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DOSSIERActualités dans le VIH

Les outils de diagnostic et de suivi virologiques utiles en 2015Diagnostic and virological monitoring tools useful in 2015Laurence Morand-Joubert*

* Département de virologie, hôpital Saint-Antoine, AP-HP, Paris ; Sorbonne Universités, UPMC université Paris 6, Inserm, institut Pierre-Louis d’épi-démiologie et de santé publique (IPLESP UMRS 1136), Paris.

Interventions : les nouveaux outils diagnostiquesDepuis leur mise en place en 1985, les tests de diag-nostic de l’infection à VIH n’ont cessé d’évoluer pour aboutir, à l’heure actuelle, à un seul test de dépistage combiné antigène/anticorps (tests de 4e génération) afin de réduire au minimum la fenêtre sérologique. Le Western Blot, test de confirmation, n’a pas changé et est toujours recommandé pour affirmer le diag-nostic et pallier les défauts de spécificité des tests de dépistage. Le diagnostic de la primo-infection aux stades précoces (Fiebig I et II), sans présence encore d’anticorps, impose la recherche systématique de l’ARN viral plasmatique. En cas de résultat positif, l’initiation immédiate du traitement antirétroviral permet de limiter la constitution du réservoir viral et de prévenir l’activation immune (1). C’est dans l’intérêt de ce bénéfice individuel et collectif, par la réduction de la transmission, que l’outil “charge virale plasmatique” peut et doit être utilisé pour le diagnostic, sans attendre l’apparition des anticorps ou un Western Blot positif.La nouveauté dans les tests diagnostiques est l’arrivée des autotests. Les tests d’orientation diagnostique sont déjà utilisés dans des cadres précis depuis les arrêtés de 2010. L’avancée n’est pas technique, puisque leur fiabilité est celle d’un test de dépistage de 3e génération, permettant la détection des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2 sans détection de l’antigène p24, mais il s’agit d’une petite révolution, puisque cela place ces tests de dépistage au sein même de la stratégie individuelle de dépistage. Ces tests peuvent être réalisés directe-ment par l’intéressé sans l’intervention d’une tierce personne, à partir du sang total ou du liquide cravi-culaire. Cependant, les tests salivaires présentent une bien moindre sensibilité que les tests sanguins. Il faut aussi rappeler que ces tests ne sont interpré-

tables que pour une prise de risque datant de plus de 3 mois et que, par conséquent, ils ne sont pas recommandés dans un contexte de primo-infection. Tout résultat positif doit être confirmé rapidement par la technique standardisée de dépistage classique et le Western Blot, avec une prise en charge sans délai du patient dans le système de soins (2).

Les nouveaux outils du suivi virologiqueLes marqueurs virologiques comme la charge virale, témoin de la réplication virale, et la résistance géno-typique ont montré leur intérêt à un double niveau : dans la recherche clinique, avec un apport considé-rable dans l’évaluation rapide de l’efficacité d’une stratégie thérapeutique par rapport aux marqueurs cliniques, et aussi, de façon essentielle, dans le suivi virologique individuel, pour mesurer et adapter le traitement antirétroviral.Comme toujours, les marqueurs biologiques de substitution sont confrontés au progrès thérapeu-tique, avec la nécessité de s’adapter aux questions posées et aux nouveaux objectifs, et aussi d’amé-liorer leur sensibilité. C’est dans cette optique que plusieurs outils virologiques ont été développés et sont potentiellement disponibles : l’ADN proviral, la charge virale ultrasensible et la détection des variants minoritaires de résistance. C’est leurs places respectives, avec leurs intérêts et leurs limites, que nous discutons ici.

Les nouveautés dans les tests de résistanceDans la détection de la résistance, à côté du test standard génotypique de résistance réalisé dans

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Cible amplifiéeCodonSéquençage classique (Sanger)PCR sélective de mutation Non réalisé

65

... ATA AAG ARA AAA GAT....K65KR

... ATA AAG AGA AAA GAT ...


... ATA AAG AAA AAA GAT ...



...





... ATA AAG AGA AAA GAT ...50 % K65R

100 % Y181C

181

Y181C

184 1

5 % M184V

100 % Y181C

100 % Y181C CCR5

CCR5

5 % M184V

... GTG ATC TGC CAA TAT ATG GAT GAT ....

... GTG ATC TGC CAA TAT ATG GAT GAT ...








... GTG ATC TGC CAA TAT GTG GAT GAT ...






... ACG TTT AAT GGA ACA GGG CTA TGC CAG ...

... --- TTT AAT GGA ACA GGG CCA TGC CAG ...

... ACG TTT AAT GGA ACA GGG CTA TGC CAG ...

... --- TTT AAT GGA ACA GGG CCA TGC CAG ...

... NNN TTT AAT GGA ACA GGG CYA TGC CAG ...




... ATA AAG AAA AAA GAT ...50 % K65R

Transcriptase inverse Boucle V3 de la gp120

Séquençage à haut débit Non réalisé

Non réalisé

Séquençage du génome entier

Figure 1. Exemples des performances de séquençage obtenues par différentes méthodes (d’après [8]).

Points forts

le plasma, il existe ce même test effectué dans les cellules mononucléées sanguines (PBMC), dont la place est aujourd’hui encore discutée, et la recherche des variants minoritaires résistants par les techniques NGS (Next Generation Sequencing technologies), plus sensibles.La réalisation du test génotypique de résistance dans le plasma est actuellement recommandée pour mettre en évidence une éventuelle résistance trans-mise ou acquise afin de mieux adapter le traitement antirétroviral. Chez les patients en échec virologique, le test génotypique effectué dans l’ADN proviral montre une bonne corrélation avec le test effectué au niveau de l’ARN plasmatique (3), mais il peut également manquer de sensibilité, notamment chez les patients pour lesquels on dispose de l’informa-tion cumulée de plusieurs génotypes antérieurs (4). À l’inverse, le test de résistance réalisé dans l’ARN plasmatique peut être en défaut lors de l’absence de pression de sélection et, surtout, il est limité par le niveau de la charge virale. Lors d’un changement de traitement pour simplification ou intolérance, il est utile de s’assurer de l’absence de virus résis-tants archivés ou de polymorphismes susceptibles de réduire l’efficacité thérapeutique. Dans l’infection à VIH, les mutations de résistance peuvent persister et

“s’archiver” malgré un contrôle complet et durable de la charge virale. C’est dans ce contexte que la résistance dans l’ADN proviral prend tout son intérêt et apporte une information supplémentaire (5, 6). Mais, à la différence des mutations de résistance présentes dans le plasma chez des patients en échec virologique, l’impact réel de ces mutations archivées sur le maintien de la réponse virologique chez des patients à charge virale contrôlée reste à déterminer.Les NGS sont bien plus sensibles que les techniques classiques de séquençage et permettent la détection de variants minoritaires représentant approximati-vement 1 % de la population virale avec un délai plus long d’exécution et une expertise bio-informatique indispensable (figure 1) [7, 8]. Chez les patients non traités, il a été bien montré que ces tests permettent d’améliorer la sensibilité de détection. Dans une étude française, la fréquence de la résistance trans-mise mesurée par NGS est évaluée à 20 % à au moins un ARV alors qu’elle n’est que de 6 % par la technique classique de Sanger (9). De même, il existe une augmentation de la résistance acquise à l’échec de l’association TDF/FTC/EFV (10). Plusieurs études ont démontré l’impact de ces variants résis-tants sur la réponse virologique, notamment pour la classe des INNTI de première génération. Dans la

» Les autotests VIH, dans leurs limites connues de sensibilité, représentent une offre supplémentaire parmi les moyens de dépistage du VIH, en particulier dans la stratégie individuelle de dépistage.

» La charge virale plasmatique permet d’affirmer le diagnostic de l’infection à VIH lors d’une primo- infection, afin de commencer le traitement antirétroviral sans attendre la confirmation sérologique.

» Le génotype de résistance dans l’ADN proviral, par sa mise en évidence des mutations archivées, présente un intérêt dans les situations où le test génotypique de résistance réalisé sur le plasma est en défaut : absence de pression de sélection thérapeutique, charge virale faible ou indétectable.

» La prévalence des variants minoritaires détectés par les techniques NGS montre des prévalences de la résistance transmise et acquise plus élevées. L’impact controversé de ces variants minoritaires sur la réponse virologique ne permet pas encore la recommandation de leur recherche en pratique courante.

Mots-clésAutotest VIH

Génotype de résistance du VIH dans l’ADN proviral

Variants minoritaires de résistance

ADN proviral

Charge virale ARN ultrasensible

Virémie résiduelle

Highlights

» Home tests in their known sensitivity limits represent an additional offer of HIV testing, especially in the individual screening strategy.

» The viral load can confirm the diagnosis of HIV infection, during a primary infection, to begin antiretroviral treatment without waiting for serological confirmation.

» Proviral DNA resistance testing by detection of archived mutations may provide addi-tional resistance information, particularly in the setting of no ARV-selective pressure or of low or undetectable viremia.

» New sequencing technol-ogies allow the detection of minority variants not detected by conventional techniques and show a greater prevalence of transmitted and acquired resistance mutations. The controversial impact of these minor variants on the virolog-ical response does not yet allow the recommendation of their use in routine practice

» New tools for quantifying HIV reservoir (proviral DNA and ultrasensitive RNA PCR), are essential to lead to a better understanding of HIV patho-physiology and to evaluate clin-ical research strategies. These assays might also be interesting to identify individuals who could benefit from treatment simplification or interventions to reduce reservoirs.

Keywords

Home HIV testing

HIV resistance in proviral DNA

Minority viral variants

HIV-DNA

Residual viremia

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Les outils de diagnostic et de suivi virologiques utiles en 2015


méta-analyse de Li (JAMA 2007), la charge muta-tionnelle (fréquence des variants minoritaires × charge virale) est associée de façon proportionnelle au risque d’échec virologique. Cependant, d’autres études rapportent à ce sujet des résultats discor-dants, notamment pour les classes des inhibiteurs de protéase et d’intégrase (tableau). L’étude réalisée à partir des 2 essais OCTANE chez les femmes rece-vant ou non une dose de névirapine (NVP) pour réduire la transmission mère-enfant montre que l’association “présence de variants minoritaires et échec” existe uniquement chez les femmes ayant reçu une dose de NVP. Autrement dit, la présence de variants non liés à une pression de sélection théra-peutique n’affecte pas la réponse (11). Ces données s’avèrent très importantes pour interpréter les résul-tats obtenus avec ces tests.Nul doute que ces techniques NGS, notamment celles évaluant le génome entier, permettront de mieux appréhender et caractériser les populations virales. Pour leur utilisation courante, il reste à améliorer leur facilité de réalisation et à préciser les seuils impactant la réponse virologique, en fonction des mutations et surtout des combinaisons théra-peutiques de puissance et de barrière génétique différentes.

Les nouveautés dans l’évaluation du réservoir viral

Dans toutes les recommandations, l’objectif viro-logique du traitement antirétroviral reste toujours la réduction de la réplication virale sous le seuil de 50 copies/ml. Cependant, ce marqueur n’apporte aucune information sur l’impact des traitements sur le réservoir viral. Dans le contexte actuel de l’éradication ou de la simple cure fonctionnelle et aussi de la disponibilité de traitements de plus en plus puissants, il est nécessaire de disposer de marqueurs sensibles, spécifiques et reproductibles pour quantifier le réservoir viral et, surtout, pour évaluer l’impact de stratégies utilisées en vue de sa réduction. De nombreux marqueurs virologiques existent, avec des avantages et des inconvénients variables (figure 2) [12]. Les techniques fondées sur la biologie moléculaire avec une amplification des gènes d’intérêt ont l’avantage de leur sensi-bilité, mais ne permettent pas de différencier les virus défectifs non infectieux, contrairement aux techniques fondées sur la culture virale. Les niveaux mesurés par ces 2 types de technique montrent une

Tableau. Résultats sur les variants minoritaires obtenus dans différentes études.

Études Nombre de patients Mutations détectées Méthodes Résultats

Johnson et al., 2008 (22) 824 L90M, M41L, K70R, K103N, Y181C, M184V, T215FY

qPCR spécifique d’allèle Association

Geretti et al., 2009 (23) 93 K65R, K103N, Y181C, M184V, G190A Séquençage de population vs qPCR spécifique d’allèle

Association

Simen et al., 2009 (24) 194 Mutations aux INTI, INNTI, IP Séquençage de population vs UDPS Association

Halvas et al., 2010 (25) 103 K103N, Y181C Séquençage de population vs séquençage du génome unique vs qPCR spécifique d’allèle

Association

Paredes et al., 2010 (26) 195 K103N, Y181C qPCR spécifique d’allèle Association

Goodman et al., 2011 (27) 485 K103N qPCR spécifique d’allèle Association

Cozzi-Lepri et al., 2015 (28) 260 Mutations aux INTI, INNTI UDPS Association

Peuchant et al., 2008 (29) 127 K103N, M184V, L90M qPCR spécifique d’allèle Pas d’association

Balduin et al., 2009 (30) 159 K103N qPCR spécifique d’allèle Pas d’association

Charpentier et al., 2010 (31) 74 Q148R qPCR spécifique d’allèle Pas d’association

Liu et al., 2011 (32) 71 Mutations RAL Séquençage parallèle spécifique d’allèle Pas d’association

Jakobsen et al., 2010 (33) 61 M41L, K65R, K7OR, Q151M, M184V, T215FYD, K103N, Y181C, G190ASE

Séquençage de population vs PCR multiplex et extension d’amorce

Pas d’association

Metzner et al., 2011 (34) 146 K65R, K103N, M184V qPCR spécifique d’allèle Pas d’association

Messiaen et al., 2012 (35) 53 M184V, A98G, L100I, K101E, V106A, V108I, V179F, E138A

GS FLX UDPS Pas d’association

UDPS : Ultra-Deep Pyrosequencing ; qPCR : PCRquantitative.

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Infection latente

Charge virale plasmatique (ARN viral)

ARN viral cellulaire ARN non épissé

et ARN multiépissé

Charge virale ultrasensibleau seuil de 1 copie/ml

ADN viral non intégré

Charge virale cellulaire (ADN viral total)

ADN viral intégré(unités infectieuses

par millions de cellules)

Infection active

Figure 2. Marqueurs virologiques dans une cellule infectée latente et dans une cellule activée, productrice de virus (d’après [12]).

1 000 000

Début du traitement

ARV

0 5 10Durée sous ARV (années)

Seuil de détection (50 copies/ml)

Virus défectifs Virus infectieux

Cellule non productrice de virus

Cellule activée productrice de virus

Virémie résiduelle

Charge virale ADN

15

Char

ge vi

rale

ARN

(cop

ies/

ml)

Char

ge vi

rale

ADN

(cop

ies/

106 PB

MC)

100 00010 000

1 000

100

101

0,1

0,010,001

1 000 000

100 00010 0001 000

100

10

0,11

0,010,001

Figure 3. Réplication et production virale sous traitement antirétroviral (d’après [21]).

différence de plus de 2 log avec seulement 12 % de virus infectieux (13) . La plus utilisée pour sa simplicité et sa standardisation est la mesure de l’ADN proviral. C’est, en fait, l’ADN viral total qui est quantifi é, comprenant l’ADN intégré et l’ADN non intégré. Dans une méta-analyse, ce marqueur a démontré sa forte valeur prédictive en termes de progression de l’infection vers le sida et de mortalité, indépendamment du taux de CD4 et de la charge virale plasmatique (14) . De façon concordante, chez les patients contrôlant naturellement leur infec-tion, le niveau d’ADN proviral est très bas, à moins de 2 log10 copies/million de cellules mononucléées sanguines. De même, ce niveau d’ADN est et reste faible chez les patients commençant leur traite-ment pendant la primo- infection, à la différence de ceux le commençant à la phase chronique (15) . Dans les essais d’interruption thérapeutique, il est également prédictif du délai de survenue du rebond virologique (16) . De même, en cas d’allègement thérapeutique par une monothérapie d’inhibiteur de protéase , un niveau faible d’ADN avant le change-ment est prédictif du succès de cette stratégie (17) . Ainsi, ce marqueur du réservoir viral a un intérêt pour mieux identifi er les patients susceptibles de bénéfi cier de stratégies moins puissantes. Il se révèle toutefois décevant pour comparer des stratégies thérapeutiques en raison de sa trop faible variation sous traitement et de son manque de sensibilité. En effet, il ne montre pas d’effet dans les essais où la charge virale plasmatique démontre une différence signifi cative entre les stratégies comparées (18) . A fortiori, il n’est pas étonnant qu’aucune différence ne soit retrouvée dans les essais d’intensifi cation où les patients présentent une charge virale déjà indétectable. Récemment, ce défaut de sensibilité a été mis en évidence chez 2 patients allogreffés de moelle par le rebond virologique malgré l’ab-sence de détection d’ADN dans le sang et les tissus lymphoïdes (19) . Toujours dans cette quête de tests plus sensibles et faciles à réaliser, la charge virale ultrasensible au seuil de 1 copie/ml a permis de révéler la présence d’une virémie résiduelle en dessous du seuil de 20-50 copies/ml, persistante sous traitement antirétroviral (fi gure 3) . L’origine de cette virémie se trouve dans une réplication réelle à bas bruit et/ou un simple relargage viral. La fréquence de cette virémie résiduelle varie selon les études et les techniques utilisées. La sensibilité et la précision de la quantifi cation sont dépendantes du volume de sang utilisé. Il est aussi possible, à partir des techniques usuelles de charge virale, d’obtenir un

résultat qualitatif correspondant à la présence ou non d’une amplifi cation. En pratique, la question est de savoir si les patients présentant une virémie résiduelle sous traitement ont un risque plus impor-tant de se trouver en échec virologique. Des études vont dans ce sens en montrant que les patients avec une PCR positive ont un risque légèrement supérieur d’échec virologique (> 400 copies/ml) par rapport aux patients avec une PCR négative (20) . Ce qui distingue ces 2 groupes de patients, c’est, d’une part, l’adhésion au traitement et, d’autre part, la durée

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Les outils de diagnostic et de suivi virologiques utiles en 2015


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Références bibliographiques

L’auteur déclare avoir des liens d’intérêts avec Abbott, BMS,

Gilead, Roche (co-investigateur d’essais cliniques) ; avec Gilead,

Janssen, MSD, ViiV Healthcare (participation à des réunions

d’experts) ; avec Abbott, BMS, Boehringer, Gilead, Janssen, MSD,

Mylan, Roche, ViiV Healthcare (interventions ponctuelles :

congrès, conférences, colloques, formations, autres réunions).

du traitement antirétroviral, indiquant l’importance de laisser du temps pour parvenir à la complète indétectabilité (PCR négative). Comme avec l’ADN proviral, aucun essai d’intensification n’a montré de bénéfice d’efficacité sur cette virémie résiduelle (21), ce qui, pour l’instant, ne justifie pas de modifier le traitement, mais plutôt de renforcer l’adhésion à celui en cours. Cette virémie résiduelle, corrélée au niveau de l’ADN proviral, s’est montrée prédictive de la réponse virologique lors d’un allègement par monothérapie d’inhibiteur de protéase (17), ce qui pourrait être intéressant pour sélectionner au mieux les patients susceptibles d’en bénéficier.

Conclusion

Les outils diagnostiques comme les tests rapides d’orientation diagnostique, dont les autotests, ainsi que la charge virale plasmatique dans le contexte de la primo-infection apportent sans conteste un bénéfice individuel et collectif.Pour les outils virologiques utilisés dans l’évaluation des résistances et du réservoir, s’ils montrent tout leur intérêt dans les études physiopathologiques et dans les sous-analyses d’essais thérapeutiques, leur utilisation et leur indication en pratique courante restent encore limitées et à préciser. ■

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