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Dosage des
protéines
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Le dosage des protéines :
Intérêts du dosage :
Il est souvent nécessaire de connaître la concentration totale de l’ensemble des protéines
contenues dans un échantillon, par exemple pour suivre les différentes étapes d’une
purification. Pour ce faire, on cherche à mesurer stoechiométriquement l’ensemble des
protéines contenues dans cet échantillon.
Les critères importants pour une bonne technique de dosage des protéines sont :
Le seuil de détection très faible
La spécificité importante
La facilité de mise en œuvre
La rapidité
Le coût peu élevé
L’ensemble des techniques de dosage protéique repose sur l’utilisation des propriétés
physiques et chimiques intrinsèques des protéines. Citons parmis les plus répandues :
1. Folin (O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Far rand R.J. Randall (1951). J. Biol. Chem.
193, 265).
2. Absorption U.V. (J. Janin, (1985) Spectroscopie d’absorption. Collection Méthodes,
Hermann, 125-135).
3. Bradford (M.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254).
4. Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires. (S. Udenfried. (1978) Science
1978, 871-872).
Différentes méthodes utilisées pour le dosage des protéines :
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1) Absorption U.V. :
Les mesures d’absorption d’un composé en solution aqueuse sont limitées à l’ultraviolet ou à
la partie visible du spectre, zone où le solvant n’absorbe pas ou très peu. Les molécules qui
absorbent dans ces longueurs d’onde sont appelées chromophores. Ce sont principalement les
molécules comportant des noyaux aromatiques ou des doubles liaisons conjuguées. Dans le
cas des protéines, les chromophores sont les résidus d’acides aminés aromatiques (TRP,
TYR : absorption à 280nm) et les liaisons peptidiques (absorption à 230nm). L’absorption
d’un chromophore à une longueur d’onde donnée (λ) dépend de sa nature, de sa concentration
et de la longueur du trajet optique. C’est ce qui est représenté par la relation de Beer-
Lambert :
A λ = ε λ LC
Où A est l’absorption du chromophore à la longueur d’onde λ, ε représente le coefficient
d’extinction molaire (mg-1
.ml.cm-1
), L est la longueur du trajet optique dans la cuvette de
mesure (cm) et C est la concentration du chromophore (mg.ml-1
).
Au vu de cette relation, il est aisé d’imaginer une méthode de dosage des protéines d’un
échantillon par mesure de son absorption à une longueur d’onde donnée. Afin d’obtenir une
sensibilité maximale, il est préférable de choisir une longueur d’onde correspondant à un pic
d’absorption. Les protéines montrent un maximum d’absorption ultraviolette à 280nm. La
mesure de l’absorbance à 280nm peut être utilisée comme moyen d’estimer la concentration
totale en protéine ; toutefois l’absorbance dépend du contenu des protéines en deux acides
aminés seulement, et peut donc varier considérablement d’une protéine à l’autre.
D’une manière générale, l’avantage de la technique d’absorption UV pour le dosage du
contenu total en protéines d’un échantillon est que cette technique est non destructive.
Néanmoins, la présence de substances non protéiques (autres que les acides nucléiques) qui
absorbent dans l’UV peut invalidés la technique.
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2) Folin (réactions chimiques)
En 1927, Folin et Colciateu mirent au point la réaction qui porte aujourd’hui leur nom et qui
est à la base d’une des méthodes de titration des protéines les plus utilisées. L’acide
phosphomolybdo-tungstique (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O et
3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) est le constituant actif du réactif de Folin. La présence
d’une protéine entraîne sa réduction par perte d’un à trois atomes d’oxygène. La fixation de
cuivre par chélation faciliterait le transfert d’électrons vers l’acide mixte. On obtient ainsi
plusieurs espèces réduites possédant une couleur caractéristique (absorption maximale à 745-
750nm).
3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O
3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O
Espèces réduites colorées (bleues)
λ max = 745-750nm
Le mélange d’acides mixtes phosphomolybdo-tungstiques est réduit par une réaction rapide
avec des résidus d’acides aminés aromatiques (TYR et TRP) et par une réaction plus lente
avec les complexes cuivre-liaisons peptidiques et/ou cuivre-chaînes latérales polaires.
3) Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires (fixation
covalente sur la protéine)
Il est possible d’utiliser la réactivité de certains groupements d’une protéine pour y greffer des
molécules de type chromophore ou fluorophore. La fluorescamine en est un exemple. Cette
molécule se fixe sur les amines primaires. A l’état libre, elle n’est pas fluorescente. Très
rapidement à pH 9, on obtient un produit de couplage fluorescent entre l’amine primaire et la
fluorescamine. Cette réaction se déroule en parallèle avec une réaction de dégradation de la
fluorescamine, plus lente, produisant des composés non fluorescents. On mesure la
fluorescence à une longueur d’onde d’émission de 475nm consécutive à une excitation à
390nm. Il est alors possible de détecter 0.5µg de protéines (10 fois plus sensible que la
méthode de Folin).
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L’intensité de fluorescence reflète la quantité de fluorescamine couplée, c'est-à-dire la
quantité d’amine primaire. Bien que très sensible, cette technique est plus variable que les
méthodes vues précédemment puisque la fluorescence est principalement due à un seul acide
aminé seulement (LYS). De plus, cette méthode n’est pas absolument spécifique des protéines
et ne doit donc être utilisée que pour le dosage des protéines débarrassées de toute
contamination par des amines primaires (peptides, acides aminés, tampon tris, Glycine….).
4) Bradford (fixation non covalente d’une colorant)
Certaines molécules ont une affinité pour les protéines et peuvent donc s’y fixer plus ou
moins fortement. Dans le cas où le spectre d’absorption de ces molécules est modifié par la
fixation (avec ou sans traitement ultérieur) ou quand une forme ayant un spectre
caractéristique se fixe seule (équilibre déplacé vers cette forme), il est possible de les utiliser
pour doser les protéines en solution. L’exemple le plus courant est certainement la méthode de
Bradford qui utilise la fixation du bleu de Coomassie sur les protéines. Ce colorant existe sous
trois formes différentes (anionique, neutre, cationique) ayant chacune un spectre d’absorption
caractéristique. C’est la forme anionique qui interagit (de manière non covalente)
préférentiellement avec les protéines. La fixation du bleu de Coomassie se réalise si la
molécule à évaluer comporte des groupements fonctionnels basiques et/ou aromatiques.
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Cette méthode est donc basée sur l'adsorption d’un colorant, le bleu de Coomassie G250 aux
protéines. Cette méthode est très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. Elle est aussi
assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. Seuls
les détergents, comme le Triton et le dodécyl sulfate de Na (SDS), et des bases fortes
interfèrent avec celle-ci.
5) Conclusions :
Il existe de nombreuses méthodes de dosage des protéines, comportant souvent un certain
nombre de variantes. Le choix d’une méthode de dosage dépendra avant tout de la quantité de
protéines à doser, des interférences possibles avec des contaminants non protéiques puis de la
facilité de mise en œuvre, de la rapidité de la réponse souvent importante en cours de procédé,
ainsi que des conditions de dosage.
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Manipulations expérimentales :
But :
Au cours de ces travaux pratiques, vous déterminerez la concentration en protéines totale
d’une solution diluée de blanc d’œuf. Pour ce faire, vous utiliserez les techniques
d’absorption UV et de Bradford.
1) Absorption UV :
- Mesurer l’absorbance à 280nm d’une solution stock d’albumine bovine afin d’en calculer la
concentration protéique exacte. (ε280nm BSA = 0.66 ) (Concentration théorique de 1mg/ml).
- Réaliser un spectre d’absorption dans l’UV d’une solution de blanc d’oeuf diluée entre 250
et 350nm.
2) Méthode Bradford :
Une solution stock de colorant a été préparée. Celle-ci contient 1g de bleu de Coomassie
G250 dissout dans 200ml d’acide phosphorique 88% et 100ml d’éthanol 95%.
A partir de cette solution, préparer le réactif colorant. Pour ce faire, additionner à 30ml de
solution stock, 80ml d’acide phosphorique 88% et 40ml d’éthanol 95%, amener à 600ml avec
de l’eau distillée. Diluer cette solution 2X puis la filtrer sur papier Wathman N°1.
Une solution stock d’albumine bovine à 1mg/ml a été préparée. Cette solution vous permettra
de tracer une courbe d’étalonnage.
Préparer une solution de NaCl 0,9% nécessaire à la réalisation des différentes dilutions de
blanc d’œuf.
Manipulation :
Dans un premier temps, vous effectuerez une courbe d’étalonnage donnant l’absorbance du
réactif colorant en fonction de la concentration de protéine standard, ici l’albumine bovine.
Pour cela :
Préparer trois séries de tubes numérotés de 1 à 6
Pipeter les quantités de la solution d’albumine bovine indiquées dans le tableau ci-
après
Amener le volume, dans chaque tube, à 100µl à l’aide d’eau distillée
Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du
vortex
Après 5 minutes et avant 1 heure, mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau
distillée
Tracer la courbe d’étalonnage, c'est-à-dire l’absorbance à 595nm en fonction de la
quantité d’albumine bovine (µg)
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Tube
n°
Albumine
à 1mg/ml
(µl)
Eau distillée
(µl)
Colorant
(ml)
Albumine
Concentration
finale (µg)
D.O. à
595nm
D.O. à
595nm -
blanc
1
1’
1’’
- 100 4
2
2’
2’’
10 90 4
3
3’
3’’
20 80 4
4
4’
4’’
50 50 4
5
5’
5’’
80 20 4
6
6’
6’’
100 0 4
La concentration finale d’albumine dans chaque tube peut être calculée précisément à partir
de la concentration réelle de la solution stock d’albumine calculée préalablement par la loi de
Beer-Lambert.
Dans un second temps, vous allez déterminer la concentration en protéines du blanc d’œuf, à
partir de la droite d’étalonnage. Pour cela :
Réaliser plusieurs dilutions de blanc d’oeuf (10X, 100X, 500X, 1000X) dans une
solution de NaCl 0,9%
Numéroter ensuite 2 tubes pour chacune des dilutions réalisées
Placer dans ceux-ci, 100µl de la dilution adéquate de blanc d’œuf
Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du
vortex
Après 5 minutes et avant 1 heure, mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau
distillée
A partir de la courbe étalon, déterminer la concentration protéique du blanc d’œuf.
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Tube n°
Blanc d’œuf
dilué
(µl)
NaCl 0,9%
(µl)
Colorant
(ml)
D.O. à
595nm
D.O. à
595nm -
blanc
Concentration
protéique
(µg)
Blanc
Blanc’ - 100 4
10X
10X’ 100 - 4
100X
100X’ 100 - 4
500X
500X’ 100 - 4
1000X
1000X’ 100 - 4
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Electrophorèse sur gel
de polyacrylamide
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L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide :
Introduction :
La technique d’électrophorèse repose sur le déplacement (et la séparation) de particules
chargées dans un champ électrique. La vitesse de déplacement d’un ion (mobilité), sous
l’influence d’un champ électrique, dépend d’une part de la charge de l’ion et d’autre part des
forces de viscosité qui ralentissent son mouvement dans le solvant (fr iction).
On a : mobilité d’une molécule = (champ appliqué * charge de la molécule)/(friction de la
molécule)
Soit : V=qE/f avec q : charge de la particule ; E : champ électrique ; f : coefficient de
frottement entre les particules et le solvant.
Dans le cas des protéines, la charge est due essentiellement aux groupements fonctionnels des
chaînes latérales (lysine, arginine, histidine, acides aspartiques et glutamiques, cystéine et
tyrosine). La charge portée par ces acides aminés dépend du pH et de la constante d’ionisation
des groupes fonctionnels.
La technique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodécyl
Sulfate (SDS) permet de séparer les protéines par rapport à leur masse moléculaire. On parle
alors de SDS-PAGE pour SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (voir plus bas).
Electrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de dénaturant : le
dodécyl sulfate de sodium (SDS) :
Le SDS est un détergent dont la formule est :
CH3-(CH2)11-OSO3-Na
+
Comme toutes les substances amphiphiles, le SDS est constitué d’une tête polaire (-) et d’une
queue hydrophobe.
Ce détergent s’adsorbe, grâce à sa chaîne aliphatique, sur les protéines et les dénature
complètement. 1.4gr de SDS se lie par gramme de protéine, soit une molécule de SDS pour 2
acides aminés. La portion protéique du complexe protéine-SDS ainsi obtenu subit un
changement de conformation conduisant à un haut degré d’ordre : le complexe (chargé
négativement) prend la forme d’un bâtonnet. Ce qui permet une séparation des protéines dans
un champ électrique en fonction exclusivement de leur masse moléculaire.
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Cette méthode permet de déterminer rapidement la masse moléculaire des protéines, celles-ci
ayant une migration électrophorétique inversement proportionnelle au logarithme de leur
masse moléculaire.
Le gel de polyacrylamide :
Le réseau de polyacrylamide est formé par la polymérisation de monomère d'acrylamide
(CH2=CH-CO-NH2) (acryl) en présence de bis acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-
CH=CH2) (NN'méthylène-bisacrylamide). Le bis acrylamide, appelé aussi Bis, est l'équivalent
de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl et est utilisé comme agent
pontant.
Figure 1 : formules des monomères
L'acrylamide polymérise en longue chaîne incorporant des molécules de bis acrylamide au
sein du polymère ainsi formé. La polymérisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse
par radicaux libres (polymérisation vinylique), initiée par l'addition de persulfate d'ammonium
et de TEMED (NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine), le TEMED catalysant la décomposition
des ions persulfates pour donner des radicaux libres.
Figure 2 : initiation de la polymérisation
Si on représente ce radical R· et M un monomère d'acrylamide, on peut alors représenter la
polymérisation ainsi :
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Figure 3 : réaction de polymérisation
Figure 4 : structure moléculaire du gel
Remarque : L’oxygène, molécule qui peut se transformer en radical libre, interfère avec ce
processus de polymérisation.
On obtient ainsi un réseau, dont les mailles sont de tailles variables en fonction des
proportions d’acrylamide et de bisacrylamide utilisées ; le gel obtenu se comporte donc
comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d’autant moins vite qu’elles sont
volumineuses).
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Plus précisément, quelles sont les caractéristiques générales d’un gel
électrophorèse SDS-PAGE et comment se déroule la migration des
protéines dans celui-ci ?
Caractéristiques générales :
Un gel SDS-PAGE comprend deux parties distinctes : le gel de concentration d’une part et le
gel de séparation d’autre part. Le passage de l'une à l'autre se fait avec un changement de pH
et une augmentation de la concentration en acrylamide d’un gel à l’autre. L'objectif du gel
d'électrophorèse en deux parties est de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de
protéines et aux volumes parfois non négligeables déposés dans les puits. On réalise donc une
étape de concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans
le gel de concentration (stacking gel), qui migreront ensuite dans le gel de séparation
(resolving gel).
Caractéristiques moléculaires :
Un gel SDS-PAGE typique comprend 2 parties distinctes : gel de concentration et gel de
séparation. Le taux de réticulation de ces gels, qui correspond à la porosité du gel, dépend des
quantités d'acrylamide et de bis acrylamide. Le gel de concentration est de 4%, le gel de
séparation varie entre 5 et 20 % suivant la taille des protéines que l'on veut séparer.
Masse moléculaire (KDa) % d'acrylamide
10 - 40 15 - 20
40 - 100 10 - 15
100 - 300 5 - 10
300 - 500 5
Champ
électrique
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Phénomène d’isotachophorèse, principe de la concentration :
Le gel de concentration a pour but de concentrer les échantillons déposés.
L’électrophorèse se déroule dans un tampon Tris-Glycine contenant du SDS (TGS). A pH 6.8
du gel de concentration, les ions glycinates ont une faible mobilité comparés à celles des
protéines. Par contre, les ions chlorures contenus dans le gel ont une mobilité plus importante
(ions pilotes). Ceci induit la formation de 2 limites mobiles : une entre l'ion d'arrière garde et
le complexe SDS-protéines et une entre SDS-protéines et l'ion pilote. Les complexes
protéines-SDS vont donc se concentrer entre les ions chlorures et les ions glycinates. Au
niveau de l’interface du gel de concentration et de séparation, des changements drastiques
vont s’opérer.
Ces changements se font sur deux niveaux :
Le gel de séparation est plus réticulé que le gel de concentration. Celui-ci sert dès lors
de tamis moléculaire.
Le gel de séparation a un pH différent, il est basique (pH=8.8, le gel de concentration
étant à 6.8) cette modification de pH ne modifie pas la mobilité des protéines mais
augmente la mobilité des ions glycinates complètement ionisés à ce pH.
Figure 8 : vitesse des différents composés ioniques
Les vitesses de migration indiquées dans le tableau de la figure 8 sont celles des différents
acteurs de l'électrophorèse, ce sont en fait les vitesses au niveau des protéines si ces ions
étaient seuls.
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Au terme de l’électrophorèse, lorsque le bleu de bromophénol contenu dans les échantillons
atteint le bas du gel, le gel est coloré afin de faire apparaître les protéines ainsi séparées.
Différents types de coloration existent, parmis les plus courantes, la coloration au bleu de
coomassie ou la coloration à l’argent. L’intensité des différentes bandes protéiques reflète
partiellement leur abondance dans l’échantillon et la position/migration reflète la masse
moléculaire relative de chaque protéine. Cette masse moléculaire est comparée à des étalons
calibrés en unité de masse protéique (Dalton, Da).
La mesure des distances de migration parcourue par les protéines de référence permet de
tracer une droite étalon représentant le logarithme du poids moléculaire de celles-ci en
fonction de leur mobilité, on obtient ainsi une droite de pente négative, les petites protéines
migrant plus bas que les grosses. Pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine
donnée, il suffit dès lors de rapporter la distance de migration observée pour celle-ci sur la
droite d’étalonnage.
Expérimentations :
1. But :
Le but de cette manipulation est de déterminer la masse moléculaire de protéines inconnues à
l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de déterminer si
celle-ci est constituée de plusieurs sous unités reliées par des ponts disulfures.
a) pour cela, vous établirez un étalonnage du gel à l’aide d’un mélange protéique
constitué de différents référents dont les masses respectives sont connues (250kDa,
150kDa, 100kDa, 75kDa, 50kDa, 37kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa, 10kDa).
b) A partir de cette droite d’étalonnage, vous déterminerez la masse moléculaire des
protéines inconnues.
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2. Préparation des gels :
Les gels que vous allez préparer sont constitués de deux parties distinctes : un gel dit de
« concentration » et un gel dit de « séparation ». Comme le nom l’indique, le gel de
concentration a pour effet de concentrer les différents échantillons de façon à augmenter la
résolution de séparation électrophorétique. Le gel de séparation est utilisé pour séparer les
différents constituants des échantillons en fonction de leur masse. Ces deux gels diffèrent par
leur concentration en acrylamide, leur pH et leur concentration en ions.
- gel de séparation : (0.375mM Tris-HCl, pH 8.8)
7 % 7.5 % 8 % 9 % 10 % 11 % 12 % 13 % 14 % 15 %
Acryl/Bis
(ml) 2.331 2.4975 2.664 2.997 3.33 3.66 4 4.33 4.66 5
Eau (ml) 5.014 4.8475 4.681 4.348 4.02 3.68 3.35 3.02 2.68 2.35
Tris 8.8
(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Persulfate
(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Temed
(µl) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
SDS (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Volume
total pour
2 mini
gels (ml)
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
- Mélanger les différentes solutions correspondant au gel de séparation 12% (cf. Tableau ci-
dessus) dans 1 petit erlenmeyer.
- Bien homogénéiser. Dès ce moment, il faut procéder très rapidement pour couler la solution
ainsi préparée entre deux plaques de verre.
- Avant que les gels ne polymérisent, déposer sur leur sommet, très prudemment, quelques
gouttes de butanol.
- Les gels sont polymérisés après 40 minutes environ. Avant leur emploi, éliminer la couche
de butanol en les rinçant avec de l’eau distillée. Couler de la même manière, le gel de
concentration. Avant polymérisation du gel, placer le peigne en évitant la formation de bulle.
Ce peigne a pour but de former des créneaux : endroits où se déposeront les différents
échantillons.
- gel de concentration : (0.125mM Tris-HCl, pH 6.8)
4 %
Acryl/Bis (ml) 1.33
Eau (ml) 6.02
Tris 6.8 (ml) 2.5
Persulfate (µl) 50
Temed (µl) 10
SDS (ml) 0.1
Volume total pour 2 mini gels (ml) 10
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3. Préparation des échantillons :
Préparer les tubes eppendorfs suivants :
- échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon sans réducteur
- échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon avec réducteur
- échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon sans réducteurs
- échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon avec réducteurs
Remarque : composition du tampon échantillon (concentré 4X)
Eau distillée 8.5 ml
Tris pH 6.8 2.5 ml
glycérol 5 ml
SDS 10% 4 ml
0.05% bleu de bromophénol Quelques grains
Réducteurs : Mercaptoéthanol 1 ml
4. Electrophorèse :
- Recouvrir dans l’appareil, les gels à l’aide du tampon d’électrophorèse (Tris 2.5mM pH 8.3,
glycine 19.2mM, SDS 0.01% (w/v). Eliminer soigneusement toutes les bulles d’air
éventuelles.
- Remplir les deux compartiments de l’appareil à l’aide du même tampon.
- Déposer, TRES PRUDEMMENT, les échantillons au sommet des gels.
- Raccorder les électrodes au générateur.
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- Réaliser l’électrophorèse sous courant constant de 20mA/gel. Dans ces conditions, le
colorant de référence (contenu dans le tampon échantillon) parcourt les ¾ du gel en 1 heure
environ.
Après l’électrophorèse, retirer les gels. Attention, ces gels sont hautement fragiles et cassent
facilement. En conséquence, les manipuler avec prudence.
5. Coloration et décoloration :
- solution de coloration :
Bleu de coomassie R-250 1.25 g
Méthanol 100 ml
Acide acétique 50 ml
Eau distillée 350 ml
Les gels sont recouverts de solution colorante pendant 1 heure.
- Mesurer la longueur du gel
- Dénombrer le nombre de bandes protéiques constituant l’échantillon de référence (marqueur
de masse moléculaire), ainsi que les différents échantillons et mesurer leur migration relative
(Mr) définie par la relation suivante :
Mr = (P/l) * (L/C)
- P = distance parcourue par la protéine (mm)
- l = longueur du gel après décoloration (mm)
- L = longueur du gel avant décoloration (mm)
- C = distance parcourue par le colorant de référence (mm)
- Porter en graphique le logarithme de la masse moléculaire (pour les référents) en fonction de
leur migration relative. Tracer la meilleure droite passant par ces points.
- Déduire à partir de ce graphique, la masse moléculaire des protéines inconnues et déterminer
si celles-ci sont constituées de plusieurs sous unités. Si oui, déterminer la masse moléculaire
de chacune des différentes sous unités.
Après coloration, les gels sont retirés de la solution colorante, rincés à l’eau distillée, puis
placés dans une solution de décoloration. Les laisser dans cette solution jusqu’à décoloration
complète (en dehors des zones protéiques).
- solution de décoloration :
Méthanol 300 ml
Acide acétique 100 ml
Eau distillée 600 ml
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Purification des
protéines
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Purification des protéines :
Séparation des protéines par filtration moléculaire :
Parmi toutes les méthodes chromatographiques permettant la purification des protéines, la
filtration moléculaire sur gel (ou chromatographie d’exclusion) occupe une place
déterminante.
Principe de la filtration moléculaire :
La filtration moléculaire sur gel est un procédé qui permet de séparer des molécules en
fonction de leur taille (masse).
Les gels utilisés sont constitués de particules insolubles mais solvatées (se présentant sous
formes de perle) formant un réseau tridimensionnel. Le degré de réticulation détermine les
dimensions des mailles du réseau et par conséquent l’accessibilité de ce dernier aux molécules
de solutés que l’on souhaite séparer.
Le principe de la filtration moléculaire sur gel est basé sur la capacité des molécules à
pénétrer dans les pores de la phase stationnaire constituée par le gel.
Une substance dissoute dans un solvant, est appliquée sur une colonne contenant un gel : ses
molécules se distribuent d’abord librement dans la phase mobile (solvant), si elles sont
suffisamment petites pour avoir accès aux pores du gel, il s’établit un équilibre entre les deux
phases (phase mobile et phase stationnaire). Les molécules situées dans le gel ne sont plus
entraînées par le flux et sont retardées. Ce phénomène d’équilibre, répété tout au long de la
colonne, explique l’action de tamis moléculaire. Les molécules sont donc éluées dans l’ordre
des masses moléculaires décroissant.
De manière générale :
- Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes sont totalement exclues du gel
et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes, c'est-à-dire dans la phase mobile
(solvant). Elles sortent les premières, à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la
colonne.
Elution
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- Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes peuvent pénétrer librement
dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide
à l'intérieur des billes (phase stationnaire) + volume de liquide à l'extérieur des billes (phase
mobile)). Elles sortent donc les dernières, à un volume d'élution Vt ou volume total des
liquides de la colonne.
- Les molécules de taille intermédiaire pénètrent dans les billes, en fonction de leur taille et de
leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont éluées dans
l'ordre des masses molaires décroissantes.
Chaque type de molécule sera caractérisé, pour un gel de réticulation donnée, par un
coefficient de distribution Kd.
Le volume total (V) d’une colonne comportant du gel est égal à la somme du volume de
tampon extérieur aux grains de gel (V0), du volume à l’intérieur des grains de gel (Vi) et du
volume du gel lui-même (Vg) :
V = Vo + Vi + Vg
- Vo est également appelé volume mort. Il correspond au volume de liquide nécessaire
pour éluer une substance à travers une colonne quand les molécules sont
complètement exclues du gel.
- Vi peut être calculé à partir du poids sec du gel (a) et du coefficient de rétention d’eau
(Wr) :
Vi = a x Wr
- Le volume d’élution d’une substance (Ve) dépend du volume extérieur au gel (Vo) et
du coefficient de distribution Kd :
Ve = Vo + Kd x Vi
Donc Kd = (Ve-Vo)/Vi = (Ve-Vo)/(axWr)
- Pour les grosses molécules qui ne peuvent pénétrer dans la phase stationnaire : Kd = 0
(molécules totalement exclues du gel).
- Pour les petites molécules qui pénètrent totalement : Kd = 1 (diffusion libre dans la
phase stationnaire).
Deux substances de masses moléculaires différentes auront, vis-à-vis d’un type de gel
déterminé, des coefficients de distribution Kd’ et Kd". Les volumes d’élution de ces deux
substances diffèreront d’une quantité Vs définie par l’équation :
Vs = Ve’-Ve" = (Vo + Kd’ x Vi) - (Vo + Kd" x Vi)
Vs = (Kd’ - Kd") x Vi
- 23 -
Pour séparer complètement deux substances, le volume de l’échantillon ne doit pas être
supérieur à Vs. Donc il faut que V échantillon < (Kd’ - Kd") x Vi.
Parmi un grand nombre de gels que l’on peut trouver commercialement, citons :
le Sephadex G formé à partir d’un hydrate de carbone de haut poids moléculaire : le
dextrane
le Biogel P, formé de polyacrylamide
Les gels d’agarose (Sepharose, Biogels A) formés généralement à partir de
polysaccharides
Les gels mixtes formés de polyacrylamide et de polysaccharides copolymérisés
(Ultrogel et Sephacryl).
L’ensemble de ces gels est de type hydrophile. Il existe des gels de type organophiles dont les
plus courant sont à base de polystyrène ponté.
Nous nous intéresserons lors de ce TP, au gel de Sephadex ; le plus couramment utilisé. Le
Sephadex est un gel formé de perles, préparé par réticulation du dextran à l’aide de
l’épichlorhydrine CH3- CH-CH2-Cl. Les chaînes de polymères sont reliées les unes aux autres
par des ponts de type éther glycérate -O-CH2-CH-CH2-O-
Le grand nombre de groupements hydroxyles (-OH) confère au gel un caractère hydrophile.
En conséquence, le Sephadex gonfle très facilement dans l’eau et les solutions d’électrolytes.
Les gels de Sephadex diffèrent entre eux par leur degré de réticulation.
OH
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Types et qualité de
Sephadex
Diamètres des
grains (µm)
Domaine de
fractionnement
(Daltons)
Volume de gel en
ml/g de Séphadex sec
Sephadex G-10 40-120 -700 2-3
Sephadex G-15 40-120 -1500 2.5-3.5
Sephadex G-25
Coarse
Medium
Fine
Superfine
100-300
50-150
20-80
10-40
1000-5000
4-6
Sephadex G-50
Coarse
Medium
Fine
Superfine
100-300
50-150
20-80
10-40
1500-30000 9-11
Sephadex G-75 10-40 3000-70000 12-15
Sephadex G-100 10-40 4000-100000 15-20
Sephadex G-150 10-40 5000-150000 20-30
Sephadex G-200 10-40 5000-250000 30-40
A chaque type de Sephadex est associé un domaine de fractionnement. Cet intervalle de poids
moléculaire correspond à la zone de séparation. La limite supérieure de ce domaine est
appelée limite d’exclusion. Les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à cette limite
sont totalement exclues du gel et sont éluées dans un volume appelé volume mort. Celles qui
ont un poids moléculaire plus petit que la limite inférieure du domaine de fractionnement sont
éluées dans un volume sensiblement égal au volume du gel.
Ainsi, si l'on connaît la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par
cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté, celui dont le domaine de fractionnement,
c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale,
englobe la masse molaire de la molécule à purifier.
Stabilité chimique :
Le Sephadex est insoluble dans la plupart des solvants. Il est stable dans l’eau, les solutions
salines, les solvants organiques, les solutions alcalines et faiblement acides. En présence
d’acide fort, les chaînes glycosidiques de la matrice sont hydrolysées.
Stabilité physique :
Le Sephadex peut être stérilisé soit à l’état sec soit à l’état humide à pH neutre par autoclave à
120°C. Par contre, chauffé à plus de 120°C, à l’état sec, il commence à caraméliser.
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Manipulation :
Préparation d’une colonne de Sephadex :
Pour obtenir une bonne séparation des constituants d’un mélange, la préparation de la colonne
doit être exécutée avec soin.
Faire gonfler le Sephadex au minimum une nuit dans le tampon choisi (calculer la
quantité nécessaire pour le volume de la colonne d’après le tableau de la page 25).
Remplir ensuite la colonne au 2/3 à l’aide du tampon, puis versé la suspension de
Sephadex (robinet fermé). Quand les grains ont sédimentés sur une hauteur de
quelques cm, on ouvre le robinet et on fait couler goutte à goutte. Du Sephadex est dès
lors ajouté pour compléter la colonne. Pour obtenir un remplissage de la colonne
homogène, juste avant de rajouter du Sephadex, homogénéiser la surface du gel sur
une profondeur de quelques cm (à l’aide d’une pipette pasteur).
N.B : Il faut surtout éviter que le gel ne vienne jamais à sec.
Application de l’échantillon :
Aspirer (au moyen d’une pipette pasteur) la plus grande partie du liquide se trouvant
au dessus de la surface du gel (robinet fermé)
Ouvrir le robinet légèrement et lorsque le reste du liquide a disparu dans le gel,
(ATTENTION jamais à sec !!!) fermer le robinet
NaCl 0.9% Sephadex Sephadex
NaCl 0.9%
0.9%
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Déposer ensuite délicatement et uniformément l’échantillon le long de la colonne avec
un mouvement rotatif juste au-dessus de la surface du gel (éviter de perturber la
surface du gel). La manière dont l’échantillon est déposé est très importante.
Faire pénétrer l’échantillon en ouvrant le robinet. Dès que l’échantillon a pénétré dans
le gel, déposer de la même manière quelques ml de tampon. C’est le début de
l’élution, c'est-à-dire que la fraction recueillie dès cet instant portera le n°1.
On remplit ensuite complètement de tampon la colonne et on la relie au réservoir.
But :
Séparer 3 substances de poids moléculaires différents sur deux types de Sephadex G : un
Sephadex G100 et un Sephadex G25.
Pour cela, chaque groupe a à sa disposition le matériel suivant :
1) Un mélange constitué de :
un polymère de haut poids moléculaire : le « blue dextran 2000 ». C’est un
polysaccharide d’un poids moléculaire moyen d’environ 2.000.000 daltons sur lequel
est couplé un chromophore polycyclique donnant une couleur bleue. La concentration
en Blue dextran 2000 est de ± 2mg/ml.
L’hémoglobine (Hb), une protéine globulaire (rouge) d’un poids moléculaire de 65000
daltons. Sa concentration est de ± 5mg/ml.
Le Ferrycianide de potassium (FP), K3Fe(CN)6 composé jaune d’un poids moléculaire
de 329 daltons. Sa concentration est de ± 2mg/ml.
2) Une colonne de G100 conditionnée en NaCl 0.9%.
3) Une colonne de G25 conditionnée en NaCl 0.9%.
4) Du matériel nécessaire pour la chromatographie (bouchons, pipette, tuyau, pinces
seringues,…)
Manipulation :
Chromatographier ± 500µl de la solution décrite ci-dessus sur les colonnes de Sephadex. Pour
cela suivre les instructions données précédemment. Eluer avec du NaCl 0.9%. Régler le débit
soit au moyen de la pince, soit en jouant sur la hauteur du réservoir à NaCl 0.9% de manière à
avoir un débit de ± 15 ml/h. Observer les séparations au niveau des différents types de
Sephadex.
Résultats :
Observer les séparations. Interpréter les résultats obtenus à la lumière des notions
théoriques développées précédemment.
Tracer une courbe étalon à partir des données obtenues pour la colonne G100
- 27 -
Extraction et
dénaturation de l’ADN
- 28 -
Extraction et dénaturation de l’ADN :
L'ADN peut être extrait et purifié à partir de n'importe quel type de cellules nucléées. Dans
notre cas, nous utiliserons, le thymus de veau.
Le thymus de veau (connu sous le terme « ris de veau » dans le commerce) est constitué de
cellules jeunes dont le rapport nucléocytoplasmique est élevé. Il s’agit d’une glande bilobée
qui ne joue un rôle important que pendant les premières années de la vie. Il est situé à la base
du cou, en arrière du sternum. Déjà étendu chez le nouveau-né, il se développe pendant
l’enfance, période au cours de laquelle il est le plus actif. Il cesse de croître à l’adolescence,
après quoi, il s’atrophie graduellement. Chez la personne âgée, il est presque entièrement
remplacé par une masse de tissu conjonctif et adipeux. Les cellules épithéliales du thymus
sécrètent principalement une famille d’hormones peptidiques, dont la thrompoïétine et la
thymosine, qui semblent jouer un rôle essentiel dans le développement des lymphocytes T et
dans l’établissement de la réponse immunitaire.
1.1 Principe d’extraction :
Les étapes d’isolement de l’ADN sont :
- Libération de l’ADN sous une forme soluble par destruction des membranes
cellulaires et nucléaires ;
- Dissociation du complexe ADN-protéines (histones, protamines) par dénaturation des
protéines (traitement par un détergent, le SDS) ;
- Séparation de l’ADN des autres macromolécules par précipitation à l’alcool et
extraction en présence de sels.
1.2 Méthode d’extraction :
1) couper 10g de thymus de veau (1g d’ADN) en petits morceaux
2) homogénéiser au mixer 3 minutes dans 40ml du tampon glacé suivant :
NaCl 0.9% - Citrate de Na 0.01M
3) centrifuger à froid à 5000t/min pendant 10 minutes dans un tube à centrifuger
4) récupérer le culot, et y ajouter 40ml de tampon glacé, homogénéiser en agitant
fortement et centrifuger à nouveau 10 minutes
5) renouveler l’opération une troisième fois
6) récupérer le culot et homogénéiser 3 minutes dans un récipient contenant 200ml de
NaCl 0.09% glacé
7) ajouter en agitant (agitateur magnétique) 18ml d’une solution Sodium Dodécyl Sulfate
(SDS) 5% dans de l’éthanol 45%
- 29 -
8) agiter lentement 1heure à température ambiante
9) ajouter ensuite 13g de NaCl solide et agiter 10 minutes
10) filtrer sur étamine (récupérer le filtrat dans un bécher)
11) ajouter lentement 200ml d’alcool dénaturé en tournant délicatement à la main avec
une baguette de verre
Remarques : Pendant les manipulations d’extraction, il faut faire attention à ne pas altérer
l’ADN : éviter les pH extrêmes, les températures élevées, les faibles forces ioniques.
12) Une fois la purification terminée, remettre l’ADN en solution dans 100ml d’une
solution de NaCl 150mM, citrate de sodium 15mM.
1.3 Dénaturation de l’ADN purifié :
La dénaturation de l’ADN est possible par variation du pH, de la température ou de la
concentration en sels. Dans ces conditions, les 2 brins d’ADN se séparent pour se retrouver
sous forme d’ADN monobrin. Dans notre cas, nous allons dénaturer l’ADN, préalablement
purifié à partir du thymus de veau en augmentant graduellement la température.
Dénaturation de l’ADN par variation de la température :
Les deux brins antiparallèles d'ADN sont toujours étroitement reliés entre eux par des liaisons
hydrogène formées entre les bases complémentaires A-T et G-C.
Lorsque l'énergie thermique apportée par une augmentation de la température, est suffisante
les liaisons H interbrins rompent. Ce sont les appariements A-T qui se séparent les premiers
au cours de la montée de la température car ils ne possèdent que deux liaisons hydrogènes
contrairement aux appariements G-C qui en possèdent trois. Ainsi une molécule d'ADN
double brin composée uniquement d'appariements G-C (3 liens H) nécessitera plus d'énergie
- 30 -
pour être dénaturée sous la forme de molécules simple-brins, qu'un ADN de même taille
composé d'appariements A-T (2 liens H).
La dénaturation de l’ADN peut être mise en évidence par mesure de la densité optique à
260nm. En effet, celle-ci augmente au cours du désappariement, c’est ce qu’on appelle l’effet
hyperchrome.
La dénaturation de l’ADN peut être suivie par mesure de la DO260nm en fonction de la
température. La séparation des 2 brins d’ADN s’accompagne d’un changement des propriétés
de la solution (la viscosité diminue) et a lieu dans un intervalle de température étroit. On
nomme « température de fusion » Tm (melting temperature), la température pour laquelle
50% des molécules d'ADN sont désappariées (i.e. sous forme simple brin).
Plusieurs formules empiriques permettent de calculer la valeur de la température de fusion.
Elles tiennent compte du pourcentage de base (G+C), de la salinité du milieu ainsi que de
- 31 -
divers facteurs correctifs, tels que la présence de structures secondaires intra ou extra
moléculaires (repliement de l'ADN sur lui-même, formation d'appariements entre deux brins).
Dans cette partie de la manipulation, vous allez déterminer la Tm et le contenu en GC de
votre ADN purifié. Pour ce faire, votre solution d’ADN purifié est placée dans un bain marie
à 90°C, avec un thermomètre dedans afin de contrôler sa température. Veuillez à bien
homogénéiser votre solution en la mélangeant continuellement. Prélever 1ml de votre
solution à chaque saut de température de 5°C et mesurer la densité optique de celui-ci à
260nm. Porter en graphique, l’évolution de la DO260nm en fonction de la température et
déterminer sur ce graphe, la Tm de votre ADN purifié. Déterminer ensuite grâce à cette
valeur, le % de GC contenu dans votre ADN en vous rapportant à la figure présentée ci-
dessus.
Remarques :
Prendre une mesure de la DO260nm avant toute élévation de la température (ADN sous
forme double brins)
Il faut que celle-ci avoisine une valeur de 0.2 (soit 10µg/ml). Si ce n’est pas le cas,
diluer votre solution d’ADN purifié pour arriver à cette valeur de départ.
- 32 -
Analyses des lipides du
tissu adipeux et de la
cervelle
- 33 -
Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle :
Introduction
Les lipides constituent la matière grasse des êtres vivants. Ce sont de petites molécules
hydrophobes ou amphipathiques principalement constituées de carbone, d’hydrogène et
d’oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. A température ambiante, les lipides
peuvent être à l'état solide, comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles.
Le groupe des lipides est diversifié et comprend les graisses neutres, les phospholipides, les
stéroïdes et une certain nombre d’autres substances lipoïdes.
Les graisses neutres :
Les graisses neutres, aussi appelées triglycérides ou triacylglycérols, sont des esters d’acides
gras (R1, R2, R3) et de glycérol. Ils sont dits « simple » lorsque les 3 acides gras sont
identiques et « mixtes » lorsqu’ils contiennent 2 ou 3 acides gras différents.
CH2 – O – CO – R1
CH – O – CO – R2
CH2 – O – CO – R3
Les triglycérides se retrouvent principalement au niveau du tissu adipeux sous cutané et
entourant certains organes. Ils servent de protection et d’isolation à ces organes mais sont
également une réserve d’énergie pour l’organisme.
Les phospholipides :
Les phospholipides ou glycérophospholipides, sont des triglycérides modifiés ayant un
groupement contenant du phosphate et deux chaînes d’acides gras au lieu de trois.
Les phospholipides diffèrent les uns des autres par le type d'acides gras rattachés au glycérol.
Généralement, un des deux acides gras est saturé et l'autre ne l'est pas. Ils diffèrent aussi par
différents groupements chimiques qui peuvent se rattacher au groupement phosphate.
CH2 – O – CO – R1
CH – O – CO – R2
CH2 – O – CO -- O -- P – O --
Squelette glycérol
Liaison ester
Groupement
Acyle
Squelette glycérol
Liaison ester
Groupement
Acyle
Ethanolamine
Choline
Sérine
Inositol
O
O Tête hydrophyle
- 34 -
Le tableau ci-après présente les différents groupements chimiques pouvant se lier au
groupement phosphate :
Ethanolamine NH2 – CH2 – CH2 - OH
Choline
|
CH3 – N - CH2 – CH2 - OH
|
Sérine
NH2 – CH2 – CH – OH
|
COOH
Inositol
OH OH
OH
OH
OH OH
Les glycérophospholipides sont amphiphiles comportant à la fois une caractères hydrophile et
hydrophobe.
Les glycérophospholipides sont les principaux constituants des membranes cellulaires et sont
abondants dans le tissu nerveux.
Les stéroïdes :
Les stéroïdes ont une structure très différente des graisses. Les stéroïdes le plus courant pour
l’être humain est le cholestérol.
Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires, il contribue à leur stabilité
et au maintien de leurs structures en s'intercalant entre les phospholipides. Le cholestérol est
également un précurseur de nombreuses molécules :
la vitamine D3 qui intervient dans la calcification des os,
les hormones stéroïdes : cortisol, cortisone et aldostérone,
les hormones stéroïdes sexuelles : progestérone, œstrogène et testostérone
les acides biliaires,….
CH3
CH3
+
- 35 -
Autres substances lipoïdes :
Manipulations :
Le but de la manipulation est de passer en revue les principaux lipides des mammifères. A
cette fin, nous allons analyser deux tissus riches en lipides, à savoir le lard et la cervelle. A
partir de ces tissus, nous allons préparer des extraits dont nous séparerons les trois principales
classes de lipides : les graisses neutres ou triacylglycérols, les phospholipides et le cholestérol,
sur base de leur solubilité dans divers milieux.
A. Matériel : (pour 10 groupes)
Solvant chloroforme/méthanol (1 :2) Chloroforme 300ml
Méthanol 600ml
Lard
Cervelle
Solution de KOH saturée (dans une bouteille en plastique) KOH 50g
H2Od 45ml
Solution KOH dans l’alcool Solution KOH saturée 20ml
Alcool dénaturé 180ml
Alcool éthylique (alcool dénaturé) 50% Alcool éthylique 300ml
H2Od 300ml
Chlorure de cadmium (solution saturée dans l’alcool éthylique) CdCl2 1/2H2O 28g
H2Od 19.6ml
Alcool dénaturé 450ml
Solvant chromatographie (65 : 25 : 1 : 4) Chloroforme 260ml
Méthanol 100ml
Acide acétique 4ml
H2Od 16ml
Chlorure de calcium 2M CaCl2 29.4g
H2Od 100ml
Ether diéthylique 200ml
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Acétone 300ml
Ninhydrine Ninhydrine 25mg
Butanol 50ml
Ether de pétrole 200ml
Molybdenum blue
!!!! Remarque importante : les solvants organiques, spécialement l’éther et l’éther de pétrole,
sont très inflammables. Il est donc interdit d’allumer une flamme à proximité de ceux-ci.
B. Préparation des extraits de lard et de cervelle :
L’extrait de lard et de cervelle est réalisé avec l’assistant (30g de tissu / 300ml de solvant). Il
consiste en un broyage mécanique du tissu dans un mélange chloroforme : méthanol (1 : 2).
Les résidus insolubles sont ensuite éliminés par filtration. L’analyse des lipides de ces deux
tissus se fait en parallèle.
C. Exercice I : Séparation des 3 groupes de lipides :
Dans un bécher marqué lard ou cervelle, pipeter 20ml de l’extrait correspondant. Evaporer sur
la paque électrique jusqu’à élimination complète du solvant (SOUS HOTTE !!!!!). Pendant
l’évaporation, commencer à préparer les chromatographies (exercice II).
1. Précipitation des phospholipides :
Les phospholipides et spécialement leurs sels de cadmium sont insolubles dans un mélange
acétone : éther (3 :1).
Après refroidissement, dissoudre le résidu de l’évaporation dans 2ml d’éther, verser cette
solution dans un tube à centrifuger marqué lard ou cervelle selon le cas. Ajouter 5 gouttes de
la solution de CdCl2 et 6ml d’acétone. Centrifuger quelques minutes et comparer l’importance
des précipités obtenus dans chacun des tubes.
2. Saponification des graisses neutres :
Le surnageant de la centrifugation contient les graisses neutres et le cholestérol. Décanter ce
surnageant dans un bécher marqué lard ou cervelle selon le cas. Ajouter 6ml de la solution
KOH-alcool et mélanger. Chauffer jusqu’à évaporation (SOUS HOTTE !!!!!). Les graisses
sont saponifiées. Les acides gras libérés sont présents sous formes de sels de potassium
(savons). Laisser évaporer pour voir les savons se déposer sous forme de masse visqueuse
dans le fond du bécher.
3. Séparation des savons et du cholestérol : (l’assistant le fait pour tout le monde)
Après refroidissement, dissoudre le résidu du bécher « cervelle » à l’aide de 7ml d’alcool à
50%. Transvaser le tout dans une ampoule à décanter et ajouter 10ml d’éther de pétrole. Par
agitation, le cholestérol est extrait dans cette phase organique, tandis que les savons restent
dans la phase aqueuse. Après séparation des deux phases, on laisse s’écouler la phase
aqueuse. L’éther de pétrole est recueilli dans un bécher sec marqué, et est laissé sous la hotte
jusqu’à évaporation. Le cholestérol cristallise en aiguille.
- 37 -
Remarque : A la fin des manipulations, rincer l’ampoule à décanter avec une dizaine de ml de
la solution alcool à 50%. Agiter vigoureusement et éliminer le liquide à l’évier.
4. Précipitation des savons calciques :
Reprendre le résidu du bécher « lard » à l’aide de 20ml d’eau. Mélanger. La solution de savon
peut être assez visqueuse lorsque ceux-ci sont abondants. Séparer ces 20ml en deux tubes
contenant 10ml chacun. Ajouter, goutte à goutte, 10 gouttes de la solution de CaCl2 2M à l’un
des deux tubes et 10 gouttes d’acide acétique à l’autre. Bien observer le phénomène. Les sels
d’acides gras précipitent. Agiter vigoureusement.
D. Exercice II : Chromatographie sur couche mince :
La chromatographie sur couche mince se réalise sur des plaques de verre recouvertes d’une
mince couche de silice, ou acide silicilique amorphe, renfermant 13% de CaSO4.H2O. Il s’agit
d’une méthode physique de séparation des différents constituants d’un mélange. Cette
technique est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases : la
phase stationnaire fixée sur une plaque de verre (la silice) et la phase mobile (solvant ou un
mélange de solvants) qui progresse le long de la phase stationnaire.
Une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une plaque de
chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par la silice ; ce qui signifie que les molécules
interagissent avec cette dernière et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. La
plaque de chromatographie est ensuite trempée dans un solvant (éluant) et placée dans un
récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long de la plaque à chromatographie
par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Les différentes substances constituant
l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement
avec la silice. Une fois la migration terminée, généralement quand le front de solvant (éluant)
est presque arrivé en haut de la plaque à chromatographie, celle-ci est retirée de la cuve et le
solvant est évaporé. Par la suite le résultat de la migration, le chromatogramme, peut-être
révélé de différentes manières.
Plaque de
chromatographie
- 38 -
1. Préparation des plaques :
Préparer une plaque de chromatographie en prenant comme modèle le dessin suivant :
A l’aide d’un crayon fin, (!!!!! ne pas appuyer trop fort avec la pointe du
crayon), tracer dans le gel de silice, une ligne divisant la plaque de
chromatographie en deux parties égales, noter L ou C pour lard ou cervelle
respectivement. Noter également les initiales de votre groupe dans un coin.
L’application des échantillons est une opération délicate : attendre la démonstration par
l’assistant. Un petit volume de l’échantillon à analyser est prélevé par capillarité, dans une
pointe de pipette pasteur. Il est appliqué délicatement, par simple contact, à l’endroit prévu sur
la plaque. Le liquide diffuse dans le gel à partir du point de contact. Le diamètre de la tâche
formée ne peut pas excéder 4 à 5 mm. Laisser sécher. Recommencer à côté en appliquant 3
gouttes puis 5, laisser bien sécher avant l’application des gouttes successives. Procéder de
manière similaire pour chacun des échantillons (lard ou cervelle).
2. Chromatographie :
La plaque, une fois préparée est disposée dans une cuve (les bords correspondant aux tâches
trempent dans le solvant). Fermer la cuve hermétiquement. Le solvant monte dans le gel par
capillarité (chromatographie ascendante). Laisser migrer le solvant jusqu’au moment où il
atteint la ligne transversale.
Le solvant utilisé pour la chromatographie est constitué d’un mélange acide (chloroforme
(65vol) – méthanol (25vol.) – acide acétique (1vol) – eau (4vol)) qui assure une migration
complète des lipides neutres et une rétention partielle des lipides polaires et surtout chargés.
Pendant la migration, continuez l’exercice I.
3. Révélations : (réalisées par l’assistant)
Gel de concentration
Gel de séparation
C L
1 3 5 1 3 5
- 39 -
On enlève la plaque de la cuve, sans toucher la couche de gel, et on laisse sécher.
Trois révélations différentes sont appliquées à cette chromatographie.
vapeur d’iode : la vapeur d’iode a la propriété de s’adsorber au niveau des différents
lipides séparés. Ceux-ci apparaissent alors sous forme de tâches jaunes brunes. Cette
adsorption est réversible. En effet, l’iode se désorbe à l’air libre.
Placer votre plaque à chromatographie dans une cuve contenant des paillettes d’iode. Les
tâches de lipides apparaissent après quelques minutes. Sortir la plaque et dessiner le
chromatogramme sur la plaque à chromatographie à l’aide d’un crayon fin. Lorsque l’iode est
sublimé, appliquer le second révélateur.
Ninhydrine : certains phospholipides portent une fonction NH2 libre que l’on peut
révéler à la ninhydrine.
Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. Pulvériser de
façon homogène la solution de ninhydrine et mettre la plaque de chromatographie à l’étuve
quelques instants. Des tâches colorées apparaissent. Sur le chromatogramme déjà réalisé,
colorer les tâches qui ont réagis à ce test.
Réactif du phosphore : ce réactif contient du molybdate et un réducteur. En présence
de phosphore, il se forme un complexe phosphomolybdique qui est réduit en
phosphomolybdyle bleu. Seuls les phospholipides réagissent.
Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. Pulvériser
prudemment et de façon homogène la solution de molybdène bleu (le liquide est très acide).
Compléter à nouveau le chromatogramme.
Ces deux dernières méthodes de révélations n’étant pas applicables en même temps sur une
même plaque de chromatographie, certains groupes appliqueront la première et d’autres
groupes la deuxième. Les résultats seront donc mis en commun afin d’identifier les différentes
tâches révélées sur la plaques de chromatographie que ce soit pour l’extrait lard ou pour
l’extrait cervelle.
L’ensemble de ces méthodes permet la détection, par ordre croissant, des principaux lipides
d’intérêt biologique :
1. les lipides neutres et cholestérol
2. glycolipides
3. phosphatidyléthanolamine
4. phosphatidylcholine
5. phosphatydylsérine
6. sphingomyéline
- 40 -
Caractérisation des
sucres
- 41 -
Caractérisation des sucres :
Les glucides sont les biomolécules les plus abondantes de la terre.
Chez les végétaux, la photosynthèse synthétise, à partir du gaz carbonique et de l’eau, le
glucose qui est stocké sous forme d’amidon ou transformé en cellulose. Chez les animaux, la
majeure partie des glucides est apportée par l’alimentation et est d’origine végétale ;
néanmoins, les glucides peuvent également être synthétisés à partir de molécules non
glucidiques.
Les glucides sont constitués d’une ou de plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques
polyhydroxylées. Ce groupement aldéhyde ou cétone leur confère un caractère réducteur. En
effet, en milieu alcalin, le glucose va réduire le Cu2+
(bleu) de la liqueur de Fehling, en Cu+
(précipité rouge brique).
Le rôle des glucides est multiple. Tout d’abord, au niveau extracellulaire, ils jouent un rôle
structural important, soutenant et protégeant les structures biologiques.
Exemples :
la cellulose de la paroi cellulaire végétale
la chitine des exosquelettes d’insectes et de crustacés
Au niveau intracellulaire, ils ont un rôle énergétique (production d’énergie, réserve sous
forme de cellulose chez les végétaux et sous forme de glycogène chez les animaux,…) et
métabolique important.
On classe les glucides de la manière suivante :
les monosaccharides, formés d’une seule sous unité (le glucose par exemple)
les disaccharides, formés de deux sous unités (le saccharose par exemple = glucose +
fructose)
les oligosaccharides, formés de 3 unités ou plus
les polysaccharides, formés de plus de 10 unités ou plus
Les monosaccharides :
Les monosaccharides possèdent tous une fonction carbonyle :
Aldéhyde pour les aldoses (exemple : glucose) qui sont composés d'une chaîne
d'alcools secondaires ayant à une extrémité un alcool primaire et un aldéhyde à l'autre
extrémité.
Cétone pour les cétoses (exemple : fructose), les autres carbones étant porteur d'une
fonction alcool primaire ou secondaire selon la position.
Ils sont caractérisés par leur nombre de carbone : formule générale : Cn(H2O)n
- Les trioses possèdent 3 carbones : dihydroxyacétone, glycéraldéhyde ;
- Les tetroses possèdent 4 carbones : érythrose, thréose, érythrulose;
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- Les pentoses possèdent 5 carbones : ribose, arabinose, xylose, lyxose, ribulose,
xylulose;
- Les hexoses possèdent 6 carbones : allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose,
galactose, talose, psicose, fructose, sorbose, tagatose;
- Les heptoses possèdent 7 carbones ; sedoheptulose;
Les disaccharides :
Ils sont constitués de 2 oses liés par une liaison osidique. Par exemple : le maltose (-D-
glucopyranosyl(14)-D-glucopyranose), le saccharose (-D-glucopyranosyl(12)-D-
fructofuranose), le lactose (-D-galactopyranosyl(14)-D-glucopyranose), ...
Les saccharides simples et les disaccharides ayant de libre leur carbone hémiacétalique sont
réducteurs de par leur fonction aldéhyde. La fonction aldéhydique est oxydée en fonction
acide carboxylique. L'une des fonctions alcool primaire peut être oxydée en fonction acide
carboxylique.
Saccharose Maltose
Lactose
Dihydroxyacétone Ribose Galactose Fructose Glucose
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Les disaccharides non réducteurs sont ceux dont aucun carbone hémiacétalique n'est libre, il
est mis en jeu dans la liaison osidique.
Les polysaccharides :
Association d'un très grand nombre de molécules liées par des liaisons O-glycosidiques. Les
chaînes sont soit linéaires soit ramifiées.
L'amidon
L'amidon est un glucide de réserve utilisé par les végétaux supérieurs pour stocker de l'énergie
(dans les graines, les racines, …) au même titre que le glycogène chez les animaux.
C'est un polysaccharide (C6H10O5)n constitué de deux composés :
L'amylose, molécule formée d'environ 600 molécules de glucose chaînées
linéairement par une liaison α(1→4)
L'amylopectine, amylose ramifié par une liaison α(1→6) environ toutes les 20 unités de
glucose.
L'amylose s'organise en une hélice droite à six glucoses par tour. Il se dissocie en glucose
assimilable sous l'action d'enzymes, les amylases. Ces enzymes sont présentes dans la salive,
ainsi que dans le suc pancréatique.
L'alpha-amylase est spécifique des liens α(1-4) glycosidiques, ce qui a pour conséquence la
transformation de l'amylose en molécules de maltose (disaccharides de α-glucose).
L'amidon est insoluble dans l'eau froide. En le traitant par l'eau chaude, on obtient l'empois
d’amidon. Il est exploité dans l'industrie pour ses propriétés d'épaississant et de gélifiant.
L’amidon peut-être mis en évidence par le lugol (eau iodée) qui conduit à une coloration noire
caractéristique (réaction entre l'amylose et l'iode).
Le glycogène
Au niveau de sa structure, il est pratiquement identique à l'amidon. Toutefois, il possède plus
de ramifications que ce dernier (ramification environ toutes les 10 unités de glucose), tout le
α(1→4)
α(1→6)
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reste de la structure est identique à l'amidon. C'est la substance de réserve glucidique des
animaux.
La cellulose
La principale molécule structurelle des plantes est la cellulose. Le bois est en partie composé
de cellulose, tandis que le papier et le coton sont de la cellulose presque pure. La cellulose est
un polymère de glucose liés par une liaison β(1→4). C'est une molécule très longue et rigide,
dont la structure lui confère ses propriétés mécaniques telles qu'observées chez les plantes.
Le lien osidique
L'hydrolyse du lien osidique peut être chimique, elle n'est alors pas spécifique et elle conduit à
la formation de plus petites sous unités : les monosaccharides. Elle peut être réalisée en
présence d'acide chlorhydrique.
L'hydrolyse du lien osidique peut également être enzymatique. Dans ce cas, elle est spécifique
et réalisée par des hydrolases.
la β-glucosidase hydrolyse les liaisons osidiques mettant en jeu un glucose dont l'OH
hémiacétalique est en position β ;
L'α-amylase rompt les liaisons osidiques à l'intérieur de la chaîne d'amylose ;
La β-amylase hydrolyse les liaisons osidiques à partir des extrémités.
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Manipulations :
Tests de la mise en évidence des glucides :
1) Test à la liqueur de Fehling :
La réaction de Fehling est une réaction caractéristique des aldéhydes. Ainsi, le test à la liqueur
de Fehling met en évidence la présence des glucides (aldose ou cétose*) par l’action réductrice
d’une solution de sel cuivrique. (* : En milieu alcalin, le cétose est isomérisé en aldose et se comporte
donc comme un sucre réducteur.)
Pour l'essentiel, la solution de Fehling (ou liqueur de Fehling) est un complexe basique d’ions
cuivriques par les ions tartrates.
Au cours de la réaction, le cuivre oxyde l'aldéhyde pour donner un acide selon la réaction
bilan d'oxydo-réduction générale :
R-CHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O(s) + 2H2O
En présence de sucres réducteurs, le cuivre présent dans le complexe bleu est réduit et
précipite sous forme d’oxyde cuivreux Cu2O de couleur jaune rouge.
Préparation de la liqueur de Fehling :
Solution A : 3.47g de CuSO4.5H2O, ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentré et compléter
à 50ml avec de l’eau distillée
Solution B : dissoudre avec précaution 17.3g de tartrate sodico-potassique
(KNaC4H4O6.4H2O) et 5g de NaOH en pastille dans H2Od et amener le volume de la
solution à 50ml
Les solutions A et B sont mélangées à volumes égaux au moment de l’utilisation pour le test.
Remarque : Il est indispensable d’ajouter le tartrate sodico-potassique afin que le cuivre reste
en solution sous forme de complexe bleu soluble. En effet, si ce dernier n’est pas présent, le
NaOH réagit avec le CuSO4 par la réaction suivante :
CuSO4 + 2NaOH → Na2SO4 + Cu(OH)2
Bleu insoluble
Puis, déjà à température ambiante, mais encore plus si on chauffe, l’hydroxyde cuivrique est
déshydraté par la réaction suivante :
Cu(OH)2 → H2O + CuO
Noir insoluble
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Par contre, si avant d’ajouter NaOH à CuSO4 en solution, on ajoute le tartrate sodico-
potassique, le cuivre restera en solution sous forme de complexe bleu soluble.
Test de Fehling :
- Répartir dans 5 tubes à essai 1ml de la solution A et 1ml de la solution B
- Dans chaque tube, ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v), glucose 5%
(w/v), amidon 5%, sucrose 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v) acidifié de 4 gouttes d’HCl
concentré.
- Placer les tubes dans un bain-marie à 100°C pendant 5 minutes
- Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats
obtenus.
2) Test de Tollens :
La réaction de Tollens est une réaction caractéristique des aldéhydes. Il met donc en évidence
la présence des glucides (aldose ou cétose*). (* : En milieu alcalin, le cétose est isomérisé en aldose et
se comporte donc comme un sucre réducteur.)
Pour l'essentiel la solution de Tollens est un complexe de nitrate d'argent en solution
ammoniacale. Au cours de la réaction l'ion argent I oxyde l'aldéhyde pour donner un acide
selon la réaction bilan d’oxydo-réduction générale :
R-CHO + 2Ag(NH3)2OH + NaOH → RCOONa + 2Ag + 2H2O + 4NH3
Un dépôt d’argent se forme alors sur les parois du tube évoquant un miroir, ce qui confère à
ce test le nom de « test du miroir d'argent ».
Préparation du réactif de Tollens :
- Préparer une solution de 2ml d’AgNO3 5%
- Ajouter 1ml de NaOH 10% pour précipiter Ag2O
- Ajouter par petites portions (environ 0.5ml) NH4OH 10% en agitant fréquemment le
tube jusqu'à dissolution du précipité (3ml de NH4OH devraient suffire)
- Compléter à 10ml avec H2O
Test de Tollens :
- Répartir dans 4 tubes à essai 1ml de réactif de Tollens
- Dans chaque tube, ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v), glucose 5%(w/v),
amidon 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v).
- Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats
obtenus.
Hydrolyse de l’amidon par les α-amylases:
L’étudie de l’hydrolyse de l’amidon par les α-amylases salivaires consiste en une analyse des
produits formés au cours du temps. Cette hydrolyse se réalise en plusieurs étapes :
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Amidon soluble → dextrines de longueurs variables → maltose
Afin de mettre en évidence, l’hydrolyse de l’amidon, deux tests vont être réalisés, le test à la
liqueur de Fehling d’une part et le test de l’iode d’autre part.
Test de l’iode pour les polysaccharides :
L’iode se complexe avec les polysaccharides (amidon, glycogène) en formant
vraisemblablement une structure de coordination résultant de sa fixation entre les chaînes
adoptant une conformation hélicoïdale. La couleur du complexe formé dépend de la longueur
entre branchements du polysaccharide considéré.
La molécule présentant le plus grand nombre de branchement étant l’amidon, celui-ci devrait
réagir fortement avec l’iode. Cette réaction devrait ensuite diminuer graduellement en
fonction de la digestion de l’amidon par les α-amylases.
Mode opératoire :
- Mélanger 0.4g d’empois d’amidon dans 10ml d’H2Od. Verser cette suspension dans
20ml d’H2O bouillante. Laisser bouillir 2 minutes. Laisser refroidir dans la glace.
Amener à 40ml avec H2O. Bien mélanger.
- Quand l’amidon est refroidi, ajouter 0.4 à 0.5ml de salive
- Répartir le mélange dans 6 tubes à essai (solution bien homogène) et les placer dans
un bain-marie à 37°C
- Sortir un tube à la fois après 0, 2, 5, 15, 30 et 60 minutes et stopper la réaction en
plongeant le tube dans un bac de glace.
- Effectuer immédiatement le test de l’iode. Pour ce faire, prélever 2ml du tube à essai
puis leurs ajouter 2ml H2O et 1 goutte de réactif à l’iode (lugol = 5g I2 + 1g KI +
100ml H2O)
- Effectuer ensuite un test à la liqueur de Fehling comme expliqué précédemment sur
1ml d’échantillon.
- Observer et expliquer les différents résultats obtenus.
Métabolisme du glucose chez la levure :
La fermentation alcoolique est une réaction biochimique consistant à libérer de l'énergie à
partir de sucre (du glucose la plupart du temps). La fermentation ne nécessite pas de
dioxygène, elle peut donc avoir lieu en milieu anaérobie. Elle se distingue, par son faible
rendement énergétique, de la respiration cellulaire, qui nécessite, elle, de l'oxygène (milieu
aérobie). Lors de la respiration, l'accepteur final des électrons provenant des cofacteurs réduits
NADH, H+ sont transférés à l'oxygène, alors que dans le cas de la fermentation, les électrons
sont transférés à des composés des voies métaboliques, tels que le pyruvate entraînant la
formation d’éthanol.
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP
La fermentation alcoolique est réalisée par de nombreux organismes (bactéries, levures)
vivant de manière permanente ou occasionnelle dans des milieux dépourvus d'oxygène. La
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propriété de certaines levures à transformer le sucre en éthanol est utilisée par l'homme dans
la production de boissons alcoolisées et pour la fabrication du pain. Le meilleur milieu de
température est à 35°C-40°C.
Le but de l’expérience est d’observer le métabolisme du glucose chez la levure et donc sa
consommation. Ceci peut-être réaliser par mesure du CO2 produit au cours de la fermentation.
Pour ce faire, dans un système hermétique, nous allons mettre en présence des levures avec
différentes concentrations de glucose. La réaction suivante va alors avoir lieu :
1 glucose → 2 pyruvate → 2CO2 + 2 éthanol
En intégrant dans notre système une quantité connue de NaOH, nous allons pouvoir par la
suite titrer la quantité restante de celui-ci après un temps donné puisque ce dernier va réagir
avec le CO2 produit de la manière suivante :
CO2 + 2 NaOH → Na2CO3 + H2O
Afin de ne pas renverser la réaction, et donc de ne pas provoquer une libération du CO2
produit, lors du titrage de NaOH restant, nous ajouterons dans le système du BaCl2, amenant à
la production d’un précipité de BaCO3.
Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2 NaCl
Mode opératoire :
a) préparation de la levure :
- peser 4g de levure par groupe
- placer la levure dans un tube à centrifuger
- la suspendre dans 10ml H2Od, porter le volume à 40ml
- centrifuger 5 minutes (centrifugeuse de table), décanter et jeter le surnageant
- laver une deuxième fois la levure de la même manière, centrifuger, …
- reprendre le culot de levure dans 5ml H2Od. Ceci constitue la suspension de levure.
b) fermentation du glucose :
- Dans 3 fioles coniques avec un compartiment central, placer les différentes solutions
comme indiqué dans le tableau ci après :
Fiole n° 1 (contrôle) Fiole n° 2 Fiole n° 3
Compartiment extérieur :
Suspension de levure 1.5ml 1.5ml 1.5ml
H2O 2.5ml - -
Solution de glucose 20mg/ml - 2.5ml -
Solution de glucose 40mg/ml - - 2.5ml
Compartiment intérieur :
Solution de NaOH 3M 0.6ml 0.6ml 0.6ml
- Fermer les 3 fioles avec 2 feuilles de parafilm afin que le système soit bien hermétique
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- Incuber les fioles 45 minutes à 25°C (étuve), agiter très délicatement de temps en
temps
- Au terme des 45 minutes, injecter à travers le parafilm 1ml de TCA 20% dans le
compartiment extérieur des 3 fioles pour stopper la fermentation
- Refermer avec une nouvelle feuille de parafilm
- Incuber 15 minutes à 25°C (étuve)
- Titrer le CO2 produit par la fermentation*. Pour ce faire, ajouter dans un bécher, 2ml
de BaCl2 1M + 1ml H2Od + 3 gouttes de phénophtaléine + 0.5ml du NaOH de votre
fiole conique. Titrer le tout avec 10ml de HCl 0.3M
*Remarque : réaliser au préalable un titrage test afin de connaître quelle est la quantité
maximum de HCl qu’il faut pour neutraliser 0.5ml NaOH 3M normalement. Pour ce faire
réaliser la même opération mais placer dans votre bécher du NaOH frais (n’ayant fixer aucune
molécule de CO2).
Grâce aux différents volumes de titration obtenus pour les 3 fioles, vous pouvez à présent
calculer combien de molécules de glucose ont été consommées et quels sont les rendements
observés dans chaque cas.
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