BIOCHIM1E, 1977, 59, 303-309.

la Libdration et rdassociation

membrane de la glucokinase microsomique du foie de chat.

G6rard AZZAR et Ren6 GoT <>. Laboratoire de Biochimie des Membranes,

Universitd Claude Bernard, Lyon I, 69621 Villeurbanne, France.

(3~9-1976).

Summary. - - The particulate glucokinase of cat liver is sho'wn to be microsomal. The activity is readily solubilized by glueose-fi-phosphate, ATP, pyrophosphate, high salt concentrations and, to a lesser extent, ribonucleoside triphosphates. The solubilization by glueose-6-phosphate is inhibited by Pi. Solubilizations by ATP and glucose-6-phosphate differ in their sensitivity to temperature changes ; they are relatively specific for gluco- kinase as compared to solubilization by detergent (Triton X 100).

The enzyme can be bound again to previously eluted microsomal membranes.

Treatment of membrane ~with trypsin, at 0°C, destroys the ability to rebind the enzyme to the membrane. It is suggested that electrostatic forces are of considerable importance for the binding of glucokinase to a possible protein binding site in the membrane.

INTRODUCTION.

Des 6tudes ant6r ieures [1] ont montr6 la pr6- sence d 'une glucokinase mic rosomique dams les foies de diverses espbces animales. Cette enzyme, qui a 6t6 pa r t i cu l ib rement 6tudi6e chez le ra t [2-4], se t rouve en quanti t6 impor tan te dams les h6patocytes de chat [5]. Cette prot6ine membra- naire est in t6gra lement solubilis6e par une con- cen t ra t ion de 0,15 p. cent (v/v) en Tr i ton X100. Elle se compor te comme une prot6ine extr ins6que puisqu 'e l le ne requier t plus de d6tergent pour ma- nifes ter la totalit6 de son activit6. Mats sa lib6ra- t ion est alors asp6cifique, car l ' ac t ion du d6tergent sur les mic rosomes ent ra ine la solubi l isat ion d 'en- v i ron 25 p. cent des prot6ines membrana i res , pro- duisant ainsi un m61ange complexe.

Or, d iverses hexakinases mi tochondr ia les [~-7] ont 6t6 solubilis6es par incubat ion en pr6sence de

Enzymes : glucokinase ou ATP: o-glucose-6-phos- photransf~rase (EC 2.7.1.2) ; hexokinase ou ATP : D-hexose-6-phosphotransf6rase (EC 2.7.1.1) ; glucose-6- phosphate d~shydrog~nase ou D-glucose-6-phosphate : NADP ÷ 1-oxydor6ductase (EC 1.1.1.49); cytochrome oxydase ou ferricytochrome c : oxyg6ne oxydor~duc- tase (EC 1.9.3.1) ; phosphatase acide on orthophospho- r ique-monoester phosphohydrolase (optimum acide) (EC 3.1.3.2); catalase ou ferrocytochrome c : hydro- g6ne peroxyde oxydor6ductase (EC 1.11.1.6); phospholi- pase A on phosphatidate 1-acylhydrolase (EC 3.1.1.32); phospholipase C o u phosphatidylcholine choline phos- phohydrolase (EC 3.1.4.3) ; phospholipase D o u phos- phatidylcholine phosphatidohydrolase (EC 3.1.4.4) ; trypsine (EC 3.4.21.4).

A qui toute correspondance doit 6tre adress6e.

leurs m6tabolites. I1 nous a donc paru int6res- sant de r e c h e r c h e r si le caract6re m e m b r a n a i r e de la glucokinase mic rosomique pouvai t 6tre modi- fi6 par divers agents ch imiques et physiques , quelle 6tail la nature des sites de fixation et dams quelle mesure la glucokinase lib6r6e pouvai t se r e c o m b in e r h la membrane .

MATERIEL ET METHODES.

Les chats domest iques (Fells catus) prov i ennen t d'61evages locaux et sont nour r i s /I volont6. Ils sont tu6s par d6capi ta t ion ; les foies sont im- m6dia lement pr61ev6s, lav6s et dilac6r6s dams le tampon de broyage.

Les microsomes sont pr6par6s par u l t racent r i - fugation diff6rentiel le selon une m6thode pr6c6- demment d6cri te [5]. Cetle f rac t ion ne cont ien t que 4 p. cent des prot6ines et 9,2 p. cent du cholest6rol cellulaire. Elle est peu contamin6e par les mi tochondr ie s (7 p. cent de la cy toch rome oxydase), les lysosomes (14 p. cent de la phospha- tase acide) et les p6roxisomes (6 p. cent de la catalase). Aucune activit6 soluble n 'y est d6cela- ble. On y t rouve plus de 50 p. cent des enzymes marqueuses de l ' appare i l de Golgi et 40 p. cent en- v i ron des membranes plasmiques. Les contrbles morpholog iques y font appara i t re t rois types d'616ments : v6siculaires, tubulaires et granulaires . Tons les essais sont effeetu6s sur des membranes pr6par6es ex temporan6ment .

304 G. A z z a r et R . Got.

La gluco.kinase est dos6e pa r couplage h la glu- cose-6-phosphate d6shydrog6nase et mesure spec- t rophotom6tr ique de la r6duct ion du NADP [8, 9]. Dans le cas oh l 'on veut doser l 'activit6 en pr6- sence de glucose 6-phosphate, on util ise du glu- cose [U-14C], C.E.A., 0,02 Ci/mole) comme sub- strat. Le glucose-6-phosphate radioact i f obtenu est s6par6 par 61ectrophorbse h haut voltage. Quelle que soit la m6thode utilis6e, t o u s l e s dosages sont effectu6s en pr6sence de Tr i ton X100 (0,15 p. cent, v/v) .

La s6parat ion entre activit6 par t ieu la i re et acti- vit6 soluble est r6alis6e par cent r i fugat ion du mi- lieu d ' i ncuba t ion 1 h. h 145 000 × g.

Afin de v6rifier que l 'activit6 glucokinasique dos6e au n iveau des membranes microsomiques n 'est pas due fi une con tamina t ion par la gluco- kinase soluble, le culot membrana i r e est soumis h deux sortes de lavage r6put6es pour 61trainer les prot6ines adsorb6es ou contenues dams les v6si- c u l e s :

1) Lavage selon Larsen et al [101. 10 mg de pro- t6ines microsomiques sont suspendues dans 30 ml d 'eau distill6e. Aprbs 15 minutes d ' i ncuba t ion h 30°C, le mi l ieu est refroidi dans un bain glac6 et centrifug6 45 minutes h 145 000 × g. Le culot ob- tenu est suspendu dams 30 ml de t ampon Tris 0,15 M, pH 8, et de nouveau centrifug6 45 minutes h 145000 × g.

2) Lavage selon Keenan et Huang [11]. Une suspension de 10 mg de prot6ines microsomiques dans 30 ml de chlorure de sodium molaire est cen- trifug6e 45 minutes h 145 000 × g. Ceci est r6p6t6 deux fois, puts le culot est remis en suspension dams 30 ml d 'un m61ange Na2CO 3 0,1 M-NaHCO 3 0,1 M. Une nouvelle cent r i fugat ion de 45 minu tes h 145 000 × g est alors effectu~e.

La solubi l isa t ion de l ' enzyme est obtenue dans le mil ieu d ' incuba t ion suivant [121 : Tris-HC1 pH 7,5 (20 raM), mann i to l (0,3 M), EDTA (1 mM), Mg2+ (4 raM). A c e mil ieu sont ajout6s les diff6- rents effecteurs, aux concent ra t ions indiqu6es. Les incuba t ions sont de 30 minutes h 37°C, saul dams le cas des cin6tiques en fonct ion du temps ou des essais h d 'autres temp6ratures. La concen t ra t ion en prot6ines membrana i r e s est toujours de 10 mg / ml. Afin de v6rifier qu ' i l n 'existe pas la l ib6rat ion spontande de renzyme, des membranes sont incu- b6es dans les m~mes condi t ions que les essais, mats sans effecteur.

La r~association est r6alis6e en incubant , dans les condi t ions d6crites ci-dessus, un culot mi- crosomique (dont on a pr6a lablement lib6r6 la glucokinase) et remis en suspension dans un sur-

nageant con tenan t l ' enzyme solubilis6e, dialys6 pour en 61trainer l 'effecteur ayant provoqug la solubil isat ion.

Pour les essais de cong61ation-d6cong61ation, un culot microsomique est congel6 dans l 'azote l iquide imm6dia tement aprbs sa pr6parat ion. I1 est ensui te d6congel6 h t ° ambiante (environ 10 min) dams le mi l ieu d ' incuba t ion et centrifug6.

Afin de pr6ciser la na ture du site me mbr a na i r e de fixation, des essais de r6associat ion sont effec- tugs sur des microsomes lib6r6s de la glucokinase par act ion du pyrophosphate et ayant subi l 'ac t ion de diverses hydrolases. D 'une part , ils sont incu- b6s 20 minutes h 37 °, dans le tampon de solubili- sation contenant en plus du CaC12 (5 raM), en pr f - sence de phosphol ipase A (Crotalus terr. terr., Calbiochem) ou de phosphol ipase C (C. Welchi i , Calbiochem). L'activit6 des phospholipases est v6- rifi6e, dans ces condi t ions opfratoires . D'autre part , Faction m6nag6e de la t ryps ine (Worthing- ton 2 × cristallis6e) est r6alis6e par incuba t ion de 30 minutes h 0°C clans le t ampon de pH 7,5. Les membranes sont ensuite centrifug6es et lav6es pour 61trainer les traces d 'enzyme, puts soumises aux essais de r6association.

Des pr6para t ions purifi6es de glucokinase sont obtenues ~ par t i r de Ia phase cytoplasmique so- luble ou d 'un extrai t microsomique par le Tri- ton X100, par chromatographie d'affinit6 sur Se- p h a r o s e - A T P , selon une m6thode d6j~ d6- crite [13].

Les prot6ines sont dos6es par la m6thode de Lowry et al. [14]. Les prot6ines solubilis6es sont analys6es par 61ectrofocalisation en gel selon Vesterberg [151.

R~SULTATS.

Liaison de la glucokinase & la membrane .

Dams les h6patocytes de chat, 30 h 40 p. cent de l 'activit6 glucokinasique cellulaire est r6gu- l i6rement retrouv6e dams la f ract ion microsomi- que, avec une activit6 sp6cifique 10 fois sup6rieure /t celle de la glucoikinase soluble [1, 51. Dans les condi t ions de dosages utilis6es, cette activit6 membrana i r e ne se manifeste qu 'en pr6sence de Tr i ton X100, la concen t ra t ion optimale en d o e r - gent 6rant comprise entre 0,15 et 0,20 p. cent, con- cent ra t ion finale [5]. Si l 'on centr ifuge des mi- erosomes ayant subi ce t ra i tement , route l 'activit6 rnise en 6vidence passe sons forme soluble clans le s u r n a g e a n t ; aucune activit6 n 'est d6celable dams le culot ainsi obtenu. Toutefois, l '6ventuali t6 d 'une con tamina t ion par la glucokinase soluble doit 6tre envisag6. Or, les deux types de lavage,

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 3.

L i b d r a t i o n et rdassoc ia t ion d ' u n e g l u c o k i n a s e m e m b r a n a i r e . 305

auxquels les membranes mic rosomiques sont sou- mises, ont des effets s imi la i res et l imit6s : 10 p. cent des protCines sont solubilis6s ainsi que 20 p. cent env i ron de l 'act ivi t6 glucokinase. L 'essent ie l reste donc fix6 aux microsomes , ce qui confi rme le caractbre membrana i r e de la glucokinase.

Comme dans le cas de la gluco~inase microso- mique du foie de rat [lt6], celle du chat est pro- gress ivement lib6r6e par des opCrations succes- sives de congClation-d6cong61ation. Les trois pre- mieres opCrations solubil isent respec t ivement 25, 21 et 20 p. cent de l 'act ivi t6 lice au culot membra- naire.

Ce r6sultat sugg~re que la glucokinase n 'est pas implant6e dans la couche l ip idique, mais qu 'e l le est l ice h la surface de la membrane . Rappelons qu 'une fois solubilis6e, elle ne requ ie r t plus de d6- tergent pour fonct ionner .

Liberat ion de la glucokinase membranaire .

Si la r6par t i t ion entre activit6 membrana i r e et activitC soluble reste assez constante d 'un foie h l 'autre, il n 'en est pas de m6me pour les activit6s spCcifiques qui mont ren t de grandes var ia t ions indiv iduel les ; sur 26 foies, les membranes micro- somiques possbdent pour la glucokinase, une activit6 sp6cifique moyenne de 0,75 ± 0,65 × 10-~ U/ rag de protCines. Dans ces condi t ions, il nous a p a r u plus dCmonstrat i f de chi f f rer l 'act ivi t6 lib6r6e en pourcen tage de l 'act ivi t6 pr6sente dans les membranes utilisCes. Cette activit6 est d o e r - mince in i t i a lement en prCsence de Tr i ton X100 h sa concen t ra t ion optimale. De plus, pour chaque essai, on dose sys t6mat iquement l 'act ivi t6 lib6r6e dans le surnageant et celle rest6e au niveau membrana i re . Dans t o u s l e s cas, la somme de ces deux activitCs est 6gale, aux er reurs exp6r imen- tales pros, h l 'act ivi t6 init iale. Ainsi, aucune acti- vat ion ou inh ib i t ion ne se manifes te scion que l ' enzyme reste membrana i r e ou passe en solution. PrCcisons enfin que les rCsultats obtenus sont trbs reproduc t ib les ; ils reprCsentent la moyenne d 'au moins 3 essais effectu6s sur des pr6para t ions diff6- rentes, les var ia t ions restant toujours inf6r ieures h 10 p. cent de l 'act ivi t6 mise en jeu.

La solubi l isa t ion de la glucoikinase membra- naire est maximale pour une concent ra t ion de 12,5 mM en glucose-6-phosphate (fig. la) . Pour I 'ATP le m a x i m u m est at teint pour uue concen- t ra t ion de 7,5 mM si 1'on main t ien t constant la concen t ra t ion en Mg 2+ (4 raM) ou, pour une con- cent ra t ion de 4 mM, si l 'on conserve le r appor t mola i re ATP/Mg2+ 6gal h 1 (fig. la) . Dans tous les cas, la quanti t6 d 'enzyme solubilis6e d iminue pour des concent ra t ions sup6rieures h celle cor respon-

dant au m a x i m u m de solubil isat ion. L ' enzyme reste mCme to ta lement par t icul6e pour des con- cent ra t ions en Mg e+ sup6rieure h 12 raM.

I1 faut env i ron 30 minutes d ' incuba t ion pour obtenir le m a x i m u m de solubi l isat ion (fig. lb) . Toutefois , alors qu 'en pr6sence d'ATP, on a r r ive h u n palier , la c in6t ique obtenue avec le glucose-

"/o de t'ach~=tE membranalr¢ mlba(¢ (a }

--'mH

(b)

70 .

6O. /

so • / / / / / "

,o / J ' / ~o / / /

/ / ?o / / .

'°Z / (mmutes)

FIG. 1. - - Libdration de la glucoJcinase microsomique par le glucose-6-phosphate et I'A.T.P.

a) en fonction de la concentration en effeeteur : Q - - . - - O , glucose-6-phosphate ; / . . . . . ×, ATP, en pr6sence d'une concentration eonstante en Mg2* (4 raM) ; O O, ATP, en maintenant le rapport molaire ATP/Mg2+ constant et 6gal h 1.

b) en fonction du temps : • • , en pr6sence de glucose-6-phosphate (12,5 mM) ; / . . . . . X, en pr6- sence d'ATP (7,5 mM, Mg2+ 4 mM). Dans le eas de lib6- ration par le G-6-P, le surnageant est dialys6 pour 61iminer l'effeeteur avant le dosage.

6-phosphate a une al lure par t icul ibre : e n_ effet, la l ib6rat ion pr6sente une cer ta ine la tence pu i squ 'au bout de 15 minutes d ' incubat ion , aucune activit6 n'est apparue dans le surnageant .

Dans le cas du pyrophospha te , les cin6tiques pr6sentent un aspect classique avec un pa l ie r au bout de 30 minutes d ' incuba t ion (fig. 2b) pour une concent ra t ion d ' env i ron 7,5 mM (fig. 2a).

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306 G. A z z a r et R. Got.

Les r 6 s u l t a t s d u t a b l e a u I m o n t r e n t que la l ib6- r a t i o n de l ' e n z y m e s e m b l e l i6e s p 6 c i f i q u e m e n t h l a s t r u c t u r e d u g l u c o s e et que la p h o s p h o r y l a t i o n d u c a r b o n e 6 p o u r r a i t j o u e r u n r61e p a r t i c u l i e r . E n effet , le g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e et le g l u c o s e - l , 6 - d i p h o s p h a t e o n t u n e a c t i v i t 6 s i m i l a i r e , c e p e n d a n t que le g lucose , le g l u c o s e - l - p h o s p h a t e et la g luco-

*/*de L actlVl

80

70

60

50

40

30

20

I0

0

÷ I

J (a)

/ 2,5 5 7,5 I0 12,5 mM

*/o d, ['act~v,t~ membranatre mlt ,at¢

÷ / J + J ~

/ /

(b)

,o 2"o i0 io i0 ~- temps (minu~s)

Fro. 2. - - Libdration de la gluco$cinase microsomique par le pyrophosphale.

a) en fonc t ion de la concen t ra t ion en effecteur, b) en fonct ion du temps, en pr6sence d 'une concen-

t r a t i o n 7,5 raM.

TABLEAU I.

Ef fe t de d ivers gIucides sur la solubi l isat ion de la gluco,kinase microsomique .

Glucides

Glucose-6-phosphate . . . . . . . . . Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glucose-l-phosphate . . . . . . . . . Glucose-1,6-diphosphate . . . . . Galactose-6-phosphate . . . . . . . Galactose- l -phosphate . . . . . . . Mannose-6-phosphate . . . . . . . . Glucosamine . . . . . . . . . . . . . . .

Glucokinase solubilis6e (p. cent de l'activit6

membranaire initiale)

73 50 50 72

0 0 0

35

T o u s l e s sucres ont 6t6 essay6s h la concen t ra t ion de 12,5 raM, h 37°C, pendan t 30 minutes , condi t ions dana lesqnel les la l ib6ra t ion est m a x i m u m avee le glneose- 6-phosphate .

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s a m i n e s o n t e n c o r e a c t i f s m a i s n e t t e m e n t m o i n s e f f icaces , les d e u x a u t r e s h e x o s e s p h o s p h a t e s e s say6s 6 t a n t t o t a l e m e n t i n a c t i f s .

De m 6 m e , I ' A T P es t de l o i n le n u c l 6 o s i d e t r i - p h o s p h a t e le p l u s a c t i f ( t a b l e a u II) ; i l es t b o n de p r 6 c i s e r que I ' A T P es t le seu l d o n n e u r de p h o s - p h a t e p o u r l a g l u c o k i n a s e . L ' A D P est 6 g a l e m e n t u n m 6 d i o c r e a g e n t de s o l u b i l i s a t i o n . N o t o n s que d a n s le cas des h e x o k i n a s e s m i t o c h o n d r i a l e s , les n u c l 6 o s i d e s t r i p h o s p h a t e s s o n t p r e s q u e a u s s i a c t i f s que I ' A T P [~, 7].

TABLEAU II .

Ef fe t de d ivers nucl~otides sur la solubil isat ion de la glucokinase.

Nuct6otides

ATP . . . . . . . . . . . . . ADP . . . . . . . . . . . . . CTP . . . . . . . . . . . . . . GTP . . . . . . . . . . . . . ITP . . . . . . . . . . . . . . UTP . . . . . . . . . . . . .

Glucokinase solubilis6e {p. cent de l'aetivit6 membranaire

initiale)

64 36 28 40 39 28

T o u s l e s nucl6otides ont 6t6 essay6s h la concent ra- t ion de 7,5 mM, h 37°C p e n d a n t 30 minutes , condi t ions dans lesquelles la l ib6ra t ion est m a x i m u m pour I'ATP.

La s o l u b i l i s a t i o n de l ' e n z y m e p a r le d 6 t e r g e n t es t i n d 6 p e n d a n t e de la t e m p 6 r a t u r e ( t a b l e a u I I I ) . Au c o n t r a i r e , e l le y es t 6 t r o i t e m e n t l i6e l o r s q u e le g l u c o s e - 6 - p b o s p h a t e es t u t i l i s6 c o m m e effec- t e u r : n u l l e h 0°C, el le es t e n c o r e 3 fo is p l u s f a i b l e h 18 ° p a r r a p p o r t h 37°C. L ' a c t i o n de I ' A T P es t b e a u c o u p m o i n s s o u m i s e h la t e m p 6 r a t u r e p u i s - q u ' u n e s o l u b i l i s a t i o n i m p o r t a n t e es t o b s e r v 6 e h 0°C et que le m a x i m u m est o b t e n u h 18°C. Q u a n t h F a c t i o n d u p y r o p h o s p h a t e , e l le e n es t p r a t i q u e -

TABLEau I I I .

Ef fe t de la temperature sur la solubil isat ion de la #1ucokinase.

Effecteurs

Tri ton X100 (0,15 p. cent) Glucose-6-phosphate (12,5 mM) ATP (7,5 mM) Pyrophosphate (7,5 mM)

0 o C

98

0

40

68

18" C

98

23

65 75

37 ° C

98

72

67,5 78

Les r6sul ta ts sont exprim6s en p. cent d 'act ivi t6 glu- cokinas iqne lib6r6e pa r r appor t h l 'ae t ivi t4 m e m b r a - na i re ini t iale . Dans t o u s l e s eas la dur6e d ' ineuba t ion est de 30 minutes .

Libdration et rdassociation d 'une gIucokinase membranaire . 307

ment ind6pendante . L '6nergie d 'ac t iva t ion , pour la solubi l isa t ion par le glucose-6-phosphate, doi t 6tre beaucoup plus 61ev6e que pour I 'ATP et le pyrophospha te .

Comme les hexokinases mi tochondr ia les [6, 7], la glucokinase mic rosomique du foie de rat est solubilis6e par une force ionique 61ev6e. A c e pro- pos, il faut rappe le r que les lavages des membra- nes microsomiques , destin6s h mon t r e r le carac- t6re membrana i r e de l ' enzyme, 6taient r6alis6s 0°C. M6me avec une force ionique trbs 61ev6e

TABLEAU IV.

Action de divers effecteurs sur la solubilisation de la glucolcinase microsomique.

Effecteurs

EDTA (12,5 mM, 37oC) EGTA (12,5 mM, 37oC) NaC1 (0,25 M, 37oC) Pi (10 raM, 37oC) Glucose-6-phosphate (12,5 mM) -}- Pi (10 mM)~ 37oC

Glueokinase solubilis6e (p. cent de l'activit6

membranaire initiale)

23 25 55 3O

30

Les temps d'incubation sont toujours de 30 minutes.

(NaC1 M), aucune activit6 n '6tai t lib6r6e. Au con- t raire , h 37°C, une force ionique de 0,25 M lib6re 55 p. cent de l 'act ivi t6 ini t ia le (tableau 1V). Ce r6sultat confirme le r61e impor t an t jou6 par la temp6ra ture sur la solubil isat ion.

L'efficacit6 du pyrophospha te , ainsi que les solubi l isat ions par t ie l les obtenues avec les nu- cl6osides t r iphosphates autres que I 'ATP, pour- ra ient amener h envisager que ces compos6s, pa r ai lIeurs sans effet sur la glucokinase, agissent en l iant des cat ions divalents impl iqu6s au niveau du site de fixation. I1 semble cependan t qu 'un autre mode d 'ac t ion puisse 6ire envisag6, puisque I 'EDTA comme I'EGTA, ne p rovoque qu 'une lib6- ra t ion limit6e.

Enfin, comme dans le cas des hexokinases mito- chondr ia les le Pi, qui seul, en t ra lne une 16g6re solubil isat ion, inhibe ref fe t du glucose-6-phos- phate. I1 faut pr6ciser , que, lh encore, n i l e Pi, ni le glucose-6-phosphate n 'ont une act ion sur l 'act i - vit6 glucokinasique, dans les condi t ions exp6ri- mentales utilis~es.

Signalons enfin que les solubil isat ions obtenues par les divers effeeteurs ne sont pas addit ives, ce qui pe rmet de conc lure h l ' exis tenee d 'une seule eat6gorie de sites de fixation.

Rdassociation de la glucokinase ~ la membrane.

La r6associat ion est estim6e en d6 te rminan t l 'act ivi t6 re t rouv6e au n iveau m e m b r a n a i r e au d6- t r iment d ' enzyme solubilis6e remise en contac t avec les membranes microsomiques .

Comme le mont ren t les donn6es rappor t6es dans le tableau V, un pourcen tage re la t ivement 61ev6

TABLEAU V.

Rdassociation de la glucokinase aux membranes microsomiques.

Traitement pr6alable des membranes

Aucun (a) Glucose-6-phosphate (12,5 raM) (b) ATP (7,5 raM) (b) Pyrophosphate (7,5 raM) (b) Triton X100 (0,15 p. cent, v/v) Pyrophosphate (7,5 mM) (e) -~ glucokinase solubilis6e par le Triton Pyrophosphate (7,5 mM) (c) -71- PCS Pyrophosphate (7,5 mM) (c) -~- glucokinase purifide h par- tir de la PCS

Glucokinase r6assoei6e (p. cent de l'activit6

prealablement lib~r6e)

70 62 70

0

(a) Des membranes intactes sont incub~es 30 mi- nutes en pr6sence d'une solution de glucokinase lib~r6e par le pyrophosphate.

(b) Les membranes sont incubdes pr~alablement pendant 30 minutes St 37°C, en pr6sence de l'effeeteur indiqu6. Apr6s centrifugation, elles sont remises en suspension dans le surnageant dialys6 et incub6es St nouveau darts les mdmes conditions.

(c) Les membranes sont trait~es comme en b, en pr6- sence de pyrophosphate. Elles sont remises en suspen- sion en presence de la pr6paration enzymatique indi- qu6e.

Une nouvelle eentrifugation permet de s~parer la glueokinase r~assoei~e de eelle rest~e fi l'gtat soluble.

Le glucose-6-phosphate, I'ATP, le pyrophosphate sont 61imin~s des surnageants par dialyse.

La glucokinase solubilis6e par le Triton et l 'enzyme de la phase cytoplasmique soluble (PCS) sont purifi6es par chromatographic d'affinit6.

de la glucokinase solubilis6e peut 6tre r6associ6 aux membranes dont on a lib6r6 les sites. Les r6- sultats sont assez voisins pour le glucose-6-phos- phate, I 'ATP et le pyrophospha te .

Des exp6r iences crois6es ont 6t6 r6alis6es, dans lesquelles on chercha i t h r~associer la glucokinase solubilis6e par le glucose-6-phosphate, h des membranes dont les sites avaient 6t6 lib6r6s par I 'ATP, ou vice-versa. Les r6sultats, s imila i res ceux obtenus en met tant en jeu un seul effecteur,

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confi rment l 'exis tence d 'une seule cat tgorie des sites.

Aucune rdassociation n 'est possible sur des membranes intactes, ce qui mont re que t o u s l e s sites sont occup6s.

Les membranes trait6es par le Tr i ton X100 perden t leur capacit6 de fixation, vraisemblable- ment parce que l ' int$gri t6 de leur s t ructure est atteinte. De plus, la gluco,kinase solubilis6e par ce d6tergent ne peut ~tre r6associ6e, m6me h des membranes dont les sites ont 06 lib6r6s par un autre effecteur et qui gardent ainsi leur capacit6 de fixation.

Enfin, la gluco~kinase de la phase cytoplasmique soluble ne se r6associe pas aux membranes , qu'elle se trouve h l '6tat b rn t darts le surnageant des mi- crosomes ou purifi6e 85 fois par une chromato- graphic d'affinit6 [14].

Nature du site membranaire de fixation.

Des membranes microsomiques ayant subi l 'ac- t ion de diverses phosphol ipases conservent int6- gra lement leur capacit6 de l iaison, ce qui semble exclure la par t ic ipa t ion de phosphol ip ides au site de fixation. Au contraire , l ' ac t ion m6nag6e de la t ryps ine annule tota lement la r6associat ion de la glucoikinase, qui reste alors in t6gra lement sous forme soluble (tableau ¥I) . I1 appara l t doric que le r6cepteur membrana i r e est, au moins part iel le- ment, de na ture prot6ique.

TABLEAU VI.

E[fets d'hydrolases sur la r~association de la glueokinase aux membranes microsomiques.

Enzymes

Phosphol ipase A . . . . . . . . . Phosphol ipase C . . . . . . . . . Trypsine . . . . . . . . . . . . . . . .

Glucokinase r6assoei6e (p. cent du contrble)

100 94

0

Les quan t i t6 s d ' enzyme ut i l isdes son t de 0,1 mg p o u r 10 m g de prot~ines m e m b r a n a i r e s .

Sp~cificit6 de lib6ration.

II est 6vident que Fact ion du Tr i ton X100 sur les membranes est asp6cifique ct qu 'une grande vari6t6 de prot6ines extr ins6ques ou m~me in t r in - s6ques peuvent Ore lib6r6es. Au contraire , on est en droi t d 'a t tendre que des compos~s comme le glucose-6-phosphatc ou I'ATP, qui prSsentai t des in terac t ions sp6cifiques avec la glucokinase, n ' e n t r a i n e n t qu 'une solubi l i sa t ion tr6s limit6e de prot6ines membrana i res .

Les activit6s sp~cifiques des extraits obtenus (tableau VII) confirment ce po in t de v u e : elles sont 3 h 4 fois plus 61ev6es avec le glucose-6-phos- phate ou rATP, par rappor t au d6tergent, n est in t6ressant de rioter que la glucokinase solubilis6e par le pyrophosphate a u n e activit6 sp6cifique @ale ~ celle obtenue avec le glucose-6-phosphate.

TABLEAU VII.

Activitds spdcifiques de la glucokinase solubilis~e.

Effecteurs

A T P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Glucose-6-phosphate . . . . . . . . . . . . Py rophospha t e . . . . . . . . . . . . . . . . Tr i ton X 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . Mierosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aetivit6 sp6eifique X t0 3

16,5 11,5 11,4

4 1

L'act ivi t6 sp6ciflque est expr im6e en ~mole de p ro- du i t ob tenu , p a r m i n u t e d ' i ncuba t ion , p a r mg de p ro- tdine.

L'6lectrofocalisat ion en gel est en accord avec ces r6sultats. En effet, l ' ext ra i t Tr i ton pr6sente

(b)

s,s a,5 5,~ %5 ~s a,s ~,s pH 3S 45 5,5 6,S ~S B.S 9,S pH

~o ~o

[¢ ) (d }

ES ~S

. . . . . . : i 'M . . . . -- 35 45 55 $73 75 85 B5 p 3,5 415 5,5 6,5 7,'5 8,5 9,5 -pH

Fz6. 3. - - Enregistrements densitom~triques des dlec- trofocalisations en gel d'acrylamide d'extraits solubles obtenus en prdsence : a) d 'ATP ; b) de glucose-6-phos- phate ; c) de pyrophosphate ; d) de Triton X 100. La m~me quan t i t6 d ' enzyme est d6pos6e dans t o u s l e s cas.

Grad ien t de pH : 3 ,5- 9. Appare i l Mul t i pho r (LKB). Les gels son t r~v61~s pa r le b leu de Coomass ie . La fl6che ( ~ ) ind ique la pos i t i on de l 'act ivi t6 glu-

cokinas iqne .

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Libdra t i on et rdassoc ia t ion d ' une g l u c o k i n a s e m e m b r a n a i r e . 3 0 9

u n p r o f i l b e a u c o u p p l u s c h a r g 6 , avec , e n p a r t i - cu l i e r , t r o i s b a n d e s m o y e n n e s c o r r e s p o n d a n t a u x p H 6,5 et 9, q u i s o n t a b s e n t e s des a u t r e s p r o f i l s (fig. 3). N o t o n s que les a u t r e s p r o f i l s m o n t r e n t des b a n d e s e s s e n t i e l l e m e n t e n t r e p H 4,4 et 5,5. Or, u n e 6 1 e c t r o f o c a l i s a t i o n p r 6 p a r a t i v e s u r U l t r o d e x a p e r m i s de l o c a l i s e r l ' a c t i v i t 6 g l u c o k i n a s i q u e e n t r e p H 4,9 et 5,1.

D I S C U S S I O N .

Le g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e et I ' A T P s o n t des m 6 t a - b o l i t e s de la g luco!k inase s u r l a q u e l l e e x i s t e n t des s i t e s de r e c o n n a i s s a n c e p o u r ces c o m p o s 6 s . L ' oc - c u p a t i o n de ces s i t e s p a r u n de ces l i g a n d s p e u t e n t r a l n e r u n 16ger c b a n g e m e n t d ' 6 t a t de l ' e n z y m e p r o v o q u a n t la r u p t u r e des l i a i s o n s 6 t ab l i e s e n t r e ce l le -c i et s o n s i te r 6 c e p t e u r m e m b r a n a i r e .

C o m m e i l a 6t6 sugg6r6 h p r o p o s de l ' h e x o k i - n a s e m i t o c h o n d r i a l e d u c e r v e a u [7~, l ' e f fe t so lu- b i l i s a n t d u p y r o p h o s p h a t e p e u t ~ t re r e l i6 fi la c a p a c i t 6 de c o m p l e x e r le Mg ÷÷. Le p y r o p h o s p h a t e a u n e c o n s t a n t e de f o r m a t i o n de c o m p l e x e 61ev6 et le Mg ÷÷ s e m b l e O r e i m p l i q u 6 d a n s la l i a i s o n de la g l u c o k i n a s e h la m e m b r a n e .

La n a t u r e de la l i a i s o n g l u c o k i n a s e - m e m b r a n e ne p e u t e n c o r e 6 t re p r6c i s6e . C e p e n d a n t , les f o r c e s i m p l i q u 6 e s s o n t 6 v i d e m m e n t de s f o r c e s de f a i b l e 6 n e r g i e ; de p lus , l ' e f f e t de la f o r c e i o n i q u e , de n u c l 6 o t i d e s d u Mg ÷~ p e r m e t d ' e n v i s a g e r que ce t t e l i a i s o n es t f o n d 6 e s u r des i n t e r a c t i o n s 61ec t ros ta - t i q u e s e n t r e la m o l 6 c u l e e n z y m a t i q u e et u n r 6 c e p - t e u r m e m b r a n a i r e d o n t la s e n s i b i l i t 6 h la t r y p s i n e m o n t r e r a i t la n a t u r e p r o t 6 i q u e .

Le f a i t que ]a g l u c o k i n a s e de la p h a s e cy to - p l a s m i q u e n o n p a r t i c u l a i r e ne p u i s s e se f ixe r s u r la m e m b r a n e s ugg6 r e que , c o n t r a i r e m e n t a u x h e x 6 k i n a s e s m i t o c h o n d r i a l e s [16, 71, l a f o r m e so- l u b l e et la f o r m e p a r t i c u l 6 e s o n t d i f f 6 r e n t e s et q u ' i l n ' e x i s t e pas , e n t r e el les, u n 6 q u i l i b r e c o n - t r 61an t l ' a c t i v i t 6 h e x o k i n a s i q u e de s h 6 p a t o c y t e s . I1 s e m b l e p l u t S t que , c o m m e d a n s le cas de r a t [17], ces d e u x g l u c o k i n a s e s s o i e n t i m p l i q u 6 e s d a n s des vo tes m 6 t a b o l i q u e s d i f f 6 r e n t e s .

Les r 6 s u l t a t s o b t e n u s s u r la l i b 6 r a t i o n et la r 6 a s s o c i a t i o n de la g l u c o k i n a s e d o n n e n t des i n d i - c a t i o n s i n t 6 r e s s a n t e s s u r s o n i m p l a n t a t i o n m e m - b r a n a i r e . Sa I o c a l i s a t i o n t o p o g r a p h i q u e d o l t se s i t u e r s u r la face e x t e r n e de v 6 s i c u l e s m i c r o s o - m i q u e s . E n effet , si l ' e n z y m e se t r o u v a i t h l ' i n t6 - r i e u r des v6s i cu l e s , e l le n e p o u r r a i t p a s s e r d a n s la p h a s e s o l u b l e q u ' a p r 6 s d e s t r u c t i o n de la s t r u c t u r e

m e m b r a n a i r e , le m o u v e m e n t (( f l ip- f lop >~ 6 t a n t p r a t i q u e m e n t i n t e r d i t a u x p r o t 6 i n e s .

I1 r e s t e h p r 6 c i s e r l a n a t u r e des m e m b r a n e s m i c r o s o m i q u e s s u r l e s q u e l l e s se t r o u v e n t les s i t e s de f ixa t ion . D a n s le cas des h 6 p a t o c y t e s de r a t , l a g l u c o k i n a s e es t l o c a l i s 6 e d a n s l ' a p p a r e i l de G o l g i [9, 163. Des t r a v a u x s o n t en c o u r s a u l a b o r a t o i r e s u r la l o c a l i s a t i o n s u b - m i c r o s o m i q u e d e la g luco- k i n a s e des h 6 p a t o c y t e s de c h a t .

R ~ s u ~ .

La glucokinase par t iculge de foie de chat cst micro- somique. L'activi tg est libgr~e pa r le glucose-6-phos- phate, I 'ATP, le py rophospha te et des fortes concen- t r a t ions en sel ct, h u n degrg moindre , pa r les r ibo- nucl~osides t r iphospha tes . La so lubi l i sa t ion pa r le g lucose-6-phosphate est inhibge pa r le Pi. Les soluhi- l i sa t ions par I 'ATP et le glucose-6-phosphate diff6rent dans leurs sensibi l i t~s aux va r i a t ions de tempgrature . Cette l ibera t ion est r e l a t i vemen t sp~cifique compar~e

la so lub i l i sa t ion pa r un d~tergcnt (Tri ton X 100).

L 'enzyme peut ~tre rgassocige aux m e m b r a n e s mi- crosomiques dont elie a ~t~ p rda l ab l emen t lib~r~e.

Le t r a i t e m e n t de la m e m b r a n e par la t ryps ine ~ 0°C dgt ru i t la possibi l i t6 de rgassocia t ion de l ' enzyme h la membrane . Les forces glectrostat iques semblen t joue r u n rSle considdrable sur le site de f ixat ion de la glu- cokinase qui pou r r a i t ~tre de na tu re protgique.

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