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L'infestation du myoepithelium de l'oesophage par des microorganismes pigmentes et la structure des organes a bacteries du vestibule chez le Bryozoaire Chilostome
Palmicellaria skenei (E. et S .)
G E N E V I ~ V E LUTAUD Laboratoire dJHistologie et de Cytologie des Inverte'bre's marins, Universite' Pierre et Marie Curie, 12, rue Cuvier, 75230
Paris Cedex 05 et
Station Biologique de Roscoff, Centre National de la Recherche Scientifique, France R e p le 29 octobre 1985
LUTAUD, G. 1986. L'infestation du myokpithClium de l'oesophage par des microorganismes pigment& et la structure des organes h bactkries du vestibule chez le Bryozoaire Chilostome Palmicellaria skenei (E. et S .). Can. J. Zool. 64: 1842- 185 1.
Chez 75% des colonies vivantes de Palmicellaria skenei provenant des sites rocheux profonds des c6tes nord de la Bretagne, on observe dans l'oesophage de chaque polypide des taches 1atCrales bleues qui correspondent h des rangkes de cellules myokpithkliales envahies par des microorganismes pigmentks sphkrulaires. L'examen ultrastructural montre qu'il s'agit de protocaryotes intracellulaires, sans organite membranaire de type thylakoide, que leur pigmentation naturelle et une couche corticale de vCsicules rapprochent des bactkries autotrophes h pigment chlorophyllien. L'association n'est pas obligatoire, mais sp6cifique et circonscrite h la premikre subdivision contractile du tube digestif. L'ktude ultrastructurale des organes pairs qui s'attachent au diaphragme de la gaine tentaculaire montre que chacun est composk par l'accolement d'un des diverticules glandulaires du diaphragme et d'une poche compartimentCe par les replis d'une cuticule interne, qui dkrive de la paroi du vestibule et contient des bactCries filamenteuses. Les caractkres structuraux des bactkries sont prCcisCs. Les microvillositCs interdigitkes de 1'CpithClium de cette poche et la prksence i l'intkrieur de plaquettes fibrillkes provenant probablement de l'organe sCcrCteur adjacent suggkrent d'kventuels Cchanges entre la population bacterienne et l'h6te. L'association est obligatoire et vraisemblablement symbiotique.
LUTAUD, G. 1986. L'infestation du myoCpithklium de l'oesophage par des microorganismes pigmentks et la structure des organes h bactkries du vestibule chez le Bryozoaire Chilostome Palmicellaria skenei (E. et S .). Can. J . Zool. 64: 1842- 185 1.
Blue lateral spots, corresponding to rows of myoepithelial cells invaded by spherular pigmented microorganisms, were observed in the oesophagus of every polypide in 75% of living colonies of Palmicellaria skenei from deep rocky sites off the northern coast of Brittany. Ultrastructural examination of the microorganisms showed that they are intracellular procaryonts with no membranous organelle of thylakoid structure. Their natural pigmentation and a cortical layer of vesicles cause them to resemble autotrophic bacteria with chlorophyllic pigments. The association is not obligatory, but it is specific and is restricted to the first contractile region of the digestive tract. Ultrastructural examination of the paired organs attached to the diaphragm of the tentacular sheath showed that each organ is formed by the adhesion of one of the glandular diverticula of the diaphragm to a pouch, itself derived from the vestibular wall and containing filamentous bacteria, which is divided by the folds of its internal cuticle. The structural characters of the bacteria are described. Thz interdigitated microvilli of the epithelium of this pouch and the presence inside it of fibrillated plates, probably originating from the adjacent secretory organ, suggest that there may be exchanges between the bacterial population and the host. The association is obligatory and probably symbiotic.
Introduction La cavite coelomique et la paroi externe des Bryozoaires
marins sont generalement envahies par divers microorganismes et protistes qui sont plus ou moins occasionnels et d'autant plus nombreux que les zoi'des sont plus iiges. Parmi les associations les plus frequentes, on cite des peritriches fixes au bord de l'orifice zoi'dal et des chlorelles commensales ou symbiotes qui vivent dans la cavite generale des zoi'des chez certaines especes. 11 n'est pas exclu que des microorganismes participent a la lyse des tissus et a la formation des corps bruns residuels au moment du renouvellement periodique des polypides. I1 n'a pas ete signale jusqu'a present de symbiotes intracellulaires intervenant dans la degradation des aliments dans les subdivisions stomaca- les de l'anse digestive. Mais il existe chez les Chilostomes des cas d'association permanente et vraisemblablement symbiotique avec des populations de bacteries specifiques qui sont abritees dans une structure adaptee du Bryozoaire (Waters 1894, 19 12; Harmer 1926; Hastings 1943; Lutaud 1964, 1965, 1969; Palk 1911). Ces organes a bacteries, que d'anciens auteurs ont parfois confondus avec un ovocyte ou un testicule, se trouvent dans l'autozoi'de ou l'aviculaire chez pres de 10% des especes de la region de Roscoff. 11s se foment au cours de la morphogenese
des zoi'des et persistent dans la cavite generale au moment des renouvellements successifs des polypides . Leur enveloppe cellulaire comprend les assises epitheliale et peritoneale sous- jacente de la paroi zoi'dale dont elle derive. Leur localisation est differente chez les Anasca oh ce sont des kystes clos et situes sur le trajet des principaux cordons du funicule (Flustridae, Buguli- dae, Beaniidae), et chez les Ascophora oh les bacteries sont contenues dans une poche qui debouche sous l'opercule au bord de l'orifice zoi'dial dans la depression vestibulaire de la paroi externe (Cribrilinidae, Schizoporellidae) .
Dans le cas particulier de Palmicellaria skenei (E. et S.) (Smittinidae), la structure d'hebergement des bacteries asso- ciees ne constitue pas d'organe distinct dans la cavite generale du zoi'de, mais se confond avec les diverticules glandulaires du diaphragme de la gaine tentaculaire qui existent chez tous les Ascophora ("glandes vestibulaires," Lutaud 1964). La presence constante de bacteries sgcifiques dans les glandes du diaphragme du polypide fonctionnel et dans des structures homologues du polypide abortif de l'aviculaire, a ete mise en evidence par une etude histologique precedente et l'examen de frottis de leur contenu en contraste de phase et de frottis colores par des methodes bacteriologiques simples (Lutaud 1965). Une autre
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association concomitante, mais diffkrente par les caractkris- tiques spkcifiques du microorganisme impliquk, sa localisation et ses relations avec les tissus de l'hbte, a kt6 rkcemment constatke chez cette meme espece oh l'examen de taches pigmentkes dans le myokpithklium de l'oesophage a rkvklk la presence de protocaryotes intracellulaires a cet emplacement. L'identification du microorganisme oesophagien au microscope klectronique a kt6 l'occasion de prkciser par un examen ultrastructural complkmentaire les modalitks de l'hkbergement de bactkries symbiotes dans les organes annexes du diaphragme.
Materiel et methodes Les colonies rameuses et fortement calcifikes de P. skenei dont les
branches bilaminkes, plurisCriCes et dichotomes prdsentent gCnCrale- ment une teinte jaune verdiitre caractdristique, appartiennent aux biocoenoses des fonds durs de la Manche (Cabioch 1968). Les Cchantillons utilisds au cours de ce travail ont CtC rCcoltCs par dragage sur les fonds rocheux situCs au Nord et au Nord-Ouest de l'lle de Batz, en trois points caractCrisCs par de riches populations de Cellaria, au Trou Santic par 85 m de profondeur moyenne (04'06'30" W, 38O47'07" N), au Tachad (04'00'37" W, 48O48' N) et un site intermkdiaire (04O03'30" W, 47O47' N) par :75 m de profondeur moyenne, et sur le haut fond d'Astan a 1'Est de l'lle de Batz (03O57'30" W, 48'44'50'' N) par 40 m de profondeur.
Pour Ctablir la localisation spkcifique des organes a bactdries dans le zoi'de et le caractere constant ou sporadique des associations, les colonies de P. skenei, et d'autres Chilostomes provenant des m6mes gites, ont CtC examinCes sur le vivant et sur montages colorCs in toto par I'hCmatoxyline de Groat apres fixation-dCcalcification au Bouin aqueux, ou par le bleu de toluidine dans un tampon de Soerensen de pH 7,2 apres fixation par le formaldChyde a 10% dans l'eau de mer et ddcalcification ultCrieure par le citrate amrnoniacal a 5%. Des colonies fixCes par le glutaraldkhyde et l'osmium, et dCcalcifiCes dans les conditions techniques de 1'Ctude ultrastructurale parallele, ont CtC obsewdes sans coloration.
L'Ctude ultrastructurale a CtC faite a partir de pieces fixCes par le glutaraldkhyde a 2'5% dans un tampon de cacodylate de sodium 0,4 M, de pH 6'8 et 7,2, ajustC a une osmolaritd un peu supCrieure a celle de l'eau de mer locale par adjonction de 0'5% de NaCl. Les pieces ont CtC ensuite dCcalcifiCes par I'EDTA 0'2 M dans le tampon avant postfixation par le tetroxyde d'osmium a 1% dans le tampon, et incluses dans un mClange Epon-Araldite. Dans la marge utilisCe, il n'a pas CtC constat6 de modification sensible dans la conservation des tissus en fonction du pH. Les coupes ultrafines semi-sCriCes ont 6tC con- trastCes par la mCthode a I'acCtate d'uranyle - citrate de plomb.
RCfCrence sera faite aux prkparations histologiques qui avaient CtC faites au cours de 1'Ctude morphologique antCrieure des organes vestibulaires de P. skenei (Lutaud 1965) et qui ont CtC rCutilisCes. Celles-ci avaient CtC colorCes par la gallocyanine, I'hCmalun - picro indigo carmin, l'hdmatoxyline de Regaud ou l'azocarmin G selon Heidenhain, et par les rCactions de l'acide pdriodique - Schiff, du vert de mCthyle-pyronine selon Unna-Brachet et de Feulgen-Rossenbeck contr81Ces par des tCmoins trait& par la dCsoxyribonuclCase (Gabe 1968).
Recherches et resultats Infestation spe'cifique du myoe'pithe'lium de l'oesophage
Lorsqu'on observe des colonies vivantes de P. skenei, on re- marque immkdiatement dans l'oesophage partiellement extrude des polypides dont le lophophore est deploye, deux taches latero- ventrales, symetriques et reniformes, qui sont intensement et naturellement colorkes en bleu-vert. Ces taches paires qui tendent a s'etendre et se rejoindre parfois du c6te ventral, couvrent une surface importante du mydpithelium scalariforme qui constitue la paroi contractile de la premiere subdivision du tube digestif (Matricon 1973). Observkes aux grossissements du microscope optique sur des polypides vivants extraits de leur
loge calcifike, ou sur des colonies fixkes et dCcalcifiCes dont les deux faces accolkes ont kt6 dissocikes a l'aiguille pour kviter la superposition des images, ces taches se montrent constitukes par des corps pigmentks, globuleux et relativement polymorphes, souvent rkpartis le long d'un sillon axial, qui envahissent les rangees latkrales des cellules myokpithkliales et dont les dimen- sions moyennes sont de l'ordre de 5 p m sur le vivant (fig. 1 '2 '3) . Certains, a la base des cellules, sont sphkriques et tres foncCs avec parfois une area centrale plus claire ou des figures de clivage. D'autres ont une teinte bleu-vert plus claire avec des tortillons internes de corpuscules tres foncks et multiples et l'apparence de volumineuses inclusions dans la grande vacuole centrale des cellules myokpithkliales, et sont dkformables par les contractions peristaltiques de la paroi de l'oesophage. On ne distingue pas de noyau ou autre organite cellulaire. A la lisiere de l'orifice oral, on trouve dans les cellules du goulet pharyngien des germes pigment& plus fins dont les dimensions sont inferieures au micrometre. L'aspect et la couleur de ces corps pigmentks ne sont pas sensiblement altkrks par les fixateurs utilisks. Les coupes histologiques sagittales ou transversales de l'oesophage montrent dans la meme situation deux plages lathales de volumineux globules ovoides sans structure interne apparente, qui prennent intensement les laques d'hkmatoxyline, la gallocyanine et la pyronine dans la rkaction de Unna-Brachet, et presentent une reaction de Feulgen-Rossenbeck diffuse et faiblement positive sous contr8le enzymatique.
Ces taches bleues dans la paroi de l'oesophage sont presentes sans exception chez tous les polypides fonctionnels de la plupart des colonies. Leur localisation est tout a fait stricte et on ne trouve pas d'area colorke analogue ailleurs dans les autres organes du polypide ou les tissus parietaux du zoide. Pourtant, bien qu'elle soit tres gknkrale, l'infestation du myoepithelium par des elkments pigment& intracellulaires n'est pas constante. Chez environ 25% des colonies provenant des meme rkcoltes, ces taches latkrales caractkristiques manquaient dans tous les polypides actifs. I1 n'a pas etk observe de cas intermkdiaire d'infestation partielle des polypides d'une m2me colonie. Aux stades de la morphogenkse, on ne discerne pas d'inclusions pigmentees dans l'ebauche de l'oesophage entre le lophophore inacheve et le sac stomacal dorsal de l'embryon polypidien. Les premiers elements spherulaires bleu-vert de petite dimension apparaissent au debut de l'activite des jeunes polypides, puis se multiplient et grossissent pour atteindre leur aire d'extension maximale au niveau des troisieme et cinquieme rangees de zoi'des fonctionnels en arriere des bourgeons. Les unites pigmentees sont disperskes dans les corps bruns au moment de la dkgknerescence periodique des polypides et rkapparaissent dans l'oesophage des polypides de regknkration. On ne voit pas de germes pigmentes dans les ovocytes immatures et matures, ou dans les larves incubties dans les ovicelles. L'infestation est vraisemblablement d'origine externe et conskcutive a la pre- miere extrusion du lophophore.
L'examen ultrastructural confirme la presence dans le myok- pithklium et la localisation intracellulaire de microorganismes qu'on trouve sous trois formes correspondant aux aspects polymorphes observes sur le vivant. Les micrographies des coupes qui traversent les taches bleues de l'oesophage montrent des alignements d'organismes protocaryotes spheriques ou oblongs dont le diametre en section varie entre 2 et 6 pm, qui se trouvent a l'inte5rieur des cellules myoepitheliales entre leur grande vacuole centrale et leurs myofibrilles marginales, le plus souvent pres du noyau dans la region cytoplasmique du p61e basal (fig. 2, 3 , 4). Ceux-ci sont circonscrits, isolement ou par
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FIG. 1. Palmicellaria skenei. Interprdtation de la structure des organes 2 bactkries vestibulaires et de leur relation avec les diverticules glandulaires du diaphragme (les ligaments de la gaine tentaculaire ne sont pas reprCsentCs). bsp, microorganismes sphCru- laires pigmentis ; ca, cardia; cue, caecum; ct, cuticule interne de la poche 2 bactCries; dia, diaphragme; eps, CpithClium sCcrCteur des diverticules glandulaires du diaphragme; gt, gaine tentaculaire; oes, oesophage; p.bc, poche 2 bactCries; per, revetement pCritonCa1; ph, pharynx; py, pylore; st, estomac; vest, vestibule.
groupes de deux ou trois unites accolkes, dans un espace limite par une membrane de l'hbte. Du fait de leur volume, ils sont plus ou moins prokminents dans la vacuole centrale dont ils restent skparks par un film de cytoplasme entre la membrane de celle-ci et la membrane qui les entoure. Le protocaryote posskde une double membrane limitante externe qui est redoublke par une seconde double membrane interne a intervalle approximatif de 50 nm (fig. 8). Certaines images qui sont peut-etre dues a un effet de rktraction, suggkrent l'existence de points d'adhkrence Nriodique entre les deux membranes. Le cytoplasme est uniformkment granulaire a l'exception d'une plage sphkrulaire plus ou moins excentrke de matkriaux plus fins de moindre den- sitk. Le matkriel chromatique diffus, et partiellement coagulk dans les conditions optimales de fixation des tissus du Bryozoaire, est rkparti en amas qui correspondent soit a des nuclkoi'des multiples, soit a la section rkpktke d'un tortillon de chromatine. I1 n'y a pas d'organite membranaire feuilletk. Cependant, tout ou partie de la surface cellulaire a la lisikre de la membrane interne est constituke par une couche superficielle d'alvkoles ou vksicules au contenu diffus de faible densitk, dont le diamktre
FIG. 2. Palmicellaria skenei. Localisation des microorganismes pigment& dans le myoCpithClium de l'oesophage. bsp, microorga- nismes sphkrulaires dans le cytoplasme; cn.ph, canal pdripharyngien; col, armature collagkne de la gaine tentaculaire; gph, germes intracellulaire du pharynx; in.pig, inclusions pigmenties intrava- cuolaires; m, muscles annulaires de l'oesophage; mf, myofibrilles; myo, myoCpithClium; n.oe, nerf moteur de l'oesophage; n.ph, ganglion p6ripharyngien; oes, oesophage; per, revetement pCrito- nCal; ph, pharynx; vac, vacuoles du myoCpithClium.
moyen est de l'ordre de 120 nm (fig. 6, 8). Aux plus forts grossissements utilisks ( x 45 000 direct), il n'a pas kt6 possible de prkciser si ces alvkoles sont dklimitkes par un systkme membranaire dkrivant de la membrane plasmique interne, ou simplement par une disposition ordonnke des particules du cytoplasme.
D'autres cellules myokpithkliales au voisinage de celles dont le cytoplasme contient des microorganismes caractkrisks par leur organisation structurale et parrni celles-ci, renferment des inclusions inorganiskes de volume kquivalent qui remplissent tout ou partie de leur vacuole centrale (fig. 5). Ces inclusions, dkpourvues de membrane limitante propre, sont constitukes de substances diffuses, plus ou moins homogknes, avec des traces sporadiques de rksidus membranaires et un cerne pkriphkrique de matkriaux granuleux opaques. Elles sont parfois subdiviskes par la zonation interne de leurs composants. Ces volumineux globules qu'on trouve dans la vacuole de la cellule-hate a des degrks divers de condensation ou de dissociation, correspondent aux plus claires des unitks pigmentkes qu'on observe dans la
FIG. 3 8. Palmicellaria skenei. Fig. 3. Distribution bilatCrale des microorganismes pigment& dans l'oesophage (sur le vivant non colorC, dis- section). X 300. L, base du lophophore; MR, section du muscle grand rCtracteur; Oe, oesophage. Fig. 4. RangCes de microorganismes sphCrulaires ?i la base des cellules myoCpithCliales. x 5800. Fig. 5. Inclusions pigmentCes globuleuses dans la vacuole centrale de cellules myoCpithCliales. ~ 5 2 0 0 . In, inclusion pigmentCe; myf, myofibrilles; N , noyau de la cellule infestee. Fig. 6. Caracteres structuraux du microorganisme. X 24 000. C, corps central; nu, nuclCoi'des prCsumCs; ves, couche corticale de vCsicules. Fig. 7. Germes infestant une cellule de la rCgion pharyngienne. x 45 000. Fig. 8. DCtail des membranes et de la structure superficielle du microorganisme pigmentC. x 40 000. mbg, doubles membranes limitante du microorganisme; mbh, membrane de l'hdte; nu, nucleoi'des; ves, vesicules corticales.
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mCme situation dans les taches oesophagiennes du polypide vivant. Compte-tenu de leur pigmentation analogue, il semble qu'on puisse les interpreter soit comme le produit d'une activitC de synthkse des microorganismes, soit plus vraisemblablement cornme les stades de leur destruction au cours d'un cycle Cvolutif ou d'un processus de dCfense de l'h8te limitant l'invasion. Des unitCs d'aspect intermediaire, avec une membrane limitante et sans organisation interne, ont 6t6 trouvkes quelquefois en situation intracytoplasmique dans la zone infestCe.
A la lisihre distale de l'oesophage, entre l'orifice oral et les premihres cellules du myoCpithClium, l'examen ultrastructural rCvhle dans les cellules ciliCes du goulet pharyngien des plages d'inclusions granulaires groupees au p81e apical, dont les dimensions sont de l'ordre du micromktre. Aux grossissements directs de 20 000 a 45 000, ces inclusions qui sont limitCes par une membrane lisse et ne sont pas enclavCes dans un espace vacuolaire, prksentent trois structures internes qui excluent a priori l'hypothhse de vCsicules de sCcrCtion ou de lysosomes (fig. 7). Elles contiennent gCnCralement une ou plusieurs areas reticulaires claires dont l'aspect evoque un nuclCoi'de bactCrien imparfaitement conserve, un corps finement fibril16 dans le sens longitudinal, unique, en forme de barre transversale ou de croissant, et a la lisikre de la membrane limitante, une ou plusieurs formations feuilletkes et gknkralement coudCes qui sont composCes d'un petit nombre de doubles feuillets granu- laires d'environ 8 nm d'6cartement. I1 s'agit probablement des germes pigment& trks fins qu'on observe au mCme endroit sur le vivant a la lisikre distale de l'oesophage. Toutefois, il n'a pas CtC observC sur les micrographies de formes intermediaires qui Ctablissent une relation avec le microorganisme install6 dans le myoCpithClium et autorisent a les interprCter comme les germes prCcoces de celui-ci. L'Cventualite de deux infestations conco- mitantes dans deux catkgories cellulaires diffkrentes de la rCgion suborale du tube digestif ne peut Ctre CcartCe.
On rencontre encore dans les assises CpithCliale et peritoneale du lophophore, de l'anse digestive ou de la paroi zoi'diale, d'autres Ctres unicellulaires, isolCs, par couples ou en amas de plusieurs unites contigues. Ces organismes intracellulaires, sporadiques et sans localisation prCfCrentielle, sont caractCrisCs par un noyau ovoi'de avec une calotte de materiaux trks opaques en croissant autour d'une area centrale de nuclCoplasme ou se trouve un nuclkole compact, et au pourtour duquel le cytoplasme rCduit contient des mitochondries et quelques vCsicules hCtCro- ghnes. Leur aspect sur le vivant Cvoque certaines images de "Nosema bryozoides," d'affinitks incertaines, que Braem (1 9 1 1 ) , Marcus (1934, 1939, 194.1), Schroder (1913) et Wiebach (1959) ont dCcrit chez les Phylactolaemes. 11s sont sans rapport apparent avec les bactCries pigmentkes de l'oesophage et il s'agit probablement de parasites ou de predateurs, compte-tenu de leur frkquence dans les zoi'des igCs et les corps bruns.
Les organes a bacte'ries vestibulaires Les organes pairs qui dkbouchent de part et d'autre du
diaphragme au niveau de l'orifice apical de la gaine tentaculaire chez les Ascophora, ont normalement la structure simple d'une poche piriforme dont l'kpithklium cubique Clabore des sCcr6- tions muqueuses (Lutaud 1964). Chez P. skenei (fig 1, 9)' ces
organes hypertrophiCs sont plus complexes et constituCs par la juxtaposition d'une poche boudinke a paroi mince qui contient une population compacte de bactkries filamenteuses, le plus souvent disposkes sur le vivant perpendiculairement a l'enve- loppe cellulaire, et d'un massif adjacent de cellules 6pithCliales cubiques, situC face au polypide, qui la bride et la coude dans sa region moyenne. Ce bourrelet, au niveau duquel l'organe adhkre aux ligaments dorsaux-latCraux de la gaine tentaculaire sur une partie de leur trajet, se prolonge jusqu'au diaphragme par une double rangCe de cellules le long du canal distal contourn6 de la poche a bactkries.
L'examen ultrastructural de coupes sCriCes montre que la poche a bactkries s'ouvre a la base du vestibule, entre les replis qui bordent la suture de la dkpression vestibulaire de la paroi externe avec l'orifice apical et le sphincter de la gaine tentaculaire (Lutaud 1984), et que ses assises CpithCliale et pCritonCale prolongent celles du vestibule sans discontinuit6 au niveau de l'embouchure. Sur toute la surface de la cavitC interne, 1'CpithClium est recouvert, comme la paroi du vestibule et du sac de compensation, par une mince cuticule de 30 nm d'epaisseur moyenne, ou l'on distingue les strates de la pellicule trilamellaire superficielle de la cuticule pariCtale et une couche fibreuse sous-jacente rCduite. La poche est compartimentCe sans Ctre complktement cloisonnCe par des replis de la cuticule qui s'Clkvent en crCtes et apophyses a travers la population bactirienne (fig. 10) a intervalles moyens de 30 Fm dans le cul de sac proximal et plus rapprochkes dans le goulet distal, formant a l'embouchure une sorte de herse de plissements con- vergents. Les cellules CtalCes de 1'CpithClium sont caractCrisCes par une bordure de microvillositCs dilatCes et interdigitkes sous la cuticule qui pCnhtrent profondCment a l'inttrieur des projec- tions lamellaires de celle-ci. A la base des microvillositCs, on observe des invaginations de la membrane plasmique qui Cvoquent des images d'endocytose, et dans le cytoplasme, un rCseau trks riche de canalicules de reticulum lisse au contenu de forte densit6 (fig. 13). Le reticulum granulaire est moins abondant. On trouve des groupes d'inclusions opaques, de 0,5 h 1,5 Fm de diamktre, sans membrane limitante.
La population bactkrienne est repartie autour d'un espace libre dans les compartiments menages par les projections cuticulaires de 1'CpithClium. Les bacilles sont Gram nkgatifs sur frottis et donnent sur les coupes histologiques de l'organe une rCaction de Feulgen-Rossenbeck faible mais positive sous contr6le enzymatique. Sur les micrographies , les bitonnets courts avec un nuclkoi'de axial, et les chaines indivises compre- nant deux nuclCoi'des ou plus, ont une section transversale d'environ 0'7 Fm. Leurs extremitks libres sont c6niques ou arrondies, avec souvent une plage sphCrulaire de matCriaux denses de 0,5 Fm de diamktre. Aucune ramification n'a CtC observCe. Les bacilles ont deux membranes, externe et interne, h 25 nm d'intervalle. L'enveloppe externe prCsente des Cpaissis- sement opacifiCs au niveau des contacts entre bactkries adjacentes, qui pourraient Ctre un facteur de la cohesion de la population bactkrienne sur le vivant. Les coupes tangentielles la surface mettent en Cvidence une ornementation corticale caractiristique au niveau de la membrane plasmique interne, sous la forme de bandes obliques ou longitudinales qui prCsentent un aspect
FIG. 9 a 13. Palmicellaria skenei. Fig. 9. Organe vestibulaire, in toto (sur le vivant, dissection). X400. Ca, canal distal de I'organe; Eps, diverti- cule sCcrCteur du diaphragme; PBc, poche a bactkries. Fig. 10. Coupe de la region moyenne de la poche a bacteries. x8200. Bc, bacteries; ct, apophyses de cuticule; vil, microvillositCs de 1'CpithClium du kyste. Fig. 1 1. Bandes striees a la surface d'une bactirie. X 20 000. Fig. 12. Detail de la structure strike superficielle. x 45 000. Fig. 13. Caracteres structuraux de I'Cpithelium de la poche a bacteries. x 24 000. cen, centriole; ct, cuticule; G, Golgi; per, assise pCriotonCale; Ret, reticulum lisse; vil, microvillosites intriqukes sous la cuticule.
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finement feuilletk dans le sens transversal (fig. 1 1). A fort grossissement, ce dispositif structural se montre constituk par des alignements de corpuscules granulaires a intervalles trks rkguliers de 5 a 6 nm (fig. 12). Entre la membrane plasmique et l'amas chromatique central, la matrice cytoplasmique est pauvre en particules denses.
Les bactkries environnkes de fines gouttelettes baignent dans un milieu diffus qui remplit la lumikre centrale de l'organe et les interstices de la couche bactkrienne et qui prksente sur coupes histologiques une mktachromasie rouge au bleu de toluidine a pH 7 et les affinitks tinctoriales gknkrales de mucopolysaccha- rides. Sur les micrographies,, ce milieu interstitiel apparait comme un mklange d'au moins deux composants qui prkcipitent skparkment. Dans une substance finement granuleuse a fort grossissement, avec des trainkes plus denses de matkriaux plus fins, on trouve des pelotons de plaquettes transparentes, d'environ 0'4 km de large, incurvkes et concentriques a 0'1 km d'intervalle, qui prksentent une fibrillation transversale en kchelle (fig. 16). Ces plaquettes aux bords rectilignes ne sont skparkes des substances ambiantes par aucune limite membra- naire ou granulaire autre que leur diffkrence de texture et de densitk. Elles sont abondantes dans le goulet distal de la poche ou les bactkries se rarkfient. Leurs formations pelotonnkes sont visibles sur le vivant sous la forme de plages hyalines aux contours arrondis, qui prksentent une rkaction acide pkriodique - Schiff positive sur les coupes histologiques.
L'assise pkritonkale est mince, sans caractkre structural particulier, et enrobe l'organe sans s'infiltrer entre la poche a bactkries et le bourrelet cellulaire adjacent. On note l'accumula- tion de prkcipitks floculeux ou opaques dans l'espace intercellu- laire entre l'kpithklium et le revetement pkritonkal.
Les cellules cubiques du bourrelet se superposent a l'assise Cpithkliale de la poche a bactkries qui n'est pas interrompue a leur niveau (fig. 14). Elles sont disposkes autour d'un canal interstitiel a la lisikre duquel leur surface apicale est dkpourvue de bordure microvilleuse et de cuticule. Leur complexe golgien remarquable est composk de plusieurs dictyosomes disposks circulairement autour d'une area centrale de cytoplasme oh se trouve un centrosome qui est parfois prolong6 par une racine fibreuse abortive. Les plateaux golgiens environnks de multi- ples petites vksicules, sont caractkrisks par le nombre klevk de leur saccules dkpassant la dizaine (fig. 14, 15). Les saccules les plus internes aux ampoules trks dilatkes sont remplies de prkcipitks granuleux opaques. Au centre et au pourtour du complexe golgien, on trouve des vksicules plus volumineuses, a membrane lisse, dont la section trks variable dkpasse couram- ment 1 km et dont le contenu mixte est composk de prkcipitks granuleux ou vermiculaires opaques dans une substance de faible densitk qui prksente parfois des figures de fibrillation. Des tortillons de matkriaux transparents fibrillks, comparables aux plaquettes plus rkgulikres de la poche a bactkries, se foment dans le canal interstitiel a la lisikre apicale des cellules. I1 semble donc que l'origine bactkrienne de ces plaquettes soit incertaine et qu'il s'agisse plutdt de produits de l'activitk golgienne des cellules skcrktrices passant secondairement dans la poche a bactkries contigue, soit par un orifice entre les deux rkgions de l'organe qui n'a pas kt6 recoupk, soit par reflux au niveau de leur
dkbouchk dans le diaphragme. Dans la rkgion basale de la cellule et autour du complexe golgien, le reticulum granulaire trks dkveloppk forme un rkseau de cisternes dilatkes au contenu diffus de moyenne densitk, dans lesquelles se trouvent sporadi- quement des corpuscules membranaires pseudomykliniques dont les dimensions sont de l'ordre de 100 nm. Des corpuscules membranaires analogues se trouvent aussi dans l'area centrale du complexe golgien. Chaque cellule contient entre les maillons du reticulum granulaire, prks du noyau basal, une volumineuse vksicule limitke par une membrane lisse dont le diamktre peut atteindre 5 km. Cette inclusion sphkrique , gknkralement unique, avec des replis internes de sa membrane limitante, est composke de matkriaux hktkrogknes dont certains trks opaques prkcipitent en nids d'abeille de f a ~ o n trks caractkristique sur tout ou partie de son volume (fig. 15). Elle prksente sur coupes histologiques les affinitks tinctoriales de polysaccharides.
Discussion Les deux esphces bactkriennes qui trouvent un emplacement
favorable a leur prolifkration dans la cavitk gknkrale du zoi'de et dans la rkgion suborale du polypide chez P. skenei diffkrent dans leur relation avec l'hdte. I1 ne peut s'agir de formes polymorphes d'un meme organisme et l'ktude ultrastructurale n'apporte pas l'indice d'une interdkpendance fonctionnelle entre les deux associations concomitantes .
Dans le cas particulier de P. skenei, les organes annexes du diaphragme, qui est issu de l'accolement des assises cellulaires de la paroi externe et de l'embryon polypidien au cours de la morphogknkse de l'orifice zoi'dial (Lutaud 1984)' sont compo- sCs de la meme f a ~ o n par la coalescence de deux diverticules CpithCliaux dont les caractkres structuraux et fonctionnels sont diffkrents. La rkgion skcrktrice de l'organe, dont l'kpithklium est nu comme celui de la gaine tentaculaire et des autres organes du polypide, dkrive de la rkgion infkrieure du diaphragme qui appartient a celle-ci. Elle correspondrait donc aux glandes piriformes qui existent chez tous les Ascophora, indkpendam- ment de la prksence ou de l'absence de kystes bactkriens, dCformkes par l'hypertrophie de la poche ii bactkries adjacente. Le terme de "glandes vestibulaires" utilisk pour dksigner celles-ci (Lutaud 1964) doit donc &re rkvisk. La poche ii bactkries, comme le sac de compensation des Ascophora et les replis de la rkgion vestibulaire du diaphragme entre lesquels elle dkbouche, posskde un revetement cuticulaire interne qui en atteste l'origine pariktale. Elle ne diffkre des kystes bactkriens qui dkbouchent sous l'opercule a l'entrke du vestibule chez d'autres Ascophora que par le niveau de son insertion. Les bactkries sont ainsi retenues comme dans une nasse par des chicanes de cuticule dans une structure d'hkbergement d'origine pariktale qui dkrive d'une invagination cavitaire du vestibule au cours de l'organogenkse de l'orifice zoi'dial. Elles sont skparkes de leur enceinte cellulaire par cette cuticule et se trouvent ainsi 2 l'extkrieur des tissus de l'hdte. D'kventuels kchanges avec le milieu marin restent possibles par le canal distal et l'orifice de la structure d'hkbergement. L'examen ultrastructural n'apporte pas d'information sur la nature des kchanges susceptibles d'inter- venii. entre le Bryozoaire et le microorganisme. Toutefois, l'assise CpithCliale de l'enveloppe cellulaire prksente les carac-
FIG. 14 a 16. Palmicellaria skenei. Fig. 14. Juxtaposition de la poche a bactCries et du diverticule sCcrCteur du diaphragme (section transversale de la rCgion moyenne de l'organe). x5600. Bc, bactCries; Cin, canal interstitiel central; Eps, cellules CpithCliales du bourrelet sCcrCteur; Epk, CpithClium limitant du kyste bactirien; G, Golgi ; Inb, inclusion basale. Fig. 15. Caracteres structuraux de 1'CpithClium sCcrCteur. x 11 200. G. Golgi; Inb, inclusion basale. Fig. 16. Pelotes de plaquettes fibrillCes dans le canal distal du kyste. x 7200. ct, apophyses de cuticule; muc, milieu muqueux ; pl, plaquettes .
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tkres structuraux d'une fonction absorbante par le dCveloppe- ment du reticulum lisse et d'un labyrin,the de microvillositCs dont les images Cvoquent celles de la bordure microvilleuse des subdivisions stomacales de l'anse digestive. I1 est donc plausible que des produits des synthkses bactkriennes diffusent a travers la cuticule et transitent vers la cavitC gCnCrale de l'h6te. D'un autre c6tC, la prksence dans la lumikre des organes a bactCries de formations caractkristiques de plaquettes qui pourraient prove- nir des glandes du diaphragme auxquelles ils sont attenants, laisse prCsumer que les sCcrCtions de celles-ci entrent dans la composition du milieu favorable a la vie des bactkries. L'association est constante dans la mesure oh l'examen de plus de 300 colonies n'a rCvClC aucune exception et l'ensemence- ment des bactCries intervient aux stades de la morphogknkse. Chez P. skenei comme chez d'autres Ascophores, les organes a bactCries vestibulaires s'kbauchent au cours des dernikres Ctapes de la formation du diaphragme et augmentent rapidement de volume dans le zoi'de jeune. 11s se dCtachent au moment du renouvellement pCriodique du polype avec la rkgression de la gaine tentaculaire et persistent ensuite dans la cavitC gCnCrale. 11s sont renouvelCs avec chaque polypide de rCgCnCration lorsque la connexion gaine-orifice se rCtablit, a c6tC des diverticules glandulaires du nouveau diaphragme (Lutaud 1965). L'association spCcifique et obligatoire, permanente pendant toute la durCe de vie du zoi'de et a bCnCfice rCciproque probable, peut &re considCrCe comme un cas de symbiose.
L'infestation du myoCpithClium de l'oesophage par des bactCries pigmentCes est stricte dans son aire de rkpartition, mais elle n'a pas le caractkre constant d'une symbiose malgrC un taux de frCquence ClevC atteignant 75% des colonies dans les sites profonds des c6tes fran~aises de la Manche. Le microorga- nisme est intracellulaire. Mais sa localisation dans la subdivi- sion distale contractile de l'anse digestive, dont il est admis qu'elle n'intervient pas dans l'absorption des mktabolites, implique qu'il ne participe pas aux processus intracellulaires de la digestion et n'en bCnCficie pas. Cette implantation est significative si on la rapproche du fait que les premiers germes pigment& s'installent lorsque les jeunes polypides dCploient leurs lophophores et commencent a s'alimenter. Aprks une phase d'invasion rapide par des germes pCnCtrant par voie orale, la propagation du microorganisme serait circonscrite a l'oeso- phage par un processus de regulation qui se traduit par 1'Climina- tion d'unitCs pigmentCes rksiduelles dans les vacuoles du myoCpithClium. L'association, commensalisme ou parasitisme sans incidence nocive apparente, est spkcifique. L'examen des autres Brvozoaires communs du meme facies. Chilostomes et
Les organismes pigment& de l'oesophage se situent parmi les bactCries par le niveau de leur organisation cellulaire. L'hypo- thkse de CyanobactCries que leur pigment bleu suggkre au premier abord, n'a pas CtC retenue en l'absence d'organite membranaire de type thylakoi'de. Un doute subsiste dans la mesure ou d'autres germes plus fins a l'entrCe du pharynx contiennent effectivement des structures feuilletkes pCriphCri- ques. Mais une relation de filiation entre les germes du pharynx et les stades sphCrulaires qu'on observe dans le myoCpithClium de l'oesophage est incertaine. Par contre, ceux-ci prksentent deux caractkres fondamentaux qu'on peut retenir comme criteres de leur diagnose et qui les rapprochent des bactCries autotrophes parmi lesquelles des espkces libres a pigment chlorophyllien utilisent les ions SH: ce sont leur pigmentation meme et la structure alvkolaire de leur surface sous la membrane plasmique. En effet, celle-ci est tout a fait comparable a la couche corticale de vCsicules que Cohen-Bazire et al. (1964) ont mise en evidence chez les bactCries "vertes" (Chlorobium thiosulfatophilum) et qu'ils ont interprCtCe comme le dispositif structural correspondant a la localisation du pigment photosyn- thCtique. Cette similitude permet d'envisager la prCsence d'une nouvelle espkce de ce groupe particulier de bactCries chez P. skenei, bien que leur couleur bleue exclue a priori un pigment chlorophyllien dans ce cas present. Mais la quantitC de lumikre susceptible de parvenir a l'intCrieur d'un Bryozoaire fortement calcifiC qui vit dans une biocoenose touffue par 80 m de fond est infime. Une faible source d'knergie pourrait &re procurke par la fameuse "luminescence des Bryozoaires" qui n'a pas CtC dCmontrCe, ou d'autres organismes de l'environnement proche. L'association avec des bactCries intervenant par l'apport de radicaux sulfhydrilCs ou de produits de la photosynthkse pourrait avoir une incidence non nCgligeable dans le mktabolis- me du Bryozoaire.
Remerciements L'auteur tient a remerci~r le Prof. G. Giraud (Laboratoire de
Botanique, Algologie, Ecole Normale SupCrieure, Paris), Mmes G. Stanier et R. Rippka (Laboratoire de recherches de Physiologie microbienne, Institut Pasteur, Paris), Mlle I. Desportes (Laboratoire d'Evolution des Etres OrganisCs, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris) et Mme S. Charnroux (Station Biologique de Roscoff, CNRS) qui l'ont aidCe de leur conseils et avis au cours de ce travail.
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Les caractkres morphologiques des bactkries des kystes vestibulaires ne suffisent pas a en situer la position systkmatique et Clucider le r6le de l'organe qu'une analyse des produits de leurs synthkses en culture permettrait peut-&re de prCciser. L'hypothkse de mycobactCries a CtC avancCe dans le cas d'autres Chilostomes posskdant des organes a bactCries vestibulaires ou funiculaires (Lutaud 1964, 1969). L'CventualitC d'organes luminescents n'a pas fait l'objet d'investigations.
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