I 1181

Les peptide-hydrolases des lactobacilles du groupe Thermobacterium. I. Mise en Cvidence de ces activites chez Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus

M. EL SODA Centre de Recherches de I' Universite' d'Alexandrie et Faculte' &Agriculture, De'p!rtement des Industries Agricoles et

Alimentaires, Universitk d'dlexandrie, Alexandrie, Egypte ET

M. J. DESMAZEAUD' Laboratoire de Microbiologie Laitiire et de Ge'nie Alimentaire, Institut National de ~echerches Zootechniques,

Centre National de la Recherche Scientijque, 78350 Jouy-en-Josas, France ApprouvC le 11 juin 1982

. . . . . . . . . . . . . EL SODA, M., et M. J. DESMAZEAUD. 1982. Les peptide-hydrolases des lactobacilles du groupe Thermobacterium. I. Mise en

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cvidence de ces activitCs chez Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus. Can. J . Microbiol. 28: . . . . . . .

. . 1181-1188. Les activitCs peptidasiques intracellulaires de Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus ont Ctt

recherchkes en utilisant des substrats synthktiques spCcifiques aux enzymes du type aminopeptidasique, dipeptidasique et carboxypeptidasique en plus des difftrentes casCines et des prottines du lactostrum. Les differentes activitks Ctaient ensuite sCparCes par Clectrophorkse en gel de polyacrylamide. On retrouve chez toutes les espkces des activitCs du type aminopeptidasique hydrolysant differents acides amints P-naphtylamides et dipeptides. Les quatre espkces testks posskdent

, aussi des dipeptidases vraies hydrolysant de nombreux dipeptides. Les systkmes intracellulaires des lactobacilles thermophiles , hydrolysent aussi les prottines du 1actosCmm (a-lactalbumine et P-lactoglobuline). Les rksultats de 1'Ctude Clectrophorttique i montrent aussi que la castine f3 peut &tre complktement hydrolysCe par L. lactis, tandis que seule une hydrolyse partielle de cette I prottine peut &tre obtenue par L. acidophilus et L. bulgaricus. D'autre part, la casCine aSl n'a CtC que partiellement hydrolysCe i par les systkmes protkolytiques de L. helveticus, L. lactis et L. bulgaricus.

/ EL SODA, M., and M. J. DESMAZEAUD. 1982. Les peptide-hydrolases des lactobacilles du groupe Thermobacterium. I. Mise en 1 Cvidence de ces activitCs chez Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus. Can. J . Microbiol. 28:

1181-1188.

I The intracellular peptide hydrolase activities of Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. lactis, and L. bulgaricus were I determined using various aminopeptidase, dipeptidase, and carboxypeptidase substrates in addition to casein and whey protein 1 fractions. The different activities were then separated using disc gel electrophoresis. Each bacterium had aminopeptidase activity

towards various amino acid P-naphthylamides and dipeptides. The four species also showed bands of true dipeptidase activities ; on a large number of dipeptides. Intracellular enzymes from thermophilic lactobacilli also hydrolysed the whey proteins

(a-lactalbumin and P-lactoglobulin). From the results of electrophoresis on p-casein and aSl-casein it was shown that p-casein was totally hydrolysed by L. lactis while it was only partially hydrolysed by the intracellular enzymes of L. acidophilus and L.

. . . . . . . . . . . .; bulgaricus. On the other hand, a,,-casein was only partially hydrolysed by L. helveticus, L. lactis, and L. bulgaricus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : . . . . . ! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , Introduction Ce mCmoire dCcrit donc la caractCrisation de l'activitk . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . Les rksultats rappo*6s par diffkrents auteurs ( L ~ ~ et cas6inolytique et le fractionnement Clectrophorttique . . . . . : shqe 1977; Desmazeaud et ~ r i ~ ~ ~ 1977; ~1 soda et des dipeptidases et des aminopeptidases intracellulaires

. . al. 1981) montrent que les bactCries lactiques jouent un de ~ ~ u c h e s aPPmenant aux esPbces Lactobaci1Eus r6le essentiel dans la maturation des fromages et qu'elles helveticus, L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus. interviennent dans la dCgradation des protCines du caillC Ces espbces appmiennent au groupe des Thermobacte- par leurs systbmes enzymatiques intracellulaires. Or, rium dkfini selon S h q e (1979) c~-e renfennant des rnalgrt la large utilisation des lactobacilles themophiles lactobacilles homofermentaires cultivant h 45°C mais pour la fabrication des fromages i p2te cuite press& pas h 15°C; ne fermentant pas le ribose et ne donnant pas (Accolas et al. 1980) un nombre trbs limit6 d'ktudes de gaz h Partir du gluconate. Une cornparaison enwe approfondies de leur systbme peptidasique diffirentes souches de chacune de ces espbces est aussi effectutes (Sorhaug et Solberg 1973; Argyle et al. raPPo*Ce. 1976; Vescovo et Bottazzi 1979; Eggimann et Bach- mann 1980). MatCriel et mCthodes

Organismes 'A qui toute correspondance doit &tre envoy&. Les souches utilisCes dans ce travail ttaient dCsigntes L.

0008-4166/82/101181-08$01.00/0 01982 National Research Council of Canada/Conseil national de recherches du Canada

. . . . . .

. . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . .

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

1182 CAN. J . MICROBIOL. VOL. 28. 1982

helveticus CNRZ 303, CNRZ 244, CNRZ 249 et CNRZ 223; L. acidophilus NCDO 1; L. lactis CNRZ 239, CNRZ 240, CNRZ 242, CNRZ 252 et CNRZ 250; L. bulgaricus CNRZ 418, CNRZ 397, CNRZ 419 et CNRZ 369. Ces bactCries ont CtC maintenues par repiquage mensuel sur lait CcrCmC stCrilisC (par autoclavage 115°C pendant 15 min) et conservks par congClation -30°C. Cultures et extraits cellulaires

Les cultures Ctaient rCalisCes sans agitation sur milieu de De Man, Rogosa et Sharpe (MRS) (De Man et al. 1960) dans des flacons de 2 L, en verre, forme haute ii col Ctroit (Prolabo, France). Le milieu (1900 mL) Ctait ensemencC par lOOmL d'une prkculture de 16 h sur le m&me milieu. La temperature d'incubation utilisCe Ctait de 40°C.

Au dCbut de la phase stationnaire de croissance les cultures Ctaient centrifugCes 2000 x g pendant 30 min, puis les cellules Ctaient rincCes trois fois avec du tampon phosphate de potassium 0,01 M pH 7,O. Aprks le dernier rin~age, les cellules Ctaient remises en suspension dans un volume de tampon equivalent au 0 , l du volume de sa culture initiale. Enfin elles Ctaient broyCes a 4°C a l'aide d'un appareil Vibrogkne (Edmund Buhler, Tubingen, RCpublique FCdCrale d'Allemagne). Par "extrait enzymatique" on dCsigne le broyat cellulaire total. Par "fraction soluble" on dCsigne le sumageant obtenu a p r b centrifugation ii 16 000 x gpendant 1 h du broyat total. Dosage des prote'ines

La concentration en protCines contenues dans les extraits Ctait dCterrninCe selon la mCthode de Lowry et al . (1951) en utilisant le reactif de Folin et Ciocalteu. La serum-albumine bovine (Sigma) Ctait utilisCe comme protCine Ctalon. Recherche et dosage des activite's prote'olytiques et pepti-

dasiques Activite' aminopeptidasique L'activitC aminopeptidasique Ctait mesurCe selon la

mCthode de Roncari et Zuber (1969) avec les substrats suivants: leucyl-para-nitroanilide (Leu-NA) (Sigma), alanyl- para-nitroanilide (Ala-NA), lysyl-para-nitroanilide (Lys-NA) (Merck). Le mClange rkactionnel avait la composition sui- vante: 0 , l mL de substrat (substrat 16,4 mM dans 1 mL de m6thanol); 2,8 mL dephosphate de potassium 0,Ol M &pH 6,5 et 0 , l mL d'extrait enzymatique. Aprks incubation 37°C pendant diffkrents temps, la rCaction Ctait arr&tCe par addition de 0,5 mL d'acide acCtique 30%.

La variation d'absorbance du melange Ctait mesurCe a 410 nm l'aide d'un spectrophotom&tre Beckrnan modkle 25 (cuve de chemin optique de 1 cm). L'unitC dYactivitC enzyma- tique Ctait arbitrairement dCfinie comme la variation de 0,01 unit6 d'absorbance en 1 min dans les conditions dCcrites ci-dessus. L'activitC spCcifique Ctait mesurCe par le nombre d'unitCs d'activitC aminopeptidasique par milligramme de protkines de l'extrait enzymatique.

Activite' endopeptidasique L'activitC endopeptidasique Ctait recherchCe par la mCthode

dCcrite ci-dessus pour I'activitC aminopeptidasique en utilisant les substrats suivants: succinyl-phknylalanine-para-nitroani- lide (Suphepa), glutaryl-phCnylalanine-para-nitroanilide (Glu- phepa), et benzoyl-arginine-para-nitroanilide (Bapa). L'unitC dlactivitC enzymatique Ctait arbitrairement dCfinie comme la

variation de 0,01 unit6 d'absorbance en 1 h dans les conditions dkrites ci-dessus. L'activitC spkcifique Ctait mesurCe par le nombre dYunitCs d'activitC endopeptidasique par milligramme de protkines de l'extrait enzymatique.

Activite's carboqpeptidasique et dipeptidasique Les substrats utilisCs Ctaient des dipeptides non substituCs ou

mono-substituCs. Le melange reactionnel avait la composition suivante: 1,8 mL de substrat a une concentration de 0,5 rnM en tampon phosphate de potassium 0,01 M pH 7,O et 0,2 mL de solution enzymatique. Aprks incubation a 37°C pendant differents temps, la reaction Ctait arr&tCe par addition de 2 mL d'acide trichloracCtique (TCA) a 24%. Les protCines prkipi- tCes Ctaient CliminCes sur filtre Whatman 42. Les groupements aminks libCrCs Ctaient estimCs aprks reaction entre 1 mL du filtrat TCA et 1 mL du reactif 21 la ninhydrine d'aprks Moore et Stein (1954). Aprks dilution par 8 mL d'alcool 50% (v/v), la variation d'absorbance Ctait mesurCe 570 nm. L'unitC d'acti- vitC enzymatique Ctait arbitrairement dCfinie comme la varia- tion de 0,01 unite de densite optique en 15 min dans les conditions dCcrites ci-dessus. L'activitC spkifique Ctait mesurCe par le nombre dlunitCs d'activitC enzymatique par milligramme de protCines de l'extrait enzymatique.

Activite' sur la case'ine L'activitC casCinolytique Ctait d o s k 37°C a pH 7,O en

utilisant la casCine isoClectrique a 2% comme substrat. Le mClange rkactionnel avait la composition suivante: 0,3 mL d'extrait enzymatique; 2,7 mL d'une solution de casCine a 2% en tampon phosphate de potassium 0 , l M ii pH 7,O. La reaction Ctait arr&tCe par addition de 3 mL de TCA 24%. La casCine prCcipitCe Ctait Climink par filtration sur filtre Whatman 42. Les groupements aminCs libCrCs Ctaient estimCs par reaction a la ninhydrine selon Moore et Stein (1954). Aprh 15 min au bain-marie bouillant, puis refroidissement et dilution par 8 mL d'alcool 50% (v/v) l'absorbance Ctait mesurCe 570 nrn. L'unitC d'activitk enzymatique Ctait arbitrairement dCfinie comme la variation de 0,01 unit6 d'absorbance en 1 h dans les conditions dCcrites ci-dessus. L'activitC spkifique Ctait mesurk par le nombre d'unitCs d'activitk casCinolytique par milligramme de protCines de l'extrait enzymatique.

Activite' sur les prote'ines du se'rum (a -lactalbumine, P -lac- toglobuline)

Les melanges rCactionnels avaient la composition suivante: 1,5 mL d'une solution d'une protCine 0,2% dans 10 mL de tampon phosphate de potassium 0,01 M a pH 7,O et 1,5 mL d'extrait enzymatique. Le mClange contenait une solution de merthiolate comme conservateur a la concentration finale de 0,05%. Les protCines ont CtC achetCes chez Sigma. Aprks 24 et 48 h d'incubation, les acides aminCs et les peptides libCrCs Ctaient mis en Cvidence sur 1 mL du mklange rkactionnel par rCaction a la nihydrine selon Moore et Stein (1954). Aprks dilution par 8 mL d'alcool ?I 50% (v/v) on mesurait la variation d'absorbance ii 570 nm. Des rCactions tCmoins contr6lant 1'Cvolution Cventuelle des solutions des protCines substrats ou de l'extrait enzymatique seul, Ctaient aussi effectuCes dans les m&mes conditions. L'unitC d'activitC enzymatique Ctait arbi- trairement dCfinie comme la variation de 0,01 unit6 d'absor- bance, en 1 h, dans les conditions dCcrites ci-dessus. L'activitC spkifique Ctait mesurCe par le nombre d'unitCs d'activitC par milligramme de protCines de l'extrait enzymatique.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

I I 1 EL SODA ET DESMAZEAUD 1183

Se'paration des aminopeptidases et dipeptidases par e'lectro- phordse

~lectro~horkse en gel de polyacrylamide des extraits bacte'riens

Les Clectrophorkses des extraits cellulaires (fractions solu- bles) Ctaient effectuks sous une tension de 3 1 V/cm dans un appareil Pleuger comportant huit tubes de verre de 7 x 0,5 cm dans lesquels avait CtC prCparC un gel de polyacrylamide a 7% en tampon Tris-borate de pH 7,O. On utilisait le bleu de bromophCnol cornrne traceur.

Aprts Clectrophorkse, les prottines Ctaient rCvC1Ces sur un I tube par coloration au Bleu de Coomassie (Serva) selon la

technique dCcrite par Chrarnbach et al. (1967). Les autres tubes servaient a la dkterrnination des diffkrentes activitCs

. . . . . . . . peptidasiques.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Se'paration des aminopeptidases par e'lectrophordse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : . . . . . . . . . . Aprks Clectrophorkse, les aminopeptidases ont CtC localis6es

en ttudiant I'hydrolyse de la L-alanine P-naphtylamide (NA), L-leucine PNA, glycine PNA, L-arginine PNA, L-acide aspartique PNA, selon la mCthode de Miller et MacKinnon (1974). Les gels itaient incubes a 25°C directement dans le mClange suivant: 0 , l mL de substrat (1 0 mg de I'acide aminC

i PNA en solution dans 1 mL de dimethyl-formarnide (Sigma)); I 5 mL d'une solution de Fast Garnet GBC (Sigma) (10 mg dans I 5mL de tampon Tris-HC1 0,2 M pH 7 3 ) . On notait, a 1 partir de 15 min, les positions relatives des anneaux de couleur I rouge apparaissant sur les gels. Avec cette technique, aucune ; diffusion de la coloration ne se produisait.

I Siparation des dipeptidases par e'lectrophorise : Aprts Clectrophorkse, les dipeptidases ont CtC localisks en i ttudiant I'hydrolyse des dipeptides selon la mCthode de Lewis

et Harris (1967). Les gels Ctaient incubts h 25°C directement i dans le mClange suivant: 5 mg de dipeptide (constituant le , substrat) dissous dans 2 mL de tampon phosphate de sodium 1 0,2 M a pH 7,O auquel on ajoutait 0,5 mg de L-aminoacide-

oxydase (Sigma); 0 ,8mg de peroxydase (Boehringer) et O,O8mL d'une solution aqueuse de O-dianisidine dihydro- chlorure (Sigma) (5 mg/mL). Afin de solidifier le milieu pour tviter la diffusion de la coloration traduisant l'hydrolyse du

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . dipeptide, 2 mL de gClose a 2% Ctaient de plus additionnCs au . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........ ......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . ..................................... :: : mClange rCactionne1 ci-dessus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......................................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . .

Fractionnement des hydrolysats des case'ines par e'lectro- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

phordse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aprks 0-24 et 48 h d'incubation, 50 p L des melanges . . . .

rkactionnels Ctaient soumis a 1'Clectrophortse aprks dknatura- tion des prot6nes en prksence d'urke 9 M contenant I% de P-mercaptoCthanol. L'tlectrophorkse Ctait rCalisCe en gel mixte d'acrylamide-agarose selon la technique d'Uriel(1966) modifiCe par l'utilisation d'urCe (Gripon et al. 1975). Les plaques de gel ktaient tout d'abord rChydratCes pendant 16 hen tampon Tris-glycine (Uriel 1966) contenant de I'urCe 4,5 Met 0,1% de P-mercaptokthanol. L'Cchantillon d'hydrolysat de protkines Ctait mClangk avec un volume Cgal d'agarose 4% prkalablement fondu, puis introduit dans un rtservoir creusC dans le gel. La prCsence d'urCe 4,5 M dans le mClange khantillon-agarose emp&che a la tempCrature ambiante la gklification de I'agarose. Celle-ci Ctait rkalisCe par incubation prkalable des plaques A 4°C pendant 15 rnin. L'Clectrophorkse Ctait rCaliste A 4°C pendant 3 h sous une tension de 13 V/cm.

Les protkines Ctaient color&s par le Bleu de Coomassie R 250 (Uriel 1966), puis les gels dCcolorCs dans le mClange mCtha- nol, acide adtique, glycCrol, eau (v/v, 200:50:30:720) additionnC de rksine Dowex 1 X 2 servant a fixer le colorant.

Resultats Mise en ividence des activitis du type peptide-hydro-

lases Les rksultats obtenus montrent que les lactobacilles

du groupe Thermobacterium possbdent des activitks du type aminopeptidasique, dipeptidasique et casCinolyti- que (tableau 1). Par contre, aucune souche n'a montrC dYactivitC vis-a-vis des substrats spCcifiques des en- zymes du type chymotrypsine, trypsine ou papaine. Parmi les espbces ttudites, il est possible de distinguer L, helveticus et L . acidophilus cornrne ktant les espbces les plus prottolytiques, L . lactis et L . bulgaricus formant un groupe moins actif.

En ce qui concerne I'hydrolyse des prottines du lactoskrum (tableau 2), L . helveticus, L. lactis et L . bulgaricus hydrolysent l'a-lactalbumine ainsi que la P-lactoglobuline. L'activitt sur l'a-lactalbumine Ctait voisine chez les trois espbces. Par contre, une hydrolyse plus importante de la P-lactoglobuline Ctait detectable chez L. bulgaricus. Lactobacillus acidophilus se dis- tingue des autres espbces de ce groupej car seule la P-lactoglobuline Ctait hydrolyde.

Caractirisation des aminopeptidases et des dipeptidases Les rksultats dCcrits prCctdemment ont perrnis de

distinguer les diffkrents types d'enzymes protkolytiques retrouvCs chez les lactobacilles sans toutefois donner une idCe prCcise du nombre de peptide-hydrolases de chaque groupe. Une ttude Clectrophorktique permettant la rCvClation directe des activitCs enzymatiques sur les gels de polyacrylamide a donc Ctk entreprise.

Les rCsultats obtenus (fig. 1) montrent que chacune des espbces possbde une aminopeptidase ayant la meme mobilitC ClectrophorCtique chez les quatre espbces (dCsignCe AP I). Cependant sa spkcificitk n'est pas la meme chez toutes les espbces (tableau 3). Elle montre une spCcificitt large chez L. helveticus et L . acidophilus oii tous les acides amints P-naphtylamides test& Ctaient hydrolysts (A l'exception de l'acide L-aspartique PNA). La sptcificitt de l'enzyme AP I est plus ttroite chez L . lactis, car seuls les dCrivCs P-naphtylamides de l'argi- nine, de la leucine et de l'alanine ttaient hydrolysks ou chez L. bulgaricus ou seule l'arginine P-naphtylamide Ctait hydrolysCe. Lactobacillus lactis se distingue des autres espbces par la presence d'une seconde minopep- tidase (dtsignCe AP 11) de plus grande mobilitt klectro- phoretique n'hydrolysant que le substrat arginine PNA.

Afin de distinguer, vis-A-vis des dipeptides, l'action hydrolytique due aux aminopeptidases de celle revenant aux dipeptidases vraies, une ktude comparative a CtC

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

1184 CAN. J. MICROBIOL. VOL. 28, 1982

TABLEAU 1. Mise en tvidence des diffkrentes activitks de type peptide-hydrolase chez les lactobacilles du groupe Thermobacteriuma

L. helveticus L. acidophilus Substrats CNRZ 303 NCDO 1

ActivitC aminopeptidasique Leucine-p-nitroanilide 24,0(+ 1,23) 18,7(+0,93) Lysine-p-nitroanilide 4,0(+0,31) 12,5(*0,87) Alanine-p-nitroanilide 2,2(+0,20) 6,2(+0,43)

L. lactis CNRZ 250

L. bulgaricus CNRZ 369

ActivitC dipeptidasique 2,2(+0,14) 1,8(*0,16)

ActivitC casCinolytique 4,7(*0,37) 1,2(+0,12)

ActivitC carboxypeptidasique 0 0

ActivitC endopeptidasique Glutaryl-phknylalanine-p-nitroanilide 0 0 Succinyl-phknylalanine-p-nitroanilide Benzoyl-arginine-p-nitroanilide

"Les dsultats sont exprimds en activitk spt5cifique. Ils reprdsentent la moyenne de quame essais. Les kcarts de chaque moyenne sont donnks dans les parenthkses.

bZ = benzyloxycarbonyl. 'Y = glycyl-arginine, glutamyl-tyrosine, glycyl-hyptophane, glycyl-phdnylalanine, glycyl-sdrine, glycyl-acide aspartique, glycyl-lysine.

TABLEAU 2. HydrOlyse des protkines du 1actosCrum par les extraits cellulaires bruts de diffkrents lactobacilles

Substrats

P-Lactoglobuline a-Lactalbumine

L. helveticus CNRZ 303 0,08(*0,008) 0,25(*0,022) L. acidophilus NCDOl 0,52(+0,031) 0 L. lactis CNRZ 250 0,07(*0,008) 0,22(*0,020) L. bulgaricus CNRZ 369 0,22(+0,019) 0,27(+0,024)

NOTE: Les dsultats sont exprimds en activitd sp6cifique. Us reprksentent la moyenne de hois essais. Les &arts de chaque moyenne sont donnds dans les parenthkses.

effectuCe sur chacun des demi-gels aprbs section longi- tudinale du cylindre d'acrylamide.

I1 apparait que les espbces se distinguent par le nombre et la spCcificitC des dipeptidases (fig. 1 et tableau 3). Les plus nombreuses ont CtC rCvC1Ces chez L. lactis oh l'on dCmontre la prCsence de trois zones d'activitk dipeptidasqiue (DP I, DP 11, DP 111) distinctes des deux aminopeptidases. Lactobacillus acidophilus se dis- tingue par la prksence de deux activitks dipeptidasiques, tandis que chez L. helveticus et L. bulgaricus on ne retrouvait qu'une seule activitC dipeptidasique. Une dipeptidase montrait une migration ClectrophorCtique identique chez les quatre espbces (dCsignCe DP I). Cette enzyme possbde une spCcificitC large chez L. helveticus, L. lactis et L. bulgaricus tandis qu'elle n'hydrolysait que les dipeptides Leu-Leu, Leu-Gly et Ala-Met chez L.

acidophilus (tableau 3). En gCn6ra1, les dipeptidases se distinguaient des aminopeptidases par une mobilitC ClectrophorCtique plus forte (fig. 1).

De'gradation pre'fe'rentielle des case'ines par les lactoba- cilles

Toutes les espbces CtudiCes attaquaient la casCine entibre (tableau I), mais il est possible de les classer en trois groupes suivant la dkgradation prkfkrentielle des casCines as, et p (fig. 2).

La premibre classe regroupe L. lactis et L. bulga- ricus, espbces hydrolysant les casCines asl et P. 11 faut cependant noter que le degrk de l'hydrolyse variait selon la fraction ou l'espbce considkrke. En effet, L. lactis entrainait une hydrolyse complbte de la castine P avec formation de deux bandes de faible mobilitk et d'une

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

1 EL SODA ET DESMAZEAUD

0 DPI

A PI

O origine

FIG. 1. Fractionnement des activitks aminopeptidasiques et . . . . . . . . . . . . dipeptidasiques de la fraction soluble des broyats des lactoba- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . cilles et caractkrisation des activitks aprbs klectrophorbse sur . . . . . . . . . . . . . . . -'. . gel de polyacrylamide. L'klectrophortse ktait rkaliske dans un

gel de polyacrylamide A 7% en tampon Tris-borate de pH 7,O dans des tubes 7 x 0,5 cm. Les aminopeptidases (AP I ou AP 11) ktaient localiskes en incubant i 25°C les gels, aprbs migration klectrophorktique, dans un mklange contenant le substrat (acide amink - P-naphtylamide) et une solution de Fast Garnet GBC. Aprts 15 rnin, on notait I'apparition d'un anneau de couleur rouge. Les dipeptidases (DP I, DP I1 ou DP HI) ktaient localiskes en incubant les gels dans un mklange contenant le substrat (dipeptide), de la L-amino-acide oxydase, de la peroxydase et une solution aqueuse de 0-dianisidine. On I notait l'apparition d'un anneau de couleur brune. Les dif-

/ fkrents substrats hydrolysks par chaque enzyme sont indiquts 'I au tableau 3. 1 = L. helveticus; 2 = L. acidophilus; 3 = L. / lactis; 4 = L. bulgaricus.

1 bande de forte mobilitC. Lactobacillus bulgaricus se I distingue de L . lactis par une hydrolyse moins poussCe

de la castine p, puisque l'on n'observait la formation i que d'un seul peptide de mobilitC supCrieure h celle-ci.

Les deux espbces ont un comportement trbs proche vis-h-vis de la casCine asl. En effet, cette castine n'ttait

. . . . . . . . . . . . . que partiellement hydrolyde, mais on notait l'appari- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . .:-' .. tion de deux nouveaux peptides de migration Clectro- . . . . . . . _ . _ _ . . . . . . . . . . . . . __ , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . " phoretique assez semblable.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Le deuxibme groupe, oh seule la casCine asl ttait

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - ' . :. - . hydrolyste, est constituC de L. helveticus. Cette bactkrie

. . hydrolysait partiellement la casCine asl en libtrant deux peptides. 11 est intCressant de noter que la migration tlectrophorCtique de ces peptides se rapprochait de celle trouvCe chez L. bulgaricus et L. lactis. Dans le dernier groupe (L. acidophilus) seule la casCine P Ctait hydro- lysCe.

Comparaison des activite's peptidasiques chez diffi- rentes souches d'une mCme espe'ce

Afin de mieux caracttriser chaque espbce, une etude comparative des activitts de plusieurs souches a Ctt effectuCe. Les rksultats obtenus montrent que l'on retrouve les mCmes activitCs peptidasiques chez toutes les souches d'une m&me espbce (tableau 4). Cependant une forte dispersion des activitCs spCcifiques doit &tre

g 5 5 5

a s s

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

1186 CAN. J . MICROBIOL. VOL. 28, 1982

TABLEAU 4. Comparaison des activitts peptidasiques chez plusieurs souches d'une m&me espkce des lactobacilles

ActivitC enzymatique et substrats

Ap, DP, c p , Endopeptidase ActivitC Leu-NA Ala-His Z-Gly-Arg Suphepa casCinolytique

Lactobacillus helveticus CNRZ 249 CNRZ 244 CNRZ 223 CNRZ 303

Lactobacillus lactis CNRZ 239 CNRZ 245 CNRZ 252 CNRZ 250

Lactobacillus bulgaricus CNRZ 418 CNRZ 397 CNRZ 419 CNRZ 369

NOTE: AP = aminopeptidase, DP = dipeptidase, CP = carboxypeptidase, Leu-NA = leucine paranitroanilide, Ala-His = alanyle-histidine, Z-Gly-Arg = benzyloxycarbonyl-glycyl-arginine et Suphepa = succinyl-phBnylalanine paranitroanilide. Les rksultats sont exprimBs en pourcentage, par rapport ti la souche la plus active pour chaque esptce.

notke. Par exemple, l'activitk dipeptidasique de la souche L. helveticus CNRZ 249 ne reprksente que 8% de celle de la souche de L. helveticus CNRZ 303. L'activitk aminopeptidasique de la souche L. lactis CNRZ 252 ne reprksente que 17% de celle de la souche L. lactis CNRZ 250. Enfin, seule la souche L. helveticus CNRZ 244 possbde une activitk de type carboxypepti- dasique puisqu'elle hydrolysait le substrat Z-Gly-Arg.

Discussion Les techniques de dosage utiliskes au cours de cette

ktude ont permis un fractionnement rapide et prkcis des diffkrents types de peptide-hydrolases chez quatre espB ces de lactobacilles du groupe Thermobacterium utilisks en industrie laitikre. Par ces mkthodes, il a kt6 possible de dkmontrer qu'en plus d'une activitk caskinolytique non specifique, le systbme protkolytique des ces bac- tkries se compose surtout d'exopeptidases: aminopepti- dases et dipeptidases. Ces rksultats se rapprochent de ceux prkckdemrnent dkcrits par Vescovo et Bottazzi (1979). En effet, ces auteurs ont montrk la prksence

FIG. 2. Hydrolyse des casCines aSl et P par les extraits intracellulaires de diffkrents lactobacilles. Aprks hydrolyse pendant 48 h par les extraits bruts intracellulaires, les melanges reactionnels contenant de la casCine a,, ou P Ctaient sournis B l'Clectrophor&se (en presence d'agents dissociants) i 4°C pendant 3 h sous une tension de 13 V/cm. Les prottines et les peptides Ctaient ensuite rnis en evidence par coloration par le Bleu de Coomassie R250. 1 = L. helveticus; 2 = L. acidophilus; 3 = L. lactis; 4 = L. bulgaricus; 5 = tCmoin contenant la casCine aSl ou p non hydrolyde.

d'une aminopeptidase et d'une dipeptidase cytoplasmi- ques chez L. helveticus. Aucune activitk sur les substrats hydrolysks par la chymotrypsine (Suphepa et Gluphepa) n'avait pu Stre mise en evidence. SIdrhaug et Solberg (1973) avaient aussi montr6 la prksence d'une dipepti- dase vraie chez L. acidophilus. Par contre, nos rksultats s'kloignent de ceux obtenus par Eggimann et Bachmann (1980) qui ont retrouvk une activitk carboxypeptidasi- que chez L. lactis.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

EL SODA ET DESMAZEAUD 1187

: I1 est possible de noter des diffirences significatives entre le systkme peptidasique des Thermobacterium et celui des Streptobacterium. En effet, L. casei posskde, en plus de l'activitk caskinolytique non spkcifique, de

; I'activitC aminopeptidasique et de l'activitk dipeptidasi- que (retrouvkes chez les Thermobacterium), une activitC

; du type carboxypeptidasique (El Soda, Bergkre et al. 1978; El Soda, Desmazeaud et al. 1978) ainsi qu'une activitC aryl-peptidyl amidase hydrolysant les substrats Gluphepa et Suphepa (El Soda et Desmazeaud 1981). Les lactobacilles du groupe Thermobacterium se distin-

. . guent aussi de L. casei par la prksence de protkases vraies dans leur systbme protkolytique puisque les

. . . . . , . . . . . . . . . . . .

caskines aSl et p sont fortement hydrolyskes avec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . formation de nouveaux peptides dktectables par Clectro-

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : . . , phorkse. La prksence d'une protease avait dCj2 CtC dCcrite chez L. lactis (Eggimann et Bachmann 1980) et

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .- ........ ., , L. bulgaricus (Argyle et al. 1976). ................................... .... ............ : . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . .

. ., ~. Contrairement A la plupart des ktudes concernant les . . . , "

i systkmes protColytiques des bactkries lactiques, nous . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . j nous sornmes aussi interessCs 2 l'hydrolyse des pro-

, . . . . . . . -

. j ttines du 1actosCrum. En effet celle-ci pourrait revstir, . . .

. . . j dans les prochaines annCes, une importance de plus en ! plus grande pour la qualitk des fromages affinCs par suite 'i du dCveloppement des techniques d'ultrafiltration en

. . I technologie fromagkre. Le fait le plus important est que I toutes les espkces testCes ont montre une activitk j vis-2-vis d'au moins l'une de ces protkines. L'hydrolyse / des protkines du 1actosCrum par les bactkries lactiques a I aussi Ctk rapportte par Shankar et Davies (1978).

Cette Ctude permet donc de dkmontrer la richesse du ; systkme peptidasique des lactobacilles du groupe Ther- i mobacterium. Ce fait peut expliquer les fortes concen-

trations en acides aminks retrouvkes dans les cultures dans le lait de ces bactkries (Miller et Kandler 1967; Tourneur 1974; Chebbi et al. 1974). En effet, ces

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .................................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . bactCries posskdent 2 la fois les systkmes permettant ; .. : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :-. I.. .:--

.:.:.:.-::..: . . :;r -.: ::: .::.:.:.::I.: :.:: :.::::: d'hydrolyser les casCines et le systkme exopeptidasique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

(arninopeptidases et dipeptidases) de large sptcificitk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

permettant l'hydrolyse des peptides issus de ces ca- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . skines.

La forte hydrolyse de la castine P par L. lactis peut aussi reprksenter une importance technologique puis- que, avec l'exception de S. thermophilus (Desmazeaud et Jug6 1976), c'est en gCnCral la caskine aSl qui est dCnradCe par les bactkries lactiaues (Annibaldi 1962: Oh;nihya i t Sato 1969).

. .

ACCOLAS, J.-P., D. HEMME, M. J. DESMAZEAUD, L. VASSAL, C. BOUILLANNE et M. VEAUX. 1980. Les levains lactiques therrnophiles: propriCtCs et comportement en technologie laitikre. Lait, 60: 487-524.

ANNIBALDI, S. 1962. Action casColytique de quelques micro- organismes. Congr. Int. Lait. 16th, B. pp. 545-555.

ARGYLE, P., G. MATHISON et R. CHANDAN. 1976. Production

of cell bound proteinase by Lactobacillus bulgaricus and its location in the bacterial cell. J. Appl. Bacteriol. 41: 175-184.

CHEBBI, N., N. CHANDER et B. RANGANATHAN. 1974. Caseinolytic activity of lactic acid bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol. 20: 149- 152.

CHRAMBACH, A., R. REISFELD, M. WICKOFF et J. ZACCARI. 1967. A procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 20: 150- 154.

DE MAN, J., M. ROGOSA et M. E. SHARPE. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23: 130-135.

DESMAZEAUD, M. J., et J.-C. GRIPON. 1977. General mecha- nism of protein breakdown during cheese ripening. Milch- wissenschaft, 32: 731-734.

DESMAZEAUD, M. J., et M. JUG&. 1976. CaractCrisation de I'activitC protColy tique et fractionnement des dipeptidases et des aminopeptidases de Streptococcus thermophilus. Lait, 55: 1-20.

EGGIMANN, B., et M. BACHMANN. 1980. Purification and partial characterization of an arninopeptidase from Lacto- bacillus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 40: 876-882.

EL SODA, M., J.-L. BERG~RE et M. J. DESMAZEAUD. 1978. Detection and localization of peptide hydrolases in Lacto- bacillus casei. J. Dairy Res. 45: 519-524.

EL SODA, M., et M. J. DESMAZEAUD. 198 1. General proper- ties of a new ribosomal Aryl-peptidylamidase in Lactobacil- lus casei. Agric. Biol. Chem. 45: 1693-1700.

EL SODA, M., M. J. DESMAZEAUD, S. ABOU DONIA et N. KAMAL. 1981. Acceleration of cheese ripening by the addition of whole cells or cell free extracts from Lactoba- cillus casei to the cheese curd. Milchwissenschaft, 36: 140- 142.

EL SODA, M., M. J. DESMAZEAUD et J.-L. BERGERE. 1978. Peptide hydrolases of Lactobacillus casei: isolation and general properties of various peptidase activities. J. Dairy Res. 45: 445-455.

GRIPON, J.-C., M. ,J. DESMAZEAUD, D. LE BARS et J.-L. BERG~RE. 1975. Etude du r6le des microorganismes et des enzymes au cours de la maturation des fromages. II. Influence de la prksure comrnerciale. Lait, 55: 502-516.

LAW, B. A., et M. E. SHARPE. 1977. The influence of the microflora of Cheddar cheese on flavour development. Dairy Ind. Int. 42: 10-14.

LEWIS, W. H. P., et H. HARRIS. 1967. Human red cell peptidases. Nature (London), 215: 35 1-355.

LOWRY, 0 . H., N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR et R. J. RANDALL. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

MILLER, C. G., et K. MACKINNON. 1974. Peptidase mutants of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 120: 355-363.

MILLER, I., et 0. KANDLER. 1967. Proteolysis and liberation of free amino acids by lactic acid bacteria in milk. II. Liberation of free amino acids by thermobacteria. Milch- wissenschaft, 22: 469-480.

MOORE, S., et W. H. STEIN. 1954. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J. Biol. Chem. 211: 907-913.

OHMIHYA, K., et Y. SATO. 1969. Studies on the proteolytic action of dairy lactic acid bacteria. Action of Lactobacillus

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.

1188 CAN. J . MICROBIOL. VOL. 28, 1982

bulgaricus, Lactobacillus helveticus and Streptococcus lactis on casein. Agric. Biol. Chem. 33: 669-675.

RONCARI, G., et H. ZUBER. 1969. Thermophilic aminopepti- dase from Bacillus stearothermophilus. i. Isolation specifi- city and general properties of the thermostable aminopepti- dases. Int. J. Protein Res. 1: 45-61.

SHANKAR, P. A., et F. L. DAVIES. 1978. Activitks pro- tkinasique et peptidasique des bactkries du yoghourt. Congr. Int. Lait. 20th. p. 473.

SHARPE, M. E. 1979. Lactic acid bacteria in the dairy industry. J. Soc. Dairy Technol. 32: 9-18.

S~RHAUG, T., et P. SOLBERG. 1973. Fractionation of dipepti-

dase activities of Streptococcus lactis and dipeptidase specificity of some lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. 25: 388-395.

TOURNEUR, C. 1974. Les caractkres de I'activitC protColy- tique des lactobacilles. Congr. Int. Lait. 19tl-1, IF. pp. 398-399.

URIEL, J. 1966. MCthode d'klectrophorkse dans les gels d'acrylamide-agarose. Bul. Soc. Chirn. Biol. 48: 969-982.

V~scovo, M., et V. BOTAZZI. 1979. Characteristics of lactic acid bacteria in natural whey cultures. VI. Cytological location of the proteolytic system in Lactobacillus helveti- cus. Sci. Tec. Latt. Casearia, 30: 434-443.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IV W

IND

SOR

on

11/1

8/14

For

pers

onal

use

onl

y.