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© Mouna Kahia, 2019
Lutte biologique contre deux pucerons ravageurs en serre (Aphis gossypii et Aulacorthum solani) par
l'utilisation des microorganismes du sol
Mémoire
Mouna Kahia
Maîtrise en biologie végétale - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
Lutte biologique contre deux pucerons ravageurs en serre (Aphis gossypii et Aulacorthum solani) par
l’utilisation des microorganismes du sol
Mémoire
Mouna Kahia
Sous la direction de :
Valérie Fournier, directrice de recherche Hani Antoun, codirecteur de recherche
iii
Résumé
Le puceron de la digitale Aulacorthum solani (Kaltenbach) et le puceron du melon Aphis
gossypii (Glover) sont parmi les pucerons les plus nuisibles pour les cultures en serre. La
lutte biologique microbienne pourrait constituer une voie efficace contre ces insectes. La
combinaison de différents agents microbiens peut augmenter leur efficacité. Ce travail évalue
l’efficacité de Beauveria bassiana ANT-03, Bacillus pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185,
utilisés individuellement ou mélangés, pour contrôler A. gossypii et A. solani sur concombre
et tomate, respectivement. En laboratoire, dix larves L2 de chaque puceron ont été placées
dans des plats de Petri contenant une feuille de tomate ou une rondelle de feuille de
concombre fixée dans la gélose. Ces larves ont été pulvérisées avec 1 mL de suspensions
préparées selon le traitement (Témoin, B. pumilus, B. subtilis, B. bassiana, B. pumilus + B.
subtilis, B. bassiana + B. pumilus, B. bassiana + B. subtilis, B. bassiana + B. pumilus + B.
subtilis). Les mêmes traitements utilisés en laboratoire ont été appliqués en serre, mais des
pucerons adultes ont été utilisés. Les résultats des essais en laboratoire et en serre ont révélé
qu’en causant la mortalité de A. solani et en affectant la reproduction de A. gossypii, les deux
bactéries (B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185) ont pu démontrer un effet aphicide
comparable à celui du produit commercial (Bioceres) contenant le champignon.
Lorsqu’utilisé en mélange, aucun effet additif entre les trois microorganismes étudiés n’a été
observé. Les essais de suivi de la survie des spores de deux bactéries et du champignon
conduits en serre ont démontré qu’ils gardent un niveau de population de 106 CFU/g de
feuilles fraîche jusqu’à neuf jours après leur application, même quand ils ont été mélangés.
Ainsi, sur plantes, les deux Bacillus n’exposent pas un effet antifongique envers B. bassiana
ANT-03.
iv
Abstract
The foxglove aphid Aulacorthum solani (Kaltenbach) and the melon aphid Aphis gossypii
(Glover) are among the most harmful aphids for greenhouse crops. Microbial biological
control may be an effective method against these insects. The combination of different
microbial agents can increase their efficiency. This work evaluates the efficacy of Beauveria
bassiana ANT-03, Bacillus pumilus PTB180 and B. subtilis PTB185, used individually or in
combination, to control A. gossypii and A. solani on cucumber and tomato, respectively. In
the laboratory, ten L2 larvae of each aphid were placed in Petri dishes containing a tomato
leaf or a cucumber leaf disc fixed in the agar plate. These larvae were sprayed with 1 mL of
suspensions prepared according to the treatment (Control, B. pumilus, B. subtilis, B.
bassiana, B. pumilus + B. subtilis, B. bassiana + B. pumilus, B bassiana +B. subtilis, B.
bassiana + B. pumilus + B. subtilis). The same treatments used in the laboratory were applied
in the greenhouse, but adult aphids were used. Laboratory and greenhouse test results
revealed that by causing A. solani mortality and by affecting A. gossypii reproduction, both
bacteria (B. pumilus PTB180 and B. subtilis PTB185) were able to demonstrate aphicide
effect equivalent to that of the commercial product (Bioceres) containing the fungus. When
used as a mixture, no additive effect between the three microorganisms studied was observed.
Spore survival tests of the two bacteria and the fungus conducted in a greenhouse have shown
that they retain a high level of population 106 CFU/ g fresh leaves up to nine days after the
application when used alone or as a mixture. Thus, on plants, the two bacilli do not exhibit
antifungal effect against B. bassiana ANT-03.
v
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................ iii
Abstract ........................................................................................................................... iv
Table des matières............................................................................................................ v
Liste des tableaux ........................................................................................................... vii
Liste des figures ............................................................................................................. viii
Remerciements ................................................................................................................ ix
Avant-propos ................................................................................................................... xi
Introduction générale....................................................................................................... 1
Chapitre 1 : État des connaissances ................................................................................ 4
1. Importance de la serriculture au Québec ............................................................. 2
2. Les principaux pucerons ravageurs en serre ........................................................ 3
2.1 Le puceron de la digitale ..................................................................................... 5
2.2 Le puceron du melon........................................................................................... 6
3. Moyens de lutte actuels contre les pucerons ravageurs en serre ......................... 7
4. Approche de lutte biologique microbienne ......................................................... 12
5. Les champignons entomopathogènes .................................................................. 14
6. Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana ...................................... 16
6.1 Mode d’action .................................................................................................... 19
6.2 Exemples d’utilisation ....................................................................................... 21
7. Les bactéries Bacillus spp.................................................................................... 23
7.1 Bacillus pumilus ................................................................................................. 25
7.2 Bacillus subtilis .................................................................................................. 26
8. Concept d’additivité et de synergie des agents entomopathogènes ................... 28
9. Problématique, objectifs et hypothèses ............................................................... 30
Chapitre 2 : Effet insecticide de Bacillus pumilus PTB180 et Bacillus subtilus PTB185
utilisés seuls ou en combinaison avec le champignon Beauveria bassiana ANT-03
contre les pucerons ravageurs en serre Aphis gossypii et Aulacorthum solani ............. 32
Résumé ........................................................................................................................ 33
1. Introduction ......................................................................................................... 34
2.1 Matériels biologiques.................................................................................... 37
2.1.1 Matériel végétal ..................................................................................... 37
2.1.2 Les insectes ............................................................................................ 37
vi
2.1.3 Matériel fongique .................................................................................. 38
2.1.4 Les bactéries .......................................................................................... 38
2.2 Traitements appliqués .................................................................................. 39
2.3 Essais au laboratoire .................................................................................... 39
2.3.1 Essai de compatibilité entre le champignon et les deux bactéries ....... 39
2.3.2 Puceron de la digitale ............................................................................ 40
2.3.3 Puceron du melon .................................................................................. 41
2.4 Essais en serre............................................................................................... 41
2.4.1 Essais avec le puceron de la digitale ..................................................... 42
2.4.2 Essais avec le puceron du melon ........................................................... 43
2.5 Essais sur la survie des conidies fongiques et bactériennes ........................ 43
2.6 Analyses statistiques .......................................................................................... 45
3. Résultats .................................................................................................................. 47
3.1 Essais de compatibilité entre le champignon et les deux bactéries .................. 47
3.2 Essais avec le puceron de la digitale ................................................................. 48
3.2.1 Essais de laboratoire ................................................................................... 48
3.2.2 Essais en serre ............................................................................................. 49
3.3 Essais avec le puceron du melon ....................................................................... 50
3.3.1 Essais de laboratoire ................................................................................... 50
3.3.2 Essais en serre ............................................................................................. 51
3.4 Essais sur la survie ............................................................................................ 52
3.4.1 Survie des bactéries .................................................................................... 52
3.4.2 Survie du champignon ................................................................................ 54
4. Discussion ............................................................................................................ 56
5. Conclusion ........................................................................................................... 60
Références ................................................................................................................... 61
Conclusion générale ....................................................................................................... 65
Bibliographie .................................................................................................................. 69
Annexes .......................................................................................................................... 82
vii
Liste des tableaux
Tableau 1 : Survie de B. pumilus PTB180 et de B. subtilis PTB185, un jour et neuf jours
après leur application sur les feuilles de tomate suivant différentes combinaisons en
fonction des traitements. Dans chaque ligne les moyennes (n= 8) suivies par la même
lettre ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05). ................................ 53
Tableau 2 : Survie de B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185, un jour et neuf jours après
leur application sur les feuilles de concombre suivant différentes combinaisons en
fonction des traitements. Dans chaque ligne, les moyennes (n= 8) suivies par la même
lettre ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05). ................................ 54
Tableau 3 : Concentration de B. bassiana ANT-03, un jour et neuf jours après son
application sur les feuilles de tomate en présence de B. pumilus PTB180 et de B. subtilis
PTB185. Dans chaque ligne les moyennes (n= 64) suivies par la même lettre ne sont pas
significativement différentes (LSD, α = 0,05). ........................................................... 55
Tableau 4 : Concentration de B. bassiana ANT-03, un jour et neuf jours après leur
application sur les feuilles de concombre en présence de B. pumilus PTB180 et de B.
subtilis PTB185. Dans chaque ligne les moyennes (n= 64) suivies par la même lettre ne
sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05). ............................................. 55
viii
Liste des figures
Figure 1: Morphologie des colonies de B. pumilus PTB180 (A) et B. subtilis PTB185 (B)
poussé sur milieu NAO (Premier tech, Québec, Canada). .......................................... 45
Figure 2: Effet des souches de B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 sur la croissance
radiale moyenne de B. bassiana ANT-03 après 3, 6 et 12 jours d’incubations sur TSA.
Les moyennes (n= 6) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement
différentes (LSD, α = 0,05). ...................................................................................... 48
Figure 3: Mortalité cumulative des larves L2 de A. solani sept jours après l’application de B.
pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et du B. bassiana ANT-03, seuls ou en
combinaison sur feuilles de tomate en serre. Les moyennes (résultantes de trois essais
indépendants répétés dans le temps, n= 15) ayant des lettres en commun ne sont pas
significativement différentes (LSD, α = 0,05). ........................................................... 49
Figure 4 : Mortalité cumulative de A. solani neuf jours après l’application de B. Pumilus
PTB180, B. subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou
en combinaison sur plants de tomate en serre. Les moyennes (résultantes de deux essais
répétés dans le temps, n= 10) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement
différentes (LSD, α = 0,05). ...................................................................................... 50
Figure 5 : Mortalité cumulative des larves L2 de A. gossypii sept jours après l’application de
B. pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et B. bassiana ANT-03, seuls ou en combinaison
(8 traitements) sur feuilles de concombre in vitro. Les moyennes (résultantes de deux
essais indépendants répétés dans le temps, n = 10) ayant des lettres en commun ne sont
pas significativement différentes (LSD, α = 0,05)...................................................... 51
Figure 6 : Variation du nombre des pucerons (A. gossypii) vivants retrouvés sur trois feuilles
de concombre échantillonnées neuf jours après l’application de B. pumilus PTB180, B.
subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou en
combinaison (8 traitements) en serre. Les moyennes (résultantes de quatre essais
indépendants répétés dans le temps, n= 20) ayant des lettres en commun ne sont pas
significativement différentes (LSD, α = 0,05). ........................................................... 52
ix
Remerciements Pour débuter, je tiens à remercier ma directrice Valérie Fournier ainsi que mon codirecteur
Hani Antoun pour m’avoir donné la chance d’embarquer dans cette expérience qu’est la
maîtrise. Je suis grandement reconnaissante pour votre aide, votre soutien, vos conseils
précieux, votre confiance, vos encouragements et votre disponibilité continue. Merci d’avoir
partagé avec moi vos expériences et votre professionnalisme reconnu.
Un merci spécial à Thi Thuy An Nguyen, une professionnelle de recherche, pour ton aide
infini, ton appui, tes conseils, tes idées débrouillardes, ta présence et ton écoute.
Ce projet n’aurait pu avoir lieu sans la collaboration, le financement et l’aide de l’équipe de
Premier Tech. Plus particulièrement, merci à Rémi Naasz, Catherine Viel et Alain Bélanger
pour leur suivi de l’avancement du projet, leurs idées et leurs suggestions. Merci également
de nous avoir fourni les deux bactéries, Bacillus pumilus PTB180 et Bacillus subtilis
PTB185, tout au long de nos essais, ainsi que pour les informations qu’ils nous ont fournies
concernant ces bactéries.
Je suis également reconnaissante à Anatis Bioprotection pour le soutien financier. Merci à
toute l’équipe, spécialement, Silivia Todorova et Martin Nadeau pour nous avoir fourni le
« Bioceres », produit commercial contenant le champignon Beauveria bassiana ANT-03 et
pour leurs commentaires constructifs.
Merci à nos partenaires financiers : le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie
du Canada (CRSNG) et le Consortium de recherche et innovations en bioprocédés industriels
au Québec (CRIBIQ) pour avoir participé dans le financement de ce projet.
J’aimerais aussi exprimer ma reconnaissance à la Mission universitaire de la Tunisie en
Amérique du Nord (MUTAN) pour m’avoir donné la chance de pursuivre mes études de
deuxième cycle à l’Université Laval et pour leur support financier.
x
Un énorme merci à Gaétan Daigle pour son aide et ses conseils aux différentes étapes
d’analyses statistiques.
Un grand merci, du fond du cœur à mes collègues de laboratoire : Mathieu Bouchard-
Rochette, Elizabeth Demeule, Émilie Maillard, Amélie Gervais, Sabrina Rondeau, Frédéric
McCune, Marianne Lamontagne-Drolet, Stéphanie Patenaude, Phanie Bonneau, Mélanie
Normandeau Bonneau et Louis Cossus. Merci pour votre temps et les efforts déployés pour
réaliser la tâche la plus difficile de mon projet (les décomptes de pucerons), mais surtout,
merci pour vos encouragements, votre présence et votre humour. Merci d’avoir été là pour
moi, aussi bien dans les bons moments que dans les mauvais. Vous m’avez permis
d’apprendre plusieurs choses sur les traditions et les coutumes québécoises. Grâce à vous, je
me suis sentie toujours chez moi. Merci également à Olivier Samson-Robert pour ses
suggestions dans le cadre des présentations orales réalisées tout long de ce projet.
Je ne pourrais pas passer la section des remerciements sans souligner l’aide indispensable
des stagiaires : Jean Bélanger, Victor Brubé, Marine Daniel, Catherine Bolduc, Aurélie
Boilard, Thaïs Andro, Guillaume Guengard, Clémence Landreau, Lucie Alexandre et Andréa
Duclos pour m’avoir aidé à compter des milliers des pucerons. Sans vous, j’aurai dû passer
des jours et des nuits seule à faire mes décomptes.
Je ne pourrais pas passer sous silence le soutien non négligeable de ma famille. Merci à mes
parents Ismaïl Kahia et Samra Achour pour leur confiance en moi, leur support dans mes
choix et leur amour infini. C’était pénible d’être séparé à des milliers de kilomètres, mais
vous avez réussi à me pousser et à être présents quotidiennement. Merci à mes frères et mes
sœurs : Leila, Manel, Ibtissem, Zied et Chaker Kahia pour leur support moral même en étant
loin.
xi
Avant-propos
Le chapitre 2 de ce mémoire est présenté sous forme d’un article scientifique en français afin
de faciliter la préparation d’une éventuelle publication. Cet article sera traduit ultérieurement
en anglais et sera soumis à un journal scientifique. L’article s’intitule : Effet insecticide de
deux souches de Bacillus (PTB180 et PTB185) utilisées seules ou en combinaison avec le
champignon Beauveria bassiana contre deux pucerons ravageurs en serre (Aphis gossypii et
Aulacorthum solani). Il décrit les principaux résultats obtenus et l’ensemble des travaux
effectués dans le cadre de ce projet de maîtrise. La récolte des données, l’analyse et
l’interprétation des résultats ainsi que la rédaction de l’ensemble des textes ont été réalisés
par la candidate à la maîtrise.
1
Introduction générale
Le Québec se classe en troisième position à l’échelle canadienne, derrière l’Ontario et la
Colombie-Britannique, en termes des productions maraichères serricoles (Agriculture et
Agroalimentaire Canada, 2016). Cette province détient 7% des superficies occupées par les
serres et fournit 4% de volume de la production nationale des légumes de serre (MAPAQ,
2018).
La tomate et le concombre figurent parmi les cultures les plus produites en serre au Québec
(Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2016). En effet, la tomate demeure la principale
culture légumière serricole au Québec avec 63 ha de superficie en 2015, ce qui constitue une
hausse de 31% par rapport à 2007 (MAPAQ, 2016). En outre, la production québécoise de
cette culture génère annuellement 54 M$ des ventes (Robitaille, 2016). La culture de
concombre occupe 11 ha des superficies serricoles québécoises et engendre 5 M$ de revenues
(MAPAQ, 2018). De plus la production de cette culture au Québec connait une augmentation
durant ces dernières années, surtout avec l’arrivée d’une nouvelle entreprise spécialisé dans
les concombres de serre (serres Toundra) (MAPAQ, 2018).
Malgré l’augmentation observée dans la production de ces cultures, elles sont,
malheureusement, attaquées par plusieurs maladies et insectes ravageurs. Les pucerons sont
considéré comme les insectes les plus nuisibles sur le plan agricole (Blackman & Eastop,
2007). En effet, en plus d’être polyphage, ces insectes piqueurs seceurs de sève sont les
vecteurs les plus performants en termes de transmission des viroses (Carmo-Sousa et al.,
2016). Pour les cultures en serre, le puceron du melon Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera:
Aphididae) et le puceron de la digitale Aulacorthum solani (Kaltenbach) (Hemiptera:
Aphididae) sont parmi les aphides les plus dommageables (Jandricic et al., 2014). Le puceron
du melon est considéré comme le ravageur majeur des Cucurbitacées. Il est capable de causer
une réduction du taux de photosynthèse, de la biomasse et de la hauteur chez les plants de
concombre (Boivin & Richard, 1994; Hu et al., 2017). Le puceron de la digitale a commencé
,récemment, à être considéré comme un ravageur redoutable des cultures sous serre au
Canada (Jandricic, 2013).
2
La lutte chimique basée sur l’utilisation des insecticides de synthèse demeure la méthode la
plus utilisée contre ces deux espèces d’aphides (Wang et al., 2002). Cependant, à la suite
d’une utilisation excessive de ces produits, certains pucerons ont développé une résistance à
la majorité de ces derniers. Le puceron de melon est le premier qui a été identifié comme
résistant contre un insecticide (Blackman & Eastop, 2007). De plus, plusieurs études ont
démontré la résistance de cet aphide à tous les groupes chimiques des pesticides (Matsuura
& Nakamura, 2014; Nauen & Denholm, 2005). Pourtant, pour le puceron de la digitale aucun
cas de résistance n’a été enregistré en Amérique du Nord (Jandricic, 2013). De plus, ces
produits chimiques sont de haut risque pour toutes les composantes de l’environnement, d’où
la nécessité de trouver d’autres moyens de lutte plus respectueuses de la nature.
La lutte biologique microbienne basée sur l’utilisation des microorganismes
entomopathogènes est une méthode qui peut être efficace et sans risque sur l’environnement
et sur la santé humaine. Parmi ces microorganismes figurent les champignons et les bactéries
entomopathogènes qui sont d’ailleurs les plus utilisées pour lutter contre certains insectes
(Mascarin & Jaronski, 2016). Par exemple le champignon cosmopolite Beauveria bassiana,
grâce à la facilité de sa culture en laboratoire, est déjà commercialisé mondialement et a été
déjà utilisé efficacement comme alternative aux pesticides chimiques contre plusieurs
arthropodes (Shrestha et al., 2015; Wraight & Ramos, 2005). En deuxième exemple, les
bactéries de genre Bacillus qui se caractérisent par une abondante production des métabolites
secondaires. La bactérie Bacillus thuringiensis (Bt) est l’une des plus (Lacey et al., 2015).
Plusieurs études ont démontré une synergie et un effet additif en combinant le Bt avec B.
bassiana ou Metarhizium robertsii (S. P. Wraight & Ramos, 2005, 2017; Yaroslavtseva et
al., 2017). Cependant, quelques cas de résistance de certains insectes à cette bactérie ont été
récemment notés (Peralta & Palma, 2017). C’est pourquoi, les dernières études
s’intéressaient à trouver d’autres espèces de Bacillus au pouvoir insecticide tels que Bacillus
pumilus et Bacillus subtilis.
L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet de B. Pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et
B. bassiana ANT-03 (Bioceres® WP, Anatis Bioprotection) utilisés seuls ou en combinaison
3
sur A. gossypii et A. solani, in vitro et in vivo. Ce projet de recherche avait aussi pour but de
déterminer si ces microorganismes peuvent agir en synergie ou si un effet additif peut se
produire entre eux. De plus, on visait à tester l’effet de la combinaison de ces trois
microorganismes sur la survie de leurs conidies au cours du temps, après leur application sur
les feuilles de tomate et de concombre.
4
Chapitre 1 : État des connaissances
2
1. Importance de la serriculture au Québec
L’industrie des légumes de serre canadienne est en pleine expansion (Les producteurs en
serre du Québec, 2016). En effet, en 2015, la superficie récoltée en légumes de serre au
Canada a montré une hausse de 3%, par rapport à l’année précédente, avec une valeur de 14
millions de mètres carrés (Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2016). Au Québec, en
2015, on dénombre 685 entreprises serricoles dans deux principaux secteurs, soit la
production des fruits et légumes et la production des plantes ornementales (Les producteurs
en serre du Québec, 2016). Cette province occupe la troisième position à l’échelle canadienne
en termes des recettes monétaires serricoles avec une recette de 265 M$ dont 101 M$
proviennent de la production des légumes en serres. La serriculture maraîchère québécoise
occupe 7% des superficies serricoles canadiennes avec 190 entreprises qui ont une production
moyenne de 2 432 tonnes métriques en 2015 et qui sont réparties sur 100 ha (MAPAQ, 2016).
La tomate et le concombre sont parmi les principales cultures de légumes de serre au Québec.
En effet, la tomate demeure la principale culture légumière serricole au Québec avec 63 ha
de superficie (MAPAQ, 2016). En outre, selon les chiffres de 2014, la production québécoise
de la tomate de serre arrive en troisième rang après celle de l’Ontario et de la Colombie
britannique à raison d’une quantité de 18 032 tonnes qui représente 7% de la production
canadienne et qui engendre des revenus de l’ordre de 54 M$ (Robitaille, 2016). Concernant
l’exportation québécoise de tomates de serre, elle se fait en faibles quantités (680 tonnes en
2014) et vers une seule destination, les États-Unis. Malgré son importance, la culture de
tomates en serre au Québec tend à diminuer durant ces dernières années. Ce recul peut être
expliqué par les coûts élevés d’exploitation des serres, notamment les coûts de la main
d’œuvre, du combustible et de l’électricité (Robitaille, 2016; SPSQ, 2007). D’un autre part,
cette baisse de production s’explique aussi par la faillite d’une grosse entreprise spécialisée
dans les tomates de serre (MAPAQ, 2018).
Au Canada, c’est encore l’Ontario la première productrice de concombres de serre, suivie
par la Colombie-Britannique, l’Alberta et le Québec. La production de concombres
représente 14% de la superficie occupée par les entreprises de légumes de serre québécoises
(Groupe Agéco, 2011). En 2015, la production québécoise de concombres de serre a montré
3
une hausse de 3,2% par rapport à celle de 2014 à raison d’une quantité de 1649 tonnes (ISQ
et MAPAQ, 2016). Les revenus de concombres de serre au Québec sont en augmentation
progressive, arrivant à une valeur de 5 M$ en 2015 (ISQ et MAPAQ, 2016).
Sur le plan phytosanitaire, les tomates et les concombres de serre peuvent être attaqués par
plusieurs maladies et insectes ravageurs. En effet, les serres mal entretenues fournissent un
environnement favorable aux ravageurs (Patterson, 2015).
2. Les principaux pucerons ravageurs en serre
Les pucerons (ou aphides) sont des hémiptères polyphages présents dans les pays du monde
entier. Ces insectes se distinguent d’autres hémiptères par leur biologie complexe. En effet,
les aphides présentent des cycles de vie variés relativement compliqués. D’ailleurs, selon la
littérature, on distingue, en se basant sur leurs comportements, différents types des cycles
accomplis par ces ravageurs. Par exemple, on parle d’un cycle de vie hétéroïque si les
pucerons alternent d’hôtes et d’un cycle monoïque s’il est accompli sur le même hôte. De
plus selon le type de reproduction subi par ces insectes on distingue un cycle holocyclique si
l’aphide subit à la fois une reproduction sexuée et une reproduction parthénogénique et un
cycle anholocyclique si l’aphide se reproduit exclusivement par parthénogenèse (Blackman
& Eastop, 2007). Pour accomplir les différentes étapes de ces cycles de vie compliqués et
pour s’échapper aux conditions de stress, ces pucerons présentent plusieurs morphes. En
effet, les aphides ont la capacité de produire des morphes ailés pour migrer sur d’autres
plantes hôtes lorsqu’il y a surpopulation, une diminution de la qualité nutritive des plantes
hôtes, l’attaque des ennemis naturels ou des conditions climatiques défavorables (Blackman
& Eastop, 2007). Ainsi, cette capacité de produire des ailes accentue l’importance des
aphides comme ravageurs pour le secteur agricole.
Parmi les 4700 espèces de pucerons (Hémiptères : Aphididae) présents dans le monde,
seulement 450 espèces ont été trouvées sur des plantes d’intérêt agricole, dont uniquement
100 espèces sont considérées comme des ravageurs d’importance économique (Blackman &
Eastop, 2007). En effet, toutes les cultures à travers le monde sont attaquées par au moins
une espèce de puceron (Blackman & Eastop, 2007). Les pucerons, insectes piqueurs suceurs,
sont considérés comme les ravageurs les plus importants pour les cultures sous serres
4
(Jandricic et al., 2014; Yano, 2006). Ils causent des grandes pertes de rendement des plantes
cultivées avec une valeur annuelle mondiale estimée à des centaines de millions de dollars
(Yu et al., 2014).
Les insectes piqueurs suceurs de sève sont des vecteurs de la majorité des virus pathogènes
transmis aux plantes. Les aphides sont, de loin, les vecteurs les plus performants en termes
de transmission de viroses, en comparaison avec les autres taxons d’arthropodes (Swenson,
1968). En effet, les pucerons sont les vecteurs de plus de 50% des maladies virales connues
en agriculture à l’échelle mondiale (Carmo-Sousa et al., 2016). Les aphides causent des
dégâts directs qui résultent de leur alimentation. Ces insectes ont été décrits par Blackman et
Eastop (2007) comme « plus qu’une seringue de sève des plantes vivantes » car ils secrètent
et injectent une salive toxique dans les tissus végétaux avant de sucer la sève. La ponction de
la sève à partir du phloème engendre souvent des symptômes limités à une action toxique sur
la plante hôte, se traduisant souvent par une déformation des feuilles et un rabougrissement
des nouvelles pousses. Cependant, l’alimentation des aphides à partir du parenchyme cause
des dégâts plus importants allant jusqu’à la formation des véritables galles (Blackman &
Eastop, 2007). En plus de transmettre les viroses, les pucerons endommagent leurs plantes
hôtes d’une autre manière indirecte, soit la production de miellat et de la fumagine (Bevacqua
et al., 2016; Blackman & Eastop, 2007; Lange & Bronson, 1981). En effet, quand ils sont
nombreux, les pucerons commencent à secréter le miellat d’une façon abondante. Cette
substance constitue un milieu très favorable à la croissance des champignons tels que la
fumagine (Cladosporium spp.) qui se présente sous forme de poudre noirâtre sur les feuilles
et qui entrave la respiration et l’assimilation chlorophyllienne ou qui souille les parties
consommables et les rend impropres à la commercialisation en réduisant d’une manière
considérable leur valeur marchande (Blackman & Eastop, 2007; Lange & Bronson, 1981).
Selon Jandricic et al. (2014), le puceron vert du pêcher Myzus persicae (Sulzer), le puceron
du melon Aphis gossypii (Glover) et le puceron de la digitale, Aulacorthum solani
(Kaltenbach), sont les pucerons les plus importants et les plus problématiques en serre en
raison des dégâts qu’ils causent. Seulement A. gossypii et A. solani furent testés dans le cadre
de cette étude et conséquemment seules ces deux espèces seront décrites dans la suite du
5
mémoire.
2.1 Le puceron de la digitale
Originaire de l’Europe, le puceron de la digitale, A. solani (Kaltenbach), est un hémiptère
répandu dans le monde entier (Sato et al., 2014). Cet aphide a été récemment considéré
comme un ravageur important de cultures sous serres dans le nord-est de l’Amérique, le
Canada et le Royaume-Uni (Jandricic, 2013). Ce changement de statut pour ce puceron peut
être dû à la réduction de pulvérisation des pesticides dans le cadre de lutte contre les autres
organismes nuisibles suite à l’adoption des nouvelles pratiques de lutte antiparasitaire
integrée (Sanchez et al., 2007). Il s’attaque à une large gamme de plantes hôtes (Sato et al.,
2014), soit 95 différentes espèces appartenant à 25 familles (Blackman & Eastop, 2007;
Jandricic et al., 2010). En effet, depuis les années soixante, il a été mentionné comme
l’insecte ravageur le plus dommageable dans la culture de la pomme de terre (Wave et al.,
1965). En outre, pendant les dernières années, il est passé d’un ravageur occasionnel à un
ravageur de première importance pour une multitude de cultures en plein champ ou en serre,
notamment la laitue (Jandricic, 2013), le poivron (Sanchez et al., 2007), le soya (Takada et
al.2006) et la tomate (Jandricic, 2013). Cet aphide se distingue facilement des autres espèces
d’aphides par ses critères morphologiques assez spécifiques, particulièrement, sa grande
taille allant de 1,8 à 3 mm pour les femelles aptères et de 2 à 3 mm pour celles ailées, les
articulations sombres sur les pattes et les antennes, les tubercules antennaires parallèles et
son aspect brillant (Jandricic, 2013). Il a été démontré que ce puceron se développe plus
rapidement à une température de 25°C en passant par ses quatre stades larvaires en sept jours
(Jandricic et al., 2010). En effet, les populations d’A. solani doublent en deux jours seulement
à cette température. Cependant, la fécondité moyenne la plus élevée, soit 74 larves par adulte,
est stimulée par les températures les plus basses allant de 10 à 20°C (Jandricic et al., 2010).
De plus, plusieurs cultures ornementales sont aussi attaquées par cet aphide. D’ailleurs, il
constitue un problème préoccupant pour les producteurs, car il cause des dommages à
l’apparence de ces cultures par la production excessive du miellat et le développement de la
fumagine (Jandricic et al., 2010). Ce qui explique la faible tolérance de ces cultures à ce
puceron par rapport à celle d’autres pucerons. En outre, A. solani secrète des toxines
salivaires qui induisent un jaunissement et un enroulement des feuilles ainsi que des nécroses
6
tissulaires localisées (Sanchez et al., 2007). Ce puceron est aussi capable de transmettre plus
de 45 viroses à ses plantes hôtes (Wave et al., 1965), notamment, les virus de la mosaïque et
les virus d’enroulement des feuilles (Jandricic, 2013).
2.2 Le puceron du melon
Le puceron du melon ou puceron du coton, A. gossypii (Glover), est un hémiptère originaire
de l’Europe qui est largement répandu dans le monde, il se trouve dans toutes les régions
tempérées, tropicales et subtropicales (Blackman & Eastop, 2007; Lu et al., 2015; Satar et
al., 2005). C’est un aphide cosmopolite, polyphage qui s’attaque à 300 familles de plantes
(Fuller et al., 1999; Rostami et al., 2012), notamment le cotonnier, le concombre, les agrumes
et les plantes ornementales (Celini, 2001; Razmjou et al., 2006). Il est considéré comme le
ravageur majeur des Cucurbitacées (Razmjou et al., 2006). Du point de vue morphologique,
ce puceron est de forme globulaire et mesure 1 à 3 mm de longueur. La coloration des adultes
varie du jaune pâle, à des faibles températures, au vert ou presque noir à des températures
élevées. Les larves sont pâles. Il se caractérise par des cornicules courtes noires et par des
taches sombres sur son abdomen (Boivin & Richard, 1994). C’est surtout à l’automne que ce
puceron cause des dommages aux cultures de concombres en serre partout au Canada (Boivin
& Richard, 1994). Sur les plants de concombres, les infestations commencent souvent sur les
feuilles inférieures et se répandent ensuite sur la totalité de la plante. La dissémination d’A.
gossypii est assurée par les formes ailées qui commencent à apparaître quand les colonies
deviennent très denses ou qui proviennent d’autres plantes hôtes à l’extérieur de la serre,
(Boivin & Richard, 1994). Ce puceron est adapté à des températures élevées (Parajulee,
2007). En effet, il a été démontré que sa période de développement varie entre 21 jours à
10°C et 4 jours à 30°C (Zamani et al., 2006). Sur les plants de concombre, les populations de
cet aphide peuvent se multiplier de 10 à 12 fois en l’espace d’une semaine (Boivin & Richard,
1994). Dans toutes les zones chaudes du monde, A. gossypii se développe constamment par
parthénogenèse (Blackman & Eastop, 2007). Cependant, il a été prouvé que dans les serres
de concombre et de chrysanthème de l’Europe occidentale, A. gossypii peut produire des
morphes sexuels (Margaritopoulos et al., 2006). Ce puceron possède des associations
particulières d’hôtes, par exemple, il a été noté que les pucerons qui étaient sur chrysanthème
ne colonisent pas le concombre de serre et vice versa (Blackman & Eastop, 2007; Guldemond
7
et al., 1994).
En Amérique du Nord, il a été démontré également que ce puceron possède une phase
sexuelle annuelle quand il utilise la rose de Sharon, Hibiscus syriacus L., et le catalpa,
Catalpa bignonioides Walter, comme des hôtes primaires (Blackman & Eastop, 2007;
Margaritopoulos et al., 2006). De plus, A. gossypii serait vecteur de plus de 80 maladies
virales chez une large gamme des plantes (Hu et al., 2017; Kersting et al., 1999) dont les plus
importants sont le virus de la mosaïque du concombre (CMV) et le virus de la mosaïque de
la pastèque (WMV) (Boivin & Richard, 1994). D’autre part, une densité élevée d’A. gossypii
peut induire une réduction de la taille et de la biomasse chez la plante hôte (Shannag et al.,
1998). De plus, sur concombre, les densités d’A. gossypii peuvent atteindre 2000 pucerons
par feuille, ce qui engendre l’affaiblissement et le flétrissement de ces feuilles (Boivin &
Richard, 1994).
Afin de réguler les populations de ces pestes et réduire ainsi leurs dommages, plusieurs
moyens de lutte ont été développés. De plus, la recherche des nouvelles mesures de contrôle
ne cesse jamais d’avancer.
3. Moyens de lutte actuels contre les pucerons ravageurs en serre
Au Canada, comme partout dans le monde, la lutte chimique demeure la pratique dominante
pour lutter contre les insectes ravageurs, notamment les pucerons. Selon Blackman et Eastop
(2007), à la fin des années 80, les produits systémiques appartenant aux groupes
d’organophosphorés et de carbamates ont été en prépondérance sur le marché des aphicides.
Les associations d’environnement ont retiré la majorité de ces produits à cause de leur
persistance et leur forte toxicité même à l’égard des insectes utiles. A partir de ce moment,
les pyréthroïdes ont commencé à prendre la place et à apparaître comme des remplaçants,
surtout, des organophosphorés. Cependant, l’absence d’une activité systémique et d’une
sélectivité aux insectes ciblés a diminué l’utilisation de ces derniers. Pendant les dix dernières
années, ce sont les néonicotinoïdes qui ont envahi le marché des insecticides. Ce nouveau
groupe d’insecticides a prouvé une efficacité plus importante contre les ravageurs de par leur
nouveau mode d’action, qui consiste à affecter le système nerveux de l’insecte ciblé en
induisant sa paralyse et sa mort par la suite (Blackman & Eastop, 2007; Buchholz & Nauen,
8
2002). L’imidaclopride est le néonicotinoïde le plus utilisé qui présente une excellente
efficacité contre les pucerons et les thrips à travers le monde (Wang et al., 2002). Malgré leur
efficacité bien prouvée, ces différents groupes d’insecticides chimiques génèrent de
nombreux effets néfastes, aussi bien sur l’environnement que sur la santé humaine (Hayo &
Van der Werf, 1997; Pisa et al., 2017; Lexmond et al., 2015; Van der Slujis et al., 2015). En
effet, selon Multigner (2005), ces derniers représentent un danger puissant pour l’homme
puisqu’ils causent plusieurs maladies notamment, la stérilité, les atteintes neurologiques et le
cancer. En ce qui concerne leur effet sur l’environnement, c’est le défaut de ne pas être
sélectifs vis-à-vis de leurs cibles qui est à l’origine de l’écotoxicité des insecticides (Hayo &
Van der Werf, 1997; Pisa et al., 2017). En effet, de multiples études ont rapporté la nocivité
de ces derniers sur la microflore et la microfaune du sol (Datta et al., 2016), sur les insectes
pollinisateurs (Tasei, 1996), sur la faune aquatique (DeLorenzo et al., 2001) et sur les oiseaux
(Environnement Canada, 2002). De plus, l’utilisation répétée et irrationnelle des insecticides
chimiques a contribué au développement et à l’acquisition des résistances chez les insectes
ravageurs et notamment les aphides (Kunz & Kemp, 1994; Rongai et al., 1998). Au moins
20 espèces de pucerons ont été identifiées résistantes aux insecticides (Rongai et al., 1998),
dont les plus mentionnées sont M. persicae (Sulzer) (Foster et al., 2000; Nauen & Denholm,
2005) et A. gossypii (Glover) (Furk & Hines, 1993). De nombreuses études ont été menées
sur ce sujet et ont démontré l’acquisition des résistances par A. gossypii (Glover) aux
différents groupes d’insecticides (Herron et al., 2001), surtout sur coton et dans les serres de
Cucurbitacées (Blackman & Eastop, 2007), soit aux carbamates (Furk et al., 1980), aux
organophosphorés (Gubran et al., 1993), aux pyréthroïdes (Gubran et al., 1993; Wang et al.,
2002) et même aux néonicotinoïdes (Nauen & Denholm, 2005; Wang et al., 2002; Pisa et al.,
2017; Lexmond et al., 2015; Van der Slujis et al., 2015). Selon Rongai et al. (1998), le
Pirimicarbe (un insecticide carbamate) n’a pas seulement perdu son efficacité contre A.
gossypii (Glover), mais il a provoqué aussi une émergence précoce de ses larves ainsi qu’une
augmentation de sa capacité reproductive de 30% par rapport à celle du témoin non traité.
D’après Jandricic (2013), à date, il n’y a aucune référence qui démontre la résistance du
puceron de la digitale, A. solani aux insecticides chimiques en Amérique du Nord.
Cependant, au Japon, Takada et al. (2006) ont réussi à identifier une moindre résistance à
9
l’acéphate (un organophosphoré) chez un seul clone de A. solani parmi les huit clones testés
dans leur étude et à l’inverse une susceptibilité de tous ces derniers au fenvalérate (un
pyréthroïde).
En effet, plusieurs produits de ce genre ont démontré une bonne efficacité contre les aphides,
à savoir, le Kontos (spirotétramate) et l’Endeavor (pymétrozine) qui ont réussi à maintenir
nulles les populations d’A. solani quand ils ont été appliqués en serre sur culture de
chrysanthème par la stimulation d’une inhibition neurale de l’alimentation chez cet aphide et
en conséquence sa mortalité (Tremblay et al., 2017). Cependant, en dépit de cette efficacité
ces produits ont démontré une toxicité elevée pour l’homme et les mammifères (Sages
pesticides, 2019). Ainsi, malgré la bonne capacité des insecticides à contrôler les populations
des pucerons, leur nocivité a poussé les producteurs à chercher d’autres méthodes de lutte
plus efficaces et moins dangereuses.
La lutte culturale est également l’une des méthodes alternatives fréquemment appliquées
contre les aphides. Elle se base sur l’adoption des pratiques culturales pour éviter l’entrée et
la dispersion des ravageurs dans les champs et dans les serres. Parmi les exemples de moyens
de lutte culturale contre les pucerons, on retrouve les suivantes: 1) le retrait des mauvaises
herbes qui poussent dans les champs et qui sont des sources possibles de virus que les aphides
peuvent transmettre aux cultures saines avoisinantes (Blackman & Eastop, 2007); 2) la
création de barrières physiques via l’utilisation de cultures de couverture entre les rangées,
l’installation de filets protecteurs ou la pose de paillis, comme les paillis de polyéthylène
(Blackman & Eastop, 2007; Farias-Lario & Orozco-Santos; 1997); et 3) l’utilisation de
cultures intercalaires qui présuppose qu’une hétérogénéité et une diversité des cultures sur
une même parcelle favorisent la régulation naturelle des populations des ravageurs par le fait
d’accentuer les populations d’ennemis naturels (Gontijo et al., 2017; Karungi et al., 2010).
De plus, la lutte par amélioration génétique se démarque comme étant un moyen efficace de
contrôle des arthropodes ravageurs (Yu et al., 2012). En effet, selon Gatehouse et al. (2011),
l’établissement et la commercialisation des plantes transgéniques résistantes aux insectes
nuisibles ont commencé depuis plus de 20 ans. La plupart de ces plantes expriment des gènes
10
provenant de la bactérie Bacillus thuringiensis (Bt) et codant pour les toxines à effet
insecticide. Bien que ces plantes étaient résistantes aux Lépidoptères et Coléoptères, elles
étaient sensibles aux Hémiptères, notamment les pucerons (Yu et al., 2014). Par conséquent,
d’autres stratégies ont été développées pour combattre ces ravageurs. Selon Yu et al. (2014),
jusqu’à présent, les gènes de résistance aux pucerons qui ont été transférés aux plantes ciblent
principalement le système digestif de ces insectes. La majorité de ces gènes sont des gènes
de lectine d’origine végétale. En effet, plus que quatre gènes de lectine végétale (exemples :
Galanthus nivalis agglutinin (GNA), Pinillia ternata agglutinin (PTA), Canavalia ensiformis
lectin (CEL), …etc), récemment conçus, ont démontré leur toxicité aux aphides à la suite de
leur introduction dans plusieurs cultures transgéniques (Yu et al., 2012). Cependant, des
effets, non désirés, de ces gènes ont été également observés sur le comportement des
populations d’ennemis naturels qui peuvent servir comme des agents potentiels de lutte
biologique contre les pucerons (Han et al., 2016; Yu et al., 2012).
La séléction variétale basée sur la séléction des plantes hôtes qui possédent certains critéres
de résistance est aussi une méthode qui contribue à la gestion des insectes nuisibles dont les
pucerons (Boissot et al., 2016; Bi & Toscano, 2006). Cette résistance peut être codée par un
ou plusieurs gènes qui peuvent être dominants ou récessifs. Ainsi, cette résistance est
considérée comme un trait hériditaire qui est transmissible par des croisements entre des
plantes des différents phénotypes ou par la séléction et le transfert des gènes qui codent cette
résistance à d’autres plantes hôtes (Biossot et al., 2016). Parmi les gènes de résistance, les
plus connus contre les aphides est le gène Vat identifié chez le melon (Cucumis melo)
(Boissot et al., 2016; Bi & Toscano, 2006). Ce gène confère à ces plantes une résistance
spécifique contre A. gosypii en affectant son potentiel biotique et sa reproduction. En effet,
ce gène agit principalement sur l’alimentation de A. gossypii en bloquant les voies d’accès
de leurs stylets vers le mésophylle et le phloème (Biossot et al., 2016). De plus, ce gène est
le seul qui confère également une résistance des plants de melon aux virus transmis par ce
puceron (Schoeny et al., 2017).
La lutte biologique est définie comme étant « l’utilisation d’organismes vivants pour limiter
la pullulation et/ou la nocivité des divers ennemis des cultures » (Jourdheuil & Fraval, 1991).
11
Ces organismes peuvent être des parasitoïdes, des insectes prédateurs ou des pathogènes
comme les virus, les champignons ou les bactéries (Jourdheuil & Fraval, 1991). Trois
approches bien distinctes peuvent être appliquées pour cette méthode de lutte : classique, par
augmentation et par conservation (Lambert, 2010). L’approche classique vise l’introduction
d’un agent entomopathogène exotique dans un nouvel écosystème où survit un ravageur
exotique dans le but de supprimer les populations de ce dernier (Cloutier et Cloutier, 1992).
La lutte biologique par augmentation consiste à contrôler un ravageur indigène en faisant des
lâchers de son ou ses ennemis naturels qui existent naturellement dans le système, mais en
faible occurrence ou pas dans le moment optimal qui coïncide avec le pic d'abondance de ce
ravageur (Lambert, 2010). La stratégie de conservation vise à conserver les ennemis naturels
déjà existants dans le paysage et à améliorer leur occurrence au moyen de gestion de l’habitat
et de changement des pratiques culturales (Cloutier et Cloutier; 1992).
Les pucerons sont attaqués par divers groupes d’ennemis naturels dont plusieurs espèces sont
même commercialisées et utilisées dans les programmes de lutte contre ces ravageurs, surtout
pour les cultures sous serres (Byeon et al., 2011). En effet, comme l’a mentionné Yano
(2006), huit parasitoïdes, 15 prédateurs et plusieurs champignons entomopathogènes ont été
utilisés contre les aphides en serres. Par ailleurs, selon Boivin et al. (2011), les parasitoïdes
sont les ennemis les plus utilisés à cause de leur aptitude à s’attaquer uniquement à certaines
espèces de pucerons. Prenons l’exemple de l’hyménoptère, Aphidius colemani Viereck, le
parasitoïde le plus connu et le plus employé à l’échelle du monde, qui a réussi à parasiter M.
persicae et A. gossypii (Glover) sur plusieurs cultures en serre en Corée. Cependant, il n’a
pas parasité Macrosiphum euphorbiae Thomas et A. solani (Kaltenbach) sous les mêmes
conditions (Byeon et al., 2011). Par opposition aux parasitoïdes, les prédateurs utilisés contre
les pucerons sont souvent généralistes. Ils s’attaquent à une multitude d’organismes,
ravageurs ou parfois utiles (Byeon et al., 2011). Plusieurs études suggèrent que de
nombreuses espèces de coccinelles sont potentiellement efficaces contre les populations
d’aphides en serres (Riddick, 2017).
Malgré la réussite de ces auxiliaires (prédateurs et parasitoïdes) à contrôler les pucerons, leur
utilisation est limitée par la difficulté et le coût élevé de leur élevage (Lambert, 2010). En
12
effet, ces derniers nécessitent un apport en proies vivantes et en plantes hôtes d’une façon
constante pour maintenir leurs colonies dans la production de masse commerciale (Riddick,
2017). De plus, dans le cas d’introduction d’auxiliaires exotiques, des problèmes
d’acclimatation peuvent apparaître et ainsi l’exigence de demande des permis pour
l’importation, l’introduction et l’utilisation des toutes les nouvelles espèces au Canada
(Malausa, 2000). Cela rend leur utilisation de plus en plus compliquée (Malausa, 2000).
Ainsi, il est nécessaire de poursuivre la recherche pour trouver d’autres moyens de lutte plus
efficaces et qui peuvent être moins coûteux comme la lutte biologique microbienne.
4. Approche de lutte biologique microbienne
La lutte biologique microbienne a été définie par Wraight et al. (2016) comme étant
l’utilisation des microorganismes vivants, capables de causer des maladies aux organismes
pathogènes des cultures, comme des agents de lutte contre ces derniers. En ce qui concerne
les insectes ravageurs, de nombreux agents microbiens ont été démontrés comme des moyens
entomopathogènes efficaces, notamment les bactéries, les champignons et les virus (Lacey
& Shapiro-Ilan, 2008; Mazid et al., 2011). En effet, il y a 150 ans, l’idée d’utilisation de ces
derniers a été établie (Ravensberg, 2011). Depuis, il y a plus de 50 microorganismes
entomopathogènes qui sont actuellement commercialisés pour être employés surtout dans la
lutte biologique augmentative (Lacey et al., 2015). Toutefois, malgré l’important intérêt
donné à la production des pesticides microbiens, ils ne représentent que 1 à 2% de tous les
pesticides disponibles sur le marché (Lacey et al., 2015). Enfin, les revenus annuels des
ventes de ces pesticides représentent seulement le 2,5% de la valeur des ventes des pesticides
chimiques avec un montant de 750 millions de dollars en 2008 (Ravensberg, 2011).
C’est en France, en 1938 que le premier bioinsecticide a été produit et commercialisé sous le
nom commercial “Sporeine“. Il était élaboré avec des spores de la bactérie B. thuringiensis
(Ravensberg, 2011). Cette bactérie est la plus utilisée en lutte biologique microbienne (Bravo
et al., 2011; Lacey & Goettel, 1995; Mazid et al., 2011; Tanada, 1959). En outre, en raison
de leurs larges gammes d’hôtes (Lépidoptères, Diptères, Coléoptères et acariens), les produits
formés des sous espèces de B. thuringiensis représentent 98% des pesticides microbiens
bactériens (Lacey et al., 2015). L’utilisation de cette bactérie offre de multiples avantages :
13
B. thuringiensis agit d’une façon rapide comparable à celle des insecticides chimiques envers
ses hôtes, se conserve pour une longue durée, possède un processus de formulation, de
production et d’application facile et économique et finalement ne constitue pas un risque
pour l’environnement (Lacey et al., 2015).
Plusieurs virus sont également disponibles comme agents de lutte biologique microbienne
surtout contre les Lépidoptères (Lasa et al., 2007; Wraight et al., 2016b). L’étroite gamme
d’hôtes et la résistance extrême aux radiations solaires de ces virus, surtout des baculovirus,
favorisent leur utilisation en synergie avec d’autres agents de lutte sensibles à ces radiations,
notamment avec B. thuringiensis, pour les protéger et améliorer leur persistance sur les
cultures (Wraight et al., 2016b). Pourtant, ces virus pathogènes d’insectes n’ont joué qu’un
rôle mineur dans la gestion des ravageurs des cultures en serre puisque seule une minorité de
ces ravageurs représentent des cibles potentielles pour ces virus entomopathogènes (Wraight
et al., 2016b).
L’utilisation des champignons entomopathogènes comme agents de lutte biologique génère
un engouement mondial. En 1994, Feng et al. ont prévu un avancement significatif dans
l’industrialisation et la production de ces champignons. Actuellement, avec les nouvelles
innovations biotechnologiques, on compte plus de 170 bioinsecticides à base de champignons
entomopathogènes destinés à la gestion d’au moins cinq ordres d’insectes et d’acariens
ravageurs (Chandler et al., 2011; Wraight et al., 2016b).
Les nématodes, appartenant à la microfaune du sol, agissent en symbiose avec des bactéries
pour réussir leur activité insecticide (Wraight et al., 2016b). La majorité des nématodes
entomopathogènes appartiennent principalement aux deux familles Steinernematidae et
Heterorhabditidae (Lacey et al., 2015; Lacey & Shapiro-Ilan, 2008). Ces derniers sont
facilement reproductibles in vitro et in vivo et sont ainsi commercialisables et déjà
disponibles sur le marché depuis plus que 25 ans (Lacey et al., 2015). De plus, le nombre
d’insectes cibles de ces agents continue à augmenter, et une tendance vers les insectes du sol
a été remarquée (Lacey et al., 2015). En effet, ces nématodes ont démontrés récemment être
des suppresseurs de multiples insectes foreurs des racines ainsi que des larves d’autres
14
insectes passant une période de leur vie dans le sol (Lacey et al., 2015). D’autre part, plusieurs
avancements notables sur l’écologie et la biologie de ces nématodes, dans les techniques de
leur production et leur application ainsi que dans leurs interactions avec leurs cibles ont été
faits. Cependant, des recherches supplémentaires sont exigées pour améliorer l’implication
de ces agents dans la lutte biologique.
Au Canada, la recherche et le développement des biopesticides ainsi que leur législation et
leur réglementation sont avancés et visent à offrir des produits à faible risque pour la santé
humaine et assurant la durabilité agricole et environnementale (Kabaluk et al., 2010). En
effet, en 2010, 32 biopesticides microbiens ont été enregistrés au Canada en comparaison
avec seulement 13 produits en 2004 (Kabaluk et al., 2010). Les prévisions indiquent que le
nombre de ces produits est supposé augmenter dans le futur, suite aux programmes
gouvernementaux ayant pour but d’aider les entreprises qui n'arrivent pas à pénétrer le
marché canadien. En 2010, 38 entreprises privées canadiennes ont été classifiées comme
productrices et/ou distributrices de biopesticides microbiens (Kabaluk et al., 2010).
Cependant, les revenus des ventes des biopesticides microbiens canadiens ne représentent
que 0,5% de celles des ventes des pesticides.
5. Les champignons entomopathogènes
« Les champignons entomopathogènes sont des eucaryotes avec des noyaux, des organites
bien définis et une paroi cellulaire chitineuse » (Sabbahi, 2008). Ils se présentent souvent
sous forme d’hyphes et rarement sous forme de cellules individuelles (Sabbahi, 2008). Ces
champignons n’occupent pas une position systématique bien définie. Ils sont répartis dans
tous les groupes, allant de Phycomycètes aux champignons imparfaits (Ascomycètes et
Basidiomycètes ; Ferron, 1978). Cette caractéristique d’appartenance à différents groupes
systématiques donne aux champignons entomopathogènes une capacité de se développer
sous différentes conditions écologiques et une variabilité dans leurs modes de reproduction
(Ferron, 1978). En effet, selon Hajek et Leger (1994), ces champignons sont associés avec
des insectes vivants dans divers habitats, y compris la surface du sol et l’eau. Les deux
groupes le plus importants sont les Deutéromycètes et les Phycomycètes (Ferron, 1978). La
plupart des champignons entomopathogènes qui contribuent à la régulation des pucerons
15
appartiennent à l’ordre des Entomophthorales (Blackman & Eastop, 2007). En effet, les vrais
champignons sont les plus importants ennemis naturels microbiens des pucerons au champ
(Blackman & Eastop, 2007; Meyling & Eilenberg, 2007).
Chez les 500 espèces d’Hyphomycètes, les genres Beauveria, Metarhizium, et Verticillium
sont les plus utilisés pour la lutte biologique (Sabbahi, 2008). Une identification correcte de
ces genres est impossible sans des détails sur leurs conidiogenèse (Ferron, 1978; Sabbahi,
2008; Samson et al., 1988). La forme et la couleur des spores constituent les premiers indices
utilisés pour la taxonomie des champignons (Samson et al., 1988).
Contrairement aux autres microorganismes entomopathogènes tels que les virus et les
bactéries, la majorité des champignons entomopathogènes sont capables de pénétrer à travers
la cuticule externe de leurs hôtes et d’exploiter leurs ressources sans avoir à être ingérés par
ces derniers (Blackman & Eastop, 2007; Ferron, 1978; Hall & Papierok, 1982; Samson et al.,
1988). C’est ce qui en fait de très bons candidats dans la lutte biologique contre les pucerons
puisqu’ils ont une activité ectopique contrairement aux autres méthodes qui nécessitent une
expression ou présence dans le phloème pour être ingérés. De plus, l’ingestion d’un agent de
lutte biologique n’est pas évidente puisque les pucerons sont des insectes piqueurs-suceurs.
En outre, ces champignons sont capables de produire des épizooties chez les populations de
leurs insectes cibles (Jandricic et al., 2014). Ces épizooties réduisent les densités des
ravageurs à des niveaux acceptables qui ne nuisent pas aux cultures et garantissent ainsi le
potentiel de ces microorganismes à être utilisé comme des agents de lutte efficaces (Lacey &
Shapiro-Ilan, 2008).
Les biopesticides fabriqués à base de champignons entomopathogènes et destinés à la lutte
biologique contre les insectes ravageurs, ont récemment remplacé les produits chimiques de
lutte d’une façon remarquable (Ishii et al., 2015; Mondal et al., 2016; Strasser et al., 2000).
En effet, il y a 10 ans, 171 mycoinsecticides et mycoacaricides étaient disponibles sur le
marché, dont 52 (environ 30%) destinés à la lutte contre les insectes les plus problématiques
en serre, particulièrement les pucerons, les thrips et les aleurodes (Faria & Wraight, 2007).
Cependant, présentement seulement 28 mycoinsecticides sont disponibles et les 24 autres
produits ne sont plus disponibles ou sont utilisés pour la gestion de ces insectes dans les
16
cultures en champs (Wraight et al., 2016a).
Certains champignons entomopathogènes utilisés contre les pucerons sont quasiment
impossibles à cultiver in vitro et donc sont extrêmement difficiles à produire en grandes
quantités (Blackman & Eastop, 2007). De plus, la lente vitesse d’induction de mortalité, soit
de trois à sept jours (Mondal et al., 2016), représente l’obstacle majeur qui limite l’emploi de
ces champignons comme bioinsecticides (Ishii et al., 2015; Ortiz-Urquiza et al., 2010).
6. Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana
Le champignon Beauveria bassiana est un hyphomycète naturellement présent dans les sols
du monde entier (Sabbahi, 2008). C’est l’espèce avec la plus grande distribution
géographique au sein du genre Beauveria (Zimmermann, 2007). Il est cosmopolite,
ubiquitaire et saprophyte (Ishii et al., 2015; Ortiz-Urquiza et al., 2010; Sabbahi, 2008). Ce
champignon est généraliste (Shimazu, 2004) et s’attaque à un large éventail d’insectes
ravageurs (Gupta et al., 1999; Saranraj & Jayaparakash, 2017), soit 707 espèces dispersées
dans 15 ordres, 149 familles et 521 genres (Zimmermann, 2007), et il a souvent été retrouvé
sur des insectes infectés dans les zones tempérées et tropicales (Zimmermann, 2007). Malgré
l’identification de Cordyceps bassiana comme le téléomorphe potentiel de B. bassiana (Li
et al., 2001), ce mycète est souvent décrit comme mitosporique (Ortiz-Urquiza et al., 2010)
qui se multiplie par reproduction asexuée (Sabbahi, 2008; Ziani, 2008) en produisant des
spores de coloration blanchâtre à jaunâtre (Saranraj & Jayaparakash, 2017). Ces dernières
sont portées par des conidiophores « à base renflée et à extrémité en zigzag » (Ziani, 2008).
Les hyphes de cette espèce sont septaux, transparents et de diamètre de 1,5 à 3 µm (Saranraj
& Jayaparakash, 2017). Selon les conditions d’aérobie et d’anaérobie, le champignon produit
deux types de spores. En effet, en aérobie, il produit des conidies sphériques ou ovales de 1
à 4 µm de diamètre, tandis qu’en anaérobie, B. bassiana produit des blastospores de forme
ovale et de diamètre de 2 à 3 µm. Les conidies sont autant infectieuses que les blastospores.
(Sabbahi, 2008; Ziani, 2008).
De multiples facteurs biotiques et abiotiques conditionnent le déclenchement du processus
d’infection de B. bassiana et la germination des conidies. En effet, une température allant de
17
8 à 35°C est favorable pour la germination de ces derniers avec un optimum variant entre 25
et 30°C (Saranraj & Jayaparakash, 2017). Ce champignon est également psychrophile. En
effet, au Canada, il a été isolé fréquemment à partir des sols incubés à des températures
variant de 8 et 15°C (Bidochka et al., 1998). Selon Lord (2011), une humidité relative
ambiante est suffisante pour induire l’infection. Cependant, in vitro, une humidité relative
supérieure à 90% est exigée pour la germination (Saranraj & Jayaparakash, 2017).
Comme la majorité des champignons entomopathogènes, le mycète B. bassiana induit des
épizooties aux champs, où les spores et les hyphes produits sur les cadavres des insectes
infectés se détachent et se dispersent pour infecter, naturellement, le reste de la population
d’insectes (Feng, Poprawski, & Khachatourians, 1994). Cependant, contre les pucerons, ce
champignon n’a que rarement, ou n'a même jamais, causé des épizooties et ainsi il n’est pas
considéré comme un ennemi naturel contre ces ravageurs sous conditions de champ
(Blackman & Eastop, 2007). Selon Milner (1997), bien que les pucerons soient les insectes
les plus susceptibles aux épizooties causées par les champignons entomopathogènes
entomophtorales, ils sont rarement attaqués par l’hyphomycète B. bassiana sous les
conditions naturelles. En effet, le processus de sporulation et d’infection de ce champignon
nécessite plusieurs jours d’humidité élevée, ce qui est non favorable pour la dispersion et la
transmission des spores infectieux. En outre, pour que l’infection puisse se produire, un
contact entre les pucerons et les conidies doit se faire, ce qui est un peu difficile à cause de
la mobilité réduite des pucerons (Milner, 1997).
Il a été démontré que B. bassiana est un champignon endophyte (Rondot & Reineke, 2018;
Sánchez-Rodríguez et al., 2018; Saranraj & Jayaparakash, 2017). Une colonisation
endophyte transitoire des feuilles par ce mycète suite à une pulvérisation foliaire augmente
son pouvoir insecticide (Jaber & Ownley, 2017). Par exemple, il a été prouvé que le tube
germinatif de ce mycète pénètre à la surface des feuilles de maïs (Zea mays) et atteint le
xylème pour offrir une protection contre la pyrale du maïs (Saranraj & Jayaparakash, 2017).
Il a été démontré que B. bassiana pénètre dans les feuilles de vigne, y survit et réduit les
infestations de la cicadelle verte de la vigne (Empoasca vitis) pour une durée de cinq
semaines suivant son application (Rondot et Reineke, 2018). De plus, une colonisation
18
endophyte des plantes de coton par B. bassiana a impliqué une perturbation de la
reproduction d’A. gossypii (Mascarin & Jaronski, 2016). La pénétration de B. bassiana à
l’intérieur de la plante peut être aussi induite par injection et par aspersion (Azevedo et al.,
2000).
La plupart des champignons entomopathogènes sont facilement productibles en masse et
peuvent être mis en suspension avec des milieux aqueux et pulvérisés, c’est pourquoi ils sont
commercialisables comme des agents de lutte microbienne contre les insectes (Blackman &
Eastop, 2007). Au laboratoire, le mycète B. bassiana peut être facilement cultivé sur des
milieux de culture simples (Saranraj & Jayaparakash, 2017). En outre, il peut être produit en
masse par plusieurs techniques dont la plus simple est la fermentation diphasique liquide-
solide (Feng et al., 1994; Mascarin & Jaronski, 2016; Milner, 1997; Saranraj & Jayaparakash,
2017). La fermentation solide engendre les conidies aériennes sèches et la fermentation
liquide génère les blastospores (Feng et al., 1994; Mascarin & Jaronski, 2016; Milner, 1997).
Selon l’insecte ciblé, les conidies peuvent être utilisées directement sous forme de granules
ou être tamisées et formulées en poudre mouillable ou en huile concentrée (Feng et al., 1994;
Mascarin & Jaronski, 2016; Saranraj & Jayaparakash, 2017). Selon Wraight et al. (2016a),
le type de formulation affecte l’efficacité de B. bassiana. En effet, ils ont démontré que sa
formulation en huile émulsifiable était plus efficace contre le puceron du coton que sa
formulation en poudre mouillable. Ils ont expliqué cette amélioration d’efficacité par les
fortes attractions qui se produisent entre les formulations d’huiles, les conidies fongiques et
la cuticule des insectes. En effet, ils ont suggéré que les huiles se propagent rapidement sur
les surfaces hydrophobes de la cuticule en transportant des conidies à des zones protégées
sur le corps de l’insecte où les conditions d’humidité peuvent être favorables à l’infection et
la germination. De plus, Wraight et al. (2016a) ont proposé que la formulation en huile
émulsifiable favorise une plus forte rétention d’inoculum fongique sur les plantes et les
insectes.
L’identification de B. bassiana comme agent de lutte biologique contre les insectes remonte
à l’année 1835 (Ishii et al., 2015; Khan et al., 2016; Zimmermann, 2007). Les
mycoinsecticides produits à la base de B. bassiana sont les plus répandues à l’échelle
19
commerciale (33,9%), suivie par ceux à base de Metarhizium anisopliae (33,9%), Isaria
fumosorosea (5,8%) et Beauveria brongniartii (4,1%) (Faria & Wraight, 2007).
À la suite de nombreux tests de sécurité, l’agence américaine de protection de
l’environnement des États-Unis (USEPA) considère que les produits à base de B. bassiana
sont des produits naturels (Saranraj & Jayaparakash, 2017). En effet, ce champignon a été
démontré sans danger pour l’environnement, la santé humaine, les mammifères, les oiseaux
et les plantes (Saranraj & Jayaparakash, 2017). De plus, plusieurs expériences ont montré
que malgré sa large gamme d’hôtes, ce mycète possède un impact minimal sur les organismes
non ciblés (Zimmermann, 2007). Cependant, James et al. (2012) ont démontré que l’abeille
domestique Apis millifera est susceptible à trois souches de B. bassiana en conditions de
laboratoire.
6.1 Mode d’action
Les champignons affectent les insectes susceptibles par une pénétration directe à travers leurs
cuticules (Butt et al., 2016; Sabbahi, 2008; Vega et al., 2009). À la suite de la réussite du
contact avec la cuticule, l’unité infectieuse du champignon, la spore, germe et exerce des
pressions enzymatiques et mécaniques pour pénétrer via les téguments (Mondal et al., 2016).
Le champignon colonise ensuite l’hémocèle et les organes internes de l’insecte et induit sa
mort pour pouvoir sporuler ainsi à l’extérieur de l’insecte (Ferron, 1978; Sabbahi, 2008). Le
contact et l’attachement des spores à la cuticule sont les étapes prérequises pour la
pathogenèse (Samson et al., 1988). Le processus d’infection de B. bassiana s’accomplit en
quatre étapes différentes : l’attachement, la germination, la pénétration et la dissémination.
Phase d’adhésion : cette phase dépend de plusieurs facteurs, notamment, les conditions
climatiques, la quantité d’inoculum fongique et la densité des insectes hôtes (Samson et al.,
1988). En effet, ce champignon est beaucoup plus efficace si la densité des insectes visés est
très élevée (Sabbahi, 2008). L’adhésion est provoquée par le contact souvent passif des
spores avec le tégument de l’insecte à l’aide d’agents abiotiques comme l’eau et le vent
(Samson et al., 1988 ; Butt et al., 2016; Hajek & Leger, 1994; Sabbahi, 2008). Généralement,
l’infection est initiée à travers le tégument de l’insecte hôte (Samson et al., 1988) ; mais les
20
spores peuvent également pénétrer par la cavité buccale, le tube alimentaire (Mondal et al.,
2016) et le système respiratoire (Sabbahi, 2008).
L’adhésion de B. bassiana est un processus, fréquemment non spécifique, dont l’attachement
des spores à la cuticule est induit par des forces hydrophobiques et électrostatiques résultants
de la présence, chez les spores de B. bassiana, de protéines appelées hydrophobines (Samson
et al., 1988; Sabbahi, 2008). Cependant, une adhésion spécifique nécessitant une
reconnaissance mutuelle entre ce champignon et ses insectes cibles a été également identifiée
(Samson et al., 1988). Cette reconnaissance spécifique dépend des interactions moléculaires
et chimiques entre la spore et l’insecte hôte. Par exemple, les hémagglutinines présentes sur
la surface des spores de B. bassiana sont inhibées par le glucose et le N-acétylglucosamine
(Samson et al., 1988). Au contact avec la cuticule, les spores commencent à produire un
mucilage adhésif qui modifie l’épicuticule de l’insecte et facilite leur germination (Hajek &
Leger, 1994; Mondal et al., 2016).
L’absence d’un facteur favorisant l’adhésion peut arrêter l’infection au niveau de
l’épicuticule. En effet, le pouvoir infectieux des spores peut être empêché par une faible
humidité et une incapacité à utiliser les nutriments disponibles dans la cuticule (Hajek &
Leger, 1994).
Phase de germination : une fois en contact avec les téguments de l’insecte, les spores
germent et produisent des appressoria favorisant l’attachement à la cuticule et un tube
germinatif servant à la pénétration (Samson et al., 1988). Cette phase est influencée par les
facteurs climatiques, particulièrement l’humidité et la température. La quantité et le type de
nutriments présents dans l’épicuticule ont également un rôle primordial dans le processus de
germination (Jaronski & Goettel, 1997). En effet, la germination des spores de B. bassiana
est inhibée par l’absence de nutriments (Samson et al., 1988).
Phase de pénétration : la pénétration est dépendante de la capacité du tube germinatif à
pénétrer à travers l’épicuticule et la procuticule ; elle est réalisée par la sécrétion d'enzymes
hydrolytiques qui dissolvent la cuticule tels que les protéases, les lipases et les chitinases et
21
par des pressions mécaniques (Jaronski & Goettel, 1997; Mascarin & Jaronski, 2016; Mondal
et al., 2016). Une fois pénétré, le champignon se développe à l’intérieur de son insecte hôte
et commence à produire des blastospores, des structures spécialisées qui favorisent
l’exploitation des nutriments, l’affaiblissement de l’immunité de l’insecte et la colonisation
de ses tissus internes (Mascarin & Jaronski, 2016). De plus, la virulence de B. bassiana est
reliée à la production des métabolites toxiques non enzymatiques à effet insecticide,
antifongique et antibactérien qui lui permettent de surmonter la compétition des bactéries
symbiotiques de l’insecte hôte et d’accélérer son processus d’infection (Ortiz-Urquiza et al.,
2010). Parmi ces métabolites, la beauvericine, la bassianolide, la beauvérolide et l’oosporéine
sont les plus importants (Strasser et al., 2000; Zimmermann, 2007). De plus, Khan et al.
(2016) ont démontré que B. bassiana produit une protéine, Bb70p, qui semble être toxique
pour les insectes.
Phase de dissémination : après avoir colonisé la totalité de sa cavité interne, le champignon
cause la mortalité de l’insecte infecté à l’intérieur de trois à sept jours en absorbant tous ses
éléments nutritifs (Mondal et al., 2016). L’insecte mort présente une apparence déshydratée
et momifiée (Sabbahi, 2008). Quand les conditions climatiques sont propices, surtout lorsque
l’humidité est élevée (85% HR), le champignon émerge du cadavre de l’insecte en
produisant la muscardine blanche, un feutrage mycélien cotonneux blanc, sur lequel les
conidies aériennes vont être produites (Mascarin & Jaronski, 2016). Ces dernières peuvent
être disséminées par le vent, la pluie et d’autres moyens biotiques et abiotiques pour induire
une nouvelle pathogenèse (Mascarin & Jaronski, 2016; Sabbahi, 2008).
6.2 Exemples d’utilisation
La large distribution à travers le monde, le grand spectre d’insectes hôtes, la sécurité envers
l’homme et l’environnement et le pouvoir insecticide ont permis aux champignons
entomopathogènes de se présenter comme des agents de lutte biologique prometteurs contre
les insectes ravageurs les plus problématiques (Saranraj & Jayaparakash, 2017). Beauvaria
bassiana est considéré comme l’espèce la plus utilisée et la plus disponible sur le marché des
mycoinsecticides (Faria & Wraight, 2007).
22
Plus de 200 espèces d’insectes sont susceptibles au mycète B. bassiana (Saranraj &
Jayaparakash, 2017). Par exemple, depuis 1936 en Afrique de Sud, le potentiel insecticide de
ce champignon contre les criquets a été reconnu et même certaines de ses souches ont été
enregistrées aux États-Unis pour lutter contre ce ravageur au champ (Bitsadze et al., 2013;
Halouane et al., 2001; Jaronski & Goettel, 1997; Lednev et al., 2008). De plus, Ziani (2008)
et Sabbahi (2008) ont démontré la susceptibilité des larves et des adultes de la punaise terne
au B. bassiana, respectivement, dans les vignobles et les fraisières. Son efficacité contre la
mouche blanche, Trialeurodes vaporarium en serre a été également établi par Labbé (2005).
Plusieurs espèces d’aphides sont aussi susceptibles à cet entomopathogène. En effet, il affecte
le puceron vert du pêcher, M. persicae Sulzer (Lee et al., 2015) en prolongeant sa durée de
développement et en diminuant la fécondité des femelles (Jaber & Araj, 2018). De plus, dans
leur étude, Jandricic et al. (2014) ont démontré, pour la première fois, l’effet insecticide de
trois souches de B. bassiana sur A. solani ainsi que sur les deux pucerons les plus
problématiques en serre M. persicae et A. gossypii.
Plusieurs champignons sont commercialisés pour combattre les insectes piqueurs suceurs de
sève notamment les pucerons. En effet, on dénombre plus que 80 entreprises productrices
des mycoinsecticides et des mycoacaricides dans le monde, dont environ 80% de ces derniers
sont à la base des genres Metarhizium et Beauveria (Faria & Wraight, 2007). Ainsi, en
Amérique du Nord, de nombreux produits contenants différentes souches de B. bassiana sont
présentement disponibles (Jandricic et al., 2014). Par exemple, le BotaniGard® qui est basé
sur B. bassiana (Balsamo) Vuillemin souche GHA, le Naturalis-L® dérivé de la souche JW-
1 et finalement le BioCeres® WP formé par la souche ANT-03 originaire du Québec et qui a
été isolée à partir d’une punaise terne à l’ouest du Montréal (Bernard, 2017). Ce dernier
produit est disponible depuis 2014 au Canada contre les pucerons, les aleurodes et les thrips.
Il est sécuritaire, non phytotoxique, certifié biologique (certification biologique d’EcoCert)
et compatible avec d’autres pesticides. De plus, en 2016, le BioCeres® WP a été introduit sur
le marché américain.
23
7. Les bactéries Bacillus spp.
Les bactéries du genre Bacillus sont naturellement présentes dans le sol. Elles jouent un rôle
majeur en l’agriculture, dans l’industrie et même en médecine. Ces bactéries Gram-positifs,
aérobies ou facultativement anaérobies et formatrices de spores, sont largement distribuées
dans le monde. D’ailleurs, grâce à leur capacité à produire des endospores et à tolérer les
variations extrêmes des conditions climatiques, ces bactéries occupent des niches
écologiques variables et colonisent la majorité des organes des plantes (Fekete, 2009) . La
formation d’endospores par ces Bacillus spp. a été décrite par Nicholson (2002) comme « un
mécanisme de fuite spatiale et temporelle des conditions locales défavorables ». En effet, ces
spores sont tolérantes aux mauvaises conditions telles que l’augmentation de la salinité,
l’alcalinité, l’acidité et la température (Zouari et al., 2016). De plus, plusieurs études ont
démontré qu’ils ont une longue longévité qui peut aller jusqu’à 250 millions d’années
(Nicholson, 2002).
En plus de servir comme des agents de lutte biologique, ces Bacillus spp. peuvent agir comme
des agents de stimulation de la croissance des plantes (PGPR, de l’anglais Plant Growth
Promoting Rhizobacteria; Kloepper et al., 2004) en accomplissant une multitude d’effets
bénéfiques, par exemple la fixation biologique de l’azote atmosphérique, l’amélioration de
l’absorption d’eau et des nutriments ainsi que la production de phytohormones. Pour ce faire,
les bactéries doivent, dans un premier temps, être capables de coloniser les racines des plantes
avec lesquelles elles vont interagir. Ainsi, certaines souches de ces bactéries produisent des
enzymes qui dégradent la cellulose et sont donc capables de pénétrer à l’intérieur des tissus
des racines (Islam et al., 2017). En effet, plusieurs études ont confirmé la tendance de ces
dernières à être endophytes en démontrant leur abondance à l’intérieur de différentes espèces
de plantes (Choudhary & Johri, 2009). Ce pouvoir à former des associations avec les racines
permet à plusieurs souches de ces rhizobactéries de fixer des quantités appréciables d’azote
atmosphérique et de produire des enzymes, des acides organiques ainsi que certaines
hormones de régulation de la croissance des plantes (Naher et al., 2009). L’acide indole-
acétique (AIA), l’acide abscissique (ABA) et l’acide gibbérellique (GA) sont parmi les
principales phytohormones qui agissent en stimulant la croissance des plantes. Plusieurs
études ont trouvé que la majorité des PGPRs, notamment les Bacillus spp., produisent aussi
24
ces hormones et ont supposé que ce mécanisme peut être l’explication de l’amélioration de
la croissance et du rendement d’une multitude des cultures par ces rhizobactéries (Hayat et
al., 2010). Aux États-Unis, de nombreux produits commercialisés sont faits à base de PGPR
et la plupart renferment des souches de Bacillus spp. (Kloepper et al., 2004).
De nombreux métabolites secondaires sont aussi produits par les Bacillus spp., notamment
les antibiotiques, dont environ 167 sont dérivés des différentes espèces du genre Bacillus
(Islam et al., 2017). Ces derniers sont divisés en deux catégories : ribosomales et non
ribosomales. La première catégorie contient les bactériocines qui, en plus d’avoir des
propriétés antibiotiques contre plusieurs microorganismes, ont aussi la possibilité de causer
une dégradation dans le système digestif humain et animal. Quant à la deuxième catégorie,
elle englobe les oligopeptides circulaires comprenant une chaine d’acides gras qui révèlent
une activité antifongique et antibactérienne par la déstabilisation de la membrane de leurs
hôtes. Ces oligopeptides sont classés en trois familles majeures : les surfactines, les iturines
et les fengycines et sont souvent produits lors de la sporulation. Ainsi, plusieurs études ont
démontré l’aptitude des différentes souches de Bacillus spp. à réduire d’une façon
significative la sévérité et l’incidence d’une large gamme de champignons pathogènes et ont
confirmé qu’elles sont des candidates potentielles pour la lutte contre ces derniers (Kloepper
et al., 2004). De plus, la présence de ces bactéries dans la rhizosphère crée une sorte de
protection à la plante grâce à leur pouvoir d’éliciter une résistance systémique induite
(Kloepper et al., 2004). Cette résistance a été notée en champs et en serres dans plusieurs
cultures (la tomate, le poivron, le tabac, etc.) et contre plusieurs pathogènes, notamment,
certains champignons, bactéries, virus et même nématodes (Kloepper et al., 2004). Quant aux
virus, ils sont contrôlés d’une façon indirecte par l’action de certaines souches de Bacillus
spp. sur leurs insectes vecteurs. Le B. thuringiensis (Bt), qui produit des toxines à effet
insecticide, est le bacille le plus commercialisé et le plus utilisé pour lutter contre les insectes
ravageurs (Peralta & Palma, 2017).
Choudhary & Johri (2009) ont affirmé que les Bacillus spp. sont les microorganismes les
plus utilisés à travers la planète. En effet, la majorité de ces bactéries sont connues comme
non pathogènes et non productrices des toxines. Les produits contenant ces bactéries sont
25
donc considérés sécuritaires même dans l’industrie alimentaire.
7.1 Bacillus pumilus
La bactérie B. pumilus est connue pour son adéquation à l’industrialisation (Handtke et al.,
2014). En effet, la majorité des souches de cette bactérie ont un grand potentiel de résistance
intrinsèque au peroxyde d’hydrogène et aux radiations UV, ce qui peut améliorer le processus
de fermentation industrielle de ces souches en évitant le problème du stress oxydatif (Handtke
et al., 2014). De plus, grâce à son pouvoir de production des enzymes utilisables en industrie
(cellulase, protéase, etc.), cette bactérie est employée dans de multiples applications
pharmaceutiques et biotechnologiques (Ariffin et al., 2006; Branquinho et al., 2014).
D’autre part, différentes souches de B. pumilus sont dotées d’une capacité antifongique et
d’un potentiel de stimulation de la croissance des plantes. À titre d’exemple, la souche isolée
à partir des tissus d’une plante médicinale par Murugappan et al. (2013) inhibe plusieurs
champignons pathogènes, et elle est dotée des principaux critères souhaités chez les PGPR.
En effet, en plus de produire des sidérophores et l’acide indole-acétique, cette bactérie
solubilise les phosphates, s’adapte rapidement à l’acidité et la salinité, résiste aux
antibiotiques et n’a pas d’activité hémolytique. Murugappan et al. (2013) ont donc conclut
que cette bactérie peut être utilisée comme un biofertilisant sans risques pour la santé
humaine. Dans un deuxième exemple, Rishad et al. (2017) ont réussi à isoler la souche MCB-
7 de B. pumilus qui se caractérise par un important potentiel de production de la chitinase et
ont suggéré qu’elle peut être utilisée comme un agent puissant de lutte biologique. En effet,
ils ont trouvé qu’après sa purification, cette enzyme a démontré une excellente activité
antifongique et insecticide contre plusieurs champignons pathogènes et un insecte ravageur
du riz, respectivement. En plus, ils révèlent que cette enzyme a une activité élevée, et ce,
même sous des conditions défavorables telles qu’une température supérieure à 60°C et une
concentration élevée en sel. De plus, dans une étude réalisée en Chine, Ren et al. (2013) ont
établi qu’en plus de coloniser les différents organes du peuplier et de promouvoir sa
croissance en améliorant la photosynthèse et la production de biomasse, la souche JK-SX001
de B. pumilus produit aussi des métabolites secondaires qui inhibent le développement de
26
trois champignons pathogènes responsables de la maladie du chancre de peuplier.
L’effet insecticide de certaines souches de cette bactérie a été étudié et établi dans quelques
travaux. En fait, lors d’une étude réalisée en Espagne, une nouvelle souche de B. pumilus
(15.1) a été identifiée comme hautement toxique aux larves de la mouche méditerranéenne
des fruits Ceratitis capitata en induisant un taux de mortalité allant de 68 à 94%. Cependant,
les auteurs ont remarqué que cette toxicité n’a été observée que lorsque les cultures de cette
souche étaient conservées à basse température (0 à 4°C) avant leur application ( Molina et
al., 2010). De plus, Disi et ses coéquipiers (2018) ont trouvé que le traitement des grains de
maïs avec la souche INR-7 de B. pumilus affecte l’activité de ponte de la pyrale du maïs,
Ostrinia nubilalis, en réduisant l’émission par les feuilles des composés organiques volatiles
qui peuvent être une source d’attraction de cet insecte.
Certaines souches de B. pumilus sont toutefois phytopathogènes et attaquent différentes
cultures notamment, le gingembre, la poire et la mangue (Peng et al., 2013). De plus, cette
bactérie a été impliquée dans des intoxications alimentaires et elle est parfois considérée
comme un agent de contamination des milieux industriels et pharmaceutiques (Branquinho
et al., 2014).
7.2 Bacillus subtilis
La bactérie B. subtilis est l’une des bactéries les plus étudiées et les mieux caractérisées (van
Dijl & Hecker, 2013). Son patrimoine génétique est facilement manipulable et on la considère
comme un organisme-modèle pour l’étude de la physiologie et du mécanisme de sporulation
chez les bactéries Gram-positifs du sol (Harwood, 1992; Weber & Marahiel, 2002). Ce
microorganisme, abondamment distribué dans toutes les régions du monde, existe
naturellement dans les couches supérieures du sol d’où il peut être, en tout temps, susceptible
à diverses conditions de stress extrêmement strictes. Toutefois, grâce à son système de
défense performant, sa disposition à produire des peptides antibiotiques et sa capacité de
former des endospores très résistantes, B. subtilis a prouvé son aptitude à surmonter de telles
conditions (Weber & Marahiel, 2002). Par exemple, en cas de manque d’oxygène, cette
27
bactérie aérobie facultative est capable de se convertir à une respiration strictement
anaérobie. De plus, durant la phase stationnaire et en condition d’insuffisance de nourriture,
cette bactérie produit des molécules pour maintenir la communication entre ses cellules
(Weber & Marahiel, 2002). L’intervalle de température de développement de cette bactérie
se situe entre 11 et 53°C, sa température optimale est de 39°C et le pH optimal est de l’ordre
de 6 (Muis, 2006).
Étant donné sa capacité à produire une diversité de métabolites secondaires, notamment les
lipopeptides, les antibiotiques, les composés volatils et les enzymes, cette bactérie a établi
son potentiel à être utilisée comme un agent de lutte biologique (Kilani-Feki et al., 2016). En
effet, B. subtilis produit plusieurs enzymes extracellulaires dont certains sont industrialisées
et commercialisées. En outre, ce microorganisme est connu par sa production à grande
échelle d’une multitude des protéines hétérologues directement dans son milieu de culture,
ce qui facilite le processus de leur extraction. Cependant, la limitation majeure de ce
processus est la possibilité de dégradation de ces protéines recombinantes par les protéases
extracellulaires produites également par cette bactérie. Quant aux antibiotiques, une large
gamme de ceux-ci est aussi produite par B. subtilis, comme la surfactine (Weber & Marahiel,
2002). De plus, plusieurs souches de cette espèce sont endophytes. C’est le cas de la souche
BB de B. subtilis qui a été retrouvée dans les racines, les tiges et les feuilles de chou après
son application sur ses graines (Wulff et al., 2003).
D’autre part, certaines souches de B. subtilis interviennent de différentes manières pour
stimuler la croissance des plantes. Par exemple, Zhang et al. (2009) rapportent que
l’inoculation d’Arabidopsis thaliana avec la souche GN03 de B. subtilis a amélioré son
aptitude de fixation du fer (Fe) dans ses tissus ainsi que sa capacité photosynthétique. De
plus, selon Yao et ses collaborateurs (2006), une amélioration du rendement des plantes de
coton a été observée en champs à la suite de l’application de FZB 24® , un biofertilisant fait
à base de B. subtilis.
L’effet antifongique de B. subtilis a pareillement été étudié et établi dans de nombreuses
études. L’étude de Kilani-Feki et al. (2016) a démontré que l’application de la souche V26
28
de B. subtilis sur les fruits des tomates en post-récolte a réduit de 79% la sévérité de la
pourriture causée par le champignon Botrytis cinerea, en inhibant son développement et en
provoquant des changements morphologiques à son mycélium. Dans le même contexte des
maladies de post-récolte, Punja et al. (2016) ont démontré que l’utilisation de Rhapsody, un
biofongicide à base de B. subtilis QST 713, a diminué significativement l’incidence ainsi que
la sévérité d’une multitude de maladies fongiques qui affectent les tomates de serre. Un autre
biofongicide (Serenade®ASO) fait à base de la même souche (QST 713), a une tendance à
réduire la sévérité de la rouille jaune causée par Puccinia striiformis f. sp. triticii quand il a
été appliqué sur le blé cultivé en champs au Danemark (Reiss & Jorgensen, 2017).
L’action du B. subtilis contre les insectes n’a par contre pas été beaucoup étudiée. Cependant,
certaines études révèlent un effet insecticide de différentes souches de cette bactérie. Par
exemple, B. subtilis IN937b a diminué le nombre de stades larvaires de l’aleurode de tabac
Bemisia argentifolii (Weber & Marahiel, 2002). D’autre part, quand elles étaient appliquées
en amendement avec la chitine, les souches EPCO102 et EPCO16 de B. subtilis ont réduit
les populations du puceron A. gossypii en produisant des enzymes qui ont induit la résistance
chez le coton (Rajendran et al., 2011). La purification d’une chitinase extracellulaire à partir
de B. subtilis et son application foliaire sur des plantes de tabac a entraîné des difficultés dans
le processus de digestion et dans le développement des stades larvaires du ver gris du tabac
Spodoptera litura Fab (Chandrasekaran et al., 2012).
8. Concept d’additivité et de synergie des agents entomopathogènes
Selon la littérature, les champignons et les bactéries entomopathogènes sont les
microorganismes les plus connus et les plus utilisés en lutte biologique contre les insectes
ravageurs. Cependant, appliqués seuls, ces agents peuvent avoir une faible stabilité et ainsi
une nécessité d’applications fréquentes (Yaroslavtseva et al., 2017). Par conséquent, la
construction de différentes combinaisons en synergie de ces agents peut améliorer leur
efficacité contre les insectes nuisibles (Jaber & Araj, 2018). Dans ce contexte, plusieurs effets
additifs de différents microorganismes contre une multitude des ravageurs ont été bien établis
(Yaroslavtseva et al., 2017). Les effets de la combinaison du champignon B. bassiana avec
la bactérie B. thuringiensis contre un certain nombre d’insectes sont les plus étudiés. En effet,
29
une synergie a été observée par Wraight et Ramos (2005) suite à l’application en combinaison
de deux bioinsecticides basés sur la souche GHA de B. bassiana et du B. thuringiensis
tenebrionis contre les larves du doryphore de la pomme de terre. Les auteurs ont conclu que
cette combinaison a induit une réduction des populations de ces larves significativement plus
élevée par rapport à celle induite par les deux biopesticides appliqués seuls. Comme
explication de cet effet synergique, les auteurs ont suggéré que l’intoxication des larves par
la bactérie interrompt leur alimentation et allonge les délais entre les mues en donnant ainsi
plus du temps au champignon pour se fixer et pénétrer à travers la cuticule. Dans le but de
mieux caractériser cette synergie observée, Wraight et Ramos (2017) ont élaboré une
deuxième étude où les mêmes agents entomopathogènes étaient appliqués contre le même
insecte, sous différentes conditions en champs et en serre. Ce travail a également souligné la
complémentarité et la synergie entre B. bassiana et B. thuringiensis. De plus, la même
hypothèse explicative du mode de synergie a été confirmée. Cependant, un autre mécanisme
de synergie entre B. thuringiensis et les champignons entomopathogènes a été suggéré par
Yaroslavtseva et al. (2017). En effet, ces derniers ont également travaillé sur l’effet de
synergie entre B. thuringiensis et Metarhizium robertsii sur le doryphore de la pomme de
terre. Ils ont démontré que l’application de cette bactérie incite un effet immunosuppressif
chez le doryphore en minimisant ses éléments de défense naturels liés à la résistance envers
les champignons entomopathogènes et en augmentant ainsi leur susceptibilité à ces
champignons. Cette compatibilité entre cette bactérie et ces deux champignons a été aussi
mise en évidence par l’étude de Mantzoukas et al. (2013) qui ont établi un effet globalement
positif de la combinaison de ces agents sur la mortalité des larves de la pyrale de maïs. Ma
et al. (2008) ont également trouvé un effet additif de ces microorganismes sur la mortalité
des larves de la pyrale. Toutefois, ils ont révélé un antagonisme de ces agents suite à leur
application en doses sublétales. D’ailleurs, selon Lewis et Bing Anderson (1991), appliqués
seuls ou en combinaison, B. bassiana et B. thuringiensis ont toujours montré des effets
indépendants contre la pyrale de maïs.
En résumé, différentes sortes d’effets (additif, complémentaire, antagoniste, indépendant,
etc.) peuvent se produire en combinant des champignons entomopathogènes avec la bactérie
B. thuringiensis. Ces effets dépendent de plusieurs facteurs notamment, l’insecte hôte, les
30
doses d’application, le temps d’application, la nature des produits mélangés, la culture, les
souches des microorganismes appliquées, etc.
De multiples travaux ont étudié l’intégration du B. bassiana à d’autres agents à effet
insecticide. Par exemple, le travail de Gupta et al. (1999) qui a démontré la compatibilité
entre ce champignon et divers produits basés sur le neem (Azadirachta indica) en conditions
contrôlées du laboratoire. De plus, un effet additif a été observé entre ce champignon et le
spinosad en conséquence de leur application en combinaison contre le ver gris, Agrotis
ipsilon dans des essais in vivo (Gosselin et al., 2009). La compatibilité de B. bassiana avec
certains parasitoïdes de pucerons a également été explorée. En effet, Jaber et Araj (2017) ont
trouvé que le potentiel d’A. colemani à parasiter M. persicae n’était pas affecté lorsqu’il était
lâché sur des plantes de poivron dont les racines ont été préalablement inoculées par ce
champignon. De plus, cette étude a démontré qu’aucun effet sur le pourcentage des femelles,
la longévité des adultes émergeants et le temps de développement d’A. colemani n’a été
observé. Cependant, Martins et al. (2014) ont illustré une action négative de ce mycète sur
l’émergence de Diaeretiella rapae, parasitoïde des pucerons, quand ils ont été utilisés
simultanément in vitro.
9. Problématique, objectifs et hypothèses
Ainsi, bien que certains aspects de la lutte biologique contre les aphides ravageurs en serres
semblent établis, il reste encore des pistes de recherche à explorer, surtout dans le contexte
d’utilisation des microorganismes comme agents de lutte. En effet, l’acquisition de la
résistance à plusieurs insecticides chimiques et les difficultés d’acclimatation rencontrés par
certains auxiliaires d’insectes ravageurs imposent la recherche de nouveaux
microorganismes pour enrichir la liste des agents microbiens efficaces contre les pucerons.
De plus, selon Peralta et Palma (2017), certains insectes nuisibles ont commencé à montrer
une résistance aux produits basés sur l’agent microbien le plus populaire et le plus utilisé, B.
thuringiensis. Ce qui exige ainsi une recherche immédiate des nouvelles espèces de Bacillus
qui produisent peut-être d’autres toxines ou qui ont d’autres modes d’action sur les insectes.
D’autre part, il a été bien démontré dans la littérature qu’une synergie peut se créer entre
31
différents agents microbiens à la suite de leur application en combinaison. Au meilleur de
nos connaissances, cet aspect n’a encore jamais été testé contre les pucerons. Il se pourrait
donc qu’en combinant des agents microbiens on puisse obtenir une bonne gestion de ces
ravageurs dans les serres. De ce fait, la question qui se pose à ce stade est : quels
microorganismes doit-on combiner pour avoir une meilleure efficacité contre les pucerons ?
L’objectif principal de ce projet était donc d’évaluer l’efficacité de deux bactéries Bacillus
pumilus PTB180 et Bacillus subtilis PTB185 et du champignon Beauveria bassiana ANT-
03 comme agents de lutte biologique contre le puceron de la digitale, A. solani et le puceron
du melon, A. gossypii en serre.
Les hypothèses testées étaient :
1) les deux bactéries B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 et le champignon B. bassiana
ANT-03 entraîneront la mortalité des deux espèces de puceron ;
2) la combinaison (double et triple) de B. bassiana avec les deux bactéries augmentera leurs
effets insecticides contre les deux pucerons ;
3) la survie des deux bactéries ne sera pas affectée par la présence du champignon et vice
versa.
Les objectifs spécifiques étaient les suivants :
1) Évaluer l’effet de deux bactéries et du champignon sur la mortalité de deux pucerons en
laboratoire et en serre;
2) Tester l’effet de la combinaison de B. bassiana ANT-03 avec les deux bactéries sur les
deux pucerons au laboratoire et en serres ;
3) Déterminer l’effet de l’interaction entre les deux Bacillus spp. et le champignon B.
bassiana en suivant la survie de leurs spores sur les feuilles des plants de tomate et de
concombre en serre.
32
Chapitre 2 : Effet insecticide de Bacillus pumilus PTB180 et Bacillus subtilus PTB185
utilisés seuls ou en combinaison avec le champignon Beauveria bassiana ANT-03
contre les pucerons ravageurs en serre Aphis gossypii et Aulacorthum solani
33
Résumé
Le puceron de la digitale Aulacorthum solani et le puceron du melon Aphis gossypii sont
parmi les insectes nuisibles en serres. La lutte microbienne démontre une efficacité contre
ces insectes, qui peut être améliorée par la combinaison de différents agents microbiens. Ce
travail évalue l’efficacité de Beauveria bassiana ANT-03 (Bioceres® WP), Bacillus pumilus
PTB180 et B. subtilis PTB185, utilisés seuls ou combinés, pour contrôler ces deux pucerons.
Pour chaque espéce de puceron, huit traitements (Témoin, B. pumilus, B. subtilis, B.
bassiana, B. pumilus + B. subtilis, B. bassiana + B. pumilus, B. bassiana + B. subtilis, B.
bassiana + B. pumilus + B. subtilis) ont été appliqués au laboratoire et en serre. Les résultats
pour A. solani révèlent que tous les traitements, à l’exception de Bioceres® WP, avaient un
taux de mortalité comparable (43%), significativement plus élevé que celui du témoin. Tous
les traitements ont performé uniformément contre A. gossypii en réduisant sa reproduction
de façon significative. Ces microorganismes présentent un excellent potentiel d’utilisation en
lutte biologique.
Mots clés : Mortalité, reproduction, tomate, concombre, effet additif, pucerons, lutte
biologique microbienne.
34
1. Introduction
Au Canada, l’industrie des légumes de serre connaît un accroissement soutenu tel qu'indiqué
par les valeurs des superficies occupées par cette industrie, par ses revenus et son implication
dans les exportations qui démontrent une tendance vers la hausse (Agriculture et
Agroalimentaire Canada, 2016). Le Québec se situe en troisième position à l’échelle
canadienne en fournissant 4% de la production nationale des légumes de serre et en
représentant 7% de la superficie serricole. Au Québec, comme partout au Canada, les tomates
et les concombres demeurent les cultures les plus produites en serre (Agriculture et
Agroalimentaire Canada, 2016). La production québécoise en tomates de serre représente 7%
de la production canadienne et génère environ 54 M$ de ventes annuellement (Robitaille,
2016). En 2015, environ 1650 tonnes de concombres ont été produits en serre au Québec et
ont engendré une somme de 5M$ (ISQ et MAPAQ, 2016). En 2015, les tomates et les
concombres de serre représentaient 60 % de la valeur des exportations canadiennes de
légumes de serre avec respectivement 311 310 et 186 242 milliers de dollars (Agriculture et
Agroalimentaire Canada, 2016).
Comme toutes les autres cultures de serre, les tomates et les concombres sont attaqués par
une multitude de maladies et de ravageurs. Les pucerons sont parmi les insectes les plus
nuisibles sur le plan agricole (Blackman & Eastop, 2007). Ces insectes piqueurs suceurs de
sève s’attaquent à une large gamme de plantes en causant de grandes pertes de rendement.
Pour les cultures en serre, le puceron du melon Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera:
Aphididae) et le puceron de la digitale Aulacorthum solani (Kaltenbach) (Hemiptera:
Aphididae) sont considérés comme les aphides les plus dommageables (Jandricic et al.,
2014). En plus d’être largement répandus dans toutes les régions du monde, ces deux
hémiptères originaires de l’Europe se caractérisent par une grande polyphagie. En effet, le
puceron du melon, considéré comme le ravageur majeur des Cucurbitacées, s’attaque à plus
de 300 familles de plantes (Razmjou et al., 2006; Rostami et al., 2012). Au Canada, c’est
surtout en automne que cet aphide cause une variété de dégâts aux plants de concombre de
serre en induisant une réduction du taux de photosynthèse, de la biomasse et de la hauteur
(Boivin & Richard, 1994; Hu et al., 2017). De plus, A. gossypii est identifié comme vecteur
d’au moins 80 maladies virales (Shannag et al., 1998). Récemment, le puceron de la digitale
35
a commencé aussi à être considéré comme un ravageur redoutable des cultures sous serre au
Canada (Jandricic, 2013). Il transmet plus de 45 viroses et s’attaque à 25 familles de plantes,
avec une préférence pour les cultures ornementales, la pomme de terre et d’autres cultures
dont la tomate (Jandricic et al., 2010; Wave et al., 1965).
Comme c’est le cas pour tous les pucerons, la lutte chimique demeure une méthode encore
utilisée contre ces deux espèces (Wang et al., 2002). Cependant, l’utilisation non raisonnable
et répétée des insecticides chimiques a créé le développement de résistance chez certains
aphides à une bonne partie de ces produits. Selon la littérature, le puceron du pêcher Myzus
persicae Sulzer et le puceron du melon A. gossypii (Glover) sont les espèces les plus
identifiées comme résistantes à la majorité des insecticides (Rongai et al., 1998). Selon
Blackman et Eastop (2007), c’est en Europe, en 1964, que le premier incident de résistance
à un insecticide a été enregistré chez le puceron du melon. Depuis, plusieurs études effectuées
dans différents endroits dans le monde, particulièrement dans les cotonniers et les serres de
Cucurbitacées, ont démontré l’acquisition et le développement de la résistance chez cet
aphide envers de nombreux groupes d’insecticides chimiques notamment, les carbamates
(Furk et al., 1980), les organophosphorés (Gubran et al., 1993), les pyréthroïdes (Wang et al.,
2002) et mêmes certains néonicotinoïdes (Matsuura & Nakamura, 2014; Nauen & Denholm,
2005). Bien qu’au Japon certaines études ont démontré une moindre résistance de quelques
clones de puceron de la digitale à un organophosphoré (Takada et al., 2006), Jandricic (2013)
a affirmé qu’en 2013 en Amérique du Nord, aucun cas de résistance à un insecticide chimique
n’a été observé chez A. solani. L’importance des dégâts et des pertes économiques causés
par les pucerons et l’apparition des résistances, ont poussé l’utilisation abusive des produits
chimiques (Blackman & Eastop, 2007). Ces produits représentent une menace potentielle
pour la santé humaine et pour l’environnement, d’où l’importance de développer de
nouveaux moyens de lutte plus respectueux de l’environnement.
La lutte biologique microbienne basée sur l’utilisation des microorganismes
entomopathogènes connaît une progression stimulée par les demandes de produits agricoles
sans résidus et d’un environnement sans risque de toxicité (Mascarin & Jaronski, 2016). Les
champignons et les bactéries entomopathogènes sont les agents microbiens les plus étudiés
36
et les plus utilisés dans les programmes de lutte biologique contre certains insectes ravageurs.
Le champignon ubiquitaire, cosmopolite et naturellement présent dans les sols du monde
entier Beauveria bassiana a été déjà utilisé efficacement comme alternative aux pesticides
chimiques contre plusieurs arthropodes (Shrestha et al., 2015; Wraight & Ramos, 2005). En
effet, grâce à la facilité de sa culture en laboratoire et de sa production en masse, plusieurs
bioinsecticides contenant ce champignon sont actuellement commercialisés mondialement
(Mascarin & Jaronski, 2016). Cependant, à cause de sa lente vitesse d’action sur ses insectes
hôtes, Wraight et Ramos, (2005) ont considéré qu’appliqué seul, B. bassiana ne peut pas agir
rapidement pour protéger les plantes et éviter les dommages économiques.
Les bactéries du genre Bacillus sont les microorganismes les plus utilisés dans divers
domaines à travers la planète (Choudhary & Johri, 2009). En agriculture, grâce à leur capacité
de produire des métabolites secondaires à effets bénéfiques, certaines espèces de Bacillus ont
réussi à substituer les produits synthétiques (Mia et al., 2017). Les produits formés à base de
Bacillus thuringiensis (Bt) représentent 98% des pesticides microbiens bactériens (Lacey et
al., 2015). En effet, cette bactérie a démontré une efficacité évidente contre une large gamme
d’insectes ravageurs. D’autre part, plusieurs études ont démontré une synergie et un effet
additif en combinant le Bt avec B. bassiana ou Metarhizium robertsii (S. P. Wraight &
Ramos, 2005, 2017; Yaroslavtseva et al., 2017). Cependant, quelques cas de résistance de
certains insectes à cette bactérie ont été récemment notés (Peralta & Palma, 2017). C’est
pourquoi, les dernières études s’intéressaient à trouver d’autres espèces de Bacillus au
pouvoir insecticide. Par exemple, quelques souches bactériennes de Bacillus pumilus et
Bacillus subtilis, qui sont d’ailleurs parmi les bactéries les plus utilisées, les plus adéquates
pour l’industrialisation et les plus productrices d’enzymes, et des métabolites secondaires,
ont récemment démontré un effet insecticide (Weber & Marahiel, 2002; Molina et al., 2010).
L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet de B. Pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et
B. bassiana ANT-03 (Bioceres® WP, Anatis Bioprotection) utilisés seuls ou en combinaison
sur A. gossypii et A. solani, in vitro et in vivo. Nous avons émis les hypothèses que (1) les
deux souches PTB180 et PTB185 et le champignon B. bassiana ANT-03 entraînent la
mortalité des deux espèces de puceron et que (2) la combinaison de B. bassiana avec les deux
37
bactéries augmente leurs effets insecticides contre les deux pucerons et finalement que (3) la
survie de deux bactéries ne sera pas affectée par la présence du champignon et vice versa.
2. Matériels et méthodes
2.1 Matériels biologiques
2.1.1 Matériel végétal
Des plants de concombre (Cucumis sativus L. cv. Marketmore 70 ; Norseco, Québec,
Canada) et de tomate (Solanum lycopersicum L. cv. Hyb. Celebrity; Norseco, Québec,
Canada) biologiques ont été utilisées. Les grains ont été semés dans des pots de 946 ml (1
graine / pot) remplis de substrat "PRO-MIX BX Mycorrhizae" fourni par Premier Tech,
Québec, Canada. Les pots étaient maintenus dans une serre à une température de 22°C le jour
et 20°C la nuit, une humidité relative (HR) de 70% et une photopériode de 16 h et 8 h
d’obscurité. Un arrosage au besoin et une fertilisation hebdomadaire (fertilisant 20-20-20 à
une dose de 200 mg / l) ont été faits dès la germination des grains. À l’âge de trois semaines,
ces plants ont été utilisés pour la production des cohortes de pucerons et pour les essais
biologiques (essais au laboratoire et essais en serre).
2.1.2 Les insectes
Le puceron de la digitale, A. solani, fourni par le laboratoire de lutte biologique, département
des sciences biologiques, Université du Québec à Montréal (UQAM), a été élevé initialement
sur des plants de pommes de terre puis transféré ultérieurement, selon les exigences de
l’expérience, sur des plants de tomate.
Le puceron du melon, A. gossypii, fourni par l’Institut Québécois du Développement de
l’Horticulture Ornementale (IQDHO), Québec, Canada, a été maintenu sur des plants de
concombre. Tous les plants infestés par les deux pucerons ont été gardés dans des cages à
insectes (34,29 cm de largeur x 34,29 cm de profondeur x 60,96 cm de hauteur, BioQuip
products) grillagées à mailles fines (0,5 mm x 0,3 mm), et maintenus dans une chambre de
croissance à 23°C le jour et la nuit, avec une photopériode de 16 heures et une humidité
relative de 65%.
38
Afin d’obtenir des pucerons du même âge, 10 ou 15 adultes ont été introduits à l’aide d’un
pinceau fin, sur des plants non infestés âgés de trois semaines, de pomme de terre ou tomate
pour A. solani et de concombre pour A. gossypii. Ces plants ont ensuite été gardés dans une
chambre de croissance sous les mêmes conditions décrites plus haut pour les cages. Des
plants de pommes de terre (Solanum tuberosum, cv Norland) ont été également utilisés au
début de l’étude pour l’élevage du puceron de la digitale. Les adultes ont été retirés après 48
heures dans le but d’obtenir le matériel aphidien nécessaire pour nos essais et les larves
obtenues ont été considérées comme une cohorte synchrone.
2.1.3 Matériel fongique
Le produit commercial BioCeres ® WP, qui contient la souche ANT-03 du champignon B.
bassiana, commercialisée sous forme d’une poudre mouillable a été fournie par ANATIS
Bioprotection, Québec, Canada. Selon les indications de manufacturier, la concentration
initiale des conidies dans le produit était de 1x1010 spores/g. Dès son obtention, ce produit a
été gardé dans une chambre froide à 4°C jusqu’à son utilisation. Pour les expériences de
laboratoire ainsi que pour celles en serre, ce produit a été appliqué selon la dose recommandée
par le manufacturier, qui correspond à 4 g/L (mélanger 4 g de produit dans 1 liltre d’eau) et
qui coïncide avec une concentration conidienne finale de 4x107 UFC/mL.
2.1.4 Les bactéries
Des suspensions de spores des deux souches, Bacillus pumilus PTB180 et Bacillus subtilis
PTB185 ont été fournies par Premier Tech, Québec, Canada. Ces solutions avaient des
concentrations initiales de 1x109 UFC/ml et ont été toujours été gardées au froid à 4°C. La
suspension de B. pumilus PTB180 est celle utilisée comme un biostimulant dans le produit
commercial PRO-MIX BX Biostimulant + Mycorrhizae de Premier Tech. La suspension de
B. subtilis PTB185 a été préparée d’une manière similaire.
Pour les essais en laboratoire, suite à une série d’essais préliminaires avec différentes
concentrations bactériennes, nous avons décidé d’appliquer les deux souches (PTB180 et
PTB185) à une concentration de 1x108 UFC/ml. Pour obtenir un volume de 100 ml des
suspensions bactériennes d’une telle concentration, on a mélangé, pour chaque souche, 10
39
ml des solutions mères avec 90 ml d’eau distillée stérile. En ce qui concerne les essais en
serre, les bactéries étaient appliquées selon les recommandations du manufacturier, en
mélangeant 1 ml de chacune de leurs solutions dans 100 ml d’eau distillée stérile pour avoir
ainsi des suspensions d’une concentration de 107 UFC/ml.
2.2 Traitements appliqués
Les huit traitements ont été appliqués dans tous les essais effectués durant cette étude pour
évaluer l’effet de trois microorganismes ainsi que l’effet de leur utilisation en combinaison
sur les deux pucerons.
Ces huit traitements appliqués dans ce travail pour les deux pucerons à l’étude sont :
1) témoin (pulvérisation par l’eau distillée stérile)
2) B. pumilus PTB180
3) B. subtilis PTB185
4) BioCeres® WP (B. bassiana ANT-03)
5) Combinaison de deux souches de Bacillus spp. (PTB180 +PTB185)
6) Combinaison Bioceres et PTB180
7) Combinaison Bioceres et PTB185
8) Combinaison Bioceres + PTB180 + PTB185.
2.3 Essais au laboratoire
2.3.1 Essai de compatibilité entre le champignon et les deux bactéries
Dans un premier temps, la compatibilité entre le champignon entomopathogène B. bassiana
ANT-03 et les deux bactéries B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 a été testée. Pour ce
faire, des essais in vitro ont été conduits selon la méthodologie de Bezert et al. (1996). Ces
expériences ont été réalisées suivant un plan entièrement aléatoire avec six répétitions. Dans
une boîte de Petri de 90 mm contenant 25 mL de milieu TSA (Tryptic Soy Agar, Difco), la
bactérie à l’étude a été inoculée au centre sous forme d’une strie en zigzag partageant ainsi
la boîte de Petri en deux partie égales. Deux disques de 8 mm de diamètre, prélevés à l’aide
d’un emporte-pièce à la périphérie d’une colonie active de B. bassiana poussant sur un milieu
PDA (fournie par Anatis bioprotection), ont été déposés de chaque côté de la strie à 1 cm du
40
bord de la boîte. Des boîtes témoins ont reçu uniquement, soit les deux disques de
champignon, soit les stries des bactéries. Les boîtes de Petri ont été ensuite incubés à 28°C à
l’obscurité. Le rayon de croissance de chaque disque mycélien a été mesuré après 3, 6 et 12
jours à l’aide d’une règle. Les valeurs trouvées pour les boîtes témoins ont été comparées
avec celle d’autres boîtes et les pourcentages d’inhibition de la croissance fongique par les
deux bactéries ont été calculées selon la formule suivante : ((rayon de disque mycélien dans
la boîte témoin – rayon de disque mycélien dans la boîte contenant les bactéries) x 100) /
rayon de disque mycélien dans la boîte témoin. L’impact du champignon sur les bactéries n’a
été évalué qu’en serre.
2.3.2 Puceron de la digitale
Trois essais indépendants, répétés dans le temps ont été réalisés avec le puceron de la digitale
A. solani. Les unités expérimentales utilisées pour ces essais ont été des boîtes de Petri de 90
mm de diamètre contenant de la gélose à 1,5% (composée d’Agar-Agar) fondue (40-50 °C),
sur laquelle on place, en exposant la face abaxiale, des feuilles de tomate prélevées sur des
plants âgés de trois semaines. Pour obtenir des larves (L2) ue même âge, des pucerons adultes
(10 / boîte) ont été placés sur les feuilles pendant 48 heures pour leur permettre de se
reproduire et donner naissance à des larves (L1). Les boîtes ont été gardées dans une chambre
de croissance à 23 °C, à une humidité relative de 71 ± 5%, et une photopériode de16h de jour
et 8h de nuit. Pour chaque boîte de Petri, 10 larves (L1) ont été transférées sur des nouvelles
feuilles pour devenir des L2. Après 24 heures, les huit traitements décrits plus haut ont été
appliqués sur ces larves. Les préparations fongiques et bactériennes ont été pulvérisées en
utilisant un pulvérisateur à main de 500 mL et à un volume de 1 mL / boîte de Petri (la
quantité de 1 ml a été obtenue en appliquant trois jets de pulvérisation à partir de ce
pulvérisateur). Après l’application des traitements, sous notre surveillance pour éviter
l’échappement des pucerons, on laisse les feuilles sécher dans une hotte à flux laminaire
durant 30 minutes, jusqu’à la disparition des gouttelettes de pulvérisation. Les boîtes de Petri
sont ensuite fermées avec une membrane de parafilm et maintenues dans une chambre de
croissance dans les mêmes conditions décrites précédemment. Après 24 heures de contact
avec les microorganismes appliqués, les larves de puceron ont été transférées dans des boîtes
de Petri contenants des feuilles nouvellement fixées sur gélose dont les couvercles ont été
41
changés par d’autres ayant des trous de 3 cm de diamètre recouverts d’un tissu de mousseline
blanc finement maillé. En raison de la sénescence rapide des feuilles, les pucerons ont été
transférés tous les trois jours sur des feuilles fraîchement découpées et fixées sur gélose. La
mortalité de ces larves traitées a été évaluée quotidiennement pendant une semaine et les
pucerons morts retrouvés dans chaque boîte de Petri ont été comptés et retirés. Puisque les
pucerons se multiplient rapidement, les larves nouvellement produites par les adultes pendant
l’expérience étaient également comptées et retirées.
Pour le traitement témoin, les pucerons ont été pulvérisés avec de l’eau distillée stérile. Pour
les trois traitements 5, 6 et 7, la combinaison double des microorganismes a été établie selon
un rapport de volume de 1/1 tandis que pour le traitement 8, la combinaison a été faite avec
1 ml de mélange contenants en volume égal 1/3 de chacun des trois microorganismes.
Pour chaque essai, un total de 40 unités expérimentales (40 boîtes de Petri = 5 répétitions x
8 traitements) distribuées selon un plan complètement aléatoire a été établi. Le pourcentage
de mortalité cumulative (somme des pourcentages de mortalité quotidiens) a été utilisé pour
les analyses statistiques.
2.3.3 Puceron du melon
Le même protocole utilisé pour le puceron de la digitale et décrit dans la section précédente,
a été utilisé avec le puceron du melon avec les modifications suivantes : deux essais
indépendants, au lieu de trois, ont été retenus ; les feuilles de tomate ont été remplacées par
des rondelles de feuilles de 3 cm de diamètre découpées à l’aide d’un anneau métallique à
partir de plants de concombre âgés de trois semaines.
2.4 Essais en serre
Les essais ont été réalisés dans une serre de l’université Laval (Québec, Canada) ajustée à
une photopériode de 16 h de jour et 8 h de nuit et à des températures, diurne de 25°C et
nocturne de 21°C avec une humidité relative de 65%. Pour vérifier régulièrement ces
conditions et intervenir rapidement en cas de problème, une sonde numérique (HOBO) a été
42
placée dans la serre. L’arrosage des plants a été fait quotidiennement à l’aide d’un système
d’irrigation goutte à goutte. Une fertilisation hebdomadaire a été réalisée en ajoutant 150 mL
/ plant d’une solution contenant 200 mg/L de l’engrais 20-20-20.
Le dispositif expérimental était un plan en cinq blocs complets entièrement aléatoires avec
toujours huit traitements pour un total de 40 plants (40 unités expérimentales = huit
traitements x cinq blocs).
2.4.1 Essais avec le puceron de la digitale
Afin d’évaluer l’effet des agents microbiens sur le puceron A. solani, quatre essais ont été
répétés dans le temps en utilisant les traitements décrits en 2.2. Pour les deux premiers essais,
chaque unité expérimentale correspondait à un plant de tomate âgé de trois semaines (stade
4 feuilles) poussant dans un pot de 946 mL contenant le substrat PRO-MIX BX Mycorrhizae
de Premier Tech. Chaque plant placé dans une cage à insecte a reçu 50 pucerons adultes âgés
de 24-48 heures introduits à l’aide d’un pinceau fin. Une semaine plus tard, selon nos
décomptes, le nombre de larves de puceron était d’environ 100/plant, une application foliaire
des préparations microbiennes est faite en utilisant un pulvérisateur à main de 500 mL. Un
volume approximatif de 40 mL par plante a été pulvérisé en s’assurant que les deux côtés du
feuillage étaient suffisamment et uniformément mouillés. Pour le traitement témoin, les
plants ont été pulvérisés avec de l’eau distillée stérile.
Lors des essais en laboratoire, les trois microorganismes furent mélangés ensemble et
appliqués au même instant sur les tranches de feuilles. Toutefois, il en fut autrement pour les
essais en serrecar il fallait respecter les recommandations du manufacturier et éviter tout
risque d’incompatibilité pouvant provoquer des symptômes d’intoxication chez les plantes.
Ainsi, pour les traitements où les bactéries et le champignon ont été combinés, soit les
traitements 6, 7 et 8, le champignon a été appliqué deux jours avant l’application des
préparations bactériennes. Après neuf jours de contact entre les pucerons et les
microorganismes, les plants entiers de tomates ont été ramassés et apportés au laboratoire
pour faire les décomptes des pucerons morts et vivants retrouvés sur ces derniers sous
binoculaire. Les poils retrouvées sur les plants de tomate ont permis de retenir les pucerons
43
morts sur ces derniers. Les cages ont été aussi vérifiées et les pucerons qu’y ont été retrouvés
ont été pris en compte. Dans les cas où on n’a pas réussi à accomplir les décomptes en une
journée, les plants ont été gardés pour une nuit dans une chambre froide à 4°C.
Pour les deux autres essais, le même protocole a été suivi, mais à cause des densités élevées
des pucerons à la fin de chaque expérience et le nombre élevé de morts dans le traitement
témoin, on a diminué le nombre de pucerons introduits au début de 50 à 20 pucerons pour
tenter de réduire cette mortalité.
2.4.2 Essais avec le puceron du melon
Le même protocole expérimental a été utilisé pour évaluer l’effet des trois agents microbiens
sur le puceron du melon. Cependant, à cause d’un manque du matériel aphidien, seuls 15
pucerons du melon ont été introduits au début du premier essai. Même avec ce nombre réduit
de pucerons introduits initialement, la densité finale dépassait 1000 pucerons par plant de
concombre. Ainsi, seules trois feuilles par plants ont été échantillonnées pour les décomptes
de pucerons morts et vivants, correspondant aux feuilles les plus vieilles et ayant reçu
initialement les adultes et les pulvérisations. Pour les trois autres essais, des changements
mineurs au niveau du protocole ont été faits. En effet, le nombre de pucerons introduits a été
réduit au début des essais à 10 au lieu de 15. De plus, on a réduit le temps alloué aux pucerons
pour donner naissance aux larves à trois jours au lieu d’une semaine.
2.5 Essais sur la survie des conidies fongiques et bactériennes
Afin d’évaluer la survie des conidies de B. bassiana et des conidies des deux bactéries (B.
pumilus et B. subtilis) sur la phyllosphère du concombre et de la tomate en serre et de
déterminer l’effet de la présence simultanée du B. bassiana et des deux Bacillus spp. sur le
même plant sur leurs viabilités, des plants supplémentaires non infestés par les pucerons ont
été ajoutés pendant les essais en serre et ont été pulvérisés en même temps avec les mêmes
suspensions fongiques et bactériennes appliquées sur les plants infestés.
Pour chaque culture, ces essais sur la survie ont été répétés deux fois dans le temps. Des
feuilles de tomate et de concombre ont été prélevées à deux reprises, soit à 24 h et neuf jours
44
après la pulvérisation des produits. Les échantillons étaient gardés pour une nuit à 4 °C avant
leur utilisation au laboratoire. Des rondelles de 1 cm de diamètre ayant un poids moyen de
0,04 g pour la tomate et de 0,05 g pour le concombre ont été découpées à partir de ces feuilles
à l’aide d’un tube cylindrique en cuivre. Pour dénombrer les colonies bactériennes et
fongiques présentes sur ces feuilles, chaque disque foliaire a été mis dans un tube Eppendorf
de 1,5 ml et broyé avec 1 ml d’eau distillée stérile à l’aide d’un petit pilon broyeur. Pour
chaque broyat obtenu, des dilutions en série ont été réalisées. Pour le premier essai sur la
survie, les dilutions 10-3 et 10-4 ont été gardées pour le dénombrement. Cependant, pour les
autres essais, les dilutions 10-2 et 10-3 ont été choisies. Pour éviter le développement d’autres
bactéries, tous les tubes contenant les dilutions sélectionnées, sauf ceux contenant B.
bassiana ANT-03, ont été chauffés en bain-marie à une température de 55 °C pendant 15
minutes. Pour les tubes où le champignon était en mélange avec les bactéries, seulement la
moitié de la quantité de dilution qui a été chauffée, l’autre moitié a été gardée pour l’étaler
sur un milieu sélectif pour ce champignon. Ensuite, 100 µl de chaque dilution ont été déposés
sur les milieux sélectifs et étalés à l’aide d’un râteau préalablement flambé. Pour le traitement
témoin et les traitements où les bactéries étaient présentes, l’étalement a été fait sur le milieu
NAO (Nutriment Agar, Oxoid) et les boîtes de Petri ont été ensuite incubées à 37 °C pendant
24 h.
Pour les traitements où le champignon était présent, l’étalement a été fait sur le milieu SDA
(Sabouraud Dextrose Agar) additionné de 0,08% du sulfate de streptomycine (Sigma
Aldrich) pour inhiber la croissance bactérienne et les boîtes de Petri ont été gardées dans un
incubateur à 27 °C pendant cinq jours. Pour chaque microorganisme appliqué, le nombre de
colonies formées sur chaque boîte de Petri a été compté, permettant ainsi de déterminer son
niveau de population par gramme de feuille fraîche (de tomate ou de concombre).
Pour pouvoir faire les décomptes des colonies de deux souches de Bacillus, il était primordial
de bien identifier l’une de l’autre. Grâce à la morphologie assez différente des colonies de
ces deux souches, il était facile de les identifier par une simple observation macroscopique.
En effet, B. pumilus PTB180 se caractérise par une forme circulaire à élévation bossue avec
des traits centriques très caractéristiques, des marges enroulées et une coloration blanchâtre
45
à apparence opaque (Figure 1 (A)). Concernant B. subtilis PTB185, cette espèce se
caractérise par une forme irrégulière avec des marges dentelés, une coloration blanc crème
ou un peu jaunâtre et une élévation plate avec une surface brillante (Figure 1 (B)).
Le niveau de population final à chaque temps de mesure a été calculé selon la formule
suivante : niveau de population = ((nombre des colonies retrouvées sur chaque Petri x facteur
de dilution x volume de solution étalée sur chaque Petri) / poids d’échantillon utilisé pour
chaque feuille).
Figure 1: Morphologie des colonies de B. pumilus PTB180 (A) et B. subtilis PTB185 (B) sur milieu NAO (photos de Premier tech, Québec, Canada).
2.6 Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SAS version 9.4 (SAS
Institue, 2013). Pour chaque volet étudié (essais du laboratoire, essais en serre et essais sur
la survie des conidies fongiques et bactériennes), les données issues de tous les essais
indépendants ont été fusionnées dans un seul fichier et les essais ont été considérés comme
des critères de classification aléatoires.
Pour les essais de compatibilité entre le champignon et les deux bactéries, les données ont
été analysées par la procédure GLM suivie par une comparaison des moyennes par le test
LSD (α = 0,05).
46
Pour les essais réalisés au laboratoire les données des pourcentages de mortalité observés
chez les deux pucerons ont été exprimées en moyennes avec les erreurs-types. Ces données
ont été analysées en utilisant une analyse en modèle mixte avec la procédure Mixed (α =
0,05) en considérant les pourcentages de mortalité comme les variables dépendantes, les
traitements comme les critères fixes et les essais comme les critères aléatoires. Ces données
ont été assujetties par la suite à des comparaisons multiples par le test LSD pour déterminer
s’il y avait des différences significatives entre les traitements. La normalité des données a été
vérifiée par le test de Shapiro-Wilk et l’homogénéité des variances a été vérifiée par la
procédure Univariate.
L’application de Shapiro-Wilk sur les données des essais de laboratoire pour le puceron de
la digitale a démontré que ces dernières n’étaient pas distribuées normalement (p = 0,002).
Une valeur de Kurtosis égale à 0,95 a aussi été calculée. Toutes les transformations testées
(arcsin, etc.) pour normaliser les données ont augmenté la valeur de Kurtosis et ainsi
augmenté l’aplatissement de la distribution de ces données. Selon Douglas (2012), il était
préférable dans ce cas de garder nos données brutes même si elles n’étaient pas distribuées
normalement.
Les mêmes analyses statistiques ont été appliquées sur les données issues des essais en serre
en considérant comme variables dépendantes le nombre de pucerons vivants retrouvés sur
les feuilles de concombre échantillonnées pour le puceron du melon.
Pour les essais en serre sur le puceron de la digitale, puisqu’une modification de protocole a
été faite (50 adultes introduits au début des essais 1 et 2 et seulement 20 adultes pour les
essais 3 et 4), des analyses séparées pour chaque groupe d’essai ont été faits. Ces analyses
ont été conduites selon un dispositif split-plot avec le groupe d’essai (« 1-2 » vs « 3-4 ») en
parcelles principales et le traitement en sous-parcelles. Cela nous a permis d’évaluer l’effet
des traitements dans chaque groupe d’essai et aussi d’évaluer l’effet du groupe d’essai pour
chaque traitement. Pour chaque groupe d’essai les données moyennes des pourcentages de
mortalité ont été analysées par la procédure Mixed (α = 0,05). Par la suite une comparaison
multiple des moyennes par le test LSD a été faite.
47
Pour les essais sur la persistance des conidies fongiques et bactériennes, les concentrations
finales calculées aux deux temps de mesure (1j et 9j) ont été exprimées en Log. Pour analyser
la variation de ces concentrations au cours du temps en fonction des différents traitements,
une ANOVA en mesures répétées a été réalisée en utilisant la procédure Mixed (α = 0,05).
Par la suite, pour chaque traitement, afin de vérifier l’effet de temps sur la survie des conidies,
les concentrations retrouvées à 1j et 9j ont été comparées par le test lsmeans.
3. Résultats
3.1 Essais de compatibilité entre le champignon et les deux bactéries
Les essais de compatibilité ont démontré que les deux souches bactériennes (PTB180 et
PTB185), utilisées seules ou combinées, inhibent significativement et pareillement la
croissance de B. bassiana ANT-03 (Figure 2). Après 3, 6 et 12 jours d’incubation, incubé
seul, le champignon a présenté une croissance radiale significativement plus élevée par
rapport à celle mesurée quand il était incubé en présence des deux bactéries. Après 12 jours
d’incubation, la croissance radiale était de 3,78 cm lorsque le champignon était incubé seul.
Cette croissance a été réduite à 1,11; 1,33 et 0,58 cm, respectivement par PTB180, PTB185
et la combinaison de ces deux souches (PTB180 + PTB185). Ainsi, PTB180, PTB185 et leur
combinaison inhibent de façon significative et similaire la croissance mycélienne de B.
bassiana ANT-03 avec des pourcentages de 71%, 65% et 85% respectivement (Figure 2).
48
Figure 2: Effet des souches de B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 sur la croissance radiale moyenne de B. bassiana ANT-03 après 3, 6 et 12 jours d’incubations sur TSA. Les moyennes
(n= 6) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
3.2 Essais avec le puceron de la digitale
3.2.1 Essais de laboratoire
Ces essais ont démontré que tous les traitements appliqués ont permis d’augmenter la
mortalité des larves de A. solani de façon significative par rapport au traitement témoin (sans
microorganismes) (F7, 110 = 9,94 ; P < 0,0001) (Figure 3). Les mortalités observées pour les
pucerons du traitement témoin sont considérées comme étant naturelles. Sept jours après la
pulvérisation avec de l’eau distillée, un pourcentage moyen de 12% de mortalité a été noté
sur les plants témoins. À l’exception de la souche PTB185 qui lorsque appliquée seule a
causé 22% de mortalité, tous les autres traitements ont engendré des pourcentages de
mortalité statistiquement comparables, variant entre 29% pour la combinaison des deux
bactéries (PTB180 + PTB185) et 45% pour la combinaison de PTB185 avec le Bioceres
(bioinsecticide commercial contenant le champignon B. bassiana ANT-03). Appliqués
individuellement, la PTB180 et le Bioceres ont causé des mortalités de 38% et 43%,
respectivement. Ainsi, selon les résultats de ces essais de laboratoire, les deux souches
bactériennes ainsi que le champignon ont un pouvoir insecticide contre les larves L2 du
puceron de la digitale.
a
a
a
b
b b
bc
b
b
cb b
0
2
4
6
3 jours 6 jours 12 jours
Cro
issa
nce
rad
iale
du B
. bass
iana
(cm
)
Temps d'incubation
Beauveria (B) B + PTB 180 B + PTB 185 B + 180 + 185
49
Figure 3: Mortalité cumulative des larves L2 de A. solani sept jours après l’application de B. pumilus
PTB180, B. subtilis PTB185 et duBiocers (B. bassiana ANT-03), seuls ou en combinaison sur feuilles
de tomate en in vitro. Les moyennes (résultantes de trois essais indépendants répétés dans le temps, n= 15) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
3.2.2 Essais en serre
Les résultats des essais 1 et 2 combinés ainsi que ceux de la combinaison des quatre essais
sont présentés en Annexe (Annexes A1 et A2) car une mortalité anormale des pucerons fut
observée sur les plants témoins, probalement causée par le nombre trop élevé de pucerons
introduits au début des essais pour la capacité des plants (50 adultes avaient été introduits sur
chaque plant pour les essais 1 et 2 vs. 20 pour les essais 3 et 4). Ainsi, seuls les résultats des
essais 3 et 4 combinés sont présentés ici à la Figure 4. Ces résultats démontrent des
différences significatives entre le traitement témoin et tous les autres traitements, à
l’exception de Bioceres (F7, 80 = 3,37 ; P = 0,0025). Un pourcentage moyen de mortalité de
25% a été observé chez le témoin. Les deux souches bactériennes PTB180 et PTB185 ont pu
augmenter significativement, de plus de 20% la mortalité chez A. solani en induisant des
mortalités de l’ordre de 46% et 43% respectivement. Le champignon B. bassiana ANT-03
(Bioceres® WP) n’a provoqué que 37% de mortalité. Aucun effet additif entre les trois
microorganismes n’a été observé et aucune amélioration des mortalités n’a été remarquée en
les appliquant en mélange (Figure 4).
d
ab
c
ab
bcab
a
ab
0
20
40
60
80
100
Mort
ali
té (
%)
Traitements
50
Figure 4 : Mortalité cumulative de A. solani neuf jours après l’application de B. Pumilus PTB180,
B. subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou en combinaison sur plants de tomate en serre. Les moyennes (résultantes de deux essais répétés dans le temps, n= 10)
ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
3.3 Essais avec le puceron du melon
3.3.1 Essais de laboratoire
Les essais réalisés en laboratoire avec A. gossypii ont dévoilé qu’à l’exception du Bioceres,
le reste des traitements ont provoqué une mortalité significativement (F7, 71 = 12,73 ; P <
0,0001) plus élevée que celle du témoin (Figure 5). Une mortalité de 50% et 42% a été
observée pour les pucerons traités avec les bactéries PTB180 et PTB185 respectivement. Les
différentes combinaisons appliquées n’ont pas démontré un effet additif entre le champignon
et les deux bactéries.
c
a abbc
aab
a ab
0
20
40
60
80
100
Mo
rtal
ité
(%)
Traitements
51
Figure 5 : Mortalité cumulative des larves L2 de A. gossypii sept jours après l’application de B. pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et B. bassiana ANT-03, seuls ou en combinaison (8 traitements)
sur feuilles de concombre in vitro. Les moyennes (résultantes de deux essais indépendants répétés
dans le temps, n = 10) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
3.3.2 Essais en serre
Pour les essais du puceron du melon en serre, on a décidé de ne pas mesurer la mortalité et
de s’intéresser plutôt à la variation du nombre des pucerons vivants présents sur les feuilles
de concombre en fonction des traitements car les mortalités étaient très faibles (Figure 6).
Les résultats démontrent que les deux bactéries, le champignon, ainsi que leurs différentes
combinaisons, réduisent significativement le nombre de pucerons vivants présents sur les
plants de concombre neuf jours après leur application (F7, 133 = 4,71 ; P < 0,0001). Pour le
témoin, un nombre moyen de 1015 pucerons vivants / 3 feuilles a été obtenu. À part la
PTB185 qui a performé un peu moins, les autres traitements ont réduit, en moyenne, de 33%
le nombre de pucerons vivants comparés au témoin non traité, soit une réduction moyenne
de 300 pucerons / 3 feuilles de concombre (Figure 6). Ainsi, il semble que les deux Bacillus
spp. et le Bioceres affectent la reproduction du puceron du melon. Finalement, aucun effet
additif n’a pu être observé entre les trois microrganismes à l’étude contre le puceron du
melon.
c
a
ab
bcab
a ab ab
0
20
40
60
80
100
Mort
ali
té (
%)
Traitements
52
Figure 6 : Variation du nombre des pucerons (A. gossypii) vivants retrouvés sur trois feuilles de
concombre échantillonnées neuf jours après l’application de B. pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou en combinaison (8 traitements) en serre.
Les moyennes (résultantes de quatre essais indépendants répétés dans le temps, n= 20) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
3.4 Essais sur la survie
3.4.1 Survie des bactéries
Les tests de survie démontrent que les deux rhizobactéries ont pu persister jusqu’à neuf jours
sur les feuilles de tomate et de concombre. Appliquées initialement à une concentration de
107 UFC / ml, les populations des deux bactéries ont diminué graduellement avec le temps à
3,8x106 et 4,1x106 UFC / g de feuille fraîche pour PTB180 et PTB185 respectivement, sur
tomate au neuvième jour après l’application (Tableau 1). L’application de ces bactéries en
combinaison avec le champignon n’a pas eu d’effet négatif sur leur survie. En effet, malgré
les différences significatives observées entre les niveaux des populations observés entre un
et à neuf jours après l’application de chaque bactérie pour certains traitements de
combinaison, on a noté des concentrations finales assez élevées qui ne baissaient pas en
dessous de 2,7x106 UFC/g de feuille fraîche.
a
bcb
bc bc c cbc
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Nom
bre
m
oyen
des
pu
cero
ns
viv
ants
/ 3
fe
uil
les
Traitements
53
Sur feuilles de concombre, B. pumilus PTB180, utilisée seule ou en mélange avec Bioceres,
a pu survivre et garder un niveau de population constant au cours du temps avec une valeur
supérieure à 1x107 UFC / g de feuille fraîche à un et neuf jours après l’application (Tableau
2). Une légère diminution du nombre de colonies formées par B. subtilis PTB185 a été notée
sur concombre. Cependant, même si cette diminution est statistiquement significative, la
population moyenne de 1,3x107 UFC/g de feuille fraîche après neuf jours est importante et
devrait permettre la réussite d’une lutte biologique.
Ainsi, la PTB180 et la PTB185 survivent bien jusqu’à neuf jours après leur application
foliaire sur les feuilles de tomate et de concombre. De plus, même en les combinant avec le
champignon, les deux souches bactériennes ont pu garder des niveaux des populations
élevées.
Tableau 1 : Survie de B. pumilus PTB180 et de B. subtilis PTB185, un jour et neuf jours après leur
application sur les feuilles de tomate seules ou en mélange, en l’ansence ou en présence de Bioceres
contenant B. bassiana ANT-03. Dans chaque ligne les moyennes (n= 8) suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
Concentration des bactéries
(log UFC/g de feuille fraîche)
Traitements 1j 9j
PTB180 6,41 a 6,38 a
PTB185 6,42 a 6,41 a
180+185* 6,72 a 6,51 b
Bioceres+180 6,39 a 6,27 a
Bioceres+185 6,59 a 6,37 b
Bioceres+180+185* 6,68 a 6,48 b
*Dans le cas des mélanges 180 et 185 les valeurs des UFC/g indiquées sont la somme des UFC180 + les
UFC185 identifiée selon la morphologie des colonies.
54
Tableau 2 : Survie de B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185, un jour et neuf jours après leur
application sur les feuilles de concombre seules ou en mélange, en l’ansence ou en présence de Bioceres contenant B. bassiana ANT-03. Dans chaque ligne, les moyennes (n= 8) suivies par la même lettre ne sont pas significativement différents (LSD, α = 0,05).
Concentration des bactéries
log (UFC/g de feuille fraîche)
Traitements 1j 9j
PTB180 7,25 a 7,18 a
PTB185 7,33 a 7,13 b
180+185* 7,33 a 7,18 b
Bioceres+180 7,04 a 7,04 a
Bioceres+185 7,12 a 6,97 b
Bioceres+180+185* 7,33 a 7,21 a
*Dans le cas des mélanges 180 et 185 les valeurs des UFC/g indiquées sont la somme des UFC180 + les
UFC185 identifiée selon la morphologie des colonies.
3.4.2 Survie du champignon
Sur les feuilles de tomate, la souche ANT-03 de B. bassiana a démontré une bonne survie,
en présence ou en absence des bactéries, allant jusqu’à neuf jours après son application
(Tableau 3). Aucune différence significative n’a été détectée entre les concentrations de ce
champignon calculées à un jour et à neuf jours après son application pour tous les traitements
(Tableau 3).
Sur les feuilles de concombre, la bonne survie de B. bassiana a aussi été démontrée (Tableau
4). En effet, lorsqu’il a été appliqué seul ou en combinaison avec la PTB180, le champignon
a démontré une diminution insignifiante et non significative du niveau de ses populations
présentes sur les feuilles de concombre à la fin de l’expérience avec une valeur supérieure à
7,8x106 UFC/g de feuille fraîche (Tableau 4). Pourtant, en l’appliquant avec PTB185 et avec
la combinaison des deux bactéries, bien que la diminution notée pour ses populations ait été
considérée statistiquement significative, le champignon a pu quand même survivre jusqu’à
neuf jours avec un niveau de population supérieur à 6,3x106 UFC/g de feuille fraîche.
55
Tableau 3 : Concentration de B. bassiana ANT-03, un jour et neuf jours après son application sur les feuilles de tomate en présence de B. pumilus PTB180 et de B. subtilis PTB185. Dans chaque ligne les
moyennes (n= 64) suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
Concentration de B. bassiana
(log UFC/g de feuille fraîche)
Traitements 1j 9j
Bioceres 6,47 a 6,31 a
Bioceres+180 6,62 a 6,48 a
Bioceres +185 6,63 a 6,45 a
Bioceres+180+185 6,67 a 6,48 a
Tableau 4 : Concentration de B. bassiana ANT-03, un jour et neuf jours après leur application sur
les feuilles de concombre en présence de B. pumilus PTB180 et de B. subtilis PTB185. Dans chaque
ligne les moyennes (n= 64) suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes (LSD, α = 0,05).
Ainsi, à l’inverse des essais de compatibilité effectuées au laboratoire qui ont démontré que
la PTB180 et la PTB185 inhibent la croissance radiale de B. bassiana ANT-03, aucun effet
négatif n’a été observé sur champignon à la suite de son application en combinaison avec les
deux bactéries en serre.
Concentration de B. bassiana
(log UFC/g de feuille fraîche)
Traitements 1j 9j
Bioceres 6,86 a 6,84 a
Bioceres+180 6,81 a 6,78 a
Bioceres +185 6,81 a 6,63 b
Bioceres+180+185 6,91 a 6,75 b
56
4. Discussion
À notre connaissance, ce projet de recherche est le premier à évaluer le pouvoir aphicide de
la souche PTB180 de B. pumilus et la souche PTB185 de B. subtilis. Cependant, l’effet
d’autres souches de ces deux bactéries contre différents insectes avait été exploré dans
d’autres études (Chandrasekaran et al., 2012; Chandrasekaran et al., 2014; Rajendran et al.,
2011; Moussa et al., 2014; Molina et al., 2010).
Contre le puceron de la digitale A. solani, B. pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 ont
démontré une pathogénicité comparable ou légèrement supérieure à celle du Bioceres, le
bioinsecticide formulé à base de B. bassiana ANT-03, et ce, autant pour les essais en serre
que ceux in vitro. En effet, nos résultats ont révélé, pour la première fois, l’induction d’une
mortalité de A. solani à la suite de l’application des deux souches de Bacillus. Le pouvoir
insecticide de B. pumilus et de B. subtilis a commencé récemment à attirer l’attention des
entomologistes et à être étudié. Ainsi, différents processus d’action contre différents insectes
ont été proposés pour chaque bactérie. Ce pouvoir insecticide des deux Bacillus à l’étude
peut s’expliquer par leur capacité à produire des substances et des enzymes qui s’attaquent à
des sites bien précis sur l’insecte hôte. Par exemple, la chitinase est une enzyme impliquée
dans la dégradation de chitine formant la cuticule de la majorité des insectes lors de leurs
changements de stade de développement (Moussa et al., 2014). L’importance d’utilisation de
cette enzyme comme outil de lutte contre les insectes nuisibles est de plus en plus investiguée
(Chandrasekaran et al., 2012; Moussa et al., 2014). Les espèces de Bacillus sont bien connues
comme producteurs de cette enzyme extracellulaire. La bactérie B. subtilis possède une
activité notable de la chitinase (Kilani-Feki et al., 2016). Cette enzyme a été purifiée à partir
de différentes souches de B. subtilis et a été appliquée contre différents stades de ver gris du
tabac Spodoptera litura Fab. (Lépidoptères : Noctuidae) pour provoquer une réduction de
leur croissance, de leurs poids et ainsi une augmentation de leur mortalité (Chandrasekaran
et al., 2012; Chandrasekaran et al., 2014). Ainsi, il est possible que la souche PTB185 de B.
subtilis utilisée lors de notre étude possède ce pouvoir de production de cette enzyme qui
facilite son pénétration à l’hémocoele de A. solani en perforant sa cuticule et sa membrane
intestinale.
57
Bacillus pumilus agit possiblement de la même façon que B. subtilis. Cependant, le fait d’agir
pareillement sur A. solani ne suggère pas forcément qu’elles ont le même mode d’action. Il
existe peu d’information sur le pouvoir insecticide de B. pumilus mais la souche 15.1 de cette
bactérie a bien performé en provoquant jusqu’à 94% de mortalité des larves de la cératite,
Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Molina et al. (2010) ont observé que le facteur de
virulence de cette souche est synthétisé lors de son processus de sporulation et qu’une
incubation au froid (4°C à -20°C) est nécessaire pour que sa toxicité s’accomplisse. Notre
souche PTB180 a aussi été gardée au froid (4°C) avant son application, ce qui peut avoir
favorisé sa virulence contre le puceron de la digitale. Ce volet n’était pas pris en compte au
cours de notre étude, donc des travaux futurs seraient nécessaires pour confirmer cette
observation.
Nos résultats démontrent que les souches PTB180 et PTB185 ont performé différemment sur
le puceron du melon A. gossypii selon qu’elles étaient appliquées en laboratoire ou en serre
(Figures 5 et 6). En effet, au cours des essais en laboratoire, les deux bactéries ont causé une
mortalité du puceron du melon appréciable et plus élevée que celle causée par le champignon
B. bassiana. En serre, toutefois, de très faibles pourcentages de mortalité ont été observés sur
A. gossypii, mais nos résultats suggèrent que les deux bactéries ont eu un effet notable sur la
reproduction de ce puceron car le nombre d’individus vivants étaient réduits comparées à
ceux sur les plants témoins (Figure 6). La différence de résultats entre les essais réalisés au
laboratoire et ceux en serre peut s’expliquer par les doses appliquées (108 au laboratoire vs.
107 en serre) et les conditions d’expérimentation différentes entre les deux milieux d’essais
(ex. éclairage, température, etc). De plus, en serre, une interaction entre les plants de
concombre, les microorganismes et le puceron peut s’être produite. Cette interaction suggère
fortement l’induction d’une résistance systémique de ces plants contre les populations du A.
gossypii. Ainsi, nos résultats seraient conformes à ceux de Rajendran et al. (2011) qui ont
trouvé une diminution de l’incidence de A. gossypii sur coton après l’application de EPCO
102 et EPCO 16, deux souches endophytes de B. subtilis. Ces souches agissent en améliorant
la production et l’accumulation des enzymes de défense (peroxydase, polyphénol
oxydase…), de la chitinase et des phénoliques chez les plants traités, favorisant une réduction
des populations de ce puceron (Rajendran et al., 2011). Ces enzymes agissent contre les
58
insectes cibles des différentes manières, entre autres l’interruption de leur alimentation. Par
exemple, la chitinase bloque l’activité de la majorité des enzymes intestinales essentielles
pour l’alimentation du ver gris du tabac, Spodoptera litura (Lepidoptera : Noctuidae)
(Chandrasekaran et al., 2014). L’interruption de l’alimentation des pucerons engendre
l’inhibition du développement des divers stades larvaires, un allongement des périodes
séparatrices des mues et ainsi qu’une prolongation des durées exigées pour accomplir leur
cycle de vie. La souche INR-7 de B. pumilus, inoculée sur les grains de maïs pour ses
propriétés PGPR, a réduit l’émission de certains produits organiques volatils ce qui a induit
une détérioration de l’activité de ponte de la pyrale du maïs, Ostrinia nubilalis (Lepidoptera :
Crambidae) (Disi et al., 2018). Ainsi, en interagissant avec les plantes traitées et en induisant
leur résistance systémique par la modification de leurs profils de production de certains
métabolites, B. pumilus et B. subtilis ont la capacité d’agir sur la reproduction de A. gossypii.
L’inférence d’une mortalité était le résultat attendu pour B. bassiana ANT-03 contre le
puceron de la digitale. D’ailleurs, le mode d’action de ce champignon entomopathogène
contre les insectes est bien établi et l’effet de plusieurs souches de B. bassiana contre les
pucerons les plus nuisibles en serre a fait l’objet de plusieurs études et il est bien reconnu
(Jaber & Araj, 2018; Jandricic et al., 2014; Lee et al., 2015). Jandricic et al. (2014) ont étudié
pour la première fois l’effet de ce champignon contre A. solani et ont identifié des souches
hautement virulentes contre cette espèce de puceron, mais la souche ANT-03 ne faisait pas
partie de cette étude.
L’effet de B. bassiana sur la reproduction du puceron du melon était surprenant et inattendu.
En effet, ce champignon agit souvent en causant la mort de ses insectes hôtes (Butt et al.,
2016). Ainsi, on s’attendait à obtenir des pourcentages de mortalité assez élevés en
l’appliquant, mais même pour ce traitement, on n’a presque pas observé de mortalité. En
effet, ce champignon agit habituellement contre A. gossypii en causant sa mortalité (Jandricic
et al., 2014). Pourtant, cet effet sur la prolongation de développement et une diminution de
fécondité par B. bassiana a été récemment notée contre le puceron vert du pêcher M. persicae
(Jaber & Araj, 2018). Donc, B. bassiana ANT-03 pourrait avoir d’autres modes d’action qui
nécessitent plus de travaux pour les dévoiler.
59
Notre étude est la première à investiguer l’interaction entre B. bassiana ANT-03, B. pumilus
PTB180 et B. subtilis PTB185 et à étudier la possibilité de la création d’une synergie entre
ces entomopathogénes. Nos résultats ont démontré que l’application de ces microorganismes
en mixture, aussi bien contre A. solani que contre A. gossypii n’a pas amélioré leur efficacité
et qu’aucun effet additif n’a été observé. Pareillement, Costa et al. (2001), en appliquant B.
bassiana GHA suite à l’application d’une toxine produite par Bacillus thuringiensis (Bt),
n’ont détecté aucun effet additif et aucune amélioration de la mortalité du doryphore de la
pomme de terre Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera : Chrysomelidae). De plus, Lewis et
Bing Anderson (1991) ont révélé des effets indépendants entre ces deux agents
entomopathogènes contre la pyrale du maïs. Cependant, plusieurs études ont démontré une
interaction synergétique entre différentes souches de B. bassiana et Bt contre différents
insectes nuisibles (S. P. Wraight & Ramos, 2005, 2017; Yaroslavtseva et al., 2017).
L’absence ou la présence d’une synergie entre deux microorganismes varie selon le temps de
leur application (S. P. Wraight & Ramos, 2005). Ainsi, des travaux supplémentaires testant
l’interaction synergétique entre les souches ANT-03, PTB180 et PTB185 en fonction des
moments et la manière (simultanément ou successivement) de leur application contre les
pucerons sont recommandés pour avoir plus de détails sur ce phénomène.
Nos essais de laboratoire sur la compatibilité entre les trois microorganismes utilisés pendant
cette étude ont montré une inhibition in vitro de la croissance radiale de B. bassiana ANT-
03 en présence de B. pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et de la combinaison de ces deux
souches. Cette inhibition résulte probablement d’une compétition nutritive et non d’une
sécrétion des substances à effet antifongique par les deux souches bactériennes. En effet,
pour nos essais in vivo, une application subséquente de PTB180 et PTB185 sur des plantes
(de tomate et de concombre) préalablement traitées avec B. bassiana ANT-03 n’a affecté en
rien la survie des spores de ce dernier et vice versa. De plus, ces trois microorganismes ont
démontré une bonne survie au cours du temps. En effet, neuf jours après leur application, ils
étaient présents sur les feuilles des plantes traitées à des concentrations élevées. Ainsi, dans
l’optique d’une utilisation éventuelle comme agents de lutte en serre contre le puceron de la
digitale et le puceron du melon, ces microorganismes pourraient être réappliqués tous les
60
neuf jours.
5. Conclusion
Ce présent travail a permis de démontrer les propriétés aphicides de B. pumilus PTB180 et
B. subtilis PTB185. Ces deux souches ont pu causer la mortalité de A. solani et diminuer la
reproduction de A. gossypii, en exposant une efficacité comparable à celle du B. bassiana
ANT-03, utilisé sous sa formule commercialisée, Bioceres. Appliqué contre A. gossypii, ce
champignon a inhabituellement induit une faible mortalité et agit en diminuant sa
reproduction. Aucune synergie et aucun effet additif n’a été observé suite aux différentes
combinaisons formées entre les deux souches bactériennes et le champignon. Ainsi, B.
pumilus PTB180 et B. subtilis PTB185 sont des candidats potentiels pour la lutte biologique
contre les pucerons en serre.
61
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65
Conclusion générale
66
Les travaux effectués dans le cadre de ce projet de maîtrise ont permis d’identifier deux
nouveaux candidats bactériens performants en lutte biologique contre deux pucerons
nuisibles en serre. À notre connaissance, notre étude est la première à étudier le pouvoir
insecticide de deux espèces différentes de Bacillus, Bacillus pumilus PTB180 et Bacillus
subtilis PTB185, et à tester l’opportunité d’une synergie ou d’un effet additif en les
combinant avec le champignon entomopathogène B. bassiana ANT-03.
La première hypothèse de recherche stipulant que les deux souches bactériennes et le
champignon contrôlent les populations de deux pucerons en serre en entraînant leur mortalité
a été partiellement confirmée. En effet, c’est seulement contre le puceron de la digitale que
B. pumilus PTB180, B. subtilis PTB185 et B. bassiana ANT-03 ont induit une mortalité
significativement plus élevée par rapport à celle observée chez le traitement témoin
(pulvérisé avec de l’eau distillée). Pour le puceron du melon, de faibles pourcentages de
mortalité ont été notés pendant nos quatre essais. Cependant, une variabilité du nombre de
pucerons vivants présents sur les plants du concombre a été remarquée à la fin de chaque
expérience et un effet des trois microorganismes à l’étude sur la reproduction du A. gossypii
a été prouvé statistiquement. Cette étude est originale, car elle démontre l’effet
entomopathogène de deux souches Bacillus, contre le puceron de la digitale, sur tomate, en
causant sa mortalité et contre le puceron du melon, sur concombre en réduisant sa
reproduction.
La seconde hypothèse énonçant que la combinaison de B. bassiana avec les deux bactéries
augmentera leurs effets insecticides contre les deux pucerons a été infirmée. En effet, nos
résultats montrent que les trois microorganismes étudiés seuls ou en mélange affectent les
deux pucerons A. solani et A. gossypii de la même manière, indiquant l’absence d’un effet
additif ou de synergie. Par contre, le moment d’application de chaque agent microbien
pourrait être un élément clef pour la production ou non d’un effet additif entre différents
agents microbiens appliqués en mixture. Comme les deux Bacillus à l’étude ont montré un
antagonisme in vitro contre le champignon ANT 03, nous avons appliqué le Bioceres, produit
commercial contenant le champignon, deux jours avant les bactéries selon les directives du
67
manufacturier (Anatis Bioprotection). Ainsi, nous pouvons juste affirmer qu’une application
subséquente à celle de B. bassiana ANT-03 des souches de Bacillus utilisées seules ou en
combinaison n’engendre aucun effet additif.
Finalement, la troisième hypothèse de recherche supposant que la survie des deux bactéries
ne sera pas affectée par la présence du champignon sur le même plant et vice versa a été
affirmée. En effet, les résultats ont démontré qu’appliquées seules ou en mélange avec B.
bassiana ANT-03, sur tomate ou sur concombre, les deux bactéries et le champignon ont
gardé un niveau de population supérieur à 106 UFC/g de feuille fraîche après neuf jours
depuis leur pulvérisation. Ces résultats suggèrent donc l’absence d’antagonisme entre le
champignon B. bassiana ANT-03 et les deux bactéries, B. pumilus PTB180 et B. subtilis
PTB185, sur la surface des feuilles de tomate et de concombre.
On considère ainsi que cette étude a permis d’enrichir la liste des agents microbiens qui
peuvent être utilisés en lutte biologique contre deux pucerons parmi les plus dommageables
en serre. En effet, on a démontré, le pouvoir aphicide des souches B. pumilus PTB180 et B.
subtilis PTB185, contre le puceron de la digitale et le puceron du melon, en serre sur tomate
et sur concombre respectivement. De plus, on a prouvé l’effet insecticide du champignon
entomopathogène, B. Bassiana ANT-03 contre ces de deux pucerons. Ces résultats ont été
obtenus suite à une seule application de nos différents traitements, on suppose ainsi qu’une
efficience plus élevée des trois microorganismes pourrait avoir lieu si un traitement est réalisé
tous les neuf jours selon les résultats des essais de survie. Ainsi en étant à la fois efficaces
contre les deux pucerons, respectueux pour l’environnement, industrialisables et facilement
applicables (par pulvérisation), nous croyons que ces trois microorganismes présentent
d’excellents agents de lutte biologique microbienne qui s’exposent comme une voie d’avenir
pour une agriculture durable.
Les observations intéressantes faites dans ce travail ont été réalisées à court terme, il est donc
essentiel de vérifier si ces résultats pourraient être confirmés en mode de production en serre,
avec plusieurs cultivars et d’autres espèces d’arthropodes ravageurs. Comme les Bacillus
sont aussi connus pour leurs activités antifongiques et stimulatrices de la croissance des
68
plantes, il serait donc très utile de déterminer si la présence de ces bactéries influence aussi
les rendements, la qualité des fruits et l’état sanitaire des plants de tomate et concombre
cultivés en serre. D’autre part, une bonne compréhension des mécanismes d’actions
impliqués serait un atout pour bien exploiter ces microorganismes bénéfiques.
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82
Annexes
Figure A1 : Mortalité cumulative du A. solani neuf jours après l’application de B. Pumilus
PTB180, B. subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou en
combinaison sur plants de tomate en serre. Les moyennes (résultantes de quatre essais répétés dans le temps, n= 20) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement différentes (LSD,
α = 0,05).
b
a a aa a a
a
0
20
40
60
80
100
Mort
ali
té (
%)
Traitements
83
Figure A2 : Mortalité cumulative du A. solani neuf jours après l’application de B. Pumilus
PTB180, B. subtilis PTB185 et du Bioceres contenant le B. bassiana ANT-03, seuls ou en
combinaison sur plants de tomate en serre. Les moyennes (résultantes de deux essais (1 et 2) répétés dans le temps, n= 20) ayant des lettres en commun ne sont pas significativement
différentes (LSD, α = 0,05).
ab ab ab ab aba
bab
0
20
40
60
80
100
