cuivre et de qu seiche, Sepia o

Micheline Martoja

lnstitut oct!ancmgraphiyise, 195, rue Saint lacques, 75005 Paris, France

et Ckristiane Marcaillsu Universite Pierre et Marie Curie, baboratoire d'histophysiologie fondamentale et appiiquee, 12, rue Cuvier, 75005 Paris, France

Martoja, M. et C. Marcaillou. 1993. Localisation cytologique du chlivre et de quelques autres metaux dans la glande digestive de la seiche, Sepia officinalis L. (Mollusque Cephalapode). Can. 1. Fish. Aquat. Sci. 58 : 542-550.

La glande digestive de la seiche, Sepia officinalis C., a et6 ktudiee par mkthodes histochimiques et microanaly- tiques. La rnajeure partie du Cu y est concentree dans des spherules 6labsrees par Bes cellules basales. II y est accornpagne d'Ag et de Zn. B u Fe existe egalement mais i l est plus abondant dans les cellules digestives. Nos resultats rnontrent que les sph6rules sont constituees de 'hetaliothionein-like proteins". Le fait que les ligands des rnktaux soient des proteines a une incidence sur le plan 6cslsgique. Les metaux sant facilernent assimilables et peuvent etre transfer& aux niveaux superieurs de la chaine trophique.

The cuttlefish, Sepia officinalis C., liver was investigated by histochemical and microanalytical methods. The greater part s f the accumulated Cu is concentrated in spherulae which are elaborated by the basal cells. Cu is associated with both Ag and Zn. Fe is also found but the digestive cells are the most important site of Fe storage. Our data show that the spherulae are made of metallothionein-like proteins. The occurrence of these metal- binding proteins has ecological effects. Pke metals are easily assimilable and can be transferred to higher levels of the food chain.

R e p le f t mars 1992 Accept4 le 18 septernbre 1992 (JB434)

es ckphalopodes accurnulent, dans les conditions natu- relles, une importante quantitk de Cu. Celui-ci est rkparti de f a p n inkgale entre les organes mais c'est toujours la

glande digestive qui en contient le plus. Chez la seiche, Sepia oficinezkis L., elle dktient 50 % du rnCtal alors qu'elle ne repre- sente que 6 % du psids de l'animal (Miramand et a!. 199B), les teneurs moyemnes, exprimkes em poids sec, ktant de l'ordre de 298 p g g - ' pour les juveniles et de 1 200 pg-g-l pour les adultes (Wang Tai Si 1928 Schipp et Hevert 1978). Cegemdant , ces doranees quantitatives ne coneordent pas avec les rksultats de 19histoehimie : certes, ce mode d'analyse deckle du Cu dans les cellules digestives mais 19intensit6 des reactions est trks infk- rieure 8 ce que laissent prkvoir les dosages (Ruth et a!. 1988). Schipp et Hevert (1978) prkcisent m2me que "copper has not yet been localized on cytochemieal basis". Bar ailleurs, om sait que, chez divers cephalopodes, le Cu peut &re assoeie B d'autres mCtaux et en particuller 2i du Zn, du Cd et de l'Ag (Martin et Flegal 1975; Finger et Smith 1987), mais le mode d'association est ineonnu. Ces considkrations nous omt conduites i reprendre l'examen de la glande digestive de la seiche, par diverses rn6thodes histologiques et microanalytiques, dans le but de localiser des accumulations de Cu plus importantes que celles des cellules digestives et, le cas kchkant, de dktemimer les ligands du mCtal.

Les glandes digestives et quelques glandes branchiales ont

Received March 7 I, I992 Accepted September 18, 5 992

kt6 prClCvCes sur des seiches adultes, rkcoltees au cours de divers skjours effectuks sur la c6te mCditerrankenne (Eabora- toire Arago, Banyuls-sur-mer) .

Les amirnaux ont kt6 sacrifiks par decapitation. Certaines pikces omt CtC fixCes par les melanges de Bouin ou de Camoy pendant 12 a 24 h, puis consewees dans l'ethanol ou incluses dans la paraffine. Les coupes, de 5 pm d'epaisseur, ont kt6 traitCes par les mCthodes suivantes : trichrome de Prenant-Gabe et coloration au rouge solide-picro-indigocamin (examen topo- graphique) coloration au bleu de rnkthylkne (detection des composCs basophiles); reaction B l'acide periodique-Schiff (ABS) (dktection des composks glucidiquesh tktrazorkaction de Danielli (detection des prot6ines); rkaction de Bennett au red sulfhydril reagent (RSR) (dktection specifique des groupes SH); reaction au fenieyanure femique de Schmorl (mise en evidence du earactkre rkducteur); rkaction 8 l'hexamkthylkne tktrarnine d'Ag de Gomori (detection de l'acide urique, des urates et des phenols); reaction de substitution par l'Ag de vom Kossa (detec- tion des phosphates et des carbonates); rkaction de Bunting h l'acide sulfurique (dktection spkcifique des carbonates); colo- ration par la laque d'alizarine de Dahl et McGee-Russell (dCtection du @a, du Mg, du Sr et de 1'Al); riaction de Kashiwa au glyoxal-bis 2-hydroxyanil (GBHA) (dktection sgcifiqare du Ca); rkaction a l'acide mbkanique d'Okamots et coloration par l'hkmatoxyline de MacCallum (detection du Cu); reaction de Timann et Schmeltzer au ferricyanure de potassium (detection du Fe bivalent et du Cu monovalent); rCaction de Perls au fer- rocyanure de potassium (detection du Fe trivalent et du Cu biva-

542 Cun. J . Fish. .4qucrt. Sci., Vol. 50, I993

lent) (voir Langeron 1949, Martoja et Martoja 1967 et Pearse 1972 pour le dktail des techniques).

Pour la microscopie Clectronique par balayage, les pikces snt it6 fracturCes dans lqazote liqulde et dCshydratCes par l'kthansl absolu. Aprks dessiccation par la technique du point critique, les Ccharatillons ont it6 m6tallisCs par Cvaporatiora d'or- palladium.

Pour la microseopie Clectronique ii transmission, les pikces snt CtC fixCes pendant 90 man, B 4 "C, par le glutaraldehyde a 3 % dans un tampon cacodylate Be sodium 0,2 M additionnC de saccharme 0,35 M (pH 7, I ) , post-fixCes par le tetroxyde d'osmiurn h 2 96 et incluses dans 19Cpon-araldite. Le contraste des coupes a CtC renforcC par 19ac6tate d'uranyle et le citrate de plornb.

La microanalyse a t t t effectukes par deux mCthodes : 1) spectrographic des rayons X, au moyen d'une microsonde 6lec- tronique CquipCe de spectromktres dispersifs en longueur d'snde (Camica Ik3-461, afec une tension d'acctlCration des electrons de 1% kV, un courant d'Cchantillon de 40 nA et un diamktre Be sonde de 1 prn. Les coupes owt CtC Ctal6es sur support de mylar carbon6 et dCparaffin6es. Les CICments P et S ont kt6 recherchks avec le cristal KAP (phtalate acide de potassium), Cu et Zn avec le cristal LiF (fluomre de lithium) et Ag et Cd avec le cristal PET (penta-Crythritol); 2) emission ionique secondaire au moyen d'un analyseur Cameca SMI 300, sur coupes a la paraffine de 7 pm, CtalCes sur support d90r poli et dkparaffi- nCes, soumises aux conditions standard d'analyse en basse rCsolution en masse (bombardement : 8, + , 7 pA, 10 kV, dia- phragme de contraste 200 pm, diamktre de champ image 250 pm, grandissement direct 1 18 environ, rCsolution en masse du spectrsmktre sn/Vrn = 300).

Caractkres des cellules basales

Le Cu a kt6 mis en Cvidewce dans 19hCrnocyanine ainsi que dans de minuscules grains 1ocalisCs dans %es cellules digestives et parfsis dans la Iumikre de la glande. Toutefois, les concentrations les plus importantes ont kt6 dCcel6es dans des cellules triangulaires sitbakes il la base de 19$pithClium, entre les cellules digestives. Suivant la teminolsgie de CuCnst (1 907), wous les nommons cellules basales. Dks l'examen topographique, elles se distiwguent des cellules digestives par leur bassphilie. Aprks fixation par le mClange de Bouin ou le glutaraldChyde, leur cytsplasme est spongieux. Aprks fixation par le mtlange de Carnoy, les examens en microscopie ghotonique ou em microscopie par balayage moastremt que cet aspect est dfi ii la dissolution de sph6mles qui peuvent atteindre 5 pm et dont le nombre varie csnsidCrablement d'un individu h 1 ',autre (fig. 1 ii 4).

A l'kchelle ultrastructurale, les cellules basales se caractkrisemt par la coexistence d'un reticulum endoglasmique granulaire trks dCveloppC et de plages circulaires, trakparenies aux klectrons, comespondant aux sphtrules. Le reticulum est disposk en nappes pxall&les 2 la lame basale, plus nombreuses au vsisinage de celle-ci qu'h l'apex cellulaire (fig. 5 et 6). Les citemes sont peu dilades et denses. Les grains de sCcrCtion renferrnent un produit granuleux ne prCsentant aucune organisation particuli8re qui pemette de l'identifier (fig. '3). kes temitoires hyaloplasrniques, sCquestrCs entre les nappes de reticulum ont, au depart, une fome imCgulikre. Ils acquikrent progressivement leur transparence tamdls que leur volume augrnente gr&ce h I'apport des vCsicuIes qui restent d'abord

FIG. 1 i2 3. VariabiIitk du nsmbre des sph6mles dans la glande diges- tive. Seaon les individus, les sphCmles, qui apparaissent en noir h la p6riphCriie des tubes, peuvent &re absentes (fig. I ) , assez Hares (fig. 2) oat extr&nernent abondantes (fig. 3) (fixateur de Carnoy; rkaction de Schmorl, rouge solide; I'Cchelle reprksente 60 pm).

cantsnnCes en pCriphCrie (fig. 8). Beu A peu, leur contour se regularise puis ils fusionnent emtre eux par groupes de trsis su quatre et leur mprphologie se rapproche de plus en plus de celles des sphkr~kles. A maturit6, Ieur contenu est floconneux et il s9y

Can. J . Fish. Aquut. Sci. , Vol. 50, 1993

FIG. 4. Aspect d'une cellule basale en rnicroscopie 6lectronique i balayage. Ee contenu des sphkrbales (astCrisques), padaiternent conservC (fig. 4 4 , a un aspect granuleux et hktkrog8ne (fig, 4b). (Fixateur de Carnmoy; les Cchelles reprksentent respectivement 1 et 0,33 pm; LB : lame basale. )l

ajoute parfois de petits arnas plus opaques. Aucune image de pinocytose n 'a CtC obsewte.

Aka voisinage de 1'h6molympke9 les espaces intercellnlaires contiennent des rnolkcules d'hkmocyanine tout 2 fait identifiables. Quel que soit le sens du transit, iB est donc kvident que le pigment respiratoire traverse la lame basale. Cette demikre est ponctuke d'une rang& rkgkaliere de grains opaques (fig. 9). D'6ventuels rapports de filiation entre ces grains et Be pigment we peuvent Stre envisag6s quq2 t i k d'hypothkse. En effet, les deux structures sont contigues mais les grains n'ont pas la configuration typique de l'hkrnocyanine et aucune f ame de transition n'a Ctk observ6e. L'hkrnocyanine est tr&s abondante entre les tubes de la glande digestive et les capillaires. Ees molCcules sont le plus souvent agencCes en amas cristallins (fig. 10). Exceptionnellement , ceux-ci sont entour& d'une membrane (revoir fig. 5). Ees espaces intertubulaires renfement aussi des mitochondries et des noyaux isol6s qui, d9 aprgs leurs caractkres , ne peuvent provenir de fibrocytes. Leur origine n'a pas kt6 dCteminCe.

@aract&res des sph6mles

En ralson de leur hydrosolubilit6, l'ktude rnicroanalytique et histochimique des sphkmles a kt6 r6alis6e exclusivernent skar rnatkriel fix6 par le rnklange de Carwoy.

La rnicroanalyse X montre une exceptiownelle richesse en Cu. A titre indicatif, les valeurs extrSmes, exprim6es en coups cornptks pendant 20 s, y sont de 1 200 A 4 800 et seulernent de I40 & 308 pour les inclusions des cellules digestives, de 50- 158 pour 1'hCmocyanine et de 30 5 40 pour les cellules des glandes branchiales. Le second CICrnent rnajeur est le soufre. Le rapport des iwtensitks Cu/S va de 0,7 2i 3,0 selon Bes sph6- rules. Les autres ClCments dCtect6s sont, dams l'ordre dkcrois-

sant : Zn > Ag et @a > Mg > Sr (fig. I I et 12). La recherche des ClCments M, Na et P est restke nkgative. Le Cd n'a pas Cte d6cel6 meme en analyse ionique. Quelques sphCrules contien- nent du Fe mais la majeure partie ainsi qu'une certaine quantitk de Zn sont localiskes dans les cellules digesf ves.

Ees sph6mles sont solubles dans les acides mintraux (WCI I M, H2S04 0'5 M, H,IO,, pH 1,4), les bases (NaOH I M ou NH4BH 1 M), KCN, Li,CO,, les tampons glycine-HCE (pH 2,3) et v6ronal-HCB (pH 8,5). EEles sont lentement solubles dans une solution aquerase d'acide acktiqate (CH,GO,H, pH 2,3) : un traitement de 15 min ne les altkre pas; aprks 4 h, leur nombre a diminkt6 et aprks 18 h, toutes ont dispam. Le soufre et Hes rnttarax Cu, Zn et Ag sont CliminCs de f a ~ o n pro- gressive. En 18 h, le chlomre de cadmium, CdCl, a I %, dkplace la totalltk du Zn. Bans le m6me laps de temps, le bichlomre de mercure, HgCB, i 1 %, d6place 50 % du cuivre et 80 2 90 % du Zn. Dans les deux cas, la quanf tk de soufre reste inchangke. Les sph6mles sont insolubles dms I'eau dis- till& (pH 5 3 , l'acide picrique en solution aqueuse ou alcoo- lique, la pipkrazine, %e glyckrol et le tanrapon borate (pH 8,s).

L9examen Be coupes non colorkes permet de distinguer, dans les sph6rules, une fine coque et un coeur plus volumineux pouriu lui-meme de quelq&s inclusions. L; coque est natu- rellement noire taradis que le coeur est vert. Toutes les rkactions et colorations signalCtiques du Cu sont positives. L'hCrnatoxy- line aqueuse colore l'ensernble de la sphkmle en bleu pale et les inclusions du coeur en bleu vif. La reaction A 19acide mbCa- nique est intense (fig. 13); I'expsition aux vapeurs d'acide chlorhydrique, prkconisde pour 1e d6rnasquage du rnktal, me la renforce gas mais, au contraire, l 'ablit en dissolvant les sphk- rules. La r6action de Tirrnann et Schmeltzer rCvkle du Cu biva- lent color6 en bmn rouge, surtout dans la coque et dans les inclusions du coeur. La rCaction de Perls rkvkle Bu CBI mono-

544 fin. J . Fish. Aquat. Sci., VoI. 50, 1993

FIG. 5. A 7. Aspect ultrastructural des cellules basales. Fig. 5 . Les plages du retickalum endoplasrnique grankelaire entourent de volurnineuses sphkmles (Sp) dont le contenu est dissokes. On observe la formation de sph6mles (astkrisques) par la fusion de plkasieurs tenitoires. Dans I'espace intertubulaire. une vksicule contient de I'hCmocyanine (flkche) (l'kchelle reprksente 0,5 prn). Fig. 6. Dans cette cellaale, des amas (flkche) persistent dans les sphCmles (l96ehelle reprksente 0,62 km). Fig. 7. Les grains de sCcrdtion on8 kan ceantenra granuleux (flkche) (196chelle reprksente 0,45 ylm). (LB : lame basale, M : mitochsndrie,)

Can. 9. Fish. Aquat. Sci., b'ok. 50, 1893 545

FIG. 8. Aspet u%trastmctura% d9uaae sphkrule (Sp) rncsntrant de petites vCsicules accol6es A la membrane limitante (I'kchelle reprksente 0'57 pm; M : mitochondrie) .

valent color6 de la m h e fagon et, dans certaines sph6mles, du Fe trivalent color6 en bleu.

La solubilitk des sph6rules lirnite le nornbre des autses reac- tions histochirniques applicables. Ainsi, la reaction h 19APS est inartilisable. Une faible quantitk de protkines est identifiable par la tetrazoreaction, dans les sph6mles les plus petites. La dktection spkcifique des groarpes SH par Ba mkthode au RSW pratiquke en milieu anhydre (WSR en solution dam la dimt5- thylfomarnide) est negative. En milieu acide, les sphkmles prksentent un caractere rkducteur trks prononck, sans que celui- ci soit dQ B de l'acide urique, h des urates ou B des polyph&ols, la rkaction de Gomori ktant nkgative. L9absence d9urates coin- cide avec le manque de Na et de K constat6 en microandyse. La rkaction de Schmorl est positive des les premibes minutes qui suivent le contact avec le r6actif (revsir fig. 2 et 3). Lsrsqare son dkroulement est contrblk par microanalyse %, il appasait que 50 % du Cu et 80 % du Zn sont Ch ine s en 4 min; au bout de 20 rnin, 75 % du Cu ont dispam. Pendant ce meme temps, la quantitk de soufre ne varie pas. I1 y a accord entre la microa- nalyse et la reaction au GBWA en ce qui conceme Ba faible quamatit6 de Ca et c'est aux trois mCtaux alcalino-terreux, Ca. Mg et Sr, qu'il faut imputer Ha coloration par la laque d'aliza- rine. Le resultat nCgatif de la mCthode de prksence de carbonates et 19absence de P exclut celle de phos- phates. NCanmoins, la reaction de Von Kossa est fortement positive si le traitement au nitrate d9argent est suhi d9une reduc- tisn par un skvklateur photographique (fig. 14). S'il est accom- pagn6 d'une rkduction par la lumiere, la staction est plus faible (fig. 15). La microanalyse rnsntre que, en 28 min, 60 h 70 % du Cu naturel sont rernplac6s par 19Ag du rkactif.

Le but de ce travail Ctait de dkceler, dans la glande digestive de la seiche, des accumulations de Cu capables de rendre compte de sa tenearr en metal. L9existence des cellules basales et de leurs sphCmles nous semble r6soudre le pr~bl&me. Nos observations relatives h la presence de ces cellules sont en accord avec celles de Vigelius ( 1 88 I) , Frenzel( l886), Enriques (1902) et Cuenot ( I 907). Elks different de celles des auteurs actuels qui, oar bien ne mentionnent pas les celllules basales ou bien nient Ieur existence chez la seiche (voir Boucaud-Camcsu

usher-Rodoni 1983 pour la bibliogsaphie). L'kchec de leur en 6vidence s'explique, selsn nous, par 19emploi de fixa-

teurs inadapt&, tel le glutaraldt5hyde qui dissout les sphh l e s euou par ['examen d9anirnaux juv6niIes qui n'accumulent que peu de @u par rapport aux adultes comme le rnontrent Ies valeurs de Schipp et Hevert (1978) et de Wang Tai Si (1928).

Le Cu des sphkmles n9est pas engage dans un compost5 simple puisque, dans un tel composC, le rapport Cu/S serait constant alors qu9iI varie de f a p n continue dam une proportion de 1 B 4. La coexistence de Cu, de Zn et d9Ag ainsi que Ha forte teneur en soufre sarggerent que ces rn sont cornplexCs par une ' 'mktallothion6in-like protein" LP). La conservation daa ligand par les traitements histolsgiques anhydres Iaisse sup- poser, en outre, qu'il s'agit de pslyrneres. Plusieurs arguments appuient cette hypothese. La labilitt5 des sphkmles en milieu acide et Ieur stabilitk en milieu neutre ssnt des casaeteres de polymhres de MTLB. Elles expliquent les partieularit6s du dkroulement des r6actions au ferricyanure femique et au RSR. La r6duction du fenicyanure ferrique n'a lieu que si l'oxydaticsn des groupes SH en gssupe %-S est possible. Or, le Cu est tres vite klimint5 en raison du pH acide (2,3 ii 41, ce qui libere les groupes SH. 11 s'ensuit la rkduction imm6diate dar reactif et la formation de ponts disulfures qui stabilisent 19apoprottine. Le soufse geste decelable en microanalyse. Des ponts disarlfures naturels existent d'ailleurs dans les polyrneres de rnCtallothio- ntines. Le caractkre nkgatif de la mkthode au WSR dkrnontre que tous %es groupes SH sont complex6s et, d'apr&s la micro- analyse, les rnCtaux sont effectivement conservks pendant Ia rkaction. Si can tente de les 6liminer par un traitement acide prolcangk, %a recherche du soufre a la microsonde devient n6ga- tive paree que l'apoprotkine et ses grou s SH sont eux-mhes 6limin6s. Autre caractkre essentiel des m6tallothionCines, les mktaux les plus lcaurds dkplacent ceux qui les prkckdent. Or, dans les sph6mles9 le Hg dkplace le cuivre (l'affinitk des mktal- lothionkines pour le Hg est utiliske pour leur dosage, Piotrowski et al. 1973). Cette aptitude explique @dement la substitution du Cu par l'Ag, lors de la reaction de Von Kossa. Si l'sn res- treint cette mithode B son but initial qui est la mise en evidence de carbsnates et de phosphates alcalino-temeux, le resultat est faussement positif. La rkdarction en Ag-metal de l'Ag+ substi- taaC exige un agent knergique et cette difficult6 de le r6duire prcauve que le resultat n'est pas dQ B une liaison ionique mais

Can. 9. Fish. Aquar, Scf . , V d . 50, 1993

FIG. 9 et 10. Aspect ultrastructuraE d'un espace intertubulaire conteamant de 1'hCmmyanine (Hy) dont les msl6cules sont Cpasses (fig. 9) ou organaisCes en rCseau cristallin (fig, 10) (les Cchelles ~gsCsenatent respectivemenat 0,3 i et 0,12 pm; LB : lame basale conteamant des grains opaques).

ii une liaison de co-valence. Ceci est encore en faveur de la prksence de MTEP puisque leur affinitC pour l'Ag rksarlte d9une complexation du m6tal avec les groupes SH, caractkre lui-aussi utilisC pour leur dosage (Kiigi et Vallee 196 1). La conservation, sur pikes fixkes, de la MTLP substituee par Ag s'explique par 19emplsi d9un rCactif 2 pH neutre et won p a la formation de ponts intemol6culaires comme dans la rCaction au fedcyanure ferrique.

Outre les rnktasux caract6ristHques des MTLP, %es sphCmIes contieranent du Fe, du Ca, du Mg et du SH. Gette particularit6 a d6j2 kt6 constatke chez des vefl6brCs (Kiigi et Vallee 1969) et ne va pas 2 17encontre de notre hypothkse. L'absence Qe phos- phsre et les images amltrastructurales d6montrent que le Fe n'est pas engag6 dans un csmposk de type hCmosidCrine, comme il I'est dans les cellules digestives (Bsucaud-Camou 1973). Mais Fe+" mm&l de la classe A, a Cgalement des propriCt6s de la classe B. I1 p u t etre IiC B des acides aminks (voir Nieboer et Richardson 1988) et dsnc i des MTLP ou ii d'autres protkines.

Par ailleuss, le fait qu9aucun anion minkral we co~esponde aux alcalino-terreux et que, par consCquent, ceux-ci ne forment pas de sels minCraamx est un argument en faveur de la pr6sence de plym6res. II est cownu, en effet, que les cations bivatents jouent le s6le de stabilisateurs d'kdifices moI6culaires en for- mant des ponts en&e les mo1Ccules.

II y a une concordance parfaite entre nos d6ductions et Hes rCsarltats biochimiques, sur au moins deux points. D'une part, les variations Qu nombre des sph6mles et de la quantit6 de m6taux dans chacune d'elles rendent compte des kcarts indi- viduels qui apparaissent lors des dosages (Martin et Flegal 1975; Schipp et Hevert 1978; Finger et Smith 1987; Miramand et &el. 1991). D'autre part, la spkciation chimique du Cu est la meme que dans la glande digestive de N o t ~ t o d ~ r u s gouldi oil le Cu est associ6 B trois ligands (Finger et Smith 1987). Le premier (PM > 70 000) reprksente 19h6mocyanine et les enzymes. Le second (PM = 9 1 500) correspond B des MTEP et le troisikme (PM = 18 000) B un polymkre du pr6cCdent. Selsn nos obses-

Can. 9. Fish. Aqua. Sci., %sol. 50, 1993 547

FBG. I I . et 12. Ripartition daa Cu (fig. I 1) et Be 1'Ag (fig. 12) dans un tube de la g l ade digestive : rcrnarquer la superposition rigoureuse des deux images d9Cmission ionique (ddtails techniques dans Ie texte; 196chel%e reeprksente 20 y m) .

vations, ces deux demiers constituent les sphkmles et le poly- mkre, considCrt comme un artefact par Finger et Smith, est bien un compost naturel. En ce qui csnceme le Cd et le Zn, il est possible que l'absenee de parallelisme entre la seiche et Noto- todaru~ ne soit qu'un effet de la variabilitk individuelle. Ainsi, les sph6mles psumaient contenir du Cd sans que sa teneur ait atteint le seuil minimum de dktectisn, de meme qu'il n'a CtC trouv6, dans des MTLP, que chez les N~toto6kap.u~ qui en Ctaient les plus riches. On poumait expllquer de la m i b e fagon que les sphCmles contiennent du Zn lit5 8 des MTLP alors que des Zn- thisnCines manquent chez les Not~todcarus examinks. Enfin, les ligands de l'argent ne semblent pas avoir CtC dCteminCs ehez d9autres c6phalopodes mais ce que l'on sait de ses affinites chimiques laissent penser qu'il est liC B des protCines.

La synthkse de MTLP, qui est attestee par 19raltrastmcture des cellrales basales, pose le prsblkrne des homologies et du r6le de ces cellules. A nstre connaissance, des MTLP 1ocalisCes

FIG. 13. Ddtection histochimique du Cu dam les sphknales des cellules basales (fixateur de C m s y ; rkaction h l'acide mbkanique, rouge solide; I'tchelle reprCsente 12 pm).

ailleurs que dans des lysosornes, n9snt 6t6 mises en Cvidence, par mCthsde histslogique, que dans les amoebocytes d9hu!tres contamin6es exp6rimentalemenat (Martsja et Martin 1985) et dans les coelomocytes d'un ver marin (Dhainaut-Courtois eb a!. 1987). Les cellules basales n90nt Cvidemment que peu de rap- port avec ees types cellulaires. Au contraire, par leur fome, leur emplacement et certains cxaetkres cytologiques, elles ssnt indiscutablement homologues de eelles du nautile qui, selsn Ruth et a&. (1988), 6laborent 19h6rnocyanine. LVhypoth6se nae peut eke retenue pour la seiche : il n'y a pas trace d'hCmocya- nine dans les eavitCs du reticulum endoplasmique et, de sur- emit, il est prouv6 que la synthkse a lieu dans les glandes bran- chides (Dilly et Messenger 1972; Schipp et d. 1973; Muzzii 1981). k s cellules basales accumulent Qu cuivre c o m e Ies cellules B pores des gasttropodes (Sminia 1972) mais c9est la leur seul point comrnun. Dans les cellules B pores, le Cu issu de la dkgradation de l'htrnocyanine s9aeeumule dans des ly ss- ssmes, sous f s m e de sulfure dont la quantitC progresse avec l'iige. I1 en rCsulte que les plus vieux individus sont les plus riches en Cu (Martoja et Thiriot-Quievreux 1980; Martoja et a!. 1980; Bouquegneau et Martoja 1982). Au contraire, les cellules basales n9snt pas les earactkres de cellules impliqukes dans le catabolisme et le Cu est imrnobilisk dms un compose orgamaiqame labile. 11 est sans doute rCutilis6 ce qub expliquerait que, l'in- verse des gastCropodes, la concentration en Cu reste constante ora dCcroit quand Be poids de 19anirnal augmente (Marks 1938; Finger et Smith 1987). La synthkse et la degradation du pigment respiratsire avec fossilisation dans des lysosomes Ctant exclues, l'hypothese la plus plausible est ce!le d'une regulation du Cu sanguin faisant appel8 des MTLP. A l'exceptisn du Fe, mieux represent6 dans les cellules digestives, la regulation intCresse- rait Cgalement les autres mCtaux accsmpagraant le Cu. En effet, chez les invertkbrks marins, les MTLP jouent un r6le primordial

la fois dans le rnktabolisme normal et dans la dCtoxication de certains mCtaux (voir Roesijadi 198%; Bouquegneau et a!. 1984).

En conclusion, les sphkmles des cellules basales de la glande digestive des seiches examinees contiennent quatre des cinqs mttaux susceptibles de se concentrer &ins Ba glande digestive, seul le Cd n'ayant pas 6tC dCcel6. k Cu, le Zn et le Fe existent dans d'autres structures mais les deux premiers ssnt beaucoup

Can. J . Fish. Aquat. ,Fci., Vol. 50, 6993

de seiehes, Sepia oflicinale's et S. escukenta? sont p6chCes chaque annke au Japon et sur les c8tes afrieaines (Woms 1989).

FIG. I4 et 15. Wksultats du traitement p a le nitrate d'argeamt suivi d'unae r6ductisn par un rkvklateur photogmphique (fig. 14) ou par la lumikre (fig. 15). La difference d'intensitk traduit la difficult6 de rkduction du compost substitue. (Fixateup de Camoy; rkaction de von Kossa, rouge solide; 1'6chelle reprksente 12 km.)

plus abondants dans les sphCrules au contraire du Fe qui est plus concentr6 dans les cellules digestives. 11s sont li6s ii aan compost5 chimique ayant Hes caractkres de MTLP. Ee fait que les mCtaux soient asswiks B des protkines n'est pas sans consC- qaaence sur la chaine trophique, oh les ckphalopsdes regrksen- tent un maillon extr6mement important. En effet, ces prott5ines sont fragmentkes par digestion ewzymatiqaae et les fragments sont assirni%ks par les organes absorbants du consomrnateur. Ee eomplexe cystkine-mbtal, en pabiculier, est tr&s facilement assimilable. En outre, lorsque la digestion se fait a pH trhs bas, les mktaux sont Iibkrks de letars ligands. Or, cette situation existe ehez tous les vertkbrks et notarnrnent, chez les mamrnifkres et les oiseaaax marins qui sont les principaux prkdateurs des cCpha- lopodes (Mangold % 989). On peut dons affimer que les celIu%es basales du h i e constituent pour eux une importante source d?oligo6lCrnents qu'ils soient essentiels, csrnme le Zn et surtout le Cu, ou toxiques, comme I'Ag et le Cd. Au contraire, I'as- sociation mktal-protkines est sans danger pour I'homme, dans la mesure oh il ne consomme que le muscle. Cette inocuitk est interessante quand on sait que les c6phalopodes font 190bjet d'une exploitation csmmerciale intensive et que 40 080 tonnes

Nous remereions le D" von Boletzky qua webus a procur6 Ies animaux utilisks pour l'examen en rnicroscopie klectronique, Mmes Guillaumin et Saihi qui wous ont aidCes pour la miersscopie il balayage et l'analyse ionique, ainsi que le service commun de microscopie (CNRS-Paris Vl) et le labesratoire de biologie des inavertkbrks marins du museum d'histoire naturelle sh nous avsns effeetuk 1'Ceude ultrastmcturale.

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