Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes Les Îlots de pathogénicités (PAI) Denis Dacheux-Deschamps

Le système de sécrétion de type III (TTSS)

chez les bactéries pathogènes

Les Îlots de pathogénicités(PAI)

Denis Dacheux-Deschamps

Les Îlots de pathogénicités(PAI)

Le monde bactérienLe monde bactérien

• 5000 espèces de bactéries décrites,

• 200 000 à 500 000 espèces bactériennes estimées,

• 200 sont pathogènes pour l’Homme.

• séquençage exponentiel des génomes de Bactéries pathogènes ou non

• Transferts de gènes via la conjugaison, la transduction et la transformation.

• Génome bactérien : « partie centrale (cœur) et partie flexible »

Génome procaryoteGénome procaryote

Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

Genomic IslandsGenomic Islands


> 10kb

PAI

Genomic IslandsGenomic Islands

Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.


int : gènes d’intégrase ; vir : gènes de virulence ; mob : gènes de mobilisation

• E. coli puis nombreuses bactéries Gram + ou Gram – (pathogènes de plantes ou animaux)

• 10 à 200 kb, % G+C différent, extra- ou intrachromosomique, PAI absent chez les bactéries non pathogènes de la même espèce

Îlots de Patogènicité (PAI)Îlots de Patogènicité (PAI)

int virA virB virC mobA ∆mobB

Pathogène

Non-PathogènetRNA

Fonctions associés aux PAIFonctions associés aux PAI


Gènes de virulence associés aux PAIGènes de virulence associés aux PAIAdhésines ex : intimine adhérence intestinale pour EPEC/EHEC (attachement effacement)

Système de sécrétion Principalement le SS de type III (TTSS) et le type IV

Invasines, modulinesEx : Salmonella 5 PAI (SPI) SPI-1 invasion C. épithéliales

SPI-2 intracellulaire prolifération

SPI-3&-4 intramacrophage survie

SPI-5 inflammation et sécrétions intestinales

ToxinesPore forming : hémolysine (UPEC), listériolysine O (Listéria sp)Protéase, lipase, enterotoxine, ADP ribosilation (prot G)Superantigène

Système capture du fer Récepteur au fer : sidérophores (yersiniabactine…)

Autres Résistance sérum, apoptose, IgA protéase, gènes inconnus

Régulation des PAIRégulation des PAI

• Gènes de régulation codés par le PIA ou extérieur :

Activateur de transcription type AraC (TTSS ExsA ; VirF 37°C Yersinia)

Régulateur de réponse à deux composants (PhoP/PhoQ, Mg 2+, SPI-1)

Facteur sigma

Histones

+

Sites intégrations des PAISites intégrations des PAI

• 75% des PAI insérés en 3’ des ARNt

• DR: direct repeat 9-135 pb parfois similaire au site att des phages ou IS (élément d’insertion)

DR DR

Intérêt des tRNAIntérêt des tRNA

• Plusieurs copies du gène ARNt

• selC ARNt (selenocystéine) le plus ciblés

• Utilise souvent le promoteur

• Gène ARNt non indispensable (ex selC ARNt)

• Insertion ancestrale des phages ou plasmides

Mobilité des PAIMobilité des PAI

• Intégrase, recombinase généralement codées par le PAI

• Souvent par transduction (lors d’infection) (supposé)

• Intra-chromosomique (Yersinia), Intra-espèce, Inter-espèce (supposé)

• perte mobilité (mutation, délétion) ….Évolution

Évolution des PAIÉvolution des PAI


Le système de sécrétion de type III (TTSS)

chez les bactéries pathogènes

Les facteurs de virulence bactérienneLes facteurs de virulence bactérienne

AntibiotiquesPhagocytose

ExopolysaccharideAdhésion cellulaire

Flagelle

PiliSurvie et multiplication

dans l’hôte

Type III

PhospholipaseElastase

Type II

Exotoxine ...

Systèmes de sécrétions protéiques

Type I

Protéase alcaline ...

Type IV

CagA... Plasmide Ti

Type VAuto-tranporteur

Les différents systèmes de sécrétion des bactériesLes différents systèmes de sécrétion des bactériesGram-négativesGram-négatives

• Nombreuses protéines bactériennes sécrétées, d’activités diverses dont des facteurs de virulence.

• Type I à V (I et III sec indépendant)

Exportation, sécrétion, translocation

Le système de sécrétion de type IIILe système de sécrétion de type III(TTSS)(TTSS)

Injection dans le cytoplasme de la cellules Eucaryotes (Translocation) de protéines bactériennes toxiques.

Contact physique Cellules - Bactéries

Toxines injectées homologues à des protéines Eucaryotesagissant sur les voies de signalisation.

La sécrétion de type III chez les bactériesLa sécrétion de type III chez les bactéries Gram-négativesGram-négatives

Pseudomonas syringae, Erwinia spp., Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Rihzobium spp.

Phyto-Pathogènes :

Identifiée chez de plus en plus de bactéries pathogènes

Pathogènes d’animaux :

Intracellulaire

Extracellulaire

Burkholderia

Yersinia

YopP/J

YopE

YopT

YopH

YopM

P. aeruginosaExoT

ExoS

ExoY

ExoU

d’actined’actineCytosqueletteCytosquelette

MAP Kinase

InflammationInflammation

EPEC

TirEspB

SipBSipC

SopB

SipA

SopESalmonella

La sécrétion de type III chez les pathogènes animauxLa sécrétion de type III chez les pathogènes animaux

IpaA

IpaBShigella

Intracellulaire Extracellulaire

Bortedella

BopC

Mort Mort cellulairecellulaire

Caspases

NF-kB

Complexe isolé

(Kubori et al., 1998, Science)

Isolation du système de sécrétion de type IIIIsolation du système de sécrétion de type III

Structure du complexe inséré dans la paroi bactérienne

(Sukhan et al., 2001, J. Bac)

Purification du complexePurification du complexe(« seringue + aiguille = Injectiosome »Injectiosome »)

(Kimbrough et Miller 2000, PNAS)

(Blocker et al., 2001, Mol. Mic)

Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium

Shigella flexneriShigella flexneri

schemaschema

Yersinia enterocoliticaYersinia enterocolitica

(Cornelis 2002, Nature)

(Cornelis 2002, Nature)

Diversité des systèmes de sécrétion de type III bactériensDiversité des systèmes de sécrétion de type III bactériens

nm

nm

nm

Structure de l’appareil de sécrétion de type IIIStructure de l’appareil de sécrétion de type III« Injectiosome »« Injectiosome »

à 4 nm

Appareil de translocation« Translocateur »

Appareil de sécrétion

Membranes bactérienne

Cytoplasme bactérien

Effecteurs toxiques type III

Organisation génétique des gènes codant l’appareil du TTSSOrganisation génétique des gènes codant l’appareil du TTSS

• Gènes regroupés en « cluster » ou « îlot de pathogénicité » (PAI).

• Cluster de gènes présent soit sur le chromosome bactérienex: S. typhymurium, P. aeruginosa, EPEC

soit sur un plasmideex: S. flexneri

soit sur les deuxex: Yersinia spp.

• Souches non pathogènes ne possèdent pas ces PAI.

• Gènes organisés sous la forme d’opérons.

• Gènes de structure du TTSS très conservés entre différents pathogènes.

Gènes codant l’appareil du TTSS (15 à 20 gènes)Gènes codant l’appareil du TTSS (15 à 20 gènes)

Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

An

imau

xV

égét

aux

Modèle d’assemblage du complexe TTSSModèle d’assemblage du complexe TTSS

Galan, 2001 Annu. Rev.Cell. Dev. Biol.

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Marlovits, 2006 Nature

(Calvin et al 2005, Nature)

Caractérisation structurale de la base du TSSCaractérisation structurale de la base du TSS

EscJ(EPEC)

Gènes codant les effecteurs bactériens injectésGènes codant les effecteurs bactériens injectés

- sur plasmide de virulence associés aux gènes du TTSS.- ou dispersés sur le chromosome

• Gènes localisés à l'extérieur des clusters:

• Co-régulation transcriptionnelle avec les gènes de l’appareil du TTSS.

• Protéines variant en taille, structure et fonction et espèces-spécifiques.

• Certains domaines des effecteurs sont homologues entre différentes bactéries.

• Effecteurs possédant des activités eucaryotes. (origine eucaryote)

Fonctionnement du TTSSFonctionnement du TTSS

1. Appareil de sécrétion exprimé à la surface de la bactérie en position fermée par protéines.

2. Contact avec membrane cellule eucaryote, ouverture du canal, (position ouverte).

3. Sécrétion protéines du translocateur, par la canal s’insérant dans la membrane eucaryote (pore). Communication entre cytoplasmes bactérien et eucaryote.

4. Translocation des effecteurs protéiques dans la cellule cible.

Modèle générale du TTSSModèle générale du TTSS

Blocker et al., 2000 Mol. Micro.

Exemple de Modèle du TTSS chez Exemple de Modèle du TTSS chez YersiniaYersinia spp. spp.

(Cornelis 2002, J.C.B.)

Régulation transcriptionnelle des gènes du TTSSRégulation transcriptionnelle des gènes du TTSS

• Activateur transcriptionnel commun de type AraC, actif sur tous les opérons et gènes du TTSS (effecteur et structure).

• Régulateurs de réponse à deux composants espèce-spécifique.


Exemple de régulation transcriptionnelle Exemple de régulation transcriptionnelle

P. aeruginosapsc pop

exo

exs C B A

ExsA+

+

+

S. flexneri

Yersinia spp.

exsD

-

Signaux d’activation transcriptionnelleSignaux d’activation transcriptionnellein vitro in vitro

• Température : induction à 37°C (Yersinia, Shigella)

• Osmolarité (Shigella, Pseudomonas, Salmonella)

• pH : répression si inférieur à 7-8 (Shigella) activation si acide (Salmonella)

• Phosphate : (Salmonella)

• Oxygène : (Salmonella)

• Calcium/ Magnésium : répression (Yersinia, Pseudomonas, Salmonella )

Signaux d’activation transcriptionnelleSignaux d’activation transcriptionnelleex vivo / in vivoex vivo / in vivo

Contact cellule-bactérie

Pettersson et al, 1997 Science

Y. pseudotuberculosis / HeLa

Signal de sécrétion des effecteurs Signal de sécrétion des effecteurs via le complexe TTSS via le complexe TTSS

-15er AA Nter suffisant pour certaines protéines (ex: YopN) -pas séquence signal identifiée mais structure sur ARNm incluant AUG.

Nter Cter

1 15 AA

• Modèle ARNm

-15ème au 100ème AA Nter reconnu par une protéine chaperonne. (ex YopE et SycE).

100

• Modèle des chaperonnes

Les deux modèles de sécrétionLes deux modèles de sécrétion

Ribosome

ARNm yop

Répresseur traductionnel yop

Récepteur ribosome

Chaperonne Syc

Protéine de fermeture

Récepteur chaperonne

Polypeptide yop

Andersonet al, 1999 Trends Micro.

Les protéines chaperonnesLes protéines chaperonnes

14 kDa

pHi acide (4,4 à 5,2)

Nter Cter

• séquence putative AA reconnue.

• à proximité du gènes de l’effecteur à fixer.

• Non présentes pour tous les effecteurs à transloquer.

• maintiennent conformation (non active) de l’effecteur, indispensable à la sécrétion.

hélice amphiphile

Fixation Protéine effectrice

La translocationLa translocation

Signal in vivo : contact Cellules / Bactérie

Cellule cible

Bactérie

Contact Activation de la sécrétion de type III

PseudomonasPseudomonas et et YersiniaYersinia

effecteurs inductibles (répression avant contact) Translocation directionnelle

Salmonella Salmonella (SP-1)(SP-1) et et ShigellaShigella

effecteurs accumulés avant contact Translocation

non directionnelle

Schlumberger et al, 2005 PNAS.

= non invasive = SPI-1 TTSS-

Schlumberger et al, 2005 PNAS.

Start 10-90sec End pool 100-600 sec (6-/+3.103molecules)

Contact = récepteurs Contact = récepteurs in vivoin vivo ? ?

Cellule cible

Bactérie

Activation de la sécrétion de type IIIRécepteurs

Récepteurs bactériens et ligands cellulaires ?

Récepteurs bactériens TTSS identifiés

ex : Yersinia YopN Salmonella SipD Shigella IpaD

Ligands cellulaires

ex: Intégrine ( IpaA, IpaC, IpaD)

« Le translocateur »« Le translocateur »

m Bmp C.

Bactéries

contact

Cellules

Effecteurs

transclocateur

« Le translocateur »« Le translocateur »

• Domaines hydrophobes ( )• formant spontanément des pores membranaires (hémolyse)• Chaperonnes car lytiques pour bactéries (YopB / SycD)• Bi-fonctionnelle effecteur/translocateur (IpaB, SipB)

YopB

YopD

IpaB

Yersinia

Shigella

Les effecteurs de type III, sécrétion Les effecteurs de type III, sécrétion in vitroin vitro

kDa 98

64

50

36

30

EGTA/MgCl2 - + - + - +

CHACHA-ExsA ExsAC

ExoSExoT

PopB

PopD

ExoSExoT

PopB

PopD

9898

64

50

36

30

kDa

EGTA/MgCl2 - + - +

CHA-ExsA

kDa

64

50

36

30

EGTA/MgCl2 - + - +

P. aCHA-ExsA ExsACExsAC

- +- +- +

CHA-ExsA

- +

CHA-ExsA ExsACExsAC

- +- +- +

P. aExsA

- +

ExoSExoT

PopB

PopD

Induction sécrétion in vitro (mime le contact) :- Déplétion en Calcium (Pseudomonas, Yersinia (+37°C))- Colorant Rouge Congo (Shigella, Salmonella)

Pseudomonasaeruginosa

Translocateur

Effecteurs

Dacheux et al, 1999 Infect. Immun.

Hém

olys

e (5

40 n

m, %

)

RPM

Isu

cros

era

ffin

ose

1000

2000

3000

4000

20

40

60

80

100

P.a

P.a pcrV

6000

1500

PEG

Détermination de la taille du poreDétermination de la taille du poreOsmoprotection Osmoprotection

Diamètre de 1,3 à 3 nmDacheux et al, 2001 Mol. Mic.

Schoehn et al, 2003 EMBO

Modèle PopB/PopD (Modèle PopB/PopD (P. aeruginosaP. aeruginosa))

PopB/PopD et liposome (MET)PopB/PopD et liposome (MET)

Schoehn et al, 2003 EMBO

PopB PopB autre coloration

PopD PopB/PopD

PopB/PcrH

Les effecteurs de type III, sécrétion Les effecteurs de type III, sécrétion in vivoin vivo

• Appareils de sécrétion homologues entre espèces alors que effecteurs diversifiés spécifiques de l’espèce (voir spécificité clonale)

• Tous ne sont pas des effecteurs toxiques (éléments de régulation, de translocation)

• Effecteurs toxiques devenant actifs dans le cytoplasme cellulaireagissant sur voies de signalisation.

• But: tuer (B. extracellulaire) ou entrer (B. intracellulaire) dans la cellule.

• Responsables des phénotypes infectieux spécifiques. (mutants TTSS moins virulents)

Protéines sécrétées par le TTSS (pathogènes d’animaux)Protéines sécrétées par le TTSS (pathogènes d’animaux)

SopE Facteurd’echangeGDP-GTP

Cdc42, Rac - réorganisation du cytosqueletted’actine, modulation des MAPKs

StpP tyrosinephosphatase

inconnue YopE,YopH

réorganisation du cytosqueletted’actine

SPI-2 SipC inconnue inconnue - inhibition de la fusion phagosome-lysosome, induction apoptose

EPEC EspA - réorganisation du cytosqueletted’actine

EspB - réorganisation du cytosqueletted’actine

Tir recepteur intimine - recepteur pour l’intimine insérédans la membrane eucaryote

Bordetella Bsp22 inconnue inconnue - apoptose

Tableau III. Effecteurs de type III sécrétés par les bactéries pathogènes d’animaux.

Organisme Effecteur Activitéenzymatique

Ciblecellulaire

Similarité Effet sur la cellule hôte

Yersinia YopE GAP Cdc42, Rho, Rac ExoS, SptP déstruction du cytosqueletted’actine, inhibition de laphagocytose

YopH tyrosinephosphatase

paxilline, FAK,p130cas

StpP déstruction de la plaque focaled’adhésion, inhibition de laphagocytose

YopO/YpkA kinase sérine/thréonine

inconnue - altération de la morphologie

YopJ/YopP inconnue caspase-3 et -7

- apoptose

YopT RhoA - dépolymérisation de l’actine

YopM inconnue - migration nucléaire

Shigella IpaA vinculine SipA invasion cellulaire

IpaB intégrinealpha5beta,caspase-1

SipB invasion cellulaire,réarangement de l’actine, lysedes phagosomes, apoptose desmacrophages et nécrose desPMNs

IpaC intégrinealpha5beta

- invasion cellulaire,réarangement de l’actine, lysedes phagosomes, nécrose desPMNs

IpaD intégrinealpha5beta

- invasion cellulaire, lyse desphagosomes

SalmonellaSPI-1

SipA actine IpaA diminution d’actine-G,stabilisation actine-F

SipB caspase-1 IpaB apoptose

SopB phosphatase inositol-P - réorganisation du cytosquelette

Activités des effecteurs de type IIIActivités des effecteurs de type III

Tyrosine Phosphatase

(YopH)

Kinase sérine/thréonine

(YopO, StpP)

Récepteur bactérien

(Tir)

GAP(YopH, StpP)

Multiples ou unique

ADP-ribosylation(ExoS, ExoT)

Inconnues(YopJ, SipC,

YopM…)

Adénylatecyclase(ExoY)

Lipase(ExoU)

Effets des effecteurs de type IIIEffets des effecteurs de type III

Modification du cytosquelette

d’actined’actine

CytosqueletteCytosquelette

Shigella

Salmonella

SipBSipA

IpaA

IpaB

IpaC

Rho, Rac cdc42

SopE

« Ruffling »« Ruffling »

EPEC

TirEspBEspA

« Piédestal »« Piédestal »

P. aeruginosa

ExoTExoS

ExoY

MorphologieMorphologie arrondiearrondie

Yersinia

Inhibition Inhibition phagocytosephagocytose

YopE

YopT

YopH

YopO

Signalisation cellulaire et inflammation

Yersinia

YopE

YopT

YopH

EPEC

EspB

SipBSipA

Salmonella

IpaA

IpaBShigella

IpaC

SopE

InflammationInflammation

YopP/J

Inhibition phagocytose

MAPKinaseMAPKinase

Cytokine (TNF) InflammationInflammation

NF-kB

Cytokine (TNFIL1, IL8)

Yersinia

EPEC

TirEspB

SipC

Salmonella

IpaA

IpaBShigella

IpaD

SopE

YopM

Trafic intracellulaire

Phagosomes

Lysosomes

P. aeruginosaExoY

AMPc

condensation de la cellule

formation de protubérences membranaires (budding),

fragmentation ADN,

formation de corps apoptotiques

gonflement de la cellule et du noyau

désintégration de la membrane plasmique

absence de fragmentation de l’ADN

ONCOSE(oncos, swelling) APOPTOSE

NECROSE

Inflammation

Oncose / ApoptoseOncose / Apoptose

Phagocytose par macrophages

Mort cellulaire

Majno et al., 1995 Am. J. Pathol.

Oncose / ApoptoseOncose / Apoptose

OncoseOncose

ApoptoseApoptoseprécoseprécose ApoptoseApoptose

tardivetardive

TemoinTemoin

J774J774

Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

Mort cellulaire

Yersinia

YopE

YopT

P. aeruginosaExoT

ExoS

SipB

Salmonella

IpaBShigella

YopP/J

IpaC

ExoU

Caspase 1-3- 7

APOPTOSEAPOPTOSE

Inflammation

ONCOSEONCOSE

Origine flagellaire de la sécrétion de type IIIOrigine flagellaire de la sécrétion de type III


• Homologie avec les gènes codant l'appareil d'assemblage du flagelle. Yersinia : appareil flagellaire sécrète facteur de virulence (YplA).

• Evolution: B. Végétaux puis animaux transferts horizontaux (plasmides, PAI mobiles) entre bactéries.

• protéines de la mb externe homologues protéines appareil Type II

TT

SSF

lage

lle

Structure et fonction du TTSS conservées entre especesStructure et fonction du TTSS conservées entre especes

• Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella

Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro.

Transcomplémentations hétérologues :• Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas









Virulence du TTSS Virulence du TTSS in vivoin vivo

Exemple: infection à Exemple: infection à Salmonella thyphimuriumSalmonella thyphimurium

Galan, 2001 An. Rev.Cell.Dev.Biol.

Phagocytes

Activation de la sécrétion de type III(ExoS, ExoT, ExoU, ?)

Médiateurstoxiques

Adhésion

Epithélium pulmonaire

Bactérie

Exemple supposé: infectionExemple supposé: infection pulmonaire àpulmonaire à

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Répression de la sécrétion de type III

Oncose

Système de sécrétion de type III , Système de sécrétion de type III , outils thérapeutiques ?outils thérapeutiques ?

Délivrer dans les cellules, par le TTSS d’une bactérie atténuée,

l’épitope présenté par le CMH I pouvant activer les LT CD8+

spécifiques.

Ces LT CD8+ pourront alors éliminer la future infection virale.

Objectif : infection virale

Vaccination de souris contre virus LCMV avec S. thyphimurium injectant l’épitope protecteur via TTSS.

Rüssmann et al, 1998 Science

Epitope protecteur

Epitope non protecteur

SipD- (TTSS-)

Contrôle

LCMV:Lymphocytic choriomeningitis virus

Evan et al, 2003, J. Virol.

Activation de LTCD8+ spécifiques de l’infection au SIV chez le Macaque rhésus par ingestion de Salmonella sécrétant l’épitope

exoS,exoT,exoYexsA

CH

AC

F1

CF

2C

F3

CF

5C

F6

CF

7C

F8

CF

9C

F10

CF

11C

F12

CF

13C

F14

CF

15C

F16

CF

17C

F18

CF

19

CF

20R

IE

RE

N7

RE

N3

T6

37.1

1

K56

9

RE

N4

CF

4

RE

N0

7

kb

+ +-+ -- ---- - -++ -- ---- - -+- +- -+ -Sécrétion0

80

20

40

60

% C

ytot

oxic

ité

(J7

74)

8

3

2

exoU

Diversité clonaleDiversité clonale des effecteurs de type III parmi des des effecteurs de type III parmi des souches infectieuses de souches infectieuses de P. aeruginosaP. aeruginosa


Inhibition phagocytose chez Inhibition phagocytose chez YersiniaYersinia sp sp

« « RufflingRuffling » »

Wolf-Dietrichet al, 1998 Cell

Salmonella

Shigella

« Piédestal »« Piédestal »


Morphologie arrondieMorphologie arrondie« Round up, flat « Round up, flat eggseggs » »


J774 non infectés J774 infectés

Effet apoptotique des Yops de Effet apoptotique des Yops de YersiniaYersinia sp sp

Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

Effets anti-inflammatoires des Yops de Effets anti-inflammatoires des Yops de YersiniaYersinia sp sp

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