Volumen XXXIII, Fasciculus VI (1950) ~ KO. 213-214. 1651

2. On met en suspension dans 80 om3 d’acide ac6tique bouillant 1,65 g de styryl- 3-nitro-2-fluorCnone1), refroidit B 70° et introduit, B cette tempbrature, goutte B goutte, tout en agitant, la solution de 3 g d’anhydride chromique dans 44 cm3 d’acide acktique B 90%. Coperation dure une heure. Apres refroidissement, on code dans 500 cm3 d’eau, essore le precipite e t le purifie par dissolution et reprecipitation comme ci-desaus: 0,85 g. AprAs une cristallisation dans l’acide acktique, le F. est A. 273O. Le F. du melange ne montre pas de depression.

3,694 mg subst. ont donne 8,430 mg CO, e t 0,840 mg H,O 4,182 mg subst. ont donne 0,201 cm3 N, (22O, 709 mm)

C1,H,O,N Calcule C 62,46 H 2,62 N 5,20% (269,20) Trouvb ,, 62,28 ,, 2,54 ,, 5,19%

Pour preparer le p-dimethylamino-anilide de cet acide, on opere de la rnaniere suivante. On introduit 0,5 g d’acide dans 10 om3 de chlorure de thionyle, ajoute une trace de chlorure d’aluminium e t chauffe le melange B l’6bullition au reflux jusqu’a cessation du degagement de gaz chlorhydrique. On distille le chlorure de thionyle sur le bain- marie, traite le r6sidu par un peu de benzene et distille le benzene et I’oxychlorure de phosphore dans le vide sur le bain-marie. Le chlorure d‘acide ainsi obtenu est purifib par une cristallisation dans le chlorobenzene. On le dissout it chaud dans 15 cm3 de chloro- benzene et ajoute 0,28 g de p-dimethylamino-aniline. Le produit de rbaction se precipite aussitbt, cristallin; on l’essore, le lave B l’acetone, A. l’eau chaude et derechef A l’acbtone et le cristallise dans le nitrobenzene: 0,32 g. Aiguilles rouge brun, F. 269O (dec.).

Le produit est identique au produit A, de m6me F., obtenu dans la condensation de la m6thyl-3-nitro-2-fluorbnone avec la p-nitroso-dimethylaniline.

R I ~ s u M I ~ . La m6thyl-3-nitro-2-fluor6none se condense par son groupe

m6thyle actif avee la p-nitroso-dimdthylaniline. La rBaction fournit deux produits : le p-dim6thylamino-anile du nitro-2-fluorhone- ald6hyde-3 et le p-dimkthylamino-anilide de l’acide nitro-2-fluor6none- carboxylique-3.

Institut de Chimie de I’Universit6 de Fribourg (Suisse).

214. Les substituants des groupes Sur les polysaccharides

amino de I’h6parine2). amin6s 113)

par Kurt H. Meyer et e t D.E. Schwartz. (18 VIII 50)

Dans le cadre de nos travaux sur la constitution de certains polysaccharides azot6s, tels que la chitine*), l’acide chondroltine- sulfurique3) et l’acide hyal~ronique~), nous avons Bgalement abord6

l) Helv. 33, 1175 (1950). ?) Communication prdiminaire : o Contribution 21 1’6tude de l’hdpariner Exper.,

3, Communication I: K . H.Meyer, M.E.Odier& A.E.Siegrist, Helv. 32, 1400 (1948). 4) K. H . Meyer d H . Wehdi, Helv. 26, 353 (1937). 5, K. H . Meyer d J. FeZZig, Experientia 6, 186 (1950).

6, 332 (1950).

1652 HELVETICA CHIMICA ACTA.

1’8tude de l’hhparine. Ce polysaccharide, extrait principalement du foie et du poumon, est l’anticoagulant nature1 du sang.

MalgrB les tr&s nolnbreux travaux sur l’hbparine, sa constitution est encore loin d’8tre parfaitement connue.

On sait que I’hbparine est formde de restes glucosamine1)2) et g luc~ron ique~)~) qui sont dans le rapport de l:14). Jorpev & Berg- str0m5) ont montrB qu’il s’agit d’un polysaccharide polysulfate dans lequel le rapport du soufre A l’azote est d’environ 2,s a 1, mais ils n’ont pu specifier le mode de liaison des restes sulfate. 11s ne trou- vbrent pas de groupes amino libres. Wolfrom et ~ 0 1 1 . ~ ) ne trouvent pas non plus de groupes amino libres sur le produit brut, mais trou- vent’) ‘1, de l’azote sous forme de groupes amino libres sur un sel de baryum recristallise de I’h8parine.

En ce qui concerne la teneur en acbtyle de l’heparine, les rksultats de la litterature sont trbs contradietoires et varient de 0 0’5 groupes acetyle par atome d’azote suivant les auteurs et le mode de dosage 5)6)8).

Nous avons donc repris 1’6tude du mode de liaison de l’azote des restes glucosamine de l’hdparine.

Aprbs avoir BliminB toute une serie de substituants possibles, nous sommes arrives A la conclusion que ces groupes amino sont substitues par des restes sulfate dho tan t ainsi la presence dans l’h6- perine de liaisons du type acide sulfamique.

Alors que ce travail Ptait termin@), est paru un article de Jorpes, Bergstrom & Muttlo), dans lequel ces auteurs arrivent a la meme conclusion. Comme ces conclusions identiques sont le r h l t a t de methodes de travail et de raisonnements diff&rents, nous avons jug6 utile de publier nos propres experiences.

Toutes nos recherches ont Bt6 effectudes sur l’hdparine Rvche commerciale ((Liqubmine Rochell) I). Ce produit est exempt de proteines.

l) E. Jorpes, Biochem. J. 29, 1817 (1935). 2, E. Jorpes d 8. Bergstrom, Z. Physiol. Chem. 244, 253 (1936). 3, M . L. Wolfrom & F. A. H . Rice, Am. SOC. 68, 532 (1946). 4, H . Masamune, M . Suzuki d Y. Kondoh, J . Biochem. (Japan) 31, 343 (1940). 5, E. Jorpes d S. Bergstrorn, J. Riol. Chem. 118, 447 (1937). 6, M . L. Wolfrom, D . I . Weissblatt, J . V . Karubinos, W . H . McNeely d McLeun,

7 ) M . L. Wolfrom d V . H . McNeely, Am. SOC. 67, 748 (1945). 8, A . P . Charles & A. R. Todd, Biochem. J., 34, 112 (1940). 9) These NO 1155 presentee a la Facult6 de Sciences de l’Universit6 de GenPvc le

lo) E. Jorpes, S. Bergstrom & V . Nutt , J. Biol. Chem. 183, 607 (1950) (fasc. d’avril). 11) Nous tenons L remercier la Maison Hoffmann-La Roche (BBle) qui nous a fourni

Am. SOC. 65, 2077 (1943).

21.3.1950.

ce prodnit.

Volumcn XXXIII, Fasciculus VI (1950) - So. 214. 1653

Dosage des groupes amino librcs de l’h6pariv&e. Pour ce dosage, nous avons utilisd la methode a I’acide nitreux

de van S l y k e l ) dans laquelle I’azote ddgagk au cours de la reaction est mesurd volumdtriquement. Nous avons effectu4 la reaction h une temperature aussi basse que possible afin d’dviter tout risque d’hydro- lyse. Ainsi nous trouvons dans l’hdparine 10% de l’azote sous forme de groupes amino libres. (Fig. 1.)

P 1 2 3 4 5 6 7 8 3 rmp

en h r e S

Fig. 1. Equivalents d’azote libkre‘ en fonction d u temps a u c o w s d u dosage a l’acide nitreux selon

van 81 yke.

Xous avons essay6 de verifier le dosage selon van S l y k e en ap- pliquant l’hdparine la mdthode au dinitrofluorobenzkne (DNFB) mise au point par Porter & Sanger2) pour le dosage des groupes amino libres des protkines. Mais alors que la glucosamine elle-m6me rdagit avec le DNFB pour donner la dinitro-l,2-ph6nyl-4-glucosamine que nous avons isolde, nous n’avons pas rdussi A obtenir un produit de condensation du DNFB avec l’hdparine.

Dosage des groupes ace? yle. Nous avons utilise la mkthode de Bredereck3) qui consiste en une

alcoolyse des restes N- ou 0-acdtyles. Comme la reaction est trks lente avec les polysaccharides du type de l’heparine ou de l’acide chondroitine-sulfurique, nous avons modifie les conditions prd- conisees par Bredereck. En remplapant I’dthanol par le mdthanol, et en ajoutant de l’acide sulfurique B I’acide p-tolubne-sulfonique qui sert de catalyseur, nous avons pu reduire de moiti6 le temps ndcessaire au dosage (fig. 2). Nous avons ainsi trouvd que l’hdparine renfermait un groupe acdtyle pour 4 atomes d’azote.

Par hydrolyse de l’hkparine et titrage des acides entrainables a la vapeur d’eau, nous avons obtenu le meme resultat.

l) D. D. van Slyke, B., 43, 3170 (1910). *) R. R. Porter & F. Sanger, Biochem. J., 42, 287 (1948). 3, H . Bredereck, Z. ang. Chem., 1932, 242.

1654 HELVETICA CHIMICA ACTA.

v . . . . . . . . . I , , , ’ , *

Fig. 2. Dosage des N-acktyles.

2 4 6 8 I0 I2 (4 16 lB I D 22 24 26 28 70 Gmp m hmns

CI Ac. chondroitine-sulfuriyue, selon Bredereck o Ac. chondro’itine-sulfurique, selon notre modification 0 Heparine Roche, selon notre modification

Rech,erche d’acides organiques volatiles et non volatiles. Le distillat a la vapeur d’eau de l’hkparine hydrolyske ne rdduit

pas le chlorure mercurique et ne contient donc pas d’acide formique. Si aprks distillation a la vapeur, un hydrolysat d’hdparine est

extrait a l’dther, cet extrait ne contient pas d’acides. I1 n’y a donc pas d’acide organique non volatil dans l’hdparine. Les rksultats ob- tenus - sont rksumds dans le tableau I.

Tableau I . Rdpartition de l’azote dans l’hkparine Roche, exprimke en kquivalents.

Azote total . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00 Azote protBinique . . . . . . . . . . . . . 0,OO NH,libre . . . . . . . . . . . . . . . . 0 , l O N-AcBtyle . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 Autre NH, substituk . . . . . . . . . . . O,65

Groups sulfates . . . . . . . . . . . . . 3,00 Autres acides organiques ou inorganiques . . . 0,OO

Purification e’lectrophore’tique de l’hdparine. Masamunel) ainsi que Wolfrom2) n’ayant pas trouvk de groupes

acktyle dans l’hkparinate de baryum recristallisd, nous avons pens6 que nos rdsultats devaknt 6tre attribues a un polysaccharide acdtylk, accompagnant l’hdparine dans la Liqudmine. En effet, Wolfrom &

l) H . Masamune, M. Suzuki & Y. Kondoh, J. Biochem. (Japan) 31, 343 (1940). 2, M . L. Woyrom, E. I . Weissblatt, J . V . Karabinos, W . H . Me Neely & Me Lean,

Am. Soc. 65, 2077 (1943).

Volumen XXXIII, Fasciculus VI (1950) - No. 214. 1655

Rice1) ont trouvd que m&me l’hdparine purifiPe peut contenir jusqu’h 40 yo d’une substance inactive et immobile a l’dlectrophorkse. Aussi avons-nous effectud des dlectrophorkses sur la Liquemine (solution B 4%, tampon vdronal-acdtate, pH 4 6 , p = 0’1) et nous avons effec- tivement observe deux composantes, dont la principale, formant’ environ 90 yo du produit, migre trks rapidement (mobilitd dleetropho- rdtique: 15.10-5 em2 sec-lvolt-l, alors que la seconde est immobile. La composante mobile renferme la totalitd de l’activite anticoagu- lante, elle est exempte de groupes acdtyles ; la composante immobile, qui n’a pas d’activitd, confient env. 19% d’acdtyle et semble donc &re composde exclusivement de restes acWyl-hexosamine. La presence de ce polysaccharide rend ainsi compte de la totalitd des groupes acdtyle trouves dans l’hdparine Roche.

Argaments en fuveur de la presence de groupes szllfumiques dans l’hdparine.

Comme l’hkparine ne contJient aucun autre acide organique que l’acicle glucuronique et aucun autre acide inorganique que l’acide sulfurique, on doit admettre que l’azote des restes glucosamine de l’hdparine est substitud par des groupes -SO,H. En effet, la substi- tution des groupes amino par des groupes carboxyle uroniques est exclue par le fait que le titrage potentiomdtrique indique la presence d’un groupe carboxyle par reste glucuronique (fig. 3).

dquivalent d’azote et, par consdquent, par

I , , , I L . , I , , , , u,z a4 qs a , IU 12 14 it 18 eo cn31r,so+?i1--n

Fig. 3. Titrage de l’hkpurine.

1,6 cm3 d’une solution d’hdparine 0,Ol-n. en azote

L’hypothkse d’une substitution de ces groupes amino par des groupes alddhydiques, qu’ont proposke Wolfrom & McNeely 2), a 6td exclue par Jorpes, Bergstrom & Matt3) , qui ont montr6 que

l) M . L. Wolfroln & F. A. H . Rice, Am. SOC. 69, 2918 (1947). 2, W . L. Wolfrom & W. H . NcNeely, Am. SOC. 67, 748 (1945). s, E . Jorpes, S. Bergstrom & V . Mutt, J. Biol. Chem. 183, 610 (1950).

1656 HELVETICA CHIMICA ACTA.

l’apparition de groupes amino libres supplementaires lors d’une hydrolyse menagbe, ne correspondait pas a une augmentation du pouvoir rbducteur. Nous sommes arrivQs a la m6me conclusion en montrant que l’hkparine, Roumise a une reaction de van Xlyke pro- longke, au cours de laquelle il y a un lent degagement supplkmentaire d’azote (cf. fig. l), ne presentait aucune baisse de la viscositk (cf. tableau 11), baisse qui se produirait si l’apparition de groupes amino lihres supplementaires correspondait a une rupture tie liaisons NH- glucosidiques dans la chaine.

Par hydrolyse acide de l’hkparine, nous avons pu constater la liberation de 1,5 groupes sulfate par groupe amino libere (fig. 4) ce qui est en accord avec les resultats de Jorpes, Bergstromd3 Mutt1).

A Equiva/m7s libere? ~ la.& ha/ - 100)

OJ ~

cn h a m s Fig. 4.

Hydrolyse des groupes sulfates de l’hkparine (HCI 0,4-n.). m Groupes sulfates libbrbs

Groupes amino libbr6s = N-sulfates scindbs o 0-sulfates scindBs (par diffkrence)

A %byddpn

/a% -

en mimtes Fig. 5.

Cornparaism des vitesses d’hydrolyse de divers N - et 0-sulfates (HCl 1-n.) 0 Glucosamine-N-sulfate m N-MonomBthyl-sulfamate o Glucose-6-sulfate o Monom4thyl-sulfate

l) E. Jorpes, S. Bergstrom & V. Mut t , J. Biol. Chem. 183, 611 (1950).

Volumen XXXIII, Paic.icuhis VI (1950) - No. 214. 1657

Cette scission plus rapide des N-sulfates que des 0-sulfates de l’hdparine est en contradiction apparente avec le fait que le mono- mkthylsulfate s’hydrolyse en milieu acide plus rapidement que le N-monomBthyl-sulfamtel)2) (fig. 5).

Afin de comparer la vitesse relative d’hydrolyse de composes dont la structure est plus proche de celle de l’h4parine que ces deux ddrivks, nous avons synthhtisk le glucosamine-N-sulfate et compare sa vitesse d’hydrolyse a celle du glucose-6-sulfate. Quoique ce dernier contienne u11 groupe sulfate lid a un hydroxyle primaire, c’est Bgale- ment le glucosamine-N-sulfate qui est mind6 le plus rapidement, ce qui Plimine la contradiction mentionnee ci-dessus et confirme donc la presence de restes glucosamine N-sulfate dans l’heparine (fig. 5) .

Lorsque 1’011 traite l’hdparine par l’acide nitreux, il se forme un derive nitrose de celle-ci, comme c’est le cas general pour les sul- famates3). En effet, l’h6parine ainsi traitee donne une rdaction de Liebermann4) positive et sa teneur klevke en azote, compte tenu de l’azote des groupes amino libres qui a disparu par action de l’acide nitreux, ne peut s’expliquer que par la formation d’un nitroso-d&ivk.

Par ce traitement a l’acide nitreux, le poids molkculaire de l’he- parine n’est pas diminuk, sa teneur en soufre demeure inchangde, mais par contre son activit6 anticoagulante disparait (tableau 11).

Tableau 11. Action de l’aeide nitreux sur l’hdparine.

ActivitB en Temps Teneur d’activite

en heures en soufre d’h6parine standard

r18pc.’c

HBparine soumise aux con- ditions de la reaction de 1 1 1 118% I 6% 1 0,095 1 van Slfike:

- Heparine souniise B I’action 15 11,3”/, 95 % du tampon ac6tate seul (pH = 4) I 49 1 1%7% 1 76% 1 - I --

I 4% I 0,105 I ac. nitreux+ tampon acetate (pH = 4)

l) W . Traube, J . Hoerenz CE F . Wunderlich, B. 52, 1272 (1919). 2, W . Traube 4- E. Brehmer, B. 52, 1284 (1919). 3, W. Trazcbe & E . Brehmer, B. 52, 1254 (1919); C. Paul & L. Lozuitzsch, B . 30,

4, C . Liebermann, B. 3, 457 (1870). 869 (1897).

1658 HELVETICA CHIMICA ACTA.

teneur en amino libre provient d’une hydrolyse de ceux-cil), le reste des groupes sulfate &ant fix6 sur les hydroxyles alcooliques des restes glucosamine et glucuronique.

Le type de liaison de ces restes hexoses entre eux ainsi que la position des groupes 0-sulfates, n’ont pas encore Bt6 dbtermin8s.

Part ie e xp Crini en t ale. Ces recherches ont 6tk effectuees sur I’hkparine Roche commerciale (Liqukmine

Roche). Ce produit contient 15,8% d’humiditi.. SBchi? a poids constant (48 h. B 78O sous 0,l mm Hg, en presence de P,O,), il a la composition kkmentaire suivante: 223% C; 4,8% H; 2,180h N; 13,4% S; 0,05% P; 38,2% cendres.

LP reaction de Millon2), la reaction a la ninhydrines), a i d que la reaction d’ddam- kiewicz4), sont negatives. Le produit est donc exempt de protbines.

Dosage d’activite‘. Les mesures d’activitk ont 6th faites selon la m6thode de Reinert & Winterstein5).

L’Ctalon dans ce dosage est l’heparine standard de Toronto (= sel sodique d‘une hkparine pnrifiee par la brucine), qui possede par definition une activiti: de 130 u. a. c . ~ ) mg.

Nous exprimons I’activitk de nos produits en % de I’activite de l’heparine standard de Toronto.

Poids mole‘culaire moyen. Nous mesurons le poids molkculaire moyen en determinant le pouvoir reducteur

selon une modification de la methode de Willsttitter & SchudeP). La prise (80 mg), laissite 3 jours au vide pousse afin d‘kliminer toute trace d’alcool, cst placee dans un flacon a pcser de 10 cm3. Elle est dissoute dans 1,8 em3 de tampon B l’hydrogenocarbonate de pH 10,6 (Na,CO, 0,4-n. + HCl 0,4-n. 5 : l ) . On ajoute 0,5 om3 d’une solution d‘iode OJ-n., laisse rkagir une demi-heure a l’obscurite, acidifie par 2,5 om3 d’acide sulfurique 5-n., e t titre par une solution de thiosulfate 0,04-n., en ajoutant vers la fin du titrage 1 om3 d’une solution d’amidon 0,05o/b dans I’acide sulfurique 0,Ol-n. On obtient ainsi un poids molkculaire moyen de 17000 A 18000, ce qui correspond a un degri: de polymerisation moyen d‘environ 50 restes hexoses.

Dosage des groupes amino libres selon van Slykes) (acide nitreux dans tampon acetate de pH 4).

Afin d’kviter autant que possible la reaction secondaire observee par Wolfrom et ~011.9), qui effectuent leur dosage B 25O, nous avons fait nos dosages dans une chambre froide B 5 0 . Pour rendre exactement reproductibles les essais de longue durke, l’appareil est plonge dans un bain d’eau glade.

I ) Comme ce pourrait 6tre Bgalement le cas pour le sel acide de baryum cristallise

2, E. R. Holiday, Biochem. J. 30, 1795 (1936). j) A . I . Virtanen & 2’. Laino, Nature 142, 754 (1938). 4, A. Adamkiewicz, Pldgers Arch. 9, 156 (1874); E. Komm d E. Bohringer, Z . physiol.

5 ) M . Reinert d A . Winterstein, Arch. Intern. de Pharmacodyn. e t de Ther. 62, 47

6 ) Unit& anticoagulantes (anticoagulant units). ’) R. Willslatter & G. Schudel, B. 51, 780 (1918); K . Linderstrom-Lang d H . Holter,

s, D. D. wan Sl?yke, B. 43, 3170 (1910). g, M . L. Wolfrom d W . H . XcNeely , Am. SOC. 67, 748 (1945).

obtenu par Wolfrom et coll., Am. Soc. 65, 2077 (1943).

Chem. 124, 287 (1922).

(1939); R. H. K . Foster, J. Lab. Clin. Med. 27, 820 (1942).

Ann. chim. anal. 39, 116 (1934).

Volumen XXXIII, Fasciculus VI (1950) - KO. 214.

Pre‘paration de la dinitro-l,3-phe‘nyl-4-glueosamine. 1,35 g de glucosamine libre, en solution dans 30 em3 d’eau sont verses dans 60 cm3

d’6thanol 95% renfermant 2,7 g de dinitrofluorobenz&ne (DNFB). La solution prend immediatement une intense coloration jaune. On laisse reagir 10 h. it 200, chasse I’alcool au vide, extrait 3 fois au benzhe, 1 fois & l’ether, laisse la couche aqueuse une nuit h la glaciere e t filtre 1,29 g de produit sous forme de longues aiguilles jaunes. Le rendement est de 50%. Le rendement peut 6tre augment6 en effectuant la reaction en milieu tam- p o n d & pH 7 3 . Cependant, le produit est alors plus difficile & purifier & cause des sels minbraux qui l’accompagnent e t du dinitrophhol form& On recristallise 2 fois dans le n-propanol e t obtient ainsi des cristaux fondant a 196O f 20 (COIT.).

La dinitro-l,3-ph8nyl-4-glucosamine est tres soluble dans I’eau, 1’8thano1, le metha- nol; soluble dans le dioxane et l’ac6tone; peu soluble dans 1’6ther; insoluble dans le benzene e t 1’6ther de pktrole.

C,,H,,O,N, Calcul6 C 41,77 H 4,38 iT 12,17% Trouve C 41,71 ,, 4,38 ,, 11,94%

1659

Dosage des ace‘tyles selon Bredereck’) modifie‘. Re‘actifs: Me‘thanol purifie‘ par distillation sur 20% en volume de NaOH aq. 0,5-n.,

puis s6chi: sur Mg et redistill& 40 cm3 de cet alcool, additionnes de phinolphtal6inr, doivent virer au rose par adjonction d’une goutte de NaOH 0,05-n.

Acide p-toluknesulfonique, pr6par6 par hydrolyse de son chlorure e t recristallis6 deux fois dans l’eau.

Acide sulfurique concentr6 Pro Analysi Merck. Appreillage: Identique & celui dkcrit par Freudenberg2). Me‘thode: On introduit successivement dans le ballon: la priEe (100-150 mg),

quelques bris de porcelaine, 15 cm3 de methanol, 2 g d’ac. p-tolu8nesulfonique et 2 cm3 d’acide sulfurique. On agite un peu pour homogbneiser e t plonge le ballon dans un bain d’huile de paraffine que Yon chauffe progressivement it looo. Le polysaccharide est parfois long & se dissoudre compktement. Apres un reflux de 4 heures, on distille pendant 10 min. & volume constant en introduisant peu it peu 10 om3 de mbthanol. Le reflux et la distil- lation & volume constant avec adjonction de methanol sont rBpetes encore 3 fois. Aprks la derniere distillation, on saponifie les distillats r6unis dans le ballon rAcepteur, par 10 min. d’kbullition en prksence de 40 om3 de NaOH 0,05-n., e t titre it froid en courant d‘azote I’exc8s de NaOH par H,S04 0,05-n. en presence de phenolphtal6ine. On fait simultanement un essai & blanc dans les m6mes conditions au moyen d’un second appareil identique. Les rksultats obtenus avec l’heparine sont don& dans le tableau I et la fig. 2. La dur6e totale du dosage est de 16 heures selon notre mbthode, elle est d‘environ 30 heures selon celles de Bredereck3). Notre methode a &ti: vbrifiee avec l’acide chondroitine-sul- furique dont les teneurs en acetyle e t en azote, exprimbes en equivalents, sont &gales.

Dosage des ace‘tyles par hydrolyse et entratnement des acides volatiles. Une prise de 80 mg d‘heparine est hydrolysee 24 heures B 1’6bullition dans 20 cm

d‘H,SO, 0,02-n. On ajoute 2 cm3 d’H,S04 2 4 . de fapon que la solution finale soit a m e concentration en H,S04 de 0,2-n. On entraine & la vapeur, condense celle-ci dans un rkfrigbrant serpentin e t recueille, & l’abri du CO,, dans un kcepteur plongB dans la glace, 800 cm3 de distillat. On titre au potentiomAtre4) sensible it 5 0,02 unit& de pH) jusqu’8 pH 8,OO par NaOH 0,02-n.

Nous trouvons 0,24 kquivalents acetyle par Bquivalent d’azote, ce qui correspond au rbsultat trouv6 par notre methodc de Bredereck modifibc (cf. tableau I).

l) H . Rredereck, Z. ang. Chem. 45, 241 (1932). ,) K. Freudenberg, A. 433, 232 (1923). 3, LOC. cit. 4) Potentiomktre Type E 148c, Metrohm B.G. (Herisau).

1660 HELVETICA CHIMICA ACTA.

Absence d’acide formique dans l’hdparine. Le distillat neutralis6 obtenu ci-dessus est additionnb de carbonate de sodium, puis

concentrb au vide a 2 cm3; de cette fapon, toutes les substances volatiles non acides sont Bliminbes. On ajoute I om3 d’une solution de HgCI, (20 g HgC1, + 30 g CH,COONa + 8 g NaCl dans 100 cm3 H,O) et chauffe 3 heures au bain-marie. On laisse refroidir, ajoute 1 em3 HC1 7-n., 2,5 KI 0,24-n. e t 12 om3 d‘une solution d’iode 0,Ol-n. et titre B recul par le thiosulfate 0,01-n. I1 n’y a pas de reduction du HgCl,. La mkthodel) permettant de d6celer 20 y d’acide formique, l’h6parine contient done en tous cas moins de 0,005 Cquivalents d’acide formique par equivalent d’azote.

Absence d‘ucide organique won volatile duns I‘hdpurine. Aprbs hydrolyse de l’hhparine (80 mg) et entrainement des acides volatiles (voir

ci-dessus) la solution rbsiduelle est extraite i 1’Cther. Les extraits 6thBr6s r6unis sont agites avec une solution de carbonate 2 4 . ; la solution carbonatee est acidul6e par HCI, port6e 8. 1’6bullition pour chasser le CO,, e t ext,raite de nouveau 8. 1’6ther. Les extraits Cth6ri.s sont Bvaporbs i see et le ri?sidu repris par 2 en13 d’eau. Le pH de cette solution finale est de 4,s-5. Le pH vire B 10 par adjonction de 0,2 em3 de NaOH 0,Ol-n.; il y a done moins de 0,02 Bquivalent d’acides non volatiles par equivalent d’azote.

Titrage de l’hdparine. 1,6 cm3 d’une solution d’h6parine 0,Ol-n. en azote, sont titrev au potentiom&tre2)

(6lectrode de verre e t Clectrode de calomel, sensibilit6: 0,02 unites de pH), dans un courant d‘azote par H,SO, 0,Ol-n. (voir fig. 3). I1 y a done dans l’hbparine environ 1 groupe carboxyle par 6quivalent d’azote.

Viscosite‘ a u cours du dosage de van Slyke. On met dans l’appareil de vanSlyke 4,s em3 d’une solution d’h6parine a lo%,

ajoute 12 em3 d’une solution de nitrite de sodium 8. 40% et 3,2 cm3 d‘acide acetique glacial (volume total de la solution = 20 cm3). On agite 6 min., puis plonge dans la glace; au temps donnB, on sort du bain, agite 6 min. e t fait une prise de 4,5 em3; cette prise est immbdiatement neutralis6e sous refroidissement par 0,9 cm3 de NaOH 12,5-n. Cette solution qui renferme alors 2% d’hhparine est utilisee pour une mesure de viscositi.. Les valeurs de 7 sp./c sont rapportees a un blanc ne renfermant pas d‘hkparine, fait dans les m&mes conditions. On ne constate aucune haisse de viscositk au cours du temps (cf. Tableau 11).

Hydrolyse acide de l’hdparine. 0,6 g d’h6parine sont dissous dans 30 om3 d’HC1 0,04-n. e t hydrolysks a 100” dans

un courant d’azote. Au temps donn6, on fait une prise, neutralise immbdiatement par NaOH 0,l-n. sous refroidissement e t dialyse 3 jours contre de l’eau distillbe dont le pH est maintenu a 8 par adjonction de quelques cm3 de NaOH 0,l-n. La solution est congelbe, puis sublim6e au vide poussk at des analyses de soufre e t des groupes aminbs libres sont faites parall6lement sur ce produit. La diffbrence avec les teneurs initiales en soufre e t en groupes amino libres pour m e meme teneur en azote, permet d’exprimer la quantiti: de sulfates scind6s et d‘amino lib6rbs. Les rCsultats obtenus sont donnbs dans la figure 4.

Vitesse d’hydrolyse d u monome’thyl-sulfate et du N-monomdthyl-sulfamate. On hydrolyse des solutions de monom6thyl-sulfate de potassium et de N-mono-

mbthyl-sulfamate de potassium 0,5% it 100” dans HCI 1,5-n. en presence de BaCI,. La solution est filtrBe sur Gooch; le BaSO, formi?, qui est retenu, est dose gravimktriquement (cf. fig. 5 ) . L’hydrolyse du monomBthy1-sulfate est 10 fois plus rapide que celle du pi- monom6thyl-sulfamate.

l) 0. Riesser, Z. physiol. Ch. 96, 355 (1916). ,) Potentiombtre Type E 148c, Metrohm A.G. (Herisau).

Volumen XXXIII, Fasciculus VI (1950) - No. 214.

Prdparation et hydrolyse du glucosamine-N-sulfote.

1661

Le glucosamine-N-sulfate eat prepare par sulfatation de la glucosamine libre par le SO, dans le SO, liquide. On condense 100 om3 de SO, sec dans un ballon de 1 litre, refroidi au melange ac6tone-neige carbonique, ajoute 0,9 om3 de SO, liquide fraichement distill6 e t 4 g de glucosamine libre finement pulverisee et sechee au vide poussi: sur P,O,. On agite mecaniquement 24 heures b -20°, chasse le SO, au vide, precipite sous refroidisse- ment l’acide sulfurique par l’hydroxyde de baryum et precipite l’excks d’hydroxyde de baryum par un courant de CO,. Aprbs filtration, la solution est passee B 50 sur une colonne d’Amberlitel) IR-100 H (3 x 30 cm), chargee a l’acide acetique 4-n. e t soigneusement rincee A l’eau, immediatement suivie d’une autre colonne d’Amberlite IR-4B (3 x 30 cm) chargee b l’ammoniaque 2-n. e t Bgalement rincke B l’eau. Aprks adsorption, on rince la colonne basique I R A B avec de l’eau et 81ue le glucosamine-N-sulfate par l’ammoniaque 2,5-n. On chasse l’ammoniac au vide B temperature ordinaire, ajoute un peu d‘hydroxyde de baryum, et concentre au vide b 40O jusqu’b 20 cm3, precipite l’excks d’hydroxyde de baryum par le CO,, filtre e t isole le produit par precipitation b l’alcool 6thylique en presence d’acetate de sodium sous forte agitation (Vibro-mischer). On obtient 150 mg d’une poudre amorphe et blanche.

C,H,,O,N,S (sel d’NH,) Calcule N 5,40 S 12,35% TrouvB N 5,38 S 12,25%

20% des groupes amino de ce produit sont libres, par consequent 20% du soufre

Pour la determination de la vitesse d’hydrolyse, on procede comme pour le mono- qu’il contient est liB B l’oxygbne et 80% a l’azote.

methyl-sulfate (fig. 5).

Teneur en azote (Dumas) .- yo azote de dCpart retrouve .

Isolement d‘un nitroso-ddrivd de l’he‘parine.

Apr& 10 min. de reaction avec l’acide nitreux dans Ies conditions de van Slyke, la solution d’heparine est neutralisee, puis dialysee contre de I’eau distillee dont le pH est maintenu B 8 jusqu’B disparition de la reaction au papier iodo-amidonn6 (4 jours). La solution congelee eat sublimee au vide pousse. Le produit ainsi isole, chauffe en pr6- sence de ph6nol pur e t d’acide sulfurique concentre au bain-marie, donne une intense coloration rouge cerise caracteristique des groupes nitroso (reaction de Liebermann,)). Cette reaction a lieu avec les corps renfermant des groupes sulfamides et qui forment des nitroso-d6riv6s du type -N-SO,H ,). Ce nitroso-dCriv6 de l’heparine n’est pas stable ; isole e t B 1’8tat sec, il se decompose lentement avec liberation d’azote (tableau 111).

2 sem. 6 mois 12 mois

2, 3.30 2,03 1,70 I 100% 150% 93% 79%

Tableau 111.

I HBparine I traitke non I Heparine isolee aprks 10 min. de reaction avec HNO, et

analysee aprks

1662 HELVETICA CHIMICA ACTA.

Dbactiuation et teneur e n soufre de l’he‘parine a u cours d u dosage des groupes amino libres selon van Slyke.

Dans les produits isolks, comme ci-dessus, au cows de la reaction de v a n S l y k e , on dose le soufre e t leur pouvoir anticoagulant. Afin de voir si la perte de pouvoir anti- coagulant provient de l’acide nitreux hi-mkme ou du milieu dans lequel se fait la reaction de van Slyke, nou8 avons ktudib la diminution du pouvoir anticoagulant d‘une h6parine traitke dans les m6mes conditions, mais en \‘absence d’acide nitreux. I1 en ressort que seul l’acide nitreux desactive rapidement i’hkparine, sans perte parallkle sensible de la teneur en soufre (tableau 11).

R I ~ S U M I ~ .

1. L‘hBparine purifiee par Blectrophorbse ne contient pas d’autres groupes acides que des restes sulfuriques et uroniques.

2. La teneur en acktyle du produit commercial est due a la prd- sence de 10 yo d’un polysaccharide inactif, immobile 1’4lectropho- rhe , et composd principalemcnt, sinon exclusivement, de restes acPtyl- hexosamine.

3. Une substitution des restes aminds par les restes glucuroniques est exclue, ces derniers &ant libres comme l’indique la courbe de titrage de l’hdparine.

4. 10% des groupes aminks de l’hkparine sont libres, le reste, soit 90 yo, doit done &re substituc! par l’acide sulfurique, formant ainsi des groupes -NH-S0,H.

Cette conclusion a dtB confirmde premibrement par la com- paraison des vitesses d’hydrolyse des groupes sulfate de l’hdparine, avec les vitesses d’hydrolyse des groupes sulfate du glucosamine-N- sulfate et du glucose-6-sulfate, et secondement par le fait que sou6 l’action de l’acide nitreux l’hdparine se transforme en un nitroso- dBriv6 comme e’est le cas pour les sulfatmates.

Laboratoires de Chimie Organique et Inorganique de I’Universitd de Genbve.