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ROSSETTE SELVAMOHAN
Le rôle de Ctso et d’Acta2,
deux gènes candidats suppresseurs de métastase,
dans la cascade métastatique
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Rossette Selvamohan, 2013
II
Résumé
La métastase est la cause principale de décès chez les individus atteints de tumeurs solides.
Lors d'un criblage pan-génomique d’ARN interférence, 22 gènes candidats suppresseurs de
métastase ont été identifiés (Gobeil et al., 2008). Parmi ceux-ci, le gène de la cathepsine O
(Ctso) et celui de l’actine alpha des muscles lisses (Acta2), ont été choisis pour être
caractérisés. Les résultats obtenus en faisant des études de perte de fonction par ARN
interférence et de gain de fonction via une expression ectopique, suggèrent que Ctso et
Acta2 sont impliqués dans l’adhésion et la migration et potentiellement dans la
survie/croissance cellulaire ainsi que dans l’invasion des cellules tumorales. De plus, mes
résultats démontrent que la protéine Ctso est secrétée par des cellules de mélanome murin,
suggérant une fonction extracellulaire. Bien que ces résultats tendent à démonter
l’implication de Ctso et Acta2 dans la métastase, d’autres études doivent être accomplies
pour approfondir leur rôle.
III
Avant-propos
J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, le Dr Stéphane Gobeil, pour
son expertise et son encouragement lors de mes travaux. Il m’a appris que la science n’est
pas seulement une somme d’évidences, composé de protocoles précis à suivre.
Plutôt, il m’a appris à toujours me poser des questions, à douter de mes propres résultats,
reposant ainsi d’autres questions, pour en arriver à une fin incontestable.
Je lui souhaite une longue carrière remplie de succès.
Je remercie aussi le Dr. Dimtcho Batchvarov et sa professionnelle de recherche, Magdalena
Batchvarova, pour m’avoir appris la persistance et la discipline non seulement dans le
domaine académique mais aussi en face de l’adversité.
J’aimerais aussi remercier le Dr. Charles Doillon. Malgré son horaire chargé, il a toujours
pris le temps de m’aider lorsque j’ai frappé à sa porte.
Un gros merci aussi à Mamadou Keita, du laboratoire du Dr. Dimtcho Batchvarov, pour
avoir été un des premiers à m’avoir guidé à travers cette aventure.
Aux membres de mon équipe : votre camaraderie était précieuse lors que mon passage ici et
votre bonne humeur, contagieuse.
Et dernièrement, et non la moindre, ma famille. Malgré la distance entre nous, vous étiez
juste à un coup de fil de moi. Et des fois, ce coup de fil faisait toute la différence.
IV
Venez, mes amis, il n'est pas trop tard de partir en quête d'un monde nouveau,
Car j'ai toujours le propos de voguer au-delà du soleil couchant.
(…)
Bien que beaucoup nous a été pris, beaucoup demeure.
Et même si, nous ne sommes pas aujourd'hui la force qui autrefois
Remuait la terre et le ciel;
Ce que nous sommes, nous le sommes;
Un tempérament égal de cœurs héroïques,
Affaiblis par le temps et le destin, mais résolu
De s’efforcer, de chercher, de trouver, et de ne pas céder.
Extrait du poème Ulysses de Lord Alfred Tennyson (1809- 1892)
Traduit de l’anglais
V
Table des matières
Resumé ........................................................................................................................ II
Avant-propos ............................................................................................................ III
Table de matières ..................................................................................................... ..V
Liste d’abréviations et d’acronymes ...................................................................... VII
Liste des figures .......................................................................................................... X
Liste des tableaux ..................................................................................................... XI
Chapitre 1 Introduction ............................................................................................... 1 1.1 La métastase : impact sur la société et la communauté scientifique ....................................................... 1 1.2 La cascade métastatique ........................................................................................................................................ 2
1.2.1 L'éléphant parmi nous: comprendre la métastase .................................................................................... 2 1.2.2 Qu’est-ce qu’un nom? Comment définir la métastase. .......................................................................... 3 1.2.3 La cascade métastatique ..................................................................................................................................... 4
1.3 Un phénotype agressif : genèse de la cascade métastatique ...................................................................... 7 1.3.1 L’hyperprolifération : le rôle du cycle cellulaire et ses points de contrôles ................................. 7 1.3.2 La transition épithélio-mésenchymateuse .................................................................................................... 9 1.3.3 L’invasion : la voie vers les ramifications de la métastase ............................................................... 12 1.3.4 La survie en circulation : la résistance à l’anoïkose ........................................................................... 15
1.4 Les suppresseurs et les promoteurs de métastase ....................................................................................... 17 1.5 Le mélanome................................................................................................................................18
1.6 L’identification de candidats suppresseurs de métastase par le Dr. Stéphane Gobeil et ses
collègues ......................................................................................................................................................................... 19 1.7 Les cathepsines : leur implication dans la métastase....................................................................22
1.7.1 Ctso : une cathepsine peu connue avec un potentiel de suppression de métastase................. 23 1.7.2 Ctso : une protéine secrétée ? ....................................................................................................................... 23
1.8 L’actine : amie ou ennemie de la métastase ? ............................................................................................. 24 1.8.1 Acta2 : l’actine alpha des muscles lisses comme suppresseur de métastase ............................ 24
1.9 Hypothèses et objectifs ....................................................................................................................................... 25
Chapitre 2 Matériel et méthodes ................................................................................. 27 2.1 Production de lignées cellulaires ..................................................................................................................... 27
2.1.1 Culture cellulaire ................................................................................................................................................ 27 2.1.2 Vecteurs d'expression ........................................................................................................................................ 28 2.1.3 Petits ARN interférents ..................................................................................................................................... 39 2.1.4 Production de virus pour la sous-expression de Ctso et d'Acta2 .................................................... 40 2.1.5 Infection de la lignée B16-F0 avec les lentivirus produits pour la sous-expression de Ctso
et d'Acta2 ............................................................................................................................................................................ 41 2.1.6 Production de rétrovirus pour la surexpression de Ctso.................................................................... 42 2.1.7 Infection des cellules B16-F10 avec des rétrovirus produits pour la surexpression de Ctso
................................................................................................................................................................................................ 42 2.1.8 Production de lentivirus pour la surexpression d'Acta2 ..................................................................... 43 2.1.9 Infection des cellules B16-F10-rtTA3G avec les lentivirus produits pour la surexpression
d'Acta2................................................................................................................................................................................. 44
VI
2.1.10 Induction des lignées B16-F10-Acta2-CMVTRE3G et B16-F10-CMVTRE3G avec la
doxycyline .......................................................................................................................................................................... 44 2.1.11 Sommaire des lignées cellulaires produites .......................................................................................... 44
2.2 Validation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2................................................................... 45 2.2.1 Extraction d’ARN des lignées cellulaires ................................................................................................. 45 2.2.2 Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ....................................................................................................... 46 2.2.3 Validation de l’efficacité de l’expression différentielle par PCR quantitative (qPCR) ......... 46 2.2.4 Préparation des extraits cellulaires pour valider la sous-expression de la protéine d'Acta2
par immunobuvardage ................................................................................................................................................. 47 2.2.5 Dosage des protéines pour immunobuvardage ...................................................................................... 47 2.2.6 Immunobuvardage des lignées ayant une sous-expression d'Acta2 .............................................. 48
2.3 Les études fonctionnelles de perte et de gain de fonction selon l’expression différentielle de
Ctso et d'Acta2 .............................................................................................................................................................. 48 2.3.1 Essai de prolifération ........................................................................................................................................ 48 2.3.2 Morphologie de propagation ......................................................................................................................... 49 2.3.3 Essai d’adhésion .................................................................................................................................................. 50 2.3.4 Essai de migration .............................................................................................................................................. 50 2.3.5 Essai de culture cellulaire en 3 dimensions (3D) (Doillon et al., 2004) ...................................... 51 2.3.6 Essai de sensibilité à l’anoïkose ................................................................................................................... 53 2.3.7 Essai de formation de colonies en agar mou ........................................................................................... 53
2.4 Localisation cellulaire de la proteine CTSO ............................................................................................... 54 2.4.1 Transfection transitoire pour déterminer la localisation cellulaire de la proteine CTSO ... 54 2.4.2 Préparation d’échantillons de milieux de culture pour immunobuvardage ............................... 55 2.4.3 Préparation et dosage des extraits cellulaires pour immunobuvardage ..................................... 55 2.4.4 Immunobuvardage pour la localisation cellulaire de la proteine CTSO ................................... 55
2.5 Analyse Statistique………………………………………………………………………………………………………..55
Chapitre 3 Résultats ................................................................................................... 56 3.1 Évaluation de la sous- et surexpression de Ctso et d'Acta2 .................................................................... 56
3.1.1 Validation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 par qPCR ....................................... 56 3.1.2 Validation de la sous-expression protéique d'Acta2 par immunobuvardage ............................. 58
3.2. Études fonctionnelles de perte et de gain de fonction en relation avec l’expression différentielle
de Ctso et Acta2 ........................................................................................................................................................... 60 3.2.1 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur la prolifération .................... 60 3.2.2 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur la morphologie de
propagation ....................................................................................................................................................................... 63 3.2.3 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur l’adhésion ............................ 67 3.2.4 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur la migration cellulaire ..... 70 3.2.5 Evaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur la formation de colonies
dans un essai de culture cellulaire en 3 dimensions ........................................................................................ 79 3.2.6 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d'Acta2 sur la résistance à l’anoïkose 85 3.2.7 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la formation et la grosseur
des colonies dans un essai de culture cellulaire en agar mou ..................................................................... 89 3.3 La localisation cellulaire de la protéine Ctso murine ................................................................................ 98
3.3.1 Évaluation de la localisation cellulaire de la protéine Ctso : Ctso est secrétée à l’extérieur
de la cellule ....................................................................................................................................................................... 98
Chapitre 4 Discussion .............................................................................................. 100
Chapitre 5 Conclusion et perspectives ...................................................................... 109 Chapitre 6 Bibliographie…………………………………………………………………………...….....111
VII
Liste des abréviations et acronymes
% : pourcentage
3D : trois dimensions
Acta2/ACTA2 : alpha smooth muscle actin
ADN : acide désoxyribonucléique
ARN : acide ribonucléique
ARNi : acide ribonucléique interférent
Bax : Bcl-2–associated X protein
BRMS1 : Breast cancer metastasis-suppressor 1
Co : dégrée Celsius
C1q : complement component 1, subcomponent q
Ca : calcium
Cdk2 : cyclin-dependent kinase 2
CES : Combinatorial Enhancer Solution
cm : centimètre
CO2 : dioxide de carbone
Ctso/CTSO : Cathepsine O
DEPC : pyrocarbonate d’éthyle
DISC : death-inducing signaling complex
DMEM : Dulbecco’s modified eagle medium
dNTPs : deoxynucleotide triphosphates
Dr. : Docteur(e)
ECL : enhanced chemiluminescence
et al : et alia
FBS : sérum de veau foetal
g : accélération gravitationnelle
Gas1 : Growth arrest specific-1
gC1qR : q subcomponent binding protein
GTPase: enzymes qui lient guanosine triphosphate ( GTP)
h : heure
HA : hémagglutinine
VIII
HBSS : Hank’s balanced salt solution
HEK : cellules de rein embryonnaire humain
kb : kilobase
kDa : kilodaltons
LATS1 : Large Tumor Suppressor homolog 1
LBS : lactate de solution saline tamponnée
M : molarité
mg : milligramme
mg/ml : milligramme par millilitre
Mg : magnésium
MgCl2 : chlorure de magnésium
ml : millilitre
mM : millimolaire
MMP8 : métalloprotéinase 8
NaCl : chlorure de sodium
NaHCO3 : bicarbonate de sodium
NaOH : hydroxyde de sodium
ng : nanogramme
nm : nanomètre
NM23 : nucleoside diphosphate kinase A
P27 : kinase inhibitory protein 1
P53 : tumor protein 53
PBS : tampon phosphate salin
PCR : polymerase chain reaction
PEI : polyéthylénéimine
Phase G0 : phase de repos
Phase G1 : phase gap 1
Phase G2 : phase gap 2
Phase M : phase de mitose
Phase S : phase de synthèse
IX PRSS8 : prostasin
qPCR : quantitative polymerase chain reaction
Rab5 : Rab-protein 5
RISC : RNA-induced silencing complex
RNase : ribonucléase
rpm : rotations par minute
RT-PCR : reverse transcription polymerase chain reaction
SDS-PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du laurylsulfate de sodium
T : temps
TEM : transition epithélio-mésenchymateuse
TME : transition mésenchymateuse-épithéliale
TMPRSS4 : transmembrane protease, serine 4
TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand
U/ml : unité par millilitre
µg/ml : microgramme par millilitre
µl : microlitre
µM : micromolaire
µm : micromètre
V : volts
X
Liste des Figures
Figure 1. La cascade métastatique…………………………………………………………. 6 Figure 2. Le cycle cellulaire…………………………………………………………………9 Figure 3. La polarité apico-basale des cellules épithéliales……………………………….. 12 Figure 4. Exemples de protéases agissant comme suppresseurs de métastase……………. 14 Figure 5. Les voies intrinsèque et extrinsèque de l’anoïkose……………………………... 16 Figure 6. 22 gènes candidats suppresseurs de métastase………………………………….. 20 Figure 7. La régulation négative de CTSO et ACTA2 chez plusieurs cancers
métastatiques……………………………………………………………………………….21 Figure 8. Les vecteurs d’expression et d’ARN interférence……………………………… 34 Figure 9. Recherche de sites pour l’insertion de l’épitope HA dans la séquence de Ctso… 36 Figure 10. Validation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 par qPCR………. 58 Figure 11. Validation par immunobuvardage de la sous-expression de la protéine Acta2.. 59 Figure 12. La prolifération des cellules B16-F0 et B16-F10 selon l’expression différentielle
de Ctso et d’Acta2………………………………………………………………………………….. 62 Figure 13. Effet de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la morphologie de
propagation………………………………………………………………………………... 66 Figure 14. Effet de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la capacité
d’adhésion…………………………………………………………………………………. 69 Figure 15. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la migration
cellulaire………………………………………………………………………………….. 76 Figure 16. Quantification de la migration cellulaire dépendamment de l’expression
différentielle de Ctso et d’Acta2…………………………………………………………………. 78 Figure 17. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur l’augmentation
ou la diminution du nombre de colonies dans un essai de culture cellulaire en 3D………. 82 Figure 18. Quantification du nombre de colonies formées lors de l’évaluation des lignées
cellulaires cellulaires dans un essai de culture cellulaire en 3D………………………….. 84 Figure 19. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la résistance à
l’anoïkose 48 heures après l’ensemencement d’un nombre précis de cellules……………. 88 Figure 20. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la formation de
colonies dans un essai de culture cellulaire en agar mou…………………………………. 95 Figure 21. Quantification de la formation de colonies dans un essai de culture cellulaire en
agar mou………………………………………………………………………………… 97 Figure 22. Évaluation de la localisation cellulaire de la protéine Ctso murine…………… 99
XI
Liste des tableaux
Tableau 1. Amorces pour l’amplification de l’ADN complémentaire de Ctso .................... 29
Tableau 2. Séquences des amorces de Ctso pour l’insertion de l’épitope HA via mutagenèse
d’insertion ............................................................................................................................. 37
Tableau 3. Liste des petits ARNs interférents utilisés pour la sous-expression de Ctso et
d’Acta2............................................................................................................................................................40
Tableau 4. Sommaire des lignées cellulaires cellulaire produites ........................................ 45
Tableau 5. Amorces qPCR de Ctso, d’Acta2 et d’U6 ........................................................... 47
1
Chapitre 1 Introduction
1.1 La métastase : impact sur la société et la communauté scientifique
Des statistiques prédisent qu’il y aura 1 638 910 nouveaux cas de cancers aux
États-Unis, en 2012; de ce nombre, 577 190 en perdront la bataille contre cette maladie, ce
qui correspond à peu près à 35 % de la population atteinte de cancer. Ce pourcentage
déterminera la répercussion que la métastase aura sur la société ainsi que comment la
communauté scientifique décidera d’entreprendre ce défi. Malgré le fait que ces statistiques
sont décevantes, le taux de mortalité dû au cancer a diminué ; de 1990 à 2008, le nombre de
décès liés au cancer a été réduit de 23 % chez les hommes et de 15 % chez les femmes
(Siegel et al., 2012). Des facteurs multiples contribuent à cette baisse du taux de mortalité.
Avec le progrès de la technologie lié aux mesures de prévention et de détection ainsi que
l'émergence de l’internet dans les années 1990, la société a désormais un meilleur accès à
l'information sur les mesures de prévention et de détection précoce des cancers. Grâce à
l’éducation de la société, le dépistage précoce des cancers a non seulement permis de
mettre au point diverses options de traitements, incluant des traitements moins invasifs,
mais aussi de mieux cibler le cancer, réduisant ainsi le nombre de décès dû aux cancers
métastatiques.
Si les répercussions du progrès de la technologie se sont fait ressentir dans la
société, la communauté scientifique n’a certainement pas été exclue de ces bénéfices. De
nouveaux outils moléculaires ont donnés la possibilités aux scientifiques de mieux étudier
l'évolution du cancer et la genèse de la métastase, ce qui à son tour, a permis de concevoir
des traitements plus ciblés. De plus, une meilleure compréhension de l’hérédité, des
marqueurs moléculaires de cancer, ainsi que du fonctionnement agents carcinogéniques,
permettent aux scientifiques d'établir des mesures de dépistage précoce et des mesures de
prévention.
2
Malgré les progrès dans la prévention, le dépistage et le traitement du cancer, les
bases moléculaires de la métastase sont peu comprises et la métastase demeure la principale
cause de décès chez les patients atteints de cancer.
1.2 La cascade métastatique
1.2.1 L'éléphant parmi nous: comprendre la métastase
En août 2008, la Metastasis Research Society et la American Association for Cancer
Research se sont joints pour la première fois au Canada, pour discuter du progrès et des
aperçus dans le domaine de la recherche en métastase. Un résumé de cette conférence a été
publié par la suite par le Dr. Daniel Welch et ses collègues (Welch et al., 2008). Dans cet
article, une allégorie intéressante sur la métastase décrit de façon précise la compréhension
de cette maladie et le besoin de la communauté scientifique à se réunir pour discuter des
nouvelles découvertes dans la recherche sur la métastase, ce qui permettra de voir la
métastase comme une entité intégrale et non comme un amalgame d'étapes. Alors, le Dr.
Welch décrit la métastase comme étant un éléphant, tapoté par trois aveugles qui, chacun à
son tour, tentent de le décrire par la partie qu’il a touchée. Par contre, aucun d’entre eux
n’arrive à décrire l'éléphant en entier.
La dichotomie de la métastase, cette estropiant disparité entre ce qui est compris et
ce qui reste à comprendre, la rend aussi évasive. Dans une tentative de comprendre et
d'arrêter la progression de la métastase, de nombreuses théories ont été proposées. Même si
les étapes de la formation de nouvelles tumeurs à des sites distants sont bien connues, la
causalité de ces étapes reste à élucider. Le Dr. Stephen Paget, un des pionniers dans le
domaine de la métastase, a été un des premiers à proposer une théorie qui a permis de
comprendre pourquoi certains organes sont plus touchés que d’autres par la métastase.
3
Médecin de formation, il a étudié 735 cas de cancer du sein métastatique chez des
femmes et a remarqué que des métastases se formaient toujours aux mêmes organes, entre
autres, le foie et l’ovaire. Il conclut que même si d’autres organes avaient la même
susceptibilité à la métastase due à un débit sanguin similaire, les organes atteints de
métastases chez le cancer du sein présentent un environnement plus fertile que d’autres. De
cette observation naquit la théorie de la graine et du sol, qui prédit que le
microenvironnement des organes a un effet notable sur la propagation des tumeurs (Paget,
1889). Quelque trente années plus tard, en 1928, le Dr. James Ewing, lui aussi médecin de
formation, conteste cette hypothèse, suggérant que les métastase se propagent par les voies
qui leur sont disponibles et seul la disponibilité de ces routes permet la propagation des
tumeurs (Ewing, 1928).
Depuis ce temps, il a été établi que les deux médecins avaient raison. Le
microenvironnement et les voies disponibles pour transporter les cellules cancéreuses sont
également nécessaires à la formation de métastases. Cela démontre que notre
compréhension du mécanisme de la métastase change avec le temps et avec ceci, la manière
dont on la définit.
1.2.2 Qu’est-ce qu’un nom? Comment définir la métastase.
Le Dr. Stephen Paget et le Dr. James Ewing ont tenté de définir la métastase et sa
causalité chacun à leur manière. Depuis, les scientifiques ont pondérés sur des définitions
plus juste pour décrire ce phénomène qui demeure l’aspect terminal du cancer. Les
définitions de Paget et d’Ewing, étant jugées trop primitives pour décrire un enchaînement
moléculaire aussi complexe, furent rapidement enrichies.
Le mot « métastase », (du grecque meta « changer » et histanai, « place »), n’a pas
toujours été accepté par la communauté scientifique comme mot juste pour décrire la
formation de tumeurs secondaires. Le mot « métastase » était réservé pour décrire le
4
transfert d’oreillons d’une partie du corps à l’autre. Le terme « embolie » aurait été plus
convenable (Pope, 1938). Après de nombreuses métamorphoses, la définition du mot «
métastase » abouti à une définition universelle; un processus à étapes multiples durant
lesquelles les cellules cancéreuses échappent de la tumeur primitive, survivent en
circulation, se rendent aux sites distants et y prolifèrent (Joyce et al., 2009). D’autres
spéculent qu’inclure la distance des organes atteints dans cette définition égare ceux qui
cherchent une définition juste, car la distance ne qualifie pas la métastase (Onuigbo, 1975).
Plutôt, la métastase devrait être définie comme étant un processus dans lequel des tumeurs
secondaires sont formées à des sites discontinus de la tumeur primitive (Welch et Rinker-
Schaeffer, 1999).
1.2.3 La cascade métastatique
La cascade métastatique se compose de plusieurs étapes, chacune étant essentielle
pour la dissémination des cellules cancéreuses (Figure 1). Avant de former des tumeurs
secondaires, les cellules cancéreuses issues d’une tumeur primitive doivent passer par une
cascade d’évènements qui les mène vers les sites secondaires, commençant par une
prolifération aberrante des cellules cancéreuses de la tumeur primitive. La croissance de la
tumeur primitive est aidée par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et
lymphatiques dans un processus appelé angiogenèse. Les cellules cancéreuses échappent la
tumeur primitive par des voies sanguines et lymphatiques formées lors de l’angiogenèse.
Ainsi, le potentiel métastatique augmente grâce aux voies échappatoires formées lors de
l’angiogenèse. Si l'angiogenèse régit le potentiel métastatique, la dormance des cellules
cancéreuses est l’étape décisionnelle, car elle contrôle la progression d’un cancer in situ
vers la métastase. Il est maintenant connu que les cellules cancéreuses d’une tumeur
primitive peuvent persister dans un état quiescent, donc sans division cellulaire, jusqu’à ce
que les conditions soient propices pour permettre aux cellules cancéreuses de continuer à
proliférer et a s’étendre vers des sites secondaires (Aguirre-Ghiso, 2007).
5
Ensuite, une perte de la polarité cellulaire engendre une perte d’adhésion,
permettant aux cellules cancéreuses de se dissocier de la tumeur primitive et envahir la
matrice extracellulaire. L’intravasation, invasion des cellules cancéreuses des tissus aux
vaisseaux du système sanguin et lymphatique permet à son tour la circulation de ces
cellules aux sites secondaires. Par extravasation, passage des cellules tumorales en
circulation aux tissus, les cellules tumorales qui ont survécu le voyage en circulation
s'établissent à des sites secondaires qui forment de nouveaux vaisseaux sanguins pour
aider un accroissement de cellules, formant ainsi des tumeurs secondaires (Chambers et
al., 2002; Fidler, 2003; Wodarz et Näthke, 2007). La progression du cancer à partir d'une
tumeur in situ vers un cancer métastatique est promut par des gènes qui favorisent la
propagation des cellules cancéreuses d’une tumeur primaire vers des sites secondaires,
appelés des gènes promoteurs de métastase. D'autre part, les gènes suppresseurs de
métastase peuvent prévenir la propagation d’un cancer in situ vers des sites secondaires.
Le sous-chapitre 1.4 Les suppresseurs et les promoteurs de la métastase traite de ce sujet
dans plus de détails. L’implication de gènes spécifiques, lié à la progression d’un cancer
in situ vers un cancer métastatique, laisser à suggérer que la métastase est à la fois un
processus fortuit et/ou héréditaire. La métastase peut soit être causé par un seul gène, un
régulateur principaux, ou plusieurs gènes étant impliqués dans chacune des étapes de la
cascade métastatique. FoxM1b est un exemple d’un gène étant un régulateur principal
dans la cascade métastatique. Il a été démontré que FoxM1b joue un rôle dans la transition
épithélio-mésenchymateuse, (discuté plus en détails dans la section 1.3.2 La transition
épithélio-mésenchymateuse), la motilité cellulaire et l’invasion (discuté plus en détails
dans la section 1.3.3 L’invasion : la voie vers les ramifications de la métastase) (Park et
al., 2011). Mais la progression de la métastase est aussi favorisée par plusieurs gènes qui
chacun, jouent un rôle dans les étapes de la cascade métastatique. Par exemple, la sous-
expression de CEACAM6 diminue la résistance à l’anoïkose, permettant aux cellules
cancéreuses de survire en circulation, tandis que NOP14 joue un rôle dans la prolifération
et migration, dans la métastase du cancer du pancréas (Duxbury et al., 2005; Zhou et al.,
2012 ). L’anoïkose et l’hyperprolifération des cellules cancéreuses sont discutées plus en
détails dans les sections 1.3.4 La survie en circulation : la résistance à l’anoïkose et
6
1.3.1 L’hyperprolifération : le rôle du cycle cellulaire et ses points de contrôles,
respectivement.
Figure 1. La cascade métastatique
Les cellules tumorales provenant d’un cancer in situ (a) prolifèrent et envahissent la
matrice extracellulaire (b) pour ensuite envahir le système lymphatique (c) et/ou le système
sanguin (d). Les cellules tumorales survivent en circulation, se rendant à des sites
secondaires. Par extravasation (e), les cellules tumorales s’établissent à des sites
secondaires pour soit rester en dormance (f) ou pour former des tumeurs secondaires
métastatiques (g). (Figure adaptée de Steeg, 2003).
7
1.3 Un phénotype agressif : genèse de la cascade métastatique
Ce qui provoque l'acquisition d’un phénotype agressif chez les cellules cancéreuses
métastatiques n’est pas clair. Par contre, il est maintenant compris que les cellules
tumorales primaires doivent subir plusieurs mutations pour en arriver à ce phénotype
agressif. En 1982, Fidler et Hart publièrent un article suggérant que la présence d’une sous-
population invasive et dominante chez les cellules tumorales primaires serait la cause de la
métastase (Fidler et Hart, 1982). Au fil du temps, cette théorie a été reconnue par la
communauté scientifique comme étant fidèle aux origines de la métastase. Par contre, une
nouvelle théorie controversée suggère que l’existence d’une population de cellules
cancéreuses ayant des propriétés propre à des cellules souches, donc la propriété de se
renouveler et se différencier. L’existence de cette sous-population, portant le nom de
« cellules souches cancéreuses », ainsi que son origine est couramment une source de débat
entre les scientifiques qui étudient le domaine du cancer (Li et al., 2009).
1.3.1 L’hyperprolifération : le rôle du cycle cellulaire et ses points de contrôles
Ce phénotype agressif des cellules cancéreuses métastatiques est d’abord caractérisé
par une hyperprolifération des cellules tumorales. Pour proliférer, les cellules passent par le
cycle cellulaire, composé de quatre phases, tel que le démontre la Figure 2, chaque phase
ayant un point de contrôle qui permet sa régulation (Hartwell et Weinert, 1989). La phase
G1 (phase gap 1), une phase qui permet la croissance des cellules, est suivi de la phase S
(phase de synthèse), une phase de réplication d’ADN. La phase suivante, la phase G2
(phase gap 2), est une phase qui permet non seulement la synthèse de protéines, mais aussi
la réparation de l’ADN, si jamais des dommages ont été subis. Enfin, la phase M (phase de
mitose) est responsable de la division nucléaire et cytoplasmique des cellules, produisant
ainsi deux cellules fille à partir d’une cellule mère. Une cinquième phase, la phase G0
(phase de repos) ou quiescence, est activée en absence de facteurs de croissance et/ou de
nutriments (Cooper, 2000).
8
La prolifération aberrante des cellules cancéreuses est due à l’altération des gènes
qui régulent ces points de contrôles, en particulier le point de contrôle G1. Plusieurs études
démontrent que les gènes impliqués dans la régulation de la phase G1 sont les plus souvent
mutés dans le cancer (Platz et al., 1996; Betticher et al., 1997). Par exemple, p53 (tumor
protein 53), un gène suppresseur de tumeur qui permet aux cellules de s'arrêter en phase G1
lors de dommages à l’ADN, est un des gènes les plus mutés dans les cancers (Kastan et al.,
1991). D’autres protéines, tel que p27 (kinase inhibitory protein 1), un inhibiteur de Cdk2
(cyclin-dependent kinase 2), une cycline kinase importante pour la transition de la phase G1
à la phase S), sont sous-régulées dans certains cancers (Loda et al., 1997; Chetty, 2003). De
plus, la perte de p27 augmente le potentiel métastatique lors du cancer du sein et la
présence de p27 hors du nucléus, dans le cytoplasme, a été remarqué chez 70% des cas de
cancer de mélanome métastatique (Tan et al., 1997; Denicourt et al., 2007).
9
Figure 2. Le cycle cellulaire
Le cycle cellulaire est composé de quatre phases, donc une phase de croissance (G1), une
phase de synthèse d’ADN (S), une phase de croissance, synthèse de protéines et réparation
de l’ADN (G2) et une phase de division nucléaire et cytoplasmique (M). Une phase de
quiescence (G0) est initiée en absence de facteurs de croissance et/ou de nutriments.
1.3.2 La transition épithélio-mésenchymateuse
Suivant une prolifération aberrante, les cellules cancéreuses doivent se détacher de
la tumeur primitive et acquérir une motilité qui leur permettra de migrer jusqu’à leur
destination finale. La transition d’un phénotype cellulaire épithélial vers un phénotype
mésenchymal a été le plus souvent accusée de pourvoir les cellules tumorales avec des
caractéristiques métastatiques telles qu’une perte d’attachement ainsi qu’une plus grande
motilité. Par contre, il a été démontré que la transition inverse, joue également un rôle lors
de la métastase. Bien qu’étant moins étudiée que la transition épithélio-mésenchymateuse,
la transition d’un phénotype mésenchymal vers un phénotype épithélial (transition
mésenchymateuse-épithéliale ou TME), un processus que l’on retrouve fréquemment lors
10
de l’embryogenèse, serait aussi responsable de la colonisation des sites secondaires lors la
métastase (Nakaya et al., 2004; Hugo et al., 2007).
Durant la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), l'intégrité structurale des
cellules épithéliales est compromise et les cellules, qui normalement sont alignées sur la
lame basale, sont soumises à des changements qui leur permet, entre autres, de se détacher
de la lame basale, de devenir motile et invasive (Thompson et al., 2005; Polyak et
Weinberg, 2009). Ce qui provoque cette transition est encore à déterminer mais plusieurs
études suggèrent que des facteurs de transcription tels que Slug et Twist seraient
responsables de réprimer l’expression de la E-cadhérine, la première étape de la TEM (Yu
et al., 2010). Ainsi, la répression de la E-cadhérine serait l’élément clé qui caractérise la
TEM. De même, une réexpression de la E-cadhérine serait responsable de la transition
inverse, soit la transition mésenchymateuse-épithéliale. Plusieurs études suggèrent une
réexpression de la E-cadhérine lorsque les cellules cancéreuses ont atteintes des sites
distants et ainsi une réversion de la transition épithélio-mésenchymateuse vers une
transition mésenchymateuse-épithéliale (Kowalski et al., 2003 ; Wells et al., 2008 ;Chaffer
et al., 2006 ).
La répression de la E-cadhérine, une protéine transmembranaire qui a pour rôle de
réguler la formation des jonctions adhérentes, permet aux cellules de perdre leur adhésion
permettant ainsi la dispersion des cellules tumorales (Christiansen et Rajasekaran, 2006). Il
a été démontré que la répression de la E-cadhérine débute la cascade métastatique chez
plusieurs cancers, entre autres, le cancer ovarien (Sawada et al., 2008). Le détachement des
cellules engendre à son tour une plus grande motilité, un aspect essentiel de la TEM qui
permet aux cellules tumorales de se disséminer du site primaire et migrer pour former des
métastases ailleurs, la motilité étant induite par une perte de la polarité apico-basale
(Yilmaz et Christofori, 2010 ; Nelson, 2009).
11
Les cellules épithéliales sont composées de deux régions de polarité : apicale et
basale (Figure 3). La région apicale inclut les jonctions cellulaires (donc les jonctions
serrées et les jonctions adhérentes) et assure la signalisation entre les cellules (Cereijido et
al., 2004). Toutefois, la région basale de la cellule joue aussi un rôle important, celle
d’attacher la cellule à la membrane basale grâce à des intégrines qui permettent cette
adhésion (Lee et Vasioukhin, 2008). La perte de l’intégrine alpha2beta1 provoque des
métastases chez le cancer du sein dans des modèles de souris et est considérée comme un
suppresseur de métastase (Ramirez et al., 2011). La perte de polarité permet au
cytosquelette de se réorganiser et les cellules épithéliales adoptent une morphologie plus
allongée, la polarité apico-basale étant remplacée par une polarité avant-arrière (Nelson,
2009). Cette nouvelle morphologie ainsi que la formation de lamellipodes, protrusions
composées d’un assemblement d’actines sur la bordure avant des cellules, confère une plus
grande motilité aux cellules tumorales. Certaines études suggèrent que la formation de
lamellipodes est provoquée par les GTPases (enzymes qui lient la guanosine triphosphate
(GTP)). Rab5 (Rab-protein 5), par exemple, provoque la formation de lamellipodes
(Spaargaren et Bos, 1999). D’autres protéines, tel que gC1qR (q subcomponent binding
protein), une protéine de 33kDa qui se lie à la partie globulaire de C1q, jouent aussi un rôle
dans la migration (Dedio et al., 1998). Une perte de gC1qR réduit la formation de
lamellipodes et la motilité (Kim et al., 2011).
12
Figure 3. La polarité apico-basale des cellules épithéliales
La cellule épithéliale est composée de deux régions qui diffèrent en structures et en
fonctions : la région apicale, qui permet les jonctions intercellulaires et une région basale,
qui permet l’adhésion de la cellule à la lame basale de la matrice extracellulaire (Adaptée
de Nelson, 2009).
1.3.3 L’invasion : la voie vers les ramifications de la métastase
Mais motilité et perte d'adhésion à la membrane basale ne suffisent pas à
promouvoir la métastase. L’invasion est une des caractéristiques les plus marquantes de la
métastase et aussi la plus impérieuse. Déclenché par des protéases, l’invasion est définie
par une dégradation de la lame basale de la matrice extracellulaire, qui est composée entre
13
autres de collagène, de glycoprotéines, de protéoglycans et de facteurs de croissance
(Pitelka et al., 1980 ;Liotta et Kohn, 2000). Cette dégradation permet aux cellules
tumorales de migrer jusqu’aux vaisseaux sanguins et lymphatiques, d'où elles pourront être
transportées pour former des métastases à d’autres sites. Bien que la matrice extracellulaire
aie une importance fondamentale pour le maintien de l’homéostasie, elle agit aussi comme
une barrière entre les différents tissus et organes (Frantz et al., 2010). Le franchissement de
cette barrière par des cellules tumorales est donc fatal, car elle permet la dissémination de
cellules anormales dans d’autres tissus et organes. Plusieurs études démontrent que
l’activation de protéases lors de la TEM serait responsable d’attribuer cette qualité invasive
aux cellules tumorales métastatiques (Orlichenko et Radisky, 2008 ; Radisky et Radisky,
2010). L’étude des protéases dans ce contexte est donc d’importance majeure. TMPRSS4
(transmembrane protease, serine 4), faisant partie de la famille des serine protéases, est un
exemple d’une protéase bien étudiée dans le contexte d’invasion. Des études
immunohistochimiques sur des tissus de cancer colorectal démontrent qu’une hausse de
TMPRSS4, une serine protéase transmembranaire de type II, corrélait avec la progression
de la métastase. En effet, il a été démontré que très peu de TMPRSS4 est présent aux
premiers stades du cancer colorectal. Par contre, une hausse de TMPRSS4 aux stades plus
agressifs du cancer colorectal a permis de conclure que TMPRSS4 induit l’invasion (Kim et
al., 2010). Par contre, d’autres protéases, tel que la métalloprotéinase membranaire de type
1, la métalloprotéinase 2 et la métalloprotéinase 9, peuvent dégrader la lame basale et ainsi
aider à la progression d’un cancer in situ vers un cancer invasif (Blair et al., 2005 ;
Garavello et al., 2010 ).
Cependant, alors que de tels faits prouvent l'implication de protéases dans le
processus métastatique, l’aspect protecteur de certaines protéases dans le cancer ne devrait
pas être exclue. Certaines protéases ont été qualifiées de suppresseurs de métastase au lieu
de promouvoir la métastase. La métalloprotéinase 8 (MMP8), par exemple, semble réduire
l’invasion. Après avoir transfecté une lignée métastatique de souris (B16-F10) avec un
vecteur contenant la séquence de MMP8, des tests d’invasion ont démontrés que les
cellules agressives ayant une surexpression de MMP8 ont une baisse de leur taux d'invasion
14
comparer au contrôle (Guitierrez-Fernandez et al., 2008). La caspase 8, une protéase qui
agit comme un factor pro-apoptique, est un autre exemple de protéase agissant comme
suppresseur de métastase. Il a été démontré que la perte de la caspase 8 promeut la
métastase chez le neuroblastome (Stupack et al., 2006). De même, il a été démontré que la
perte de la cathepsine E mène à la métastase. L’étude des souris déficientes en cathepsine E
a démontré une hausse du nombre de colonies métastatiques formées comparé aux
contrôles (Kawakubo et al., 2007). Ainsi, plusieurs protéases agissent comme des
suppresseurs de métastase. La Figure 4 montre d’autres exemples de protéases suppresseurs
de métastase et quelles étapes dans la cascade métastatique ils obstruent.
Figure 4. Exemples de protéases agissant comme suppresseurs de métastase
Bien que certaines protéases soient responsables de l’invasion des cellules tumorales et
ainsi permettent la progression de la métastase, il existe des exceptions. Plusieurs protéases
ont démontré un potentiel anti-métastatique et l’étude de leurs rôles permettra d’éclaircir les
bases moléculaires de la métastase (Adaptée de Lopez-Otin et Matrisian, 2007).
15
1.3.4 La survie en circulation : la résistance à l’anoïkose
Une fois que les cellules tumorales ont dégradé la matrice extracellulaire, elles
doivent envahir le système sanguin et/ou lymphatique pour se rendre aux sites secondaires.
Lors de cette circulation, les cellules tumorales doivent survivre sans interaction
cellule/matrice extracellulaire. Chez les cellules normales, la perte d’interaction avec la
matrice extracellulaire induit un type de mort cellulaire programmé appelé anoikis (Frisch
et Francis, 1994). L’anoïkose suivant le détachement des cellules de la matrice
extracellulaire est importante. Cela évite le rattachement de ces cellules à une matrice
extracellulaire dans un environnement différent de leur origine et prévient ainsi une
croissance dysplasique. Par contre, il a été démontré que les cellules métastatiques sont
résistantes à l’anoïkose et que cette résistance est importante pour la progression
métastatique (Kim, 2012). Des mécanismes intrinsèque et extrinsèque régulent l’anoïkose
(Figure 5). Le mécanisme intrinsèque est caractérisé par la perméabilisation de la
membrane externe de la mitochondrie en réponse à un stimulus de mort cellulaire par des
facteurs pro-apoptiques. Cette perméabilisation permet le relargage du cytochrome c dans
le cytoplasme, qui à son tour, active la voie des caspases menant à l’anoïkose (Simpson et
al., 2008). En contraste, le mécanisme extrinsèque dépend des récepteurs de mort cellulaire,
tel que TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), qui sont activés lors d’un stimulus
de mort cellulaire. Cela induit la formation du complexe DISC (death-inducing signaling
complex), ce qui active la voie des caspases (Fulda et Debatin, 2006). Sachant que ces deux
voies (intrinsèque et extrinsèque) peuvent mener à l’anoïkose et que les cellules
métastatiques ont une résistance à l’anoïkose, des études ont suggérées qu’en manipulant
l’expression des facteurs impliqués dans l’anoïkose, il est possible d’inhiber la métastase en
induisant l’anoïkose. Bax (Bcl-2–associated X protein), par exemple, est un facteur pro-
apoptique impliqué dans la voie intrinsèque. Il a été démontré que l’expression de Bax
diminue avec la progression d’un cancer primaire vers un cancer métastatique (Jansson et
Sun, 2002). La surexpression de Bax sensibilise les cellules tumorales à l’apoptose et ainsi,
il a été possible de conclure que la surexpression de Bax améliore le traitement du cancer
avec des agents chimiothérapeutiques (Sakakura et al., 1997; Sakakura et al., 1996; Sawa et
al., 2000).
16
Figure 5. Les voies intrinsèque et extrinsèque de l’anoïkose
L’anoïkose peut être induite via la voie intrinsèque, qui implique des facteurs pro-
apoptiques perméabilisant la membrane externe de la mitochondrie, ou la voie extrinsèque,
qui implique des récepteurs de mort cellulaire. Les deux voies finissent par activer la
cascade des caspases pour induire une mort cellulaire
(Adapté de Simpson et al., 2008).
17
1.4 Les suppresseurs et les promoteurs de la métastase
Il est important de noter que le processus métastatique se compose d'étapes
limitantes. Cela implique que le blocage d'une seule étape peut empêcher la poursuite du
processus métastatique (Fidler et Radinsky, 1996).
Désireux de découvrir des gènes pouvant arrêter la cascade métastatique de telle
manière, la communauté scientifique s’est lancée vers une nouvelle quête. Un nouvel
ensemble de gènes émergent de cette quête; les gènes suppresseurs de métastase. Considéré
comme des marqueurs pronostiques et thérapeutiques, la découverte de gènes pouvant
arrêter une ou plusieurs étapes de la cascade métastatique sans toutefois inhiber la
formation de la tumeur primitive, ouvre la porte à une nouvelle ère de recherche et résout le
problème d’un ancien dilemme; comment inhiber la métastase. Ainsi, le premier
suppresseur de métastases, NM23 (nucleoside diphosphate kinase A), a été identifié en
1988 (Steeg et al., 1988). NM23, une kinase nucléoside diphosphate, influence la
prolifération et l’invasion (Yang et al., 2009; Gervasi et al., 1996). Des études démontrent
que l’altération ou une régulation négative de NM23 corrélait avec une hausse de
métastases (Wang et al., 1993; Nakayama et al., 1993). Depuis la découverte de NM23,
d’autres gènes ayant un potentiel comme suppresseurs de métastase ont été recherchés et
étudiés en profondeur. Ces suppresseurs de métastase semblent ne pas limiter leur activité
protectrice à un seul type de cancer. BRMS1 (Breast cancer metastasis-suppressor 1) , un
suppresseur de métastase identifié chez le cancer du sein, peut aussi inhiber le mélanome
métastatique (Seraj et al., 2000; Shevde et al., 2002).
Ainsi, l’étude des suppresseurs de métastase permettra non seulement de mieux
comprendre les bases moléculaires de la métastase, mais aussi d’appliquer cette
compréhension dans un contexte clinique. Récemment, plusieurs études mettent l’accent
sur l’utilisation de ces suppresseurs de métastase comme agents thérapeutiques (Smith et
Theodorescu, 2009 ; Shoushtari et al., 2011).
18
Par contre, il existe une catégorie de gènes qui peuvent promouvoir la métastase au
lieu d’agir comme suppresseur de métastase. Si les suppresseurs de métastase peuvent
inhiber une ou plusieurs étapes de la cascade métastatique, les promoteurs de métastase ont
la capacité de promouvoir ces étapes et sont souvent retrouver à des niveaux élevés dans les
cancers métastatiques (Kulkarni et al., 2012 ; Voigtlander et al.,2002; Nakazawa et al.,
2011). WAVE3, par exemple, est un gène impliqué lors du remodelage du cytosquelette
d’actine et des études démontrent que WAVE3 joue un rôle lors de la migration cellulaire
et de l’invasion dans la progression du cancer du sein métastatique, en activant le complexe
ARP2/3 (Sossey-Alaoui et al., 2007 ; Sossey-Alaoui, 2012). D’autres gènes, tel que
Zeppo1, peuvent promouvoir l’adhésion cellulaire et la prolifération en réduisant les
niveaux d’expression de la E-cadhérine (Slorach et al., 2011). Comme discuter dans le
sous-chapitre 1.3.2 La transition épithélio-mésenchymateuse, une baisse des niveaux
d’expression de la E-cadhérine est responsable de la transition épithélio-mésenchymateuse,
qui à son tour induirais les cellules cancéreuses à devenir motile et invasive. Les
promoteurs de la métastase peuvent aussi promouvoir la métastase en supprimant
l’expression de gènes qui induisent l’apoptose. Merm1/ Wbscr22 est un tel exemple. Ce
gène réduirait l’expression de Zac1, un suppresseur de tumeurs, qui induit l’apoptose via
p53. Ainsi, le promoteur de métastase Merm1/Wbscr22 promeut la suivie des cellules
métastatiques (Nakazawa et al., 2011 ).
1.5 Le mélanome
Le mélanome (du greque melas « foncé ») est un cancer des mélanocytes qui se
retrouvent dans la peau, l’œil et l’intestin (DeVita et al., 2008). Des facteurs
environnementaux, tel qu’une exposition prolongée aux rayons ultraviolets, et une
prédisposition génétique sont parmi les éléments causant le mélanome (Bestak et Halliday,
1996; Haluska et Hodi, 1998). Des mutations et des altérations de certaines voies de
signalisation, induisent les mélanocytes a se multiplier et a former des métastases (Tang
,2010 ; McMillan et al., 2008). Un cancer très agressif, le mélanome compte pour 80% des
19
décès dus a des cancers de la peau, malgré le fait que ce cancer ne représente que 4% des
tumeurs malignes de la peau (Moreno Nogueira et al., 2013). Ayant deux modes de
croissance, les mélanocytes transformés se propagent soit radialement ou verticalement
(Leslie et Bar-Eli, 2005). Les cellules qui se propageant de façon verticale sont
extrêmement agressives dû à l’intravasation de ces cellules dans les vaisseaux du système
sanguins/lymphatiques (Grabacka et al., 2006 ). Une fois en circulation dans le système
sanguins/lymphatiques, les cellules cancéreuses peuvent former des tumeurs à des sites
secondaires. Un dépistage précoce ainsi que la prévention sont fortement recommandé, car
le mélanome est particulièrement résistant aux traitements chimiothérapeutiques et à la
radiothérapie. Lorsque le mélanome est propagé, seulement 14 % des patients survivent la
maladie suivant les 5 ans après le diagnostique (Bandarchi et al., 2013 ).
Le mélanome est diagnostiqué grâce à l’observation de changements aux lésions
cutanées noires ou aux grains de beauté, soit des changements asymétriques, des bords
irréguliers, une coloration non-homogène et un diamètre de plus de 6 mm. Par contre,
l’évolution de ces critères à travers le temps serait le facteur le plus important pour
diagnostiquer un mélanome malin (Abbasi et al., 2004 ; Thomas et al., 1998).
1.6 L’identification de candidats suppresseurs de métastase par le Dr.
Stéphane Gobeil et ses collègues
En 2008, le Dr Stéphane Gobeil et ses collègues ont publié un article dans lequel
Gas1 (Growth arrest specific-1) a été identifié comme un suppresseur de métastase. Avec
Gas1, 22 suppresseurs de métastase potentiels (Figure 6) ont été identifiés par
l'intermédiaire d'un criblage pan-génomique par petits ARNs interférents. Un essai de
métastase in vivo démontrent que la régulation négative de ces gènes provoque des
métastases (Gobeil et al., 2008).
20
Figure 6. 22 gènes candidats suppresseurs de métastase
Le Dr. Gobeil et ses collègues ont identifié 22 gènes ayant un potentiel comme suppresseur
de métastase. La suppression de ces gènes dans une lignée murine non-métastatique (B16-
F0) mène à la formation de métastases in vivo, suggérant que ces gènes peuvent avoir un
potentiel anti-métastatique. Ces résultats ont été comparés à un contrôle Scramble (NS) et
une lignée murine métastatique (B16-F10) (Adaptée de Gobeil et al., 2008).
Une comparaison d’échantillons non-métastatiques et métastatiques démontre
qu’une diminution de l’expression de CTSO et ACTA2 est observée chez plusieurs types de
cancers métastasiques. Une régulation négative de CTSO, une cathepsine lysosomale, a été
remarque chez 10 types de cancers métastatiques tandis qu’une diminution d’ACTA2, un
type d’actine, a été remarquée chez 8 types de cancers métastatiques (Figure 7).
L’implication de ces gènes dans une grande variété de cancers métastatiques permettra
d’avoir un plus grand accès aux divers tissus métastatiques et ainsi de mieux étudier le rôle
de ces gènes dans la cascade métastasique.
21
Figure 7. La régulation négative de CTSO et ACTA2 chez plusieurs cancers
métastatiques
Une comparaison entre des échantillons métastatiques et non-métastatiques démontre
qu’une diminution de l’expression de CTSO et ACTA2 est observée chez plusieurs cancers
métastatiques. L’étude de Ctso et Acta2 chez un modèle murin permettra d’approfondir le
rôle de ces deux gènes comme candidats suppresseurs de métastase (Adaptée de Gobeil et
al., 2008).
22
1.7 Les cathepsines : leur implication dans la métastase
Le lien entre les protéases et le cancer métastatique a été étudié de façon extensive
et continue d'être d’un grand intérêt pour la recherche. Une étape marquante de la
métastase, l’invasion, est favorisée par certaines protéases, qui catalysent l’hydrolyse des
liens peptidiques et peuvent ainsi, dégrader la membrane basale (Koblinsky et al., 2000).
L’ensemble des protéases est classifié selon leur mécanisme de catalyse. Ainsi six
classes de protéases existent : des protéases de type aspartique, glutamique, cystéine,
sérine, thréonine et des métalloprotéases (Lopez-Otin et Bond, 2008). Les cathepsines,
enzymes protéolytiques localisées dans les lysosomes, comprennent des protéases de type
cystéine, sérine et aspartique (Bromme et Wilson, 2011). Les cathepsines participent au
renouvellement des protéines et sont responsables de maintenir l'équilibre entre la synthèse
et la dégradation des protéines. Bien que les cathepsines aient longtemps été associé à la
dégradation de protéines, il a été découvert qu’elles jouent aussi des rôles importants lors
de plusieurs autres activités physiologiques (Turk et al., 2000) Leur rôle dans la
dégradation des protéines a été exploré dans le contexte de la métastase dans l’espoir de
trouver les protéines responsables de l’invasion, étape fatale de la métastase. De l’étude des
cathepsines a jailli un nouvel intérêt chez la communauté scientifique, en particulier au
cours des années 1990 (Turk et al., 2001). Plusieurs études démontrent qu’une
surexpression de cathepsines est retrouvée chez plusieurs cancers métastatiques (Garcia et
al., 1990; Nomura et Katunuma, 2005; Sivaparvathi et al., 1995). Par exemple, une
surexpression de la cathepsine D augmente le phénotype agressif des métastases tandis que
la cathepsine Z induit la transition épithélio-mésenchymateuse, menant à la métastase
(Garcia et al., 1990; Wang et al., 2011). De plus, il a été démontré que la régulation
négative des cathepsines peut inhiber la métastase, comme dans le cas de la cathepsine D
(Glondou et al., 2002).
23
Par contre, comme discuté à la section 1.3. L’invasion : la voie vers les
ramifications de la métastase, on ne peut présumer que toutes les protéases, y compris les
cathepsines, jouent un rôle pro-métastatique. Il est donc important d’étudier les cathepsines
sans biais afin d’explorer la possibilité qu’une ou plusieurs d’elles aient un pouvoir anti-
métastatique.
1.7.1 Ctso : une cathepsine peu connue avec un potentiel de suppression de métastase.
Comme plusieurs cathepsines, la cathepsine O (CTSO), une cystéine protéase, a été
découverte dans les années 1990 (Velasco et al., 1994; Shi et al., 1995). La protéine CTSO
a plus de 50 % de similarité avec la cathepsine S et L chez l’humain (Shi et al., 1995). Bien
que le rôle d’autres cathepsines soit bien étudié, on en connaît très peu sur la fonction de la
cathepsine O, qui a été localisée au chromosome 4 (4q31-q32) avec une longueur de 30 kb,
ayant 8 exons et 7 introns (Santamaria et al., 1998). Les résultats du Dr Gobeil et ses
collègues présentent, à ma connaissance, une des premières instances suggérant que Ctso ai
un rôle anti-métastatique. Sa caractérisation permettra d’approfondir l’implication de ce
gène dans la cascade métastatique.
1.7.2 Ctso : une protéine secrétée ?
Plusieurs études démontrent que les cathepsines peuvent avoir une localisation
extracellulaire telle que dans le cas de la cathepsine B et L (Premzle et al., 2003; Cailhier et
al., 2008). De ce fait, le rôle potentiel des cathepsines secrétées a été exploré chez certains
cancers. La sécrétion de la cathepsine B et de la cathepsine D, par exemple, promeut
l’invasion (Roshy et al., 2003 ; Heylen et al., 2002). La cathepsine G secrétée induit
l’adhésion cellule-cellule chez les cellules du cancer du sein tandis que la sécrétion de la
cathepsine L aurait un rôle important dans l’angiogenèse (Kudo et al., 2009 ; Felbor et al.,
2000). Bien que plusieurs de ces cathepsines soient étudiées dans le contexte de la
métastase, aucune étude ne démontre, à ma connaissance, le rôle de la cathepsine O dans la
métastase ni si cette cathepsine est secrétée. Ainsi une étude approfondie de Ctso permettra
d’explorer son rôle dans la métastase plus en détails.
24
1.8 L’actine : amie ou ennemie de la métastase ?
Si la métastase peut être définie tout simplement comme une migration de cellules
tumorales d’un organe à l’autre, le rôle de l’actine dans ce processus devient évident. Il
n'est donc pas surprenant que le rôle de l'actine dans le cancer métastatique ait été
largement étudié. L’actine peut exister sous deux conformations (monomère et polymère) et
plusieurs isoformes (Lodish et al., 2000). L’actine est aussi une des composantes du
cytosquelette, étant responsable de maintenir forme et fonction cellulaire (Pollard, 2003).
La relation entre l’actine et la réorganisation du cytosquelette est d’importance majeure lors
de la métastase. En effet, plusieurs études démontrent que la réorganisation de l’actine du
cytosquelette serait clé pour l’acquisition du phénotype métastatique, déclenchant ainsi
divers processus liés à la métastase, entre autres, le détachement et la migration des cellules
métastatiques (Yamazaki et al., 2005; Hall, 2009). Tel que discuté dans la section 1.2.4 La
transition épithélio-mésenchymateuse, la perte de la polarité cellulaire lors de la transition
épithélio-mésenchymateuse peut engendrer une réorganisation du cytosquelette. En plus
d’être impliquée dans la réorganisation du cytosquelette, l’actine est aussi la force motrice
et contractile de la cellule, permettant à celle-ci de devenir motile et invasive. Bien que le
rôle de l’actine dans les mécanismes métastatiques soit étudié en profondeur, il est
important de comprendre que l’actine est aussi un élément essentiel au bon fonctionnement
de la cellule normale. Plusieurs études démontrent que la réduction d’actine corrèle avec
des cas de métastases (Uzquiano et al., 2008; Nowak et al., 2008).
1.8.1 Acta2 : l’actine alpha des muscles lisses comme suppresseur de métastase
L’actine alpha des muscles lisses, également connu sous le nom Acta2, a pendant
longtemps été associée aux anévrismes de l'aorte thoracique, une forme héréditaire de
l'anévrisme dans lequel l'aorte thoracique devient affaibli et s'étend, formant un renflement
(un anévrisme) (Bergeron et al., 2011). Il a été démontré qu'une mutation dans Acta2
provoque cette condition (Morisaki et al., 2009). Par contre, il a été récemment découvert
qu’Acta2 est aussi impliqué dans d’autres maladies telles que le diabète et le cancer (Guo et
al., 2009; Bello et al., 2009). Plusieurs études démontrent un lien entre la présence d’Acta2
25
dans le stroma et la métastase (Nanda, 2010; Fujita et al., 2010). Par contre, Acta2 pourrait
avoir un rôle de suppresseur de métastase dans d’autres types de cellules. Son rôle dans le
mélanome est très peu étudié et si Acta2 a le potentiel d’inhiber la métastase, il est
important d’étudier cette protéine dans ce contexte. Il a été démontrer que l’ARN messager
d’Acta2 est régulé par p53, un gène suppresseur de tumeur, chez le cancer du sein (Franke
et al., 2008 ).
1.9 Hypothèses et objectifs
Il a déjà été démontré que la régulation négative de Ctso et Acta2 augmente le
potentiel métastatique des cellules B16-F0 (Gobeil et al., 2008). Par contre, leur rôle dans
la cascade métastatique reste à explorer et la caractérisation de Ctso et d’Acta2 dans un
modèle cellulaire murin permettra de démontrer sur quelle(s) étape(s) de la cascade
métastatique ces deux gènes peuvent intervenir.
1ère
Hypothèse
Ctso et Acta2 sont potentiellement des suppresseurs de métastase. J’avance donc
l’hypothèse que l’expression de Ctso et/ou d’Acta2 va réduire le potentiel métastatique des
cellules B16-F10 en bloquant une ou plusieurs étapes de la cascade métastasique. Par
conséquent, la répression de Ctso et/ou Acta2 dans les cellules non-métastatiques B16-F0,
devrait augmenter leur potentiel métastasique en stimulant une ou plusieurs étapes de la
cascade métastatique. Étant des candidats suppresseurs de métastase, l’expression
différentielle de Ctso et d’Acta2 n’aura pas d’effet sur la formation de la tumeur primitive ;
ainsi, la prolifération des cellules cancéreuses ne devrait pas changer.
Objectif 1 : Réduire l’expression de Ctso et d’Acta2 via des petits ARNs interférents dans
une lignée murine non-métastatique (B16-F0).
26
Objectif 2 : Surexprimer Ctso et Acta2 via des vecteurs d’expression dans une lignée
murine métastatique (B16-F10).
Objectif 3 : Identifier les rôles de Ctso et d’Acta2 dans la cascade métastatique via des
études fonctionnelles in vitro, soit des études de prolifération, d'adhésion, de migration, de
morphologie, d’anoikis et d’invasion.
Objectif 4 : Confirmer la capacité des cellules B16-F10 à former des tumeurs suite à
l’expression de Ctso et d’Acta2.
2ième
Hypothèse
Tel que discuté dans la section 1.6.2 : Ctso : une protéine secrétée ?, certaines
cathepsines peuvent avoir une localisation extracellulaire lors des cancers. Mon hypothèse
est que pour effectuer sa fonction, Ctso est sécrétée lors du cancer de mélanome murin.
Objectif 1 : Surexprimer l’ADNc de Ctso ayant un épitope hémagglutinine (HA) dans une
lignée murine non-métastatique (B16-F0) via un vecteur d’expression.
Objectif 2 : Déterminer la localisation de Ctso chez la lignée B16-F0 surexprimant le
vecteur Ctso-HA-pQCXIP.
Chapitre 2 Matériel et méthodes
2.1 Production de lignées cellulaires
2.1.1 Culture cellulaire
Les lignées cellulaires B16-F10 (murine, mélanome métastatique) B16-F0 (murine,
mélanome non-métastatique) B16-F10-rt-TA3G (murine, métastatique avec activateur
TA3G), HEK 293T et HEK 293T G/P (lignées cellulaires humaines de rein embryonnaire)
ont été maintenues avec du milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium ; Sigma-
Aldrich, Saint-Louis, MO, E.-U) contenant 10% FBS (sérum de veau fœtal ; Sigma-
Aldrich) et 1% chaque de Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et de L-glutamine
(Sigma-Aldrich). Ce milieu est appelé DMEM complet. Pour la production de lentivirus, la
quantité de pénicilline-streptomycine a été réduite à 0.1%.
La lignée murine de mélanome métastatique, B16-F10, fut isolée de la lignée
parentale B16-F0 grâce à 10 passages consécutifs in vivo (Fidler, 1975). Ces deux modèles
murins, ayant un taux métastatique différentielle, permettent d’étudier en profondeur
l’hypothèse qu’une sous-population invasive et dominante des cellules de la tumeur
primitive serait responsable de la genèse de la métastase et que l’acquisition de certains
traits phénotypiques (soit hérités ou sélectionnables) influence la capacité métastatique des
cellules murines de mélanome (Fidler et Hart ,1982 ; Fidler, 1973). Ainsi, ces deux modèles
murins sont appropriés pour étudier les traits phénotypiques altérer par l’expression
différentielle de Ctso et Acta2.
28
2.1.2 Vecteurs d’expression
Pour produire des lignées cellulaires murines surexprimant Ctso et Acta2, des vecteurs
d’expression ont été construits tel que décrit ci-dessous. De ces vecteurs, des virus seront
produits pour ensuite infecter la lignée métastatique B16-F10, surexprimant ainsi Ctso et
Acta2.
I. Ctso-pQCXIP
L’ADN complémentaire de Ctso a été amplifié à partir d’une librairie
d’ADN complémentaires de la lignée murine B16-F10, grâce aux amorces conçus
pour son amplification (Tableau 1) ainsi que de la polymérase Pfu (New England
Biolabs (NEB), Whitby, ON, Canada), tampon de PCR (polymerase chain reaction)
Pfu 10X, dNTPs (10 mM), 2 µM de MgCl2, CES 5X (Combinatorial Enhancer
Solution composée de 2.7 M de betaine, 6.7 mM de DTT, 6.7% de DMSO et 55
µg/ml de BSA) et de l’eau Mili-Q. Le CES 5X est utilisé pour augmenter
l’efficacité de la PCR, surtout lors de l’amplification des région GC riches, qui
s’avère difficile en raison de formation de structures secondaires (Ralser et al., 2006
; Frey et al., 2008). Le programme PCR pour l’amplification de Ctso est comme
suit :
5 minutes à 95 oC
30 secondes à 94 oC
30 secondes à 58 oC
1 minutes à 72 oC
10 minutes à 72 oC
35 cycles
29
Tableau 1. Amorces pour l’amplification de l’ADN complémentaire de Ctso
sens
TTAAGCGGCCGCACCGGTATGAAGCCGCAGTTGGTGAA
Anti-sens
TTTGAATTCTTAATTAATCACACAAAGACAGCAGCTACAGAGTC
Le produit de PCR a ensuite été migré sur un gel d’agarose de 0.8 % à 100V. La
bande d’intérêt a ensuite été coupée du gel et purifiée grâce à la trousse de Qiagen Qiaex II
selon le protocole du distributeur (Qiagen, Gaithersburg, E-U). Ensuite, 2 µl du produit
PCR purifie à été cloné dans le vecteur pSC-A grâce au kit de clonage Strataclone (voir
carte à la Figure 8 A ; Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada) et transformé dans
les cellules compétentes SoloPack (inclus avec la trousse Strataclone), selon le protocole de
la trousse. Ensuite, 250 µl de milieu SOC (pH 7.2), chauffé à 37oC, a été ajouté au mélange
de transformation et pour être agité pendant 1 heures à 37oC/250 rpm (rotations par
minute). Par la suite, 100 µl de ce mélange a été étalé sur un pétri LB agar (contenant 50
µg/ml de kanamycine et 40 µl de X-gal) pour être incubé pendant toute la nuit a 37oC.
Le jour suivant, les colonies ont été analysées. Le vecteur pSC-A contient aussi le
gène lacZ dans le site de clonage multiple. Le gène lacZ code pour la β-galactosidase. La
présence d'une β-galactosidase peut être détecté par X-gal, une substance incolore qui
forme un pigment bleu lorsqu’elle est métabolisée par la β-galactosidase. Ainsi, il en résulte
une couleur bleue caractéristique dans des colonies bactériennes contenant une β-
galactosidase fonctionnelle. Par contre, en raison de l’emplacement du gène lacZ au sein du
site de clonage multiple, l’activité du gène lacZ est perturbé lorsqu’un ADN étranger s’y
insère. L'activité enzymatique perturbée est observée comme une colonie bactérienne
blanche. Il est alors possible via cette méthode de détection de colonies bleues/blanches de
sélectionner les colonies bactériennes ayant un plasmide contenant un insert d’ADN.
30
Quelques colonies blanches ont été mises en culture dans du milieu LB contenant 50
µg/ml d’ampicilline pendant toute la nuit sous agitation à 37oC et 250 rpm. Le lendemain,
des stocks glycérols ont été établis avec 250 µl de la culture bactérienne et 100 µl de
glycérol 20%. Ensuite, les bactéries ont été centrifugés pendant 30 secondes à vitesse
maximale, résultant en un culot de bactéries, et l’ADN a été purifié avec de la silice, selon
le protocole de Li et al., 2010. Pour ce faire, le LB a été aspiré et le culot a été resuspendu
dans 100µL de solution A (50 mM Tris-HCl ; 10 mM EDTA ; 100 µg/mL RNAse I
(ribonucléase) ; pH 7,5). Après l’ajout de 100 µL de solution B (0,2 M NaOH ; 1% SDS),
le mélange a été incubé 2 minutes à température pièce. Ensuite, après l’ajout de 100 µL de
solution C (1,32 M KOAc ; pH 4,8), le mélange a été centrifugé à vitesse maximale
pendant 5 minutes. Le surnageant a été transféré dans un tube eppendorf contenant 500 µL
de solution D (NaI 6M), auquel a été ajouté 20 µL de silice. Après 2 minutes d’incubation,
le mélange a été centrifugé pendant 10 secondes à vitesse maximale. Le surnageant a été
aspiré et le culot a été repris dans 500 µl de solution E (50% EtOH ; 1mM EDTA ; 100 mM
NaCl ; 10 mM Tris-HCl ; pH 7,5), pour être centrifugé de nouveau 10 secondes. Ce
processus a été répété deux fois. Après la deuxième centrifugation, les culots séchés à
température pièce puis resuspendus dans 40 µL d’eau milli-Q et ont été incubés deux
minutes à 70°C. Après une dernière centrifugation de 2 minutes à vitesse maximale, le
surnageant, contenant l’ADN élué, a été transféré dans un nouveau tube eppendorf.
L’ADN extrait a été dosé et l’insert séquencé.
De ce vecteur, le fragment EcoRI/EcoRI contenant la séquence de Ctso a ensuite été
sous-cloné dans le vecteur rétroviral pQCXIP (Figure 8B). Cela a été accompli en digérant
le vector Ctso-pSC-A et le vecteur QCXIP avec l’enzyme EcoRI, tampon NEB 2 10X et de
l’eau, selon le protocole du distributeur (NEB). Ces mélanges ont été incubés dans un bain
d’eau à 37°C pendant 1 heure pour être par la suite migrés sur un gel d’agarose de 0.8 % à
100 V. Les bandes d’intérêts ont ensuite été coupées du gel et l’ADN purifiée grâce à la
trousse de Qiagen Qiaex II selon le protocole du distributeur. Ensuite, l’ADN purifié a été
incubé selon une masse molaire de 3 inserts pour 1 vecteur avec 60 ng de vecteur, 2 µl de
tampon 10X, 1 µl d’ADN ligase T4 (Promega Biosystems, Sunnyvale, E-U), le tout
31
complété à 20 µl avec de l’eau. Ce mélange a ensuite été incubé à 14°C pendant toute la
nuit. Le prochain jour, 5 µl de ce mélange de ligation a été mélangé doucement dans 50 µl
de cellules bactériennes DH5α (Life Technologies, Burlington, ON, Canada) et incubé sur
glace pendant 30 minutes. Après ce laps de temps, les cellules ont été incubées pendant 45
seconde dans un bain d’eau à 42°C et remises sur glace pendant 2 minutes. Ensuite, 300 µl
de milieu SOC chauffé à 37°C a été ajouté et pour être agité pendant 1 heure à 37°C. Après
1 heure, 100 µl de ce mélange de transformation a été étalé sur un pétri LB agar contenant
50 µg/ml d’ampicilline et ensuite incubé pendant toute la nuit à 37°C. Le lendemain, des
colonies ont été mises en culture toute la nuit à 37°C avec du milieu LB et de l’ampicilline.
Le jour suivant, des stocks glycérols ont été préparés et l’ADN extrait à la silice pour être
par la suite séquencé.
A)
32
B)
C)
33
D)
E)
34
F)
Figure 8. Les vecteurs d’expression et d’ARN interférence
(A) Ctso a d’abord été cloné dans le vecteur pSC-A, un vecteur muni d’un gène lacZ au
sein du site de clonage multiple. (B) Ctso a aussi été clone dans le vecteur pGEM-T Easy,
un vecteur d’une taille plus petite que pSC-A, pour ensuite procéder à la mutagenèse
dirigée pour l’insertion de l’épitope HA. Ensuite, le fragment EcoRI/EcoRI contenant la
séquence codante de Ctso été sous-cloné dans le vecteur rétroviral pQCXIP (C). Acta2, par
contre, a été cloné dans le vecteur pENTR1A, un vecteur d’entrée faisant parti du système
Gateway (D). Avec la clonase, la séquence codante de Acta2 a été sous-clonée dans le
vecteur de destination CMVTRE3G, un vecteur inductible à la doxycyline (E). Finalement,
les petits ARNs interférents pour Ctso et Acta2 sont clonés dans le vecteur pLKO.1 (F).
II. Ctso-pQCXIP contenant un épitope hémagglutinine (HA) (Ctso-HA-pQCXIP)
Ctso est un gène très peu étudié. Ainsi, en raison d’un manque d’anticorps spécifique
sur le marché, il était nécessaire de créer un vecteur ayant la séquence de Ctso contenant
un épitope permettant ainsi la détection de la protéine. L’épitope hémagglutinine A (HA)
fut choisi car le laboratoire dispose d’une grande quantité d’anticorps détectant cet épitope.
35
La séquence d’ADN de l’épitope HA est comme suit : 5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA
GAT TAC GCT 3'.
Lors de l’activation des cathepsines et leur passage dans le réticulum
endoplasmique, le C-terminus et le N-terminus sont clivés. Ainsi, l’épitope HA n’a pas pu
être ajouté au C-terminus ni au N-terminus. Il était donc nécessaire d’insérer l’épitope HA
dans la séquence codante de Ctso, préférablement dans un endroit qui n’est pas conservé
entre espèces. Pour ce faire, les séquences de la protéine CTSO de plusieurs espèces ont été
alignées grâce au logiciel d’alignement de séquences multiples ClustalW2 (EBML-EBI)
(voir Figure 9). Il était possible d’observer un manque de conservation entre les séquences
de CTSO à deux sites. Il est donc possible de présumer que l’insertion de l’épitope HA à
ces sites ne touchera pas l’intégrité de la protéine Ctso murine. Le site de clivage du N-
terminus a été vérifié grâce à un logiciel de prédiction de clivage du signal peptide (Signal
4.0), et se situe entre le 23ième
et 24ième
acide aminé, après le premier site d’insertion. Ainsi,
le deuxième site d’insertion (Figure 9, en orange) a été choisi.
36
Figure 9. Recherche de sites pour l’insertion de l’épitope HA dans la séquence de Ctso
Les séquences protéiques de six espèces (Homo sapiens, Pan troglodytes, Bos taurus, Mus
musculus, Gallu gallus, Danio rerio) ont été alignées grâce à CLUSTALW2. Il est possible
d’observer deux sites où les séquences ne sont pas conservées entre espèces.
37
18 cycles
Avant de procéder à l’insertion de l’épitope HA via mutagenèse d’insertion, le
fragment EcoRI/EcoRI contenant la séquence de Ctso, du vecteur Ctso-pQCXIP a été sous-
cloné dans le vecteur pGEM (Figure 8 B), selon le protocole de la trousse pGEM-T Easy
Vector Systems (Promega, Sunnyvale, E-U). Bien que ce ne soit pas impossible, il est plus
facile d’amplifier un vecteur de petite taille lors de la mutagénèse d’insersion, tel que
pGEM (3 kb) qu’un vecteur de plus grande taille, tel que pQCXIP (7.2 kb).
Via mutagenèse d’insertion, l’épitope HA a été ajouté dans la séquence codante de
Ctso. Grâce aux amorces spécialement conçus (Tableau 2), la mutagenèse d’insertion a été
effectuée selon le protocole de Laible et Boonrod avec 10 ng de plasmide pGEM-Ctso,
ainsi que de la polymérase Pfu, tampon de PCR Pfu 10X, dNTPs (10 mM), DMSO et de
l’eau milli-Q, pour un total de 20 µl (Laible et Boonrod, 2009). Le programme PCR pour
l’amplification de pGEM-Ctso avec les amorces de mutagenèse d’insertion est comme suit:
5 minutes à 95 oC
50 secondes à 95 oC
50 secondes à 60 oC
5 minutes à 68 oC
7 minutes à 68 °C
Tableau 2. Séquences des amorces de Ctso pour l’insertion de l’épitope HA via
mutagenèse d’insertion
sens
GGCCGCCGCCTTGCGGTACCCATACGACGTACCAGACTACGCTGAAAGCCTTCATAGAC
Anti-sens
GTCTATGAAGGCTTTCAGCGTAGTCTGGTACGTCGTATGGGTACCGCAAGGCGGCGGCC
38
Après l’amplification, le produit de PCR a été digéré avec 1 µl de Dpn1, un enzyme
qui digère seulement les plasmides parentales qui sont méthylés et non les plasmides
amplifiés, pendant 1 heure dans un bain d’eau à 37°C. Ensuite, 5 µl du produit PCR digéré
a été doucement mélangé à 50 µl de cellules DH5α et ce mélange a été mis sur glace
pendant 30 minutes, puis 45 secondes à 42°C dans un bain d’eau et remis sur glace pendant
2 minutes. À ce mélange de transformation, 900 µl de bouillon NYZ+ (10 g de NZ amine,
hydrolysat de caséine), 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl dans 1 litre d'eau, 12,5 ml de
MgCl2 1M, 12,5 ml de 1M MgSO4, 20 ml de glucose 20%; pH 7.5) a été ajouté. Ce
bouillon a été préparé selon le protocole inclus dans la trousse Quickchange Site-directed
mutagenesis (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada). Ensuite, ce mélange de
transformation a été agité pendant 1 heure à 37°C. Après 1 heure, le mélange de
transformation a été centrifugé pendant 5 minutes à vitesse maximale et 800 µl de bouillon
NYZ a été enlevé avec une pipette. Le 100 µl restant a été resuspendu et étalé avec du X-
gal sur un pétri LB agar avec ampicilline pour être incubé toute la nuit à 37°C. Le prochain
jour, des colonies ont été mises en culture avec du milieu LB et de l’ampicilline pendant
toute la nuit à 37°C. Le lendemain, des stocks glycérol ont été préparés, l’ADN a été extrait
à la silice pour être séquencé. De ce vecteur, le fragment EcoRI/EcoRI contenant la
séquence de Ctso et l’épitope HA a ensuite été sous-cloné dans le vecteur rétroviral
pQCXP.
III. Acta2-CMVTRE3G
De Acta2-pQCXIP, le fragment EcoRI/EcoRI contenant la séquence d’Acta2, a été
sous-cloné dans le vecteur pENTR1A no ccDB (Figure 8 D, Addgene, Cambridge, MA,
E-U). Ensuite, avec la clonase LR (Life Technologies), la séquence d’Acta2 a été
transférée dans le vecteur pLenti CMVTRE3G Puro DEST ayant une résistance à la
puromycine (Addgene), selon le protocole fourni. Ces vecteurs sont basés sur le Système
Gateway, par lequel une séquence d'ADN est clonée dans un vecteur d'entrée (tel que
pENTR1A), qui est recombiné à un vecteur viral de destination de choix (tel que
CMVTRE3G (Voir Figure 8 E)). Cette capacité est fournie par les sites de recombinaison
39
attR1 et attR2 utilisés avec la clonase. Très efficace et rapide, le système Gateway permet
aussi de créer des vecteurs pouvant être encore modifiés pour s'adapter aux technologies
futures, sans la nécessité d'ADNc ou reclonage,
Les vecteurs CMVTRE3G sont inductibles à la tétracycline (ou son dérivé, la
doxycycline). Ces vecteurs inductibles sont munis d’un operateur tétracycline et doivent
être introduits dans une lignée cellulaire produisant un activateur (dans ce cas-ci, B16-F10-
rtTA3G, TA3G étant l’activateur). En absence de tétracycline ou doxycycline, l’activateur
ne peut se lier à l’operateur tandis que la présence tétracycline ou doxycycline changera la
conformation l’activateur qui pourra se lier à l’opérateur. Avec ces vecteurs inductibles, il
est possible de manipuler l’expression du gène cloné. Ainsi, la quantité de protéine produite
corrèle avec la quantité de tétracycline ou de doxycycline administrée (Campeau et al.
2009). Des expériences précédentes ont démontré qu’une expression trop élevée d’Acta2
est toxique pour les cellules (résultats non-montrés). Bien que la séquence codant d’Acta2
aurait pu été cloné dans un vecteur à faible expression, les vecteur inductibles présentent
l’avantage d’être utiles lors des expériences in vivo, car l’expression du gène d’intérêt peut
être contrôlée par l’alimentation des souris (en variant la quantité de doxycyline ajoutée à
l’eau).
2.1.3 Petits ARNs interférents
Pour réduire l’expression de Ctso et d’Acta2, des petits ARNs interférents ont été
utilisés. Les séquences des ARN interférents ainsi que leur provenance est décrite dans le
tableau 3. Les petits ARNs interférents sont sous-clonés dans le vecteur lentiviral pLKO.1
(Figure 8F), apportant une résistance à la puromycine. Afin d’exclure les effets non-
spécifiques lors de la comparaison des résultats, le plasmide Scramble (contenant une
séquence aléatoire qui ne cible aucun gène) est utilisé comme contrôle.
40
Les petits ARNs interférents ont été renommés selon les trois derniers numéros du
numéro de référence et le gène ciblé pour fin de simplification (voir colonne Appellation
dans le tableau 3).
Tableau 3. Liste des petits ARNs interférents utilisés pour la sous-expression de Ctso et
d’Acta2
Gene ciblé Numéro de référence
plasmide
Provenance Appellation
contrôle
Scramble
Plasmide 1864 Addgene
Cambridge,E-U
ARNi (Scramble)
Ctso TRCN0000030586 Sigma-Aldrich
Saint-Louis,E-U
ARNi_586 (Ctso)
Ctso
TRCN0000030587 Sigma-Aldrich
Saint-Louis,E-U
ARNi_587 (Ctso)
Acta2
TRCN0000091664 Sigma-Aldrich
Saint-Louis,E-U
ARNi_664 (Acta2)
Acta2
TRCN0000091666 Sigma-Aldrich
Saint-Louis,E-U
ARNi_666 (Acta2)
2.1.4 Production de virus pour la sous-expression de Ctso et d’Acta2
Pour la sous-expression de Ctso et d’Acta2, des lentivirus ont été produits avec les
différents plasmides codant les petits ARNs interférents contre Ctso et Acta2 ainsi que le
plasmide contrôle Scramble décrit dans le Tableau 3.
41
Le jour de la transfection, 6 x 105 cellules HEK 293T ont été ensemencées dans une
plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu DMEM contenant 10% FBS, 1% de L-glutamine et
0.1% de pénicilline–streptomycine. Après avoir laissé les cellules adhérer pendant au moins
8 heures, 60 µl de tampon LBS (lactate de solution saline tamponnée ; 20 mM de Sodium
Lactate : 150 mM NaCl, à pH 4), 200 ng de plasmide pMD2.G (plasmide d’enveloppe ;
Addgene) et 1.9 µg de psPAX2 (plasmide d’emballage; Addgene) ont été ajoutés à 2 µg de
plasmide d’ARN interférent. Ensuite, 60 µl de tampon LBS contenant 20 µg de
polyéthylèneimine (PEI), a été ajouté à chacun des mélanges ARNi (plasmide ARNi +
pMD2.G + psPAX2) et incubé pendant 20 minutes. Le PEI est un agent de transfection qui
aide l’ADN à se compacter, lui conférant une charge positive. Cela permet à l’ADN de se
lier à la surface cellulaire anionique pour être ensuite transporté dans la cellule via
endocytose. La compaction de l’ADN est optimale dans le tampon LBS à pH 4.0
(Fukumoto et al., 2010). Après ce laps de temps, cette solution a été diluée avec 600 µl de
DMEM sans sérum et déposée sur les cellules ensemencées HEK 293T, goutte-à-goutte, et
incubées à 37°C / 5% CO2 pendant toute la nuit. Le lendemain, le milieu a été changé avec
1.5 ml de milieu DMEM complet frais contenant 1.1 g/ml d’albumine sérique bovine et
incubé à 37°C / 5% CO2 pendant 48 heures. Après 48 heures, les lentivirus produits ont été
récoltés et filtrés avec des filtres 0.22 µm. Ces lentivirus ont été conservés à -80°C jusqu'au
jour de l’infection.
2.1.5 Infection de la lignée B16-F0 avec les lentivirus produits pour la sous-expression
de Ctso et d’Acta2
Le jour de l’infection, les cellules B16-F0 ont été ensemencées à 30 % de
confluence avec 4 ml de DMEM complet dans un pétri de 10 cm pour adhérer pendant 8
heures. Après 8 heures, 1 ml de lentivirus filtré et 4 µl de polybrène [10 µg/ml] ont été
déposé sur les cellules et incubées par la suite à 37°C / 5 % CO2 pendant toute la nuit. Le
polybrène est un polymère cationique utilisé pour augmenter l'efficacité de l'infection virale
en culture cellulaire et agit comme un agent de neutralisation de la répulsion de charge
entre les virions et les acides sialiques sur la surface des cellules (Davis et al., 2004 ; Davis
et al., 2002 ). Le lendemain, le milieu a été changé avec 10 ml milieu DMEM complet frais
42
et les cellules ont été sélectionnées avec 2 µg/ml de puromycine pendant 4 jours. La
puromycine, un antibiotique, a été utilisée comme agent de sélection, car le vecteur
pLKO.1 contient un gène de résistance à la puromycine. Par contre, la puromycine en trop
grande concentration peut aussi être toxique aux cellules. Ainsi, il était nécessaire de faire
une courbe de mort cellulaire avec les cellules B16-F0, pour déterminer la dose la plus
faible qui tue 100% des cellules.
2.1.6 Production de rétrovirus pour la surexpression de Ctso
Pour la surexpression de Ctso, des rétrovirus ont été produits avec le plasmide
Ctso-pQCXIP et le plasmide contrôle pQCXIP.
La veille du jour de la transfection, 5 x 106 cellules HEK 293T G/P ont été
ensemencées dans des pétris de 10 cm avec du milieu DMEM complet. Le jour suivant, 350
µl de tampon LBS, 1.2 µg de plasmide G/P (Addgene) et 200 ng de plasmide VSV-G
(Addgene) ont été ajouté à 12 µg de plasmide. Ensuite, 350 µl de tampon LBS contenant 35
µg de PEI, a été ajouté à chacun des mélanges de plasmides (plasmide + G/P + VSV-G)
pour incuber pendant 20 minutes. Après ce laps de temps, ces solutions ont été diluées
chacune avec 3.5 ml de DMEM sans sérum et déposées sur les cellules ensemencées HEK
293T G/P, goutte-à-goutte, et incubées à 37°C/5% CO2 pendant toute la nuit. Le lendemain,
le milieu a été changé avec 5 ml de DMEM complet frais et les cellules ont été incubés à
37°C/5% CO2 pendant 48 heures. Après 48 heures, les rétrovirus produits ont été récoltés et
filtrés avec des filtres 0.22 µm. Ces rétrovirus ont été conservés à -80°C jusqu'au jour de
l’infection.
2.1.7 Infection des cellules B16-F10 avec des rétrovirus produits pour la surexpression
de Ctso
Le jour de l’infection, les cellules B16-F10 ont été ensemencées à 30% de
confluence avec 3 ml de DMEM complet dans un pétri de 10 cm et laissées adhérer pendant
43
8 heures. Après 8 heures, 2 ml du rétrovirus filtré et 3 µl de polybrène [10 µg/ml] ont été
déposés sur les cellules et laissé incuber à 37°C/5% CO2 pendant toute la nuit. Le
lendemain, le milieu a été changé avec 10 ml milieu DMEM complet frais et les cellules
ont été sélectionnées avec 2 µg/ml de puromycine pendant 4 jours. La concentration de
puromycine a été déterminée grâce a une courbe de mort cellulaire avec les cellules B16-
F10.
2.1.8 Production de lentivirus pour la surexpression d’Acta2
Pour la surexpression d’Acta2, des lentivirus ont été produits avec le plasmide
Acta2-CMVTRE3G et le plasmide contrôle CMVTRE3G.
Tout d’abord, 4 x 106 cellules HEK 293T ont été ensemencées dans des pétris de 10
cm avec 10 ml de DMEM complet. Le lendemain, ce milieu a été remplacé avec 6 ml du
milieu DMEM contenant 10% de FBS, 1% de L-glutamine et 0.1% de pénicilline-
streptomycine. En après-midi, 350 µl de tampon LBS, 3 µg de plasmide pMD2.G, et 5.4 µg
psPAX2 ont été ajoutés à 6 µg de plasmide. Ensuite, 350 µl de tampon LBS contenant 72
µg de PEI, a été ajouté à chacun des mélanges de plasmides et laissé incuber pendant 20
minutes. Après ce laps de temps, ces solutions ont été diluées chacune avec 3.5 ml de
DMEM sans sérum et déposées sur les cellules ensemencées HEK 293T, goutte-à-goutte et
incubées à 37°C/5% CO2 pendant toute la nuit. Le lendemain, le milieu a été changé avec 5
ml de DMEM complet frais contenant 1.1 g/100 ml d’albumine sérique bovine et les
cellules ont été incubés à 37°C/5% CO2 pendant 48 heures. Après 48 heures, les lentivirus
produits ont été récoltés et filtrés avec des filtres 0.22 µm. Ces lentivirus ont été conservés
à -80°C jusqu'au jour de l’infection.
44
2.1.9 Infection des cellules B16-F10-rtTA3G avec les lentivirus produits pour la
surexpression d’Acta2
Le jour de l’infection, les cellules B16-F10-rtTA3G ont été ensemencées à 30% de
confluence avec 4 ml de DMEM complet dans des pétris de 10 cm et laissées adhérer
pendant 8 heures. Un volume de 1 ml de lentivirus Acta2-CMVTRE3G et CMVTRE3G
avec 4 µl de polybrène [10 µg/ml] ont été déposé sur les cellules qui ont été incubées à
37°C/5% CO2 pendant toute la nuit. Le lendemain, le milieu a été changé avec 10 ml de
DMEM complet frais et les cellules ont été sélectionnées avec 2.5 µg/ml de puromycine
pendant 4 jours. La concentration de puromycine a été déterminée grâce à une courbe de
mort cellulaire avec les cellules B16-F10-rtTA3G.
2.1.10 Induction des lignées cellulaires B16-F10-Acta2-CMVTRE3G et B16-F10-
CMVTRE3G avec la doxycycline
Après 4 jours sous sélection à la puromycine, chacune des lignées cellulaires
produites (B16-F10-Acta2-CMVTRE3G et B16-F10-CMVTRE3G) ont été divisées en
deux. Un pétri de chaque lignée cellulaire a été maintenu avec l’induction de 1µg/ml de
doxycycline, tel que suggéré par Campeau et al., 2009. Ainsi, 4 nouvelles lignées
cellulaires ont été produites.
2.1.11 Sommaire des lignées cellulaires produites
Le Tableau 4 résume toutes les lignées cellulaires produites ayant soit une sous-expression
de Ctso ou d’Acta2 ou une surexpression de Ctso ou d’Acta2 ainsi que les milieux de
culture utilisés pour les maintenir. Ces lignées cellulaires ont été nommées selon la lignée
dans laquelle une sous- ou surexpression a été accomplie ainsi que le nom du vecteur avec
lequel le virus a été fait pour l’infection de ces lignées cellulaires. Dans le cas de la
surexpression d’Acta2, la lignée B16-F10–rt-TA3G a été tout simplement nommée B16-
45
F10, pour simplifier. Le fait d’utiliser des vecteurs CMVTRE3G implique que l’infection a
été faite dans des lignées cellulaires ayant un activateur i.e. B16-F10-rt-TA3G.
Tableau 4. Sommaire des lignées cellulaires produites
Lignées cellulaires Milieu
B16-F0-ARNi (Scramble) DMEM complet
B16-F0-ARNi_586 (Ctso) DMEM complet
B16-F0-ARNi_587 (Ctso) DMEM complet
B16-F0-ARNi_664 (Acta2) DMEM complet
B16-F0-ARNi_666 (Acta2) DMEM complet
B16-F10-Acta2-CMVTRE3G non-induit DMEM complet
B16-F10 -CMVTRE3G non-induit DMEM complet
B16-F10-Acta2-CMVTRE3G-induit DMEM complet + 1µg/ml
doxycycline
B16-F10-CMVTRE3G-induit DMEM complet + 1µg/ml
doxycycline
B16-F10-Ctso-pQCXIP DMEM complet
B16-F10-pQCXIP DMEM complet
2.2 Validation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2
2.2.1 Extraction d’ARN des lignées cellulaires
Un pétri avec chacune des lignées cellulaires décrites dans le Tableau 4 a été
trypsiné, récolté et centrifugé pendant 5 minutes à 525 g. Ensuite, l’ARN totale de ces
lignées cellulaires a été extrait avec la trousse d’extraction d’ARN Omega Total RNA Kit I
(Omega Bio-Tek, USA) selon le protocole. L’ARN fut quantifié avec un spectrophotomètre
Nanodrop en déposant 1 µl de l’ARN élué.
46
40 cycles
2.2.2 Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
Une RT-PCR a été effectuée avec 2µg d’ARN, 2 µl d’un mélange d’amorces
aléatoires (Random Primer Mix ; NEB) complétée avec 16 µl d’eau DEPC (pyrocarbonate
d’éthyle), à 70°C pendant 5 minutes et laissée refroidir à 4 °C. Ensuite, 2µl de tampon
Reverse Transcriptase 10X, 1µl de Reverse transcriptase (NEB), 0.5 µl d’inhibiteur RNase
Murin (NEB) et 0.5 µl d’eau DEPC ont été ajoutés au mélange refroidi et une PCR a été
effectuée selon le protocole suivant :
5 minutes à 25 °C
60 minutes à 42 °C
5 minutes à 80 °C
L’ADN complémentaire produit a été dilué avec 180 µl d’eau milli-Q et conservé à -
20°C.
2.2.3 Validation de l’efficacité de l’expression différentielle par PCR quantitative (qPCR)
L’efficacité de la sous- et surexpression de Ctso et d’Acta2 a été vérifiée par qPCR,
en triplicata. Un mélange de 2.5µl d’ADN complémentaire, 1 µl d’amorces (d’un mélange
d’amorces sens + anti-sens, à 5µM), 5 µl de SybrGreen (Bio-Rad, Mississauga, ON,
Canada) et 1.5 µl d’eau milli-Q ont été déposés dans une plaque PCR de 96 puits. La
plaque a été centrifugée à 3000 rpm, pendant 1 seconde, à 4°C. Une qPCR a été complétée
dans un appareil de qPCR Connect CFX (Bio-Rad) selon le protocole suivant:
20 secondes à 95 °C
3 secondes à 95°C
30 secondes à 60°C
30 secondes à 95 °C
Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 5.
47
Tableau 5. Amorces qPCR de Ctso, d’Acta2 et d’U6
Amorce Sens Amorce Anti-sens
Ctso CAGTTGAATTGGTGGCAGATTC TGGCCCCTGAAGTTATATGCA
Acta2 TCCCTGGAGAAGAGCTACGAACT ACCATTGGAAACGAACGCTT
U6 CTCGCTTCGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT
2.2.4 Préparation des extraits cellulaires pour valider la sous-expression de la protéine
Acta2 par immunobuvardage
Les cellules des lignées cellulaires B16-F0-ARNi_664 (Acta2), B16-F0-ARNi_666
(Acta2) et B16-F0-ARNi (Scramble) ont été grattées et reprises dans un eppendorf pour être
centrifugées à 3000 rpm pendant 5 minutes à température pièce. Le surnageant a été enlevé
et 50 µl de PBS 1X (tampon phosphate salin) a été ajouté aux cellules. Ce mélange a été
bien resuspendu et 25 µl fut mis de coté pour le dosage des protéines. Le 25 µl restant a été
centrifugé de nouveau à 3000 rpm pendant 5 minutes à température pièce. Le surnageant a
été enlevé de nouveau. 100 µl de Sample buffer 1X (diluée avec de l’eau à partir du Sample
Buffer 4X qui est composé de Tris-HCl à pH 6,8 (250 mM), de Glycérol (40%), de SDS
(8%) et de 100 µl de béta-mercaptoéthanol) a été ajouté. Ce mélange a été bien resuspendu
et soniqué avec un sonicateur à puissance 3 pendant 30 secondes, pour ensuite être chauffé
à 100°C pendant 5 minutes.
2.2.5 Dosage des protéines pour immunobuvardage
Le dosage des protéines a été réalisé avec le 25 µl d’échantillon restant avec la
solution Bradford 5X (Bio-Rad). 5 µl de chaque échantillon a été déposé dans une plaque à
96 puits en triplicata. 200 µl de solution Bradford 1X (diluée avec de l’eau milli-Q) a été
ajouté et la densité optique des échantillons a été mesurée à 562 nm. Les concentrations ont
été extrapolées à partir d’une courbe standard d’albumine sérique bovine et multipliées par
le facteur de dilution.
48
2.2.6 Immunobuvardage des lignées cellulaires ayant une sous-expression d'Acta2
Une quantité de 50 µg d’extraits protéiques des lignées cellulaires B16-F10-ARNi
(Scramble), B16-F10-ARNi_664 (Acta2), B16-F10-ARNi_666 (Acta2) et 15µl de
marqueur de protéines (NEB) ont été déposés sur un gel SDS-PAGE (électrophorèse en gel
de polyacrylamide contenant du laurylsulfate de sodium), avec un gel de séparation de 10%
et un gel de concentration de 4%. Après avoir laissé les échantillons migrer à 80 V à travers
le gel de concentration et 140 V à travers le gel de séparation, les protéines ont été
transférées sur une membrane de nitrocellulose pendant 1 heure, à 90V, à 4°C. La
membrane fut bloquée avec du PBS/Tween20 avec 5% de lait. Ensuite, la membrane a été
hybridée avec l’anticorps primaire anti-Acta2 (dilution 1 : 4000 ; #cat. SAB1403519,
Sigma-Aldrich) pendant toute la nuit et par la suite, avec l’anticorps secondaire anti-souris
(dilution 1:20 000) dilué dans du PBS/Tween 20 avec 5% de lait pendant 1 heure. Après
l’hybridation finale, la membrane de nitrocellulose a été lavée avec du PBS 1X et révélée
avec du ECL (enhanced chemiluminescence) (GE Healthcare, Mississauga, ON, Canada).
La membrane de nitrocellulose a ensuite été décapée avec 2M de NaOH, pour être sondée
de nouveau avec un anticorps primaire anti-tubuline (dilution 1:100) et un anticorps
secondaire anti-souris (dilution 1:20 000).
2.3 Les études fonctionnelles de perte et de gain de fonction selon l’expression
différentielle de Ctso et Acta2
2.3.1 Essai de prolifération
Le jour de l’expérience, 5 x 104 cellules de chaque lignée cellulaire ont été
ensemencées, en triplicata, dans des plaques à 24 puits et incubées à 37°C/5% CO2 à
chaque intervalle de temps, soit à 24 heures (T=24h), 48 heures (T=48h) et 72 heures (T=72
h). Les cellules ont été passées avec de la trypsine 1X dans du PBS 1X. La moitié du
volume contenant la totalité des cellules a été récolté dans un tube et centrifugé à 525 g. Le
surnageant a ensuite été enlevé et les échantillons ont été conservés à -80 °C. L’autre moitié
a été remise en culture jusqu'à la prochaine récolte, soit 24 heures plus tard. Les cellules
récoltées ont ensuite été quantifiées avec du colorant CyQUANT (Life Technologies) selon
49
le protocole de la trousse. Un mélange 5 X a été préparé avec le colorant CyQUANT, le
tampon de lyse de cellules et l’eau et 200 µl de ce mélange a été ajouté à chaque récolte de
cellules, qui ont été dégelées avant l’ajout du mélange de quantification CyQUANT. Après
une incubation de 2 minutes à température pièce, ce 200 µl a été transféré du tube de
récolte de cellules à une plaque de 96 puits pour mesurer la fluorescence. Le colorant vert
CyQUANT devient fluorescent lorsqu'il est lié à des acides nucléiques cellulaires. Ainsi, en
mesurant la fluorescence en utilisant un filtre de 485/20 nm d'excitation et un filtre
d'émission de 528/20 nm, il est possible de quantifier le nombre de cellules viables,
produisant une courbe linéaire. Une courbe standard a servie de référence au calcul du
nombre de cellules.
Pour T=0h, 5 x 104 cellules de chaque lignée cellulaire ont été récoltées dans un
eppendorf et centrifugées. Le surnageant a été enlevé et les eppendorfs conservés à -80 °C
jusqu’à quantification avec le CyQUANT.
L’essai de prolifération a été fait en triplicata.
2.3.2 Morphologie de propagation
Des plaques à 24 puits ont été revêtues avec 200 µl de gélatine 0.5% pendant 1-2
minutes. Les puits ont ensuite été lavés une fois avec du HBSS (Hank’s balanced salt
solution) avec Ca+Mg
+ (Sigma-Aldrich), et une fois avec du milieu de culture approprié.
Chaque lignée cellulaire (1 x 104 cellules) a été ensemencée dans des plaques 24 puits
pendant 2h30 (37°C/5%CO2). Après ce laps de temps, les puits ont été lavés avec 100 µl de
PBS 1X pour enlever les cellules non-adhérentes et des photos ont été prises avec un
microscope Nikon, pour visualiser l’étalement des cellules.
50
2.3.3 Essai d’adhésion
Des plaques à 24 puits ont été revêtues avec 200 µl de gélatine 0.5% pendant 1-2
minutes. Les puits ont ensuite été lavés une fois avec du HBSS avec Ca+Mg
+ et une fois
avec du milieu de culture approprié. Chaque lignée ont été ensemencées dans des plaques
24 puits à 1 x 104 cellules/puits en triplicata et laissée adhérer à 37°C/5% CO2 pendant 2
heures. Après ce laps de temps, le milieu de culture a été enlevé et les puits ont été lavés
doucement avec 100 µl de PBS 1X. Les cellules adhérentes ont été quantifiées avec du
CyQUANT selon le protocole de la trousse. Une courbe standard a servi de référence au
calcul du nombre de cellules.
Pour T=0h, 1 x 104 cellules de chaque lignée cellulaire ont été récoltées dans un
eppendorf et centrifugées. Le surnageant a été enlevé et les eppendorfs conservés à -80 °C
jusqu’à quantification avec le CyQUANT.
L’essai d’adhésion a été fait en triplicata.
2.3.4 Essai de migration
L’essai de réparation de blessure (aussi appelé un essai de migration) est un essai
qui permet de visualiser la migration des cellules in vitro et consiste à créer une cicatrise
sur une monocouche cellulaire par intermédiaire d’une pointe de pipette. Cet essai est un
moyen rapide et simple pour comparer le comportement de cellules sous diverses
conditions. Ensuite des photos sont prises à des intervalles pour évaluer le temps que les
cellules prennent pour fermer la cicatrice (Liang et al., 2007). Par contre, des inserts
peuvent aussi être utilisés, pour créer des cicatrices uniformes. Ici, des inserts iBidi ont été
51
utilisés. Ce sont des inserts en silicone ayant deux chambres séparer par un mur de silicone,
qui crée une cicatrice uniforme.
Les cellules ont été ensemencées (5 x 104) dans chacune des petites chambres des
inserts de migration (iBidi), en triplicata et laissées adhérer pendant toute la nuit. Le
lendemain, les inserts ont été enlevés à l’aide d’une pince stérile et les puits ont été lavés
doucement une fois avec du milieu de culture approprié, pour enlever les cellules non-
adhérentes. Des photos ont été prises avec un microscope Nikon avant d’incuber les
cellules à 37°C/5% CO2 avec 1 ml de milieu de culture approprié (T=0h). Après incubation
de 16 heures, des photos ont été prises à nouveau (T=16h). Ces photos permettront de
visualiser et calculer l’aire de la cicatrice à T=0h et à T=16h. L’aire de l’espace envahie
par les cellules après 16 heures est soustraite de l’aire de la cicatrice initiale crée par les
inserts à T=0h, grâce au logiciel Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, San Diego, E-U).
L’essai de migration a été fait en triplicata.
2.3.5 Essai de culture cellulaire en 3 dimensions (3D) (Doillon et al., 2004)
Le jour de l’expérience, 260 µl de DMEM 5X , 130 µl de FBS, 130 µl de NaCO3H
(0.26 M), 5.2 µl de NaOH et 6.5 x 105
cellules de chaque lignée cellulaire dans 254.8 µl de
milieu DMEM approprié ont été mélangés ensemble sur glace. Ensuite, 520 µl de collagène
de rat (3.5 mg/ml) a été ajouté et resuspendu 2 à 3 fois pour mélanger la solution.
Rapidement, 200 µl de ce mélange a été déposé en triplicata dans les puits d’une plaque 96
puits à fonds ronds, en faisant attention de ne pas faire de bulles. Ces bouchons de
collagène ont ensuite été incubés à 37°C/5% CO2 pendant 2 heures pour solidifier.
Pendant ce temps d’incubation, 30 mg de fibrinogène (Sigma-Aldrich) a été dilué
dans 10 ml de HBSS avec Ca+Mg
+, bien suspendu et filtré avec des filtres de 0.22 µm. Un
volume de 250 µl de ce mélange a été déposé dans un puits d’une plaque à 24 puits.
52
Ensuite, 8 µl de thrombine (5 U/ml) (Sigma-Aldrich) a été ajouté, pour la polymérisation
du fibrinogène. Cela a été fait en triplicata, pour chaque lignée cellulaire testée. Les
couches de fibrinogène ont été incubées à 37°C/5% CO2 pendant 10-15 minutes afin de
polymériser.
Une fois les bouchons de collagène solidifiés, ils ont été lavés 2 fois avec du PBS
1X et à l’aide une spatule stérile, déposés sur la couche de fibrine polymérisée. Une fois
polymérisé, le fibrinogène se nomme fibrine. Le bouchon de collagène a ensuite été couvert
avec 300 µl de solution fibrinogène. Ensuite, 8 µl de thrombine a été ajouté pour
polymériser le fibrinogène pour ensuite être incubé à 37°C/5% CO2 pendant 10-15 minutes.
Un volume de 1 ml de milieu DMEM approprié, contenant 10 µl d’aprotinine (Sigma-
Aldrich) dilués avec de l’eau à une concentration de 1mg/ml, a été ajouté par-dessus les
bouchons de fibrine/collagène qui furent incubés à 37°C/5% CO2 pendant 2-3 semaines. Le
milieu de culture a été changé 3 fois par semaine. Pendant ces 2-3 semaines, les cellules
devraient migrer du bouchon de collagène vers la fibrine et former des colonies visibles.
Une fois les colonies visibles, le milieu de culture a été enlevé et les puits inondés de bleu
de méthylène pendant 2-3 minutes, pour colorer et fixer les colonies. Les puits ont ensuite
été décolorés soit avec de l’eau ou de l’éthanol 70%, jusqu’à ce que le contraste entre les
colonies de cellules colorées et le fond du puits soit bon. Ensuite, des photos ont été prises
avec une caméra Nikon. Le nombre de colonies a été compté avec l’interface « cell
counter » du logiciel Image J, en cliquant manuellement sur chaque colonie. A chaque clic,
le compteur est mis à jour.
L’essai en 3D a été fait en triplicata.
53
2.3.6 Essai de sensibilité à l’anoïkose
Des puits d’une plaque 6 puits ont été revêtus de 2 couches de 10 mg/ml de poly-
HEMA (Sigma-Aldrich) dilué dans de l’éthanol 100%. Après que la 2ième
couche ait séchée,
les puits ont été lavés 3 fois avec du PBS 1X. Ensuite, 2.5 x 105 cellules de chaque lignée
cellulaire ont été ensemencées et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 48 heures. Après 48
heures, les cellules ont été récoltées et quantifiées avec du colorant CyQUANT selon le
protocole de la trousse.
Pour T=0h, 2.5 x 105 cellules de chaque lignée cellulaire ont été récoltées dans un
eppendorf et centrifugées. Le surnageant a été enlevé et les eppendorfs conservés à -80 °C
jusqu’à quantification avec le CyQUANT.
L’essai de sensibilité à l’anoïkose a été fait en triplicata.
2.3.7 Essai de formation de colonies en agar mou
Pour faire la couche de base, un volume égal de milieu DMEM approprié 2X et de
1% d’agar pour culture cellulaire ont été mélangés ensemble pour faire une solution 0.5%
d’agar. Ensuite, 500 µl de ce mélange a été déposé, en triplicata, dans des puits d’une
plaque 24 puits laissé à température pièce pour solidifier. Pour faire la couche de dessus, un
volume égal de milieu DMEM approprié 2X et de 0.7% d’agar pour culture cellulaire ont
été mélangés ensemble pour faire une solution 0.35 % d’agar. Le milieu DMEM et les
solutions d’agar de 1% et de 0.7% ont été chauffés dans un bain d’eau à 37°C avant le
mélange. Cette solution a ensuite été ajoutée, en triplicata, à 1.25 x 104
cellules de chaque
lignée cellulaire et bien resuspendu. Un volume de 500 µl de ce mélange (2.5 x 103
54
cellules) a été déposé sur les couches de base, laissées à température pièce pour solidifier et
incubées à 37°C / 5% CO2 pendant 2-3 semaines, jusqu’à ce que les colonies soient visibles
à l’œil nu. Environ 3-4 gouttes de milieu frais ont été ajoutées à chaque semaine, afin
d’éviter un assèchement. Une fois les cellules visibles, du crystal violet 1% dilué dans de
l’éthanol fut utilisé pour mieux visualiser les colonies. Les puits ont été inondés avec 200
µl de crystal violet pendant quelques minutes et décolorés avec de l’éthanol 70%. Ensuite,
des photos ont été prises avec une caméra Nikon et un microscope Nikon. Le nombre de
colonies a été compté avec l’interface « cell counter » du logiciel Image J, en cliquant
manuellement sur chaque colonie. A chaque clic, le compteur est mis à jour.
L’essai de formation de colonies a été fait en triplicata.
2.4 Localisation cellulaire de la protéine CTSO
2.4.1 Transfection transitoire pour déterminer la localisation cellulaire de la protéine
CTSO
Pour la surexpression de Ctso ayant un épitope HA, une transfection transitoire a été
effectuée avec le plasmide Ctso-HA-pQCXIP et le plasmide contrôle pQCXIP.
Le jour de la transfection, les cellules B16-F0 ont été ensemencées à 30% de
confluence dans des pétris de 10 cm avec 6 ml de milieu DMEM complet et les cellules ont
été incubées pendant au moins 8 heures. Pour la transfection, 350 µl de tampon LBS a été
ajouté à 7 µg de plasmide Ctso-HA-pQCXIP ainsi qu’à 7 µg de plasmide contrôle pQCXIP.
Ensuite, 350 µl de tampon LBS contenant 35 µg de PEI, a été ajouté à chacun des mélanges
de plasmides (tampon LBS + plasmides) et incubé pendant 20 minutes. Après 20 minutes,
3.5 ml de DMEM sans sérum a été ajouté et le tout fut déposé sur les cellules ensemencées.
Les cellules ont ensuite été incubées à 37°C/5% CO2 pendant toute la nuit. Le lendemain, le
55
milieu a été changé avec 10 ml de milieu DMEM complet et les cellules ont été incubées à
37°C/5% CO2 pendant 48 heures.
2.4.2 Préparation d’échantillons de milieux de culture pour immunobuvardage
Après 48 heures, les milieux de culture des cellules ont été repris pour être
centrifugée à 1000 rpm pendant 5 minutes à température pièce. Un volume de 150 µl de
surnageant a été mélangé avec 50 µl de Sample buffer 4X (SB4X contenant du beta-
mercaptoéthanol), pour ensuite être chauffé à 100°C pendant 5 minutes. Du milieu de
culture DMEM complet a été utilisé comme contrôle négatif.
2.4.3 Préparation et dosage des extraits cellulaires pour l’immunobuvardage
Les extraits cellulaires ont été préparés selon le protocole décrit dans la section
2.2.4 et dosés selon le protocole décrit dans la section 2.2.5.
2.4.4 Immunobuvardage pour la localisation cellulaire de la protéine CTSO
L’immunobuvardage pour évaluer la localisation de Ctso a été accompli avec 45 µl
des échantillons des milieux de cultures, 50 µg des extraits cellulaires préparés et 15 µl de
marqueur de protéines (NEB), selon le protocole décrit dans la section 2.2.6, avec un
anticorps primaire anti-HA (dilution 1:5000) (#cat. sc-805; Santa-Cruz Biotechnologies,
Santa Cruz, E-U), et un anticorps secondaire anti-souris (dilution 1:20 000).
2.5 Analyse statistique
Chaque étude fonctionnelle a été accomplie en triplicata. Les résultats de chaque
expérience ont été enregistrés dans le logiciel Excel de Microsoft. La moyenne de chaque
expérience en triplicata a été calcule grâce a la formule MOYENNE(nombre1;nombre2;...)
et l’écart-type a été calculé grâce a la formule ECARTYPE(nombre1;nombre2;...)
Chapitre 3 Résultats
3.1 Évaluation de la sous- et surexpression de Ctso et Acta2
3.1.1 Validation de l’expression différentielle de Ctso et Acta2 par qPCR
Afin de valider la sous- et surexpression des gènes cibles, Ctso et Acta2, une qPCR
a été effectuée sur l’ADN complémentaire produit à partir de l’ARN extrait des cellules
B16-F10 ou B16-F0, infectées avec les virus appropriés permettant de réprimer ou
surexprimer Ctso et Acta2.
La Figure 10A démontre que les shRNAs utilisés réduisent l’expression des deux
gènes cibles dans le cellules B16-F0. En 10B, on peut voir que le niveau de surexpression
de Ctso dans les cellules B16-F10 est d’environ 800 fois comparativement aux cellules ne
contenant que le plasmide vide. Dans le cas de la surexpression d’Acta2 avec le système
inductible (Figure 10C), une faible fuite a été remarqué chez les cellules B16-F10 Acta2-
CMVTRE3G non-induites. Ceci est potentiellement causé par la présence de tétracycline
(un analogue de la doxycycline) dans le FBS du milieu de culture. La tétracycline est un
antibiotique qui est souvent utilisé pour traiter les animaux. Lors de l’ajout de 1 µg/ml de
doxycycline au milieu de culture, l’expression d’Acta2 est augmentée de près de 2000 fois
comparativement aux cellules contrôles. Le gène U6 a été utilisé comme contrôle interne
pour les qPCR présentés.
57
A)
B)
58
C)
Figure 10. Validation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 par qPCR
La Figure 10 démontre A) la sous-expression des gènes Ctso et Acta2 dans la lignée B16-
F0 comparé au contrôle Scramble tandis que B) et C) démontrent la surexpression de Ctso
et Acta2 dans la lignée B16-F10 comparés à leurs contrôles respectifs. Le gène U6 a été
utilisé comme contrôle interne. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
3.1.2 Validation de la sous-expression protéique d’Acta2 par immunobuvardage
Bien que la sous-expression des gènes cibles ai été validée par qPCR, il est
important de vérifier l’expression protéique par immunobuvardage, car une baisse de
l’ARN messager ne corrèle pas toujours avec une baisse de l’expression protéique. Ainsi,
l’expression de la protéine Acta2 chez les lignées cellulaires B16-F0-ARNi_664 (Acta2),
B16-F0-ARNi_666 (Acta2) et la lignée contrôle B16-F0-ARNi (Scramble) a été validée par
immunobuvardage (Figure 11). L’immunobuvardage démontre une diminution de la
protéine Acta2, ce qui corrèle avec la baisse de l’ARN messager d’Acta2, validée par qPCR
59
(Figure 10A). Cette diminution n’est pas due à une variation dans la quantité de protéines
totales utilisées car le niveau d’expression de la protéine cible est normalisé par rapport à la
tubuline, une protéine ayant une expression élevée et étant exprimée de façon stable chez
diverses espèces (Liu et Xu, 2006). Dans le cas de Ctso, étant une protéine très peu étudiée,
la sous-expression protéique n’a pas pu été validé par immunobuvardage en raison d’un
manque de disponibilité d’un anticorps spécifique.
Figure 11. Validation par immunobuvardage de la sous-expression de la protéine
Acta2
La sous-expression de la protéine Acta2 a été validée chez les lignées cellulaires B16-F0-
ARNi-664 (Acta2), B16-F0-ARNi-666 (Acta2) et la lignée contrôle B16-F0-ARNi
(Scramble). Les lignées cellulaires infectées avec des petits ARNs interférents 664 (Acta2)
et 666 (Acta2) démontrent une faible expression de la protéine Acta2 comparativement au
contrôle Scramble.
60
3.2. Études fonctionnelles de perte et de gain de fonction en relation avec
l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2
3.2.1 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la prolifération
L’hyperprolifération des cellules tumorales primaires est une des premières étapes
de la cascade métastatique. Afin d’évaluer l’implication de Ctso et Acta2 lors de la genèse
de la métastase, la prolifération des lignées cellulaires sous- et surexprimant ces deux gènes
a été surveillée pendant 3 jours. Ctso et Acta2 étant des candidats suppresseurs de
métastase, et sachant que les suppresseurs de métastase n’affectent pas la formation de
tumeurs primaires, il est anticipé que la sous-expression de ces deux gènes chez des lignées
cellulaires non-métastatiques et leur surexpression chez des lignées cellulaires
métastatiques ne devraient avoir aucun impact sur la prolifération (Horak et al., 2008).
Comme démontré à la Figure 12, la diminution de l’expression de Ctso et d’Acta2 chez les
cellules B16-F0 (12A et B) ou l’augmentation de Ctso et d’Acta2 chez le cellules B16-F10
(12 C et D) ne semblent pas avoir d’effet majeur sur la prolifération de ces lignées
cellulaires. Par contre, si la prolifération des cellules B16-F10 ayant une surexpression de
Ctso avait été surveillée sur une plus longue période de temps, il aurait peut-être été
possible d’observer un effet plus grand entre la lignée contrôle B16-F10-pQCXIP et la
lignée B16-F10-Ctso-pQCXIP (Figure 12 C).
61
A)
B)
62
C)
D)
Figure 12. La prolifération des cellules B16-F0 et B16-F10 selon l’expression
différentielle de Ctso et d’Acta2
A et B démontrent que la sous-expression de Ctso et Acta2 n’a pas d’effet majeur sur le
taux de prolifération. Ceci est vrai aussi pour la surexpression de Ctso et Acta2 (C et D).
Par contre, si l’essai de prolifération avait été réalisé sur plus de 3 jours, on aurait
probablement observé une différence plus grande entre la lignée contrôle B16-F10-pQCXIP
et la lignée B16-F10-Ctso-pQCXIP (Figure 12 C). Les barres d’erreurs représentent l’écart-
type.
63
3.2.2 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et Acta2 sur la morphologie de
propagation
La morphologie de propagation peut être définie comme étant la morphologie que
les cellules adoptent lors de l’attachement à une surface. Lors de l’adhésion, des
lamellipodes, protrusions cellulaires, sont formées. Elles ont comme fonction d’aider
l’adhésion ainsi que la migration. En évaluant la morphologie de propagation, il est
possible d’avoir un aperçue sur le potentiel d’adhésion cellulaire. Les cellules
métastatiques, étant des cellules en état de dissémination, adhèrent moins bien à une surface
et auront une morphologie de cellules motiles, donc une morphologie plus rondes (Albelda
,1993 ; Pinner et al., 2009 ; Wolf et al., 2003). Les cellules qui ont une plus grande capacité
d’adhésion auront une morphologie plus étalée (Gallant et al., 2005).
Dans cette expérience, pour évaluer la morphologie de propagation, les cellules ont
été trypsinées et ensemencées dans un puits revêtu de gélatine, une forme dénaturée de
collagène. Cela imite l’adhésion de la cellule la matrice extracellulaire in vivo. Il est
anticipé que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 dans une lignée non-métastatique rend
les cellules moins adhérentes et elles devraient ainsi avoir une morphologie plus ronde que
la lignée contrôle B16-F0-ARNi (Scramble). En contraste, la surexpression de Ctso et
d’Acta2 devrait induire une morphologie de propagation (étalement des cellules) dans une
lignée métastatique. La Figure 13 démontre que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 dans
les B16-F0 n’induit aucun changement de morphologie (A-E) tandis que la surexpression
de Ctso et d’Acta2 aide les cellules à se propager (F-G).
64
A) B16-F0-ARNi (Scramble)
B) B16-F0-ARNi_586 (Ctso) C) B16-F0-ARNi_587 (Ctso)
65
D) B16-F0-ARNi_664 (Acta2) E) B16-F0-ARNi_666 (Acta2)
F) B16-F10-pQCXIP G) B16-F10-Ctso-pQCXIP
66
H) B16-F10-CMVTRE3 I) B16-F10-CMVTRE3G
(non-induit) (induit)
J) B16-F10-Acta2-CMVTR3G K) B16-F10-Acta2-CMVTR3G
(non-induit) (induit)
Figure 13. Effet de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la morphologie de
propagation
A-E démontrent que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 dans les B16-F0 n’invoque
aucun changement de morphologie tandis que la surexpression de ces deux gènes provoque
un étalement des cellules B16-F10 (F-K). Les photos ont été prises avec un microscope
Nikon, avec un objectif 10x.
67
3.2.3 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et Acta2 sur l’adhésion
La dissémination des cellules métastatiques est caractérisée par une perte
d’adhésion. Les intégrines, sont responsables de l’adhésion à la lame basale de la matrice
extracellulaire. La matrice extracellulaire et la E-cadhérine sont responsables de l’adhésion
cellule-cellule. Ensemble, ils régulent la dissémination des cellules métastatiques. Ainsi, la
perte d’adhésion cellule-cellule et cellule-matrice est une des principales caractéristiques
qui pourvoient les cellules tumorales avec un phénotype agressif (Behrens, 1993 ;
Cavallaro et Christofori, 2001).
L’expérience permettant d’évaluer la capacité d’adhésion est similaire à
l’expérience d’évaluation de la morphologie de propagation. Les cellules ont été trypsinées
et ensemencées dans un puits revêtu de gélatine, pendant 2 heures. Comme pour
l’expérience d’évaluation de la morphologie de propagation, cette expérience imite
l’adhésion de la cellule à la matrice extracellulaire in vivo. Ainsi, si Ctso et Acta2 jouent un
rôle lors de l’adhésion, il est anticipé que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 dans une
lignée non-métastatique rend les cellules moins adhérentes que la lignée contrôle B16-F0-
ARNi (Scramble) tandis que la surexpression de ces deux gènes dans une lignée
métastatique devrait augmenter l’adhésion. La Figure 14 démontre que la sous-expression
de Ctso et Acta2 n’a aucun impact sur la capacité d’adhésion des cellules non-métastatiques
tandis que la surexpression de ces deux gènes augmente l’adhésion comparativement aux
lignées cellulaires contrôles métastatiques.
68
A)
B)
69
C)
D)
Figure 14. Effet de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la capacité
d’adhésion
Les panneaux A et B démontrent que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 n’induit pas un
phénotype agressif d’adhésion dans la lignée non-métastatique B16-F0. En contraste, la
surexpression de ces deux gènes dans une lignée métastatique augmente la capacité
d’adhésion (C et D). Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
70
3.2.4 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la migration
cellulaire
La migration cellulaire permet aux cellules tumorales de migrer à travers les tissus
pour se rendre au système sanguin et lymphatique. Cette capacité de migration représente
une des étapes majeures de la métastase. Ainsi, plusieurs études suggèrent que les cellules
métastatiques ont une capacité migratoire supérieure aux cellules tumorales primaires
(Bradbury et al., 2012).
Dans cette expérience (voir la sous-section 2.3.4 du Chapitre Matériel et méthodes),
l’évaluation de l’effet de la migration, selon l’expression différentielle de Ctso et Acta2,
donne un aperçu du rôle de ces deux gènes lors de la migration de cellules tumorales
(Figure 15). La sous-expression de Ctso chez les cellules B16-F0 provoque une migration
rapide comparée au contrôle chez les cellules B16-F0 (Figure 15 A, B et C). Ce même effet
est observé lors de la sous-expression d’Acta2 chez les cellules B16-F0 (Figure 15 A, D et
E). Par contre, la surexpression de Ctso chez les cellules B16-F10 n’a aucun impact sur la
migration, comparé au contrôle (Figure 15 F et G). La surexpression d’Acta2, induite avec
1 µg/ml de doxycycline, chez les cellules B16-F10, ralenti la migration (Figure 15 H, I, J et
K). La Figure 16 résume le pourcentage de la surface couverte lors de la migration,
quantifiant ainsi la migration.
71
A) B16-F0-ARNi (Scramble)
T=0h T=16h
B) B16-F0-ARNi_586 (Ctso)
T=0h T=16h
72
C) B16-F0-ARNi_587 (Ctso)
T=0h T=16h
D) B16-F0-ARNi_664(Acta2)
T=0h T=16h
73
E) B16-F0-ARNi_666 (Acta2)
T=0h T=16h
F) B16-F10-pQCXIP
T=0h T=16h
74
G) B16-F10-CTSO-pQCXIP
T=0h T=16h
H) B16-F10- CMVTRE3G (non-induit)
T=0h T=16h
75
I ) B16-F10- CMVTRE3G (induit)
T=0h T=16h
J) B16-F10-Acta2-CMVTRE3G (non-induit)
T=0h T=16h
76
K) B16-F10-Acta2-CMVTRE3G (induit)
T=0h T=16h
Figure 15. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la migration
cellulaire
Les panneaux A-E démontrent que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 chez les cellules
B16-F0 augmente la migration cellulaire. La surexpression de Ctso chez les cellules B16-
F10 n’affecte pas la migration cellulaire (F-G) tandis que la surexpression d’Acta2 ralenti la
migration (H-K). Les photos ont été prises avec un microscope Nikon, avec un objectif 10x.
77
A)
B)
78
C)
Figure 16. Quantification de la migration cellulaire dépendamment de l’expression
différentielle de Ctso et d’Acta2
Les panneaux A-C démontrent le pourcentage de la surface couverte par les cellules 16
heures après les blessures. Clairement, les cellules des lignées cellulaires non-métastatiques
ayant une sous-expression de Ctso et d’Acta2 remplissent la cicatrice plus vite que leur
contrôle. La surexpression de Ctso dans les B16-F10 ne provoque aucune différence dans
leur capacité migratoire tandis que la surexpression d’Acta2 produit une réduction de la
capacité de migration des cellules B16-F10. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
79
3.2.5 Evaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la formation de
colonies dans un essai de culture cellulaire en 3 dimensions
L’invasion, la capacité d’une cellule à dégrader la matrice extracellulaire, est peut-
être la plus importante étape de la métastase. Il est possible d’évaluer chez une lignée
cellulaire, via un essai de culture cellulaire en 3D, la capacité d’invasion, de migration et de
survie dans la matrice de fibrine. En bref, un bouchon de collagène contenant des cellules
est logé entre deux couches de fibrine. Suite à une période d’incubation et selon les
capacités des cellules, elles s’échappent du bouchon de collagène pour former des colonies
dans la fibrine (Doillon et al., 2004).
L’essai de culture cellulaire en 3D a été accompli avec les lignées cellulaires
produites. Il est anticipé que la sous-expression de Ctso et Acta2 dans une lignée cellulaire
non-métastatique augmente le nombre de colonies formées dans la matrice de fibrine tandis
que la surexpression de ces deux gènes dans une lignée métastatique aura l’effet inverse.
La Figure 17 A-C démontre qu’en effet, la sous-expression de Ctso chez les cellules
B16-F0 augmente la formation de colonies dans la matrice de fibrine tandis que la sous-
expression d’Acta2 dans cette même lignée ne produit pas le même effet (Figure 17 B et C ;
Figure 17 D et E). En contraste, la surexpression de Ctso dans une lignée métastatique
augmente la formation de colonies (Figure 17 G). La surexpression d’Acta2 dans cette
même lignée réduit la formation de colonies, tel qu’anticipé (Figure 17 K). Le nombre de
colonies de l’essai 3D a été compté de façon manuelle avec l’interface « cell counter » du
logiciel Image J (Figure 18).
80
A) B16-F0-ARNi (Scramble) B) B16-F0-ARNi_586 (Ctso)
C) B16-F0-ARNi_587 (Ctso) D) B16-F0-ARNi_664 (Acta2)
81
E) B16-F0-ARNi_666 (Acta2)
F) B16-F10-pQCXIP G) B16-F10-Ctso-pQCXIP
82
H) B16-F10-CMVTRE3G I) B16-F10-CMVTRE3G
(non-induit) (induit)
J) B16-F10-Acta2-CMVTRE3G K) B16-F10-Acta2-CMVTRE3G
(non-induit) (induit)
Figure 17. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur
l’augmentation ou la diminution du nombre de colonies dans un essai de culture
cellulaire en 3D.
La sous-expression de Ctso dans les cellules B16-F0 augmente le nombre de colonies
formé (B et C) tandis que sa surexpression dans une lignée métastatique ne réduit pas le
nombre de colonies formé mais l’augmente (G). En contraste, la sous-expression d’Acta2
dans une lignée non-métastatique n’augmente pas le nombre de colonies dans la matrice de
83
fibrine (D et E). La surexpression d’Acta2 dans les B16-F10 réduit cet effet, tel qu’anticipé
(K). Les photos ont été prises avec une caméra Nikon.
A)
B)
84
C)
Figure 18. Quantification du nombre de colonies formées lors de l’évaluation des
lignées cellulaires cellulaires dans un essai de culture cellulaire en 3D
Le nombre de colonies formé lors de l’évaluation des lignées cellulaires dans un essai de
culture cellulaire en 3D a été compté avec l’interface « cell counter » du logiciel Image J.
A) La sous-expression de Ctso dans les B16-F0 réduit le nombre de colonies formé tandis
que la sous-expression d’Acta2 ne produit pas le même effet. B) La surexpression de Ctso
dans une lignée métastatique augmente le nombre de colonies formé au lieu de le réduire.
C) La surexpression d’Acta2 dans les B16-F10 produit l’effet escompté; le nombre de
colonies formé est réduit. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
85
3.2.6 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la résistance à
l’anoïkose
Par intravasation, les cellules tumorales traversent les barrières du système sanguin
et lymphatique pour circuler vers d’autres organes et tissus. Lors de cette circulation, les
cellules doivent survivre sans attachement à la matrice extracellulaire. Les cellules non-
métastatiques sont soumises à l’anoïkose, une mort cellulaire induite par la perte
d’interaction cellule/matrice extracellulaire. Cela évite le rattachement de ces cellules dans
un autre environnement. Par contre, les cellules métastatiques ont une résistance à
l’anoïkose, ce qui leur permet de se détacher de la tumeur primitive, survivre en circulation
et croitre dans un environnement différent de leur origine (Kim et al., 2012).
La résistance à l’anoïkose peut être évaluée in vitro en revêtant des plaques avec du
poly-HEMA, un hydrogel, qui empêche les cellules d’adhérer au fond du pétri. Les cellules
doivent alors survivent sans ancrage. Ainsi, cette expérience reproduit in vitro, les
conditions de survie des cellules tumorales lors de la circulation dans les vaisseaux
sanguins/lymphatiques. Cet essai de viabilité permettra de conclure si l’expression des deux
gènes cibles, Ctso et Acta2, a un effet sur la survie des cellules tumorales dans des
conditions d’indépendance d’ancrage. Il est anticipé que la sous-expression de Ctso et
d’Acta2 dans une lignée non-métastatique confère une résistance à l’anoïkose à celle-ci,
tandis que la surexpression de ces deux gènes dans une lignée métastatique devrait rendre
les cellules plus vulnérables à l’anoïkose. Par contre, la Figure 19 démontre que ni la sous-
ou surexpression de Ctso et Acta2 n’a d’effet sur la résistance à l’anoïkose dans les cellules
testées.
86
A)
B)
87
C)
88
D)
Figure 19. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la résistance
à l’anoïkose 48 heures après l’ensemencement d’un nombre précis de cellules
La Figure 19 démontre que la sous-expression de Ctso et d’Acta2 (A et B) et la
surexpression de ces derniers (C et D) n’a pas d’impact sur la résistance à l’anoïkose dans
les cellules testées. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
89
3.2.7 Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la formation et la
grosseur des colonies dans un essai de culture cellulaire en agar mou Une des caractéristiques essentielles d’un suppresseur de métastase est sa capacité à
inhiber la formation de tumeurs secondaires sans toutefois inhiber la formation de tumeurs
primaires (Steeg, 2006). Il est important alors de faire la distinction entre un suppresseur de
métastase et un suppresseur de tumeur. Cette distinction permet de classifier et d’étudier les
gènes impliqués dans le cancer dans le contexte approprié, car la dynamique de la
métastase diffère de la dynamique de la formation de tumeurs primaires.
En plus d’être un essai qui permet d’évaluer la viabilité cellulaire en absence
d’ancrage, l’essai de formation de colonies en agar mou permet aussi de visualiser la
grosseur des colonies formées. Ainsi, il est possible de mesurer in vitro la tumorigénicité
des cellules. Pour que Ctso et Acta2 soient considérés comme des suppresseurs de
métastase, la sous- ou surexpression de ces derniers ne doit pas changer la capacité des
cellules à former des tumeurs primaires (c’est-à-dire leur potentiel tumorigénique). La
Figure 20 démontre la formation de colonies des lignées cellulaires ayant une sous- ou
surexpression de Ctso et Acta2 comparativement à leurs contrôles respectifs. La Figure 21
présente la quantification de l’essai de formation de colonies. Les colonies formées ont été
comptées à l’aide de l’interface « cell counter » du logiciel Image J. Ensemble, ces deux
Figures permettent de conclure que la surexpression de Ctso et d’Acta2 n’a aucun impact
sur la formation de colonies, donc le nombre et la grosseur des colonies. En contraste, il
existe une différence entre le nombre de colonies formées dans les lignées cellulaires non-
métastatiques ayant une sous-expression d’Acta2; le nombre de colonies formées est réduit.
En contraste, aucune différence n’a été remarquée entre les lignées cellulaires ayant une
sous-expression de Ctso et leur lignée contrôle. Dans tous les cas, aucun changement
morphologique des colonies n’a été remarqué.
90
A. B16-F0-ARNi (Scramble)
B. B16-F0-ARNi_586(Ctso)
91
C. B16-F0-ARNi_587 (Ctso)
D. B16-F0-ARNi_664 (Acta2)
92
E. B16-F0-ARNi-666 (Acta2)
F. B16-F10-pQCXIP
93
G. B16-F10-Ctso-pQCXIP
H.B16-F10-CMVTRE3G (non-induit)
94
I ) B16-F10-CMVTRE3G (induit)
J ) B16-F10-Acta2-CMVTRE3G (non-induit)
95
K )B16-F10-Acta2-CMVTRE3G (induit)
Figure 20. Évaluation de l’expression différentielle de Ctso et d’Acta2 sur la formation
de colonies dans un essai de culture cellulaire en agar mou
La Figure 20 démontre que la surexpression de Ctso et d’Acta2 dans une lignée
métastatique, ainsi que la sous-expression de Ctso dans une lignée non-métastatique
n’affectent ni le nombre de colonies formé ni la morphologie en comparaison avec les
lignées cellulaires contrôles appropriées (A-C, F-K). En contraste, la sous-expression
d’Acta2 dans une lignée non-métastatique réduit le nombre de colonies formé en
comparaison avec la lignée contrôle (A, D et E). Par contre, aucune différence
morphologique n’a été remarquée dans ce cas. Les photos ont été prises avec une caméra
Nikon et un microscope Nikon, avec un objectif 10x.
96
A)
B)
97
C)
Figure 21. Quantification de la formation de colonies dans un essai de culture
cellulaire en agar mou
La sous-expression de Ctso (A) ainsi que la surexpression de Ctso (B) et d’Acta2 (C) ne
réduit ni n’augmente le nombre de colonies formées. En contraste, la sous-expression
d’Acta2 réduit le nombre de colonies formées comparativement au contrôle B16-F0-ARNi
(Scramble). Les barres d’erreurs représentent l’écart-type.
98
3.3 La localisation cellulaire de la protéine Ctso murine
3.3.1 Évaluation de la localisation cellulaire de la protéine Ctso : Ctso est secrétée à
l’extérieur de la cellule
Les cathepsines sont des protéines intracellulaires localisées dans les lysosomes.
Elles sont impliquées, entre autres, dans la dégradation de protéines. Par contre, dans
certaines maladies, les cathepsines peuvent avoir une fonction et localisation extracellulaire
(Voir section 1.6.2 Ctso : une protéine sécrétée?). La cathepsine K joue un rôle
antibactérien et anti-inflammatoire chez les souris lorsque secrétée tandis que la cathepsine
L secrétée joue un rôle dans l’invasion lors de la métastase (Sina et al., 2012, Hashimoto et
al., 2006). Ainsi, la localisation de Ctso permettra d’explorer sa fonction non seulement
comme cathepsine, mais aussi son impact comme suppresseur de métastase.
Dans cette expérience, la localisation de Ctso a été évaluée grâce à une transfection
transitoire de Ctso ayant un épitope HA dans la lignée non-métastatique B16-F0. La Figure
22 démontre que la protéine Ctso est retrouvée dans le milieu extracellulaire des cellules
B16-F0. La tubuline a servi de contrôle interne pour s’assurer que la même quantité de
protéines totales a été chargée.
99
Figure 22. Évaluation de la localisation cellulaire de la protéine Ctso murine
Un immunobuvardage avec des extraits protéiques de cellules B16-F0 transfectées avec le
vecteur Ctso-HA-pQCXIP et le contrôle pQCXIP ainsi que leur milieu de culture démontre
que Ctso est secrétée chez les cellules B16-F0. Le milieu de culture DMEM complet a été
utilisé comme contrôle pour démontrer que l’épitope HA ne détecte rien dans le milieu de
culture. Ainsi, la détection du épitope HA est due uniquement à la surexpression du vecteur
Ctso-HA-pQCXIP. L’abondance de la protéine Ctso dans le milieu de culture suggère
qu’elle joue son rôle de suppresseur de métastase (du moins en partie) à l’extérieur de la
cellule. Un anticorps primaire anti-HA (Santa-Cruz, dilution 1:5000) et un anticorps
secondaire anti-souris (dilution 1:20 000) ont été utilisées.
Chapitre 4 Discussion
Ctso et Acta2 sont deux gènes qui ont été identifiés, parmi 22, comme candidats
suppresseurs de métastase du mélanome grâce à un criblage pan génomique, via des petits
ARNs interférents, réalisé par le Dr. Gobeil et ses collègues (Gobeil et al., 2008). La
métastase étant la principale cause de décès chez les individus atteints de tumeurs solides,
la découverte de ces gènes est prometteuse. La capacité de bloquer une ou plusieurs étapes
de la métastase, inhibant ainsi la progression de cette maladie, a non seulement des
applications thérapeutiques mais aussi des applications en recherche fondamentale. La
caractérisation des gènes suppresseurs de métastase pourra aider à élucider les bases
moléculaires de la métastase.
Ctso et Acta2 ont été choisis pour être caractérisés à cause de leur sous-expression
chez plusieurs cancers métastatiques (Gobeil et al., 2008). La caractérisation de ces gènes
permettra d’explorer leur rôle dans la cascade métastatique. Sachant que les cellules
cancéreuses acquirent certains des traits métastatiques lors de la métastase, des expériences
ont été conçues pour étudier le rôle de Ctso et d’Acta2 dans la cascade métastatique. Des
études de perte et gain de fonction explorent le rôle de ces deux gènes dans la prolifération,
l’adhésion, la migration, l’anoïkose et l’invasion. La capacité à former des colonies via un
essai de formation de colonies en agar mou a aussi été explorée, afin de démontrer que Ctso
et Acta2 sont des suppresseurs de métastase, et non des suppresseurs de tumorigénèse.
Le premier objectif de ce projet consistait à sous- et surexprimé Ctso et Acta2 dans
les cellules de mélanome murin. Cela a été accompli grâce à des petits ARNs interférents
ainsi qu’à des vecteurs d’expression. Des virus produits avec ces vecteurs ont permis de
créer des lignées cellulaires stables, sous- ou surexprimant Ctso et Acta2, selon le cas. Ces
deux gènes ont été sous-exprimés dans une lignée murine non-métastatique, les B16-F0.
101
Deux ARN interférents ont été utilisés pour chaque gène ainsi qu’un contrôle Scramble. Il
est important d’utiliser deux ou plusieurs ARNs interférents lors des études fonctionnelles
de perte de fonction, car cela permet de distinguer entre des traits dus à la sous-expression
d’un certain gène et des traits dus à des effets hors-cibles. Bien que les petits ARNs
interférents aient été conçus pour avoir une spécificité envers un gène en particulier,
plusieurs études démontrent que le rôle de ces petits ARNs interférents ne serait pas aussi
clair que prévu (Jackson et al., 2003; Saxena et al., 2003). Ainsi, des phénotypes similaires
causés par deux ou plusieurs petits ARNs interférents permettent de conclure que l’effet
produit est causé bel et bien par la sous-expression du gène ciblé. Il est aussi important
d’utiliser un contrôle Scramble, un petit ARN interfèrent ayant une séquence brouillée, ne
ciblant aucun gène. Ceci est pour réduire l’incertitude que le phénotype produit par les
petits ARNs interférents est causé par le mécanisme d’ARN interférence lui-même. Ainsi,
le petit ARN interférent Scramble sert comme contrôle négatif. La surexpression de Ctso et
d’Acta2 a été accomplie dans une lignée murine métastatique, les B16-F10. Pour la
surexpression de ces deux gènes, leurs séquences codantes ont été clonées dans des
vecteurs d’expression. Les vecteurs sans la séquence de ces gènes ont servi de contrôle.
Dans le cas d’Acta2, des contrôles non-induits à la doxycyline ont aussi été inclus. Par PCR
quantitative, la sous- et surexpression de Ctso et d’Acta2 a été évaluée. La Figure 10A
démontre que l’expression de Ctso et d’Acta2 a été réduite de plus de 40% dans les cellules
B16-F0 comparée au contrôle Scramble tandis que la Figure 10B démontre que
l’expression de Ctso a été augmentée d’environ 800 fois dans les cellules B16-F10 par
rapport au contrôle pQCXIP. Dans le cas d’Acta2, son expression a été induite de près de
2000 fois chez les cellules B16-F10 comparativement aux contrôles (induit et non-induit)
(Figure 10C). Ainsi, dans tous les cas, il est possible de conclure que les gènes Ctso et
Acta2 ont été sous- et surexprimés. Par contre, il est important de noter que ces deux gènes
sont probablement surexprimés à des niveaux non-physiologiques. Les résultats obtenus
dans les études de perte et de gain de fonction pourraient alors être causés par une trop
grande production de protéines. Il est possible de contourner ce problème en clonant les
gènes dans des vecteurs inductibles, tel que dans le cas de la surexpression d’Acta2, ou
dans des vecteurs à faible expression. Ainsi, il est possible de réduire la quantité de
protéines produites pour la ramener à un niveau physiologique. Cependant, il est impossible
102
de prédire avec certitude si une surexpression à un niveaux physiologique permet de
visualiser un effet marquant in vitro. L’acquisition de nouveaux traits, des changements
morphologiques et des changements de propriétés physiques de la cellule ne seraient peut-
être pas aussi marquantes. La surexpression des gènes ciblés, même à des niveaux non-
physiologiques, reste toujours un outil important car cela permet d’avoir un aperçu de la
fonction des gènes in vivo et dans ce cas-ci, de l’implication des gènes cibles dans la
cascade métastatique.
Il est important de valider l’expression des protéines Ctso et Acta2, suite à la sous-
expression. Bien que la corrélation entre la quantité d’ARN messager et la quantité de
protéine produite est généralement linéaire, il existe des cas où la diminution d’un ARN
messager ne corrèle pas avec la réduction de la protéine codée par cette ARN messager, par
exemple lorsque la protéine ciblée à une demi-vie très longue. Dans le cas de Ctso, étant
une protéine très peu étudiée, l’expression protéique n’a pas pu être validée par manque
d’un d’anticorps murin spécifique contre ce gène sur le marché. Ainsi, il faut présumer
qu’une diminution de l’ARN messager de Ctso corrèle avec une diminution de la protéine
Ctso. La Figure 11 démontre que les deux lignées cellulaires dont la sous-expression a été
validée par qPCR, B16-F0-ARNi_664 (Acta2) et B16-F0-ARNi_666 (Acta2), ont aussi une
baisse d’expression de la protéine Acta2, comparée à la lignée murine non-métastatique
ayant été infectée avec le virus produit à partir de l’ARNi Scramble. Ainsi, il est possible de
conclure, par qPCR et immunobuvardage, que l’expression d’Acta2 est bien réduite dans
les cellules B16-F0 suite à l’ARNi.
Des expériences de perte et de gain de fonction ont été accomplies avec des lignées
cellulaires ayant une sous- et surexpression de Ctso et d’Acta2. Les résultats démontrent
que l’expression différentielle de ces deux gènes n’a aucun impact sur la prolifération et la
résistance à l’anoïkose (Figure 12 et Figure 19). Dans le cas de la prolifération des cellules
B16-F10 ayant une surexpression de Ctso, si l’expérience avait été prolongée pendant plus
de 3 jours, une différence plus significative aurait peut-être été remarquée entre la lignée
103
contrôle et la lignée ayant une surexpression de Ctso (Figure 12C). Ces résultats suggèrent
que Ctso et Acta2 ne sont pas impliqués dans ces étapes de la métastase dans le modèle
testé.
En contraste, Ctso et Acta2 jouent un rôle lors de l’adhésion des cellules tel que
remarqué par l’essai de la morphologie de propagation ainsi que l’essai d’adhésion (Figure
13 et 15). L’adhésion cellulaire permet de créer des liens entre la cellule et la matrice
extracellulaire. Ce lien est rompu chez les cellules métastatiques et ceci permet la
dissémination de ces cellules. Cette dissémination s’avère désastreuse car elle permet la
propagation des cellules cancéreuses vers d’autres tissus et organes. La perte d’adhésion est
une des caractéristiques de la transition épithélio-mésenchymateuse, un processus souvent
accusé pour la genèse de la métastase. Ainsi, si Ctso et Acta2 jouent un rôle lors de
l’adhésion cellulaire, on suppose que leur sous-expression dans une lignée non-
métastatique conférera une perte d’adhésion tandis que leur surexpression dans une ligne
métastatique induira une hausse de l’adhésion cellulaire. Par contre, il a été démontré que la
sous-expression de Ctso et d’Acta2 ne confère pas une perte d’adhésion aux cellules B16-
F0, en comparaison avec la lignée contrôle, B16-F10-ARNi (Scramble) (Figure 14A et B).
Aucun changement de morphologie de propagation n’a été remarqué chez les lignées
cellulaires ayant une sous-expression de Ctso et d’Acta2 (Figure 13A-E). En contraste, les
cellules ayant une surexpression de ces deux gènes démontrent une morphologie étalée
comparée à la lignée métastatique B16-F10 (Figure 13F-K). Il est possible de suggérer que
la perte d’adhésion dans une lignée non-métastatique tel que les B16-F0 implique d’autres
facteurs, tels qu’une perte d’expression d’intégrines et de la E-cadhérine. Ainsi, la sous-
expression de Ctso et Acta2 ne suffirait pas pour induire une perte d’adhésion.
En contraste, la surexpression de Ctso et Acta2 dans une lignée métastatique
démontrent une hausse d’adhésion (Figure 14 C et D). Bien que le rôle des cathepsines dans
l’adhésion soit moins évident que le rôle des actines dans ce même processus, plusieurs
études démontrent l’implication de cathepsines lors de l’adhésion telle que les cathepsines
104
X et G, possiblement par une réorganisation du cytosquelette (Kos et al., 2009; Raptis et
al., 2006). Par contre, le rôle de Ctso dans un tel processus n’a pas encore été confirmé et
étant une protéine très peu étudiée, des études plus détaillées doivent être accomplies pour
déterminer le rôle précis de Ctso dans l’adhésion. Dans le cas d’Acta2, cette isoforme
d’actine a été démontrée comme essentielle à l’adhésion focale, les adhésions focales étant
des sites liant la cellule à la matrice extracellulaire (Hinz et al., 2003; Goffin et al., 2006 ;
Berginski et al., 2011). Ceci laisse à spéculer le rôle d’Acta2 dans la métastase et son
impact sur l’adhésion des cellules tumorales.
Ainsi, la surexpression de Ctso et d’Acta2 dans une lignée métastatique induit une
hausse d’adhésion dans le modèle étudié. Par contre, tel que déjà discuté, Ctso et Acta2 sont
surexprimés dans les B16-F10 à des niveaux élevés et potentiellement non-physiologiques.
L’effet de ces deux gènes sur l’adhésion pourrait donc être artificiel.
Bien que la perte d’adhésion soit un trait important lors de la progression de la
métastase, la hausse d’une capacité de migration permet aux cellules tumorales de se
mouvoir de leur site d’origine vers d’autres sites. Ainsi, si Ctso et Acta2 jouent un rôle lors
de la migration, leur sous-expression dans les B16-F0 doit induire les cellules tumorales à
acquérir une plus grande capacité de migration, un trait vital des cellules métastatiques.
Ainsi, l’essai de migration démontre que la sous-expression de Ctso et Acta2 dans les B16-
F0 augmente la capacité de ces cellules à migrer (Figure 15A-E, Figure 16A). La migration
cellulaire lors de la métastase peut être causée par la perte de polarité cellulaire. Lors de la
transition épithélio-mésenchymateuse, les cellules perdent leur polarité apico-basale,
remplacée par une multi-polarité. Cette polarité peut conférer aux cellules une plus grande
capacité migratoire. Dans le cas des cathepsines, les cathepsines L et S sont capables
d’augmenter la capacité de migration cellulaire (Yang et Cox, 2007; Yang, 2010). Par
contre, très peu d’études démontrent que les cathepsines seraient capables d’inhiber la
migration. Néanmoins, il est impossible de présumer que toutes les protéases accroissent la
capacité de migration. Certaines protéases peuvent influencer la production d’angiostatin,
105
une protéine générée par le clivage du plasminogène, étant capable non seulement d’inhiber
la vascularisation (angiogenèse) mais aussi la migration cellulaire (Cornelius et al., 1998;
O’Reilly et al., 1994; Yang et al., 2006). Ainsi, il est fort possible que Ctso puisse aussi
inhiber la migration par un tel processus. La migration cellulaire est aussi contrôlée par la
balance entre la polymérisation et dépolymérisation des filaments d’actine (Pollard et
Borisy, 2003). Il est possible de suggérer qu’Acta2 puisse réguler la polymérisation et la
dépolymérisation des filaments d’actine, de façon directe ou indirecte. Cela expliquerait
pourquoi la sous-expression d’Acta2 induit une hausse de la motilité cellulaire tandis
qu’une surexpression la réduit (Figure 15D, E, K, Figure 16A et C). Il est possible
d’observer ici que, malgré une meilleure sous-expression du petit ARN interférent 664 par
rapport au petit ARN interférent 666 (voir Figure 10), la migration des cellules ayant été
infectées avec le petit ARN interférent 664 est plus ralentie par rapport à celles infectées
avec le petit ARN interférent 666 (voir Figure 15D et E). Il est possible de suggérer que
l’expression d’Acta2 joue un rôle dans la migration et une trop grande sous-expression de
ce gène réduit la migration. LATS1 (Large Tumor Suppressor homolog 1), par exemple, un
suppresseur de tumeur, a la capacité de réguler de façon négative la polymérisation d’actine
(Visser-Grieve et al., 2011). En effet, la surexpression d’Acta2 dans une lignée
métastatique démontre une réduction de la capacité de migration (Figure 15K, Figure 16C).
En contraste la surexpression de Ctso dans les B16-F10 ne provoque ni une hausse ni une
basse de la capacité de migration comparée au contrôle (Figure 15F, G, Figure 16B).
La migration cellulaire est intimement liée à l’invasion. Bien que les mécanismes de
motilité cellulaire et d’invasion diffèrent, la collaboration entre la motilité cellulaire et
l’invasion permet aux cellules tumorales de se rendre jusqu’aux vaisseaux du système
sanguin/lymphatique et lors de l’extravasation, jusqu'à l’intérieur des organes/tissus à
coloniser. Ainsi, l’invasion représente une des étapes clés de la métastase. Si Ctso et Acta2
jouent un rôle lors de cette étape cruciale de la métastase, leur sous-expression dans une
lignée métastatique devrait hausser la capacité d’invasion. Une expérience de culture
cellulaire en 3D démontre que la sous-expression de Ctso dans les B16-F0 aide les cellules
tumorales à migrer et envahir, permettant à ces dernières de survivre dans la matrice de
106
fibrine, formant ainsi plus de colonies comparativement au contrôle (Figure 17A, B, C,
Figure 18A). Ainsi, une expérience de culture cellulaire en 3D permet de visualiser le
nombre de colonies formées. Par contre, malgré le fait que cette expérience surveille la
migration, l’invasion et la survie/croissance dans la fibrine, il est impossible de déterminer
lequel ou lesquels de ces paramètres est/sont affectés. Les résultats obtenus des autres
études fonctionnelles suggèrent que la migration et/ou l’invasion soient responsables pour
l’augmentation du nombre de colonies plutôt qu’un changement au niveau de la
survie/croissance dans la matrice de fibrine, car l’expression différentielle de Ctso et Acta2
ne semble pas avoir d’effet sur le cycle cellulaire et la résistance à l’anoïkose (voir Figure
12).
Bien que plusieurs cathepsines aient gagné une réputation négative en étant
impliquées dans l’invasion, des études démontrent que l’ablation complète de certaines
d’elles peut inhiber l’invasion des tumeurs (Gocheva et al., 2005). De plus, plusieurs
protéases, tel PRSS8 (prostasin), ont démontré une capacité à réduire l’invasion. La perte
de PRRS8 peut promouvoir la transition épithélio-mésenchymateuse, ce qui confère des
traits invasifs aux cellules tumorales (Chen et al., 2009). Il est donc possible de suggérer
que la perte de Ctso puisse aussi avoir un rôle similaire dans la promotion de l’invasion. En
contraste, la sous-expression d’Acta2 démontre très peu de différences dans le nombre de
colonies formé en comparaison au contrôle dans un essai en culture cellulaire en 3D (Figure
17A, D, E et Figure 18A). Bien que la diminution de l’expression protéique d’Acta2 ait
aussi été validée, il est possible de suggérer que dans ce cas-ci, la sous-expression d’Acta2
ait été inefficace pour induire l’invasion. Par contre, il est important de trouver un juste
milieu: certaines protéines, telle que l’actine, sont essentielles pour le bon fonctionnement
de la cellule. Ainsi, une trop grande sous-expression d’Acta2 pourrait aussi s’avérer
inefficace pour promouvoir l’invasion. En revanche, la surexpression d’Acta2 dans une
lignée métastatique démontre une réduction du nombre de colonies formées dans la matrice
de fibrine. Comme pour la migration, Acta2 pourrait avoir un rôle dans la régulation de la
polymérisation des filaments d’actine. Dans le cas de la surexpression de Ctso dans une
lignée métastatique, il a été démontré que sa surexpression augmente soit l’invasion, la
107
migration et/ou la survie/croissance des cellules tumorales dans la matrice de fibrine, en
comparaison avec son contrôle. Bien que ce comportement corrèle avec celui de plusieurs
cathepsines, qui surexprimées, promouvaient l’invasion, il est important de se rappeler que
Ctso est un candidat potentiel suppresseur de métastase, en contraste avec d’autres qui
elles, sont impliquées dans la métastase, telle que la cathepsine Z (Wang et al., 2011). En
même temps, il est faux de présumer que la surexpression d’un suppresseur de métastase
dans une lignée métastatique doit nécessairement réduire l’invasion, la migration et la
viabilité cellulaire tumorale même si la sous-expression de ce gène dans une lignée non-
métastatique montre un effet. La métastase est un processus hautement évolué; la
surexpression d’un seul gène n’est peut-être pas suffisant pour inhiber l’invasion.
L’essai de formation de colonies en agar mou a pour but de quantifier et qualifier la
formation de colonies après un traitement ou une altération d’expression d’un gène. Dans
ce cas-ci, l’essai de formation de colonies permet de conclure si l’expression différentielle
de Ctso et d’Acta2 a un effet sur le nombre de colonies formé ainsi que la grosseur des
colonies formée, deux indicateurs du potentiel tumoral. Ctso et Acta2 sont des candidats
suppresseurs de métastase, et non des suppresseurs de tumeur. Cette distinction réside dans
le fait qu’un suppresseur de métastase ne doit pas inhiber la formation de colonies
tumorales primaires. Ainsi, la sous- ou surexpression de Ctso et Acta2 ne devrait pas
réduire ou augmenter le nombre de colonies formé dans un essai de formation de colonies
en agar mou, comparativement à leur contrôle respectif, ce qui fut le cas pour Ctso (Figure
20A-C, F, G, Figure 21A et B ). Dans les cas de la sous-expression d’Acta2 dans les B16-
F0, le nombre de colonies fut réduit comparé à la lignée contrôle B16-F0-ARNi (Scramble)
(Figure 20A, D, E, et Figure 21A) en contraste avec la surexpression d’Acta2 (Figure 20H-
K, Figure 21C). Dans tous les cas, aucun changement morphologique n’a été remarqué,
c’est-à-dire que la grosseur des colonies issues des sous- et surexpressions de Ctso et
d’Acta2 ressemblait à leur lignée cellulaire contrôle respective. Parce que l’expression
différentielle de Ctso n’affecte pas la tumorigénicité, il est possible de conclure que Ctso
est un potentiel suppresseur de métastase. Par contre, l’expression différentielle d’Acta2 a
108
un impact sur la tumorigénicité. Ceci peut être dû au fait que la sous-expression d’Acta2 a
été inefficace.
Dernièrement, la localisation cellulaire de la protéine Ctso a été explorée. Ainsi,
Ctso a été surexprimée via une transfection transitoire dans la lignée B16-F0. La Figure 18
démontre que Ctso est secrétée à l’extérieur de cette lignée cellulaire. L’exploration de la
localisation de Ctso est importante, car elle permet d’avoir un aperçue de la fonction
possible de Ctso dans la métastase. Cette localisation permet de suggérer que Ctso puisse
avoir un substrat et une fonction extracellulaire. La cathepsine B secrétée, par exemple,
induit l’apoptose dans les neurones (Kingham et Pocock, 2001).
Chapitre 5 Conclusion et perspectives
Les bases moléculaires de la métastase sont peu comprises. Pourtant, près de 90 %
des décès liés à des tumeurs solides peuvent être attribués aux complications de la
métastase (Siegel et al., 2012). Les suppresseurs de métastase, une catégorie de gènes ayant
le potentiel d’inhiber la métastase sans toutefois inhiber la formation de tumeurs primaires,
présentent un nouvel espoir dans la lutte contre la métastase. Depuis la découverte du
premier suppresseur de métastase, la possibilité d’existence d’autres gènes a été explorée.
En 2008, le Dr. Gobeil et ses collègues ont identifié 22 gènes ayant potentiellement un rôle
de suppresseur de métastase. Parmi ces 22 gènes, Ctso et Acta2 ont été choisi dans le but de
les caractériser. Ainsi, leur caractérisation permettra d’élucider non seulement le rôle de ces
gènes dans la métastase, mais aussi les bases moléculaires de la métastase.
Les expériences présentées, conçues pour étudier certaines étapes importantes de la
métastase, démontrent que Ctso et Acta2 pourraient jouer un rôle sur une ou plusieurs
étapes de la cascade métastatique. Selon certains résultats, ces deux gènes seraient
impliqués dans l’adhésion et la migration. Un essai de culture cellulaire en 3D suggère que
Ctso et Acta2 pourraient aussi influencer les capacités d’invasion et la survie/croissance
cellulaire. Finalement, les évidences expérimentales présentées démontrent que la protéine
Ctso est secrétée par les cellules de mélanome testées.
Il est important maintenant d’explorer le rôle de ces deux gènes en détail. Pourquoi
la sous-expression de Ctso et d’Acta2 peut-elle conférer une hausse de motilité cellulaire?
Quelles sont les voies de signalisation que ces deux gènes influencent lors de la métastase?
Quel(s) est/sont le(s) substrat(s) de Ctso et sa fonction extracellulaire? Ce ne sont que
quelques questions parmi plusieurs à explorer. De plus, il est insuffisant d’étudier le rôle de
Ctso et d’Acta2 dans une seule lignée cellulaire de mélanome. Ainsi, le rôle de ces deux
110
gènes doit être certifié dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses, incluant des lignées
cellulaires humaines. Il est aussi important de conduire des tests d’immunohistochimie pour
déterminer l’expression de ces protéines et de réaliser des PCR quantitatives pour estimer
l’expression génique de CTSO et d’ACTA2 dans plusieurs tissus, métastatiques et non-
métastatiques, afin de confirmer le rôle de ces gènes dans la métastase chez l’humain.
Chapitre 6 Bibliographie Abbasi, N.R., et al.«Early diagnosis of cutaneous melanoma: revisiting the ABCD criteria.» JAMA, 2004: 2771-2776. Aguirre-Ghiso, Julio A. «Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.» Nature Reviews Cancer, 2007: 834-846. Albelda, S.M. «Role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis.» Lab Invest 68, n° 1 (1993): 4-17. Bair ,E.L., et al.«Membrane type 1 matrix metalloprotease cleaves laminin-10 and promotes prostate cancer cell migration.» Neoplasia 7, n° 4 (2005): 380-389. Bandarchi ,B., et al. «Molecular biology of normal melanocytes and melanoma cells.» J Clin Pathol., 2013. Bello, I.O., et al.«Alpha-smooth muscle actin within epithilial islands is predictive of ameloblastic carcinoma.» Oral Oncol 45, n° 9 (2009): 760-765. Bergeron, S.E., et al. «Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function.» J Biol Chem 286, n° 13 (2011): 11356-11369. Berginski, Mathew E., et al. «High-Resolution Quantification of Focal Adhesion Spatiotemporal Dynamics in Living Cells.» PLoS ONE 6, n° 7 (2011). Bestak, R. et G.M. Halliday. «Sunscreens protect from UV-promoted squamous cell carcinoma in mice chronically irradiated with doses of UV radiation insufficient to cause edema.» Photochem Photobiol, 1996: 188-193. Betticher, D. C., et al. «G1 control gene status is frequently altered in resectable non-small cell lung cancer.» Int J Cancer 74, n° 5 (1997): 556-562. Bradbury, P. et al. «Occupy tissue: The movement in cancer metastasis.» Cell adhesion & migration 6, n° 5 (2012). Cailhier, J.F., et al. «Caspase-3 activation triggers extracellular cathepsin L release and endorepellin proteolysis.» J Biol Chem 283, n° 40 (2008): 27220-27229.
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