’air. Déclencher la réaction par addition de : Solution 2 (mL) 0,05 0,05 Mélanger. Après 5 à 10 minutes à température ambiante, lire les absorbances A2 des cuves T et E contre l’air. Mélange réactionnel 1 : NAD+, aldéhyde déshydrogénase, tampon biphosphate de potassium pH 9 Solution 2 : alcool déshydrogénase ∆AT = (A1-A2) témoin ∆AE = (A1-A2) essai Données : VT = volume total dans les cuves de mesure en mL v : volume d’échantillon l : trajet optique de la cuve de mesure en m ε : coefficient d’extinction molaire du NADH à 340 nm en m2.mol-1 M : masse molaire de l’éthanol en g.mol-1

DOCUMENT 15

21

DOCUMENT 16

fig1 : Activité de l’ADH en fonction de la concentration en éthanol

fig2 : Activité de l’ADH en fonction de la concentration en NAD+

Vi (10-3 min-1)

Vi (10-3 min-1)

c (mmol/L)

c (mmol/L)

22

0

Document 17

Schéma de l’évolution de la population des bactéries lactiques et de la fermentation malolactique au cours d’une vinification.

Début de la FML

Fin de la FML

Population restant dans le vin

Phase de latence

Deuxième phase de multiplication

Jours0 30 60

logN

23

Document 18

logN = f(t)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

temps (jours)

logN

(nbr

e de

bac

térie

s/m

L)

Suivi de la population bactérienne au cours d’une FML

logN = logarithme décimal de N

24

DOCUMENT 19

( A rendre avec la copie)

AIR AIR

grande cellule alvéolaire = pneumocyte granuleux

petite cellule alvéolaire = pneumocyte membraneux

lame basale

cellule conjonctive

prolongement cytoplasmique d’un pneumocyte membraneux

hématie

cellule endothéliale d’un capillaire sanguin

fibres de collagène

25

PO2 (en kPa)

( Température = 37°C )

% de saturation de l’hémoglobine en dioxygène

DOCUMENT 20

Courbe de fixation du dioxygène sur l’hémoglobine en fonction de la teneur en dioxyde de carbone

DOCUMENT 21

Ventilation pulmonaire (L/min)

% CO2 dans l’air expiré

Ventilation pulmonaire en fonction de la teneur en dioxyde de carbone

26

Document 22 a

Document 22 b

Document 23

Manteau Siphon

Branchies

E1 S1 E2

27

NS : neurone sensoriel NM : neurone moteur

DOCUMENT 24

DOCUMENT 25

NS : neurone sensoriel NM : neurone moteur

28

Expérience Résultat

1 Augmentation de la pression sanguine dans l’oreillette gauche Augmentation de la diurèse

2 Baisse de la pression sanguine dans l’oreillette gauche Baisse de la diurèse

3 Section des voies nerveuses sensitives de l’oreillette gauche puis variation de la pression sanguine dans l’oreillette gauche

Aucun effet sur la diurèse

4

Destruction de la zone supraoptique de l’hypothalamus (document 28) puis variation de la pression sanguine dans l’oreillette gauche

Aucun effet sur la diurèse

5

Ablation de la post-hypophyse chez un animal dont l’hypothalamus est intact (document 28) puis variation de la pression sanguine dans l’oreillette gauche

Aucun effet sur la diurèse

6 Injection d’un extrait de la post-hypophyse (= vasopressine) Baisse de la diurèse

7 Stimulation électrique de la zone supraoptique de l’hypothalamus

Augmentation de la teneur plasmatique en vasopressine et baisse de la diurèse

DOCUMENT 26

DOCUMENT 27

29

DOCUMENT 28

Post-hypophyse

Anté-hypophyse

Hypothalamus Zone supraoptique