M ÉTHODES A NALYTIQUES POUR ÉTUDES TOXICOLOGIQUES Marlène Lacroix 26/01/2012

MÉTHODES ANALYTIQUES POUR ÉTUDES

TOXICOLOGIQUES

Marlène Lacroix 26/01/2012

Source d’exposition

ANALYTIQUE DANS LES ETUDES TOXICOLOGIQUES

2

AbsorptionDistributionMétabolismeElimination

Effets biologiques

Evaluation de la contamination :

Matrices environnementales (sols, air, eaux, aliments…)

Etude du contaminant et des ses métabolites dans

l’organisme : Matrices biologiques (sang, tissus,

urines, fèces…)

Etude de biomarqueurs :Endogènes (Hormones, Acides

aminés, Lipides…) ou exogènes dans matrices biologiques

3

LES TECHNIQUES ANALYTIQUES PRINCIPALES

Immunochimique(Elisa, RIA,

Chemiluminescence)

Chromatographique

(HPLC, GC, CE)

4

DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE : PRINCIPE

Principe basé sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Traceur Dosage avec compétition

Dosage sans compétition

Radiomarqué Radioimmunoassay

(RIA) Immunoradiometric

assay (IRMA)

Enzyme Enzymoimmunoassay

(EIA)

Enzyme-labeled immunosorbent assay

(ELISA)

Fluorescent Fluoroimmunoassay

(FIA) Immunofluorometric

assay (IFMA)

Luminescent Luminoimmunoassay

(LIA) Immunoluminometric

assay (ILMA)

2 méthodes de dosage : Réactifs en excès (dosage sans compétition) Réactifs limitant (dosage avec compétition)

Classification des méthodes de dosage :

5

Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps

2. Introduction de l’échantillon

3. Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps

Anticorps

Molécules à doser

Autres Molécules

DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION

6

Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

Anticorps

Molécules à doser

Autres Molécules



3. Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps4. Lavage, retrait des molécules non liées


7

Plaque 96 Puits




5. Ajout d’un 2ème anticorpsAnticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection



8

Plaque 96 Puits




Anticorps

Molécules à doser


5. Ajout d’un 2ème anticorps

6. Lavage et retrait des anticorps en excès

L’anticorps de détection peut être radiomarqué ou fluorescent

9

1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection

Anticorps

Molécules à doser


Anticorps secondairelié à une enzyme


Cas des dosages ELISA : Enzyme-Labeled ImmunoSorbent Assay

10


PRINCIPE ELISA

2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser



Substrat

11


PRINCIPE ELISA

2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser



Substrat

Substrat converti

12

Réponse

du s

ignal

Concentration


Interprétation des résultats :

Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)

Domaine quantifiable

Dosage sans compétition :

Intensité du signal proportionnelle à la concentration de la substance à doser

13

DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION

Anticorps (limitant)

Antigènes à doserAntigènes marqués (en excès)

14

DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION

Anticorps (limitant)

Antigènes à doserAntigènes marqués (en excès)

14

Réponse

du s

ignal

Concentration

Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)


Dosage avec compétition :

Intensité du signal inversement proportionnelle à la concentration de la substance à doser

MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES :PRINCIPE

15

Pompes

A B

Colonne Détecteur

Injecteur

Bille de silice greffée

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …

Phase stationnaire

Analytes

Phase mobile

Détecteur

Chromatogramme

temps

Inte

nsit

é16

Polaires

PolaireApolaire Phase directe


Phase stationnaire

Analytes

Phase mobile

Détecteur

Chromatogramme

temps

Inte

nsit

é17

Polaires

PolaireApolaire Phase directe


Phase stationnaire

Analytes

Phase mobile

Détecteur

Chromatogramme

temps

Inte

nsit

é18

Apolaires

ApolairePolaire Phase inverse

DÉTECTEURS

Caractérisés selon leur sélectivité et leur sensibilitéLes plus répandus pour analyse de biomolécules: UV et Fluo

Faisceau lumineux à λ dans ultraviolets

Excitation de la

molécule

Détection UV

Limite de quantification de

l’ordre µg/mL

Émission de la lumière

Détection Fluorescence

Limite de quantification de

l’ordre ng/mLSensibilité x1000

19

Spectromètre de masse

Ionisation des molécules Formation des charges

Séparation des ions m/z produits

Ex: Electrospray

Comptage des ions Amplification du signal

Traitement informatique

Ex: Trappe d’ion

Ex : Quadripôle

Source Analyseur Détecteur

20

Source electrospray (ESI)

Sonde electrospray

Cône

Sortie de colonne

Ionisation des molécules en sortie de colonne

21

VERS L’ANALYSEUR…

O-

O

O CH3

O

OHO

O CH3

O

+ H+

Mesure le rapport m/z d’une molécule m = masse monoisotopiquez = charge

Exemple 1 : Aspirine (acide acétylsalicylique)

9 atomes de Carbone (mC = 12)8 atomes d’Hydrogène (mH = 1)4 atomes d’Oxygène (mO = 16)

maspirine = 9 x12 +8 x1 + 4x16 = 180

Milieu basique

chargée <0

Rapport m/z = 179/1 = 179

m/z

Abondance relative %

179

massif isotopique

z = 1

22

R

H+

Exemple 2 :Mesure le rapport m/z d’une molécule

Dérivé de vancomycine

Formule : C80H87Cl3F3N11O24

Masse monoisotopique = 1750Plusieurs sites basiques

Spectre de masse :

Chargé 1xm/z = 1750+1 =1751

Chargé 2xm/z = (1750+2)/2 = 876

Chargé 3xm/z = (1750+3)/3 = 584

H+

23

Exemple : Analyseur quadripolaire

quadripôle

24

Avec un triple quadripôle

Cellule de collision

« MS » simple

« SIM » sélection d’ion

« MS/MS » fragmentation

« MRM » mode pour la quantification

Mode d’analyse

Q1 Q2 Q3Source Détecteur

25

Appareil de référence pour études quantitatives

Mode d’analyse

ס « MS » simple




Q1 Q2 Q3

ions

+ Spécifique

- Spécifique

Les quadripôles laissent passer tous les ions

Applications en bioanalyse :

Études de pureté

Quantification (concentration de l’ordre du µg/mL) 26

Mode d’analyse

« MS » simple




Q1 Q2 Q3

ions

+ Spécifique

- Spécifique

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini


Quantification

Screening de molécules Concentrations µg/mL 27

Mode d’analyse

« MS » simple




Q1 Q2 Q3

Ions

+ Spécifique

- Spécifique


Énergie de collision : gaz inerte (argon)

Fragmentation dans le deuxième quadripôlePassage des ions fils dans le troisième quadripôle

Ion « père »

Ions « fils »


Études structurales(métabolomique, protéomique…)

Quantification (+ sensible que MS ou SIM)


28

Mode d’analyse

« MS » simple




Q1 Q2 Q3

Ions

+ Spécifique

- Spécifique


Énergie de collision : gaz inerte (argon)

Fragmentation dans le deuxième quadripôleSélection d’un ion fils dans le troisième quadripôle

Ion « père »

Ions « fils »


Quantification

Screening de molécules Concentrations ng/mL

29

Couplage LC/MS

Spectromètre de masse utilisé comme détecteur

Chromatogramme

Temps

Inte

nsit

é

ΣSpectres de masse

Ab

on

dan

ce r

ela

tive %

Rapport m/z

30

31

AVANTAGES – INCONVÉNIENTS

Immunochimie Chromatographie

Méthodes rapides Méthodes sensibles Forte capacité

d’échantillon Utilisation facile

Méthodes sensibles LC/MS spécifique Dosages de plusieurs

molécules en une analyse

Pas toujours sélectives Dosage 1 molécule à la

fois Elaboration difficile

Purification échantillon nécessaire

Durée analyse Coût appareillage élevé

32

APPLICATION : ÉTUDES TOXICOCINÉTIQUE/TOXICODYNAMIE

Administration

Réponse biologiqueProfils de

concentration

Toxicodynamie

Dose

Toxicocinétique

Quantification du contaminant (et

métabolites)

Etudes de biomarqueur

0

1

10

100

1000

10000

0 50 100 150 200 250 300

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (

ng

/mL

)

1

10

100

1000

10000

0 6 12

0

1

10

100

1000

10000

0 50 100 150 200 250 300

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (

ng

/mL

)

1

10

100

1000

10000

0 6 12

0

2

4

6

44 46 48 50 52 54 56 58

1

10

100

1000

Collecte Analyse Toxicocinétique Toxicodynamie

33

ADMINISTRATION Produit chimique, produit naturel isolé, etc.

Choix d’un solvant d’aministration Documenter la stabilité du produit Attention aux substances peu solubles Verifier les doses administrées (analytique)

Produit de formulation Essai pilote

Doses commerciales (produits pharmaceutiques) Peu être inexacte Impuretés (± 5%) Se référer à la directive pour les produits pharmaceutiques

Good Manufacturing Practice (GMP) Vérifier les doses administrées (analytique)

Mode d’administration Perfusion, Bolus…. Doses simples, multiples Voie d’administion (IV reference, orale….)

A définir dans le protocole expérimental

34

STRATÉGIE DE PRÉLÈVEMENT

Un bon prélèvement Ponction ou cathéter (prélèvement sanguin) Site de prélèvement (veine, artère…) Temps de prélèvement (durée, cycle circadien, …)

Un bon traitement ou préparation des spécimens Sang total, plasma, serum… Tubes de collecte (anticoagulant, type de tube…) Conditions de centrifugation Filtration (urines)

Une bonne conservation pour s’assurer de la stabilité des substances et de leurs métabolites Température de conservation (-20°C, -80°C…) Durée de conservation avant analyse

Pour chaque spécimen collecté il faut garantir :

A définir dans le protocole expérimental

ANALYSE ET VALIDATION DE MÉTHODES

35

Valeurs des concentrations les plus fiables possibles

Sélectivité/spécificité Linéarité Exactitude Précision (répétabilité/reproductibilité) Sensibilité Stabilité

PARAMÈTRES FONDAMENTAUX

0

1

10

100

1000

10000

0 50 100 150 200 250 300

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (

ng

/mL

)

1

10

100

1000

10000

0 6 12

0

1

10

100

1000

10000

0 50 100 150 200 250 300

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (

ng

/mL

)

1

10

100

1000

10000

0 6 12

Certifie que la méthode est appropriée pour une utilisation routinière

Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), May 2001

http://www.labcompliance.com/info/links/methods/guidelines.aspx.

Texte de Référence :

SÉLECTIVITÉ/SPÉCIFICITÉ

T (min)

Rép

onse

Aire interférence < 5% LOQ

Aire à LOQ

Définitions :

Sélectivité : Capacité à différencier et quantifier un analyte en présence d’autres substances dans la matrice

Spécificité : Propriété de la méthode analytique de convenir exclusivement à l’analyte avec la garantie que le résultat ne provient que de l’analyte. (absence interférence)

Exemple :

36

Linéarité : courbe de calibration

Définition : Rapport entre les concentrations connues et les réponses analytiques expérimentales (observées).

Objectif : Déterminer les concentrations des échantillons

SI

Analyte

Chromatogramme :

Utiliser un standard interne et utiliser le

ratio :

37

Origine de l’erreur : Précision et exactitude

o Erreur systématique (non aléatoire) Biais Impossible de le corriger C’est l’exactitude (accuracy)

o Erreur aléatoire On peut l’évaluer avec des statistiques

C’est la précision

Illustration avec des cibles

Méthode précise et exacte

Méthode peu précise et exacte

Méthode précise et biaisée

Méthode peu précise et biaisée

38

Mesure de l’exactitude

o Comparaison entre moyenne des concentrations calculées et valeur théoriqueExactitude (%) = 100 x

Moy Cpréd - Cnom

Cnom+100

Critères d’acceptabilité :85 % < Exactitude <115 %

X

Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de

concentrations:(Bas (3*LOQ), Milieux, Haut)

o L’exactitude d’une méthode analytique est l’étroitesse de l’accord entre la moyenne d’une série de concentration obtenue par le modèle et la concentration réelle de l’analyte.

39

Mesure de la précision

o Pour une précision intra-jour et/ou inter-jour sur plusieurs concentrations : Analyse de variance (ANOVA)

Critères d’acceptabilité :CV < 15 %

Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de

concentrations Précision intra-jour (répétabilité) Précision inter-jour

(reproductibilité) Evaluation sur 3 jours Calculée avec le coefficient de

variation (CV%)

o La précision d’une méthode analytique mesure l’écart de chaque mesure individuelle par rapport à la moyenne des mesures d’un volume d’échantillon unique et homogène

X1 X2

CV % = Écart typeMoyenne

X 100

40

Sensibilité : LOD et LOQDéfinition : o la limite de détection (LOD) est la plus petite concentration de

l’analyte pouvant être détectée et différencier du bruit de fond. En général, elle est évaluée à 3 x le bruit de fond du signal.

o la limite de quantification (LOQ) est la plus petite concentration de l’analyte pouvant être quantifiée avec une exactitude et une précision appropriée.

LOD

Domaine d’analyse :

LOD LOQ

Non détectable

Domaine détectable


Mesure de la LOD :

Injection de six blancs matrices et mesure de la réponse

Calcul de la concentration en retour moyenne x 3 = LOD

Mesure de la LOQ :

Injection de 5 points de LOQ et calcul des concentrations

Critère d’acceptabilité : CV < 20 % et exactitude entre 80 et 120 %

41

Stabilité

Critère d’acceptabilité :

Il n’y a pas de valeurs réglementaires

Stabilité des solutions mères et filles

Stabilité à cours terme

Stabilité à long terme

Cycle de congélation-décongélation

Stabilité post – extraction

On s’autorise une variation de 15%

On s’autorise une variation de 5%

La stabilité de l’échantillon doit être évaluée à toutes les étapes précédent l’analyse.

42

Dosage en routine

Chaque jour de dosage :

1 gamme + 2 séries de QC à trois niveaux de concentrations par jour.

1 série valide la gamme du jour et une série en fin de dosage valide les échantillons

Critère d’acceptation :

75% des points de la gamme doivent avoir une variation ± 15% par rapport à leur valeur nominale (sauf à la LOQ ± 20%)

2 QC sur 6 QC peuvent être au-delà de ±15% de variation (mais pas au même niveau de concentration)

43

EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU FIPRONIL

44

Cl Cl

NN

NH2

S

O

F F

F

NF

F

F

Fipronil : Insecticide à usage phytosanitaire ou vétérinaire

Interdit en France en 2004

Métabolite principal : Fipronil sulfone (-SO2CF3)

Potentiel perturbateur endocrinien : Effet sur hormones thyroïdiennes

Substance vétérinaire la plus commercialisés au

monde

Risque pour la santé humaine lié à l’exposition au fipronil?


45

Réponse biologiqueProfils de

concentration

Toxicodynamie

Dose

Toxicocinétique

Evaluer les effets du fipronil et de son métabolite sur les hormones thyroïdiennes

Objectif :

Administration IV ou VO Fipronil

Fipronil sulfoneSolvant

Rats THX + T3 (SC)Cathétérisés

Protocole :

Dosage Fipronil et métabolite

par LC/MS

IV : Paramètres TK (t1/2, CL…)VO : Biodisponibilité

Plasma 6 jours (IV)9 jours (VO)

10 pts/cinétique

Administration IP

Thyroxine (T4) à chaque groupe

Dosage T4 et métabolites par

LC/MS

Dosage T4 par

RIAPlasma 24H

8 pts/cinétique

Gavage 14 jours

Fipronil Fipronil sulfone

Solvant

Réponse biologique : Clairance et métabolisme

T4

46


A: voie intraveineuse B: voie orale

Fipronil sulfone

Fipronil Fipronil

Fipronil sulfone

Résultats TK :

Fabs ≈ 1 quelque soit la molécule

A: T4 totale

B: T4 libre

*

*

**

**

47


* P < 0.05** P < 0.01

* P < 0.05** P < 0.01

Résultats TD (dosage RIA) :

48

EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU FIPRONILRésultats TD (dosage LC/MS) :

Permet de doser la T4 et ses métabolites

Temps (Hr)Temps (Hr)

Temps (Hr)

Co

nc

en

tra

tio

ns

pla

sm

atiq

ues

(n

g/m

L)

Co

nc

en

tra

tio

ns

pla

sm

atiq

ues

(n

g/m

L)

Co

nc

en

tra

tio

ns

pla

sm

atiq

ues

(n

g/m

L)

T4

T2

T3 Dernière SC T3

Modification du profil de la T4 et de ses métabolites en présence

de Fipronil ou de Fipronil Sulfone

Importance d’évaluer les molécules mères mais aussi les métabolites

formés

Documents

M ÉTHODES A NALYTIQUES POUR ÉTUDES TOXICOLOGIQUES Marlène Lacroix 26/01/2012