Manuel Micro 2012

Labo de Microbiologie-2012

1

http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlabo/accueil.htm


2

Horaire ............................................................................................................................................ 5 BARME ........................................................................................................................................ 6 LABO N

O 1 ..................................................................................................................................... 7

DILUTIONS ET CONCENTRATIONS ........................................................................................ 7 POURCENTAGE ..................................................................................................................... 7 POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME ............................................................................. 8 MOLARIT .............................................................................................................................. 9 POIDS/VOLUME .................................................................................................................... 9

LES DILUTIONS EN SRIE: PRPARATION POUR LE LABO No2 .............................. 12

PRPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS .............................................. 12 LABO N

O 2 ................................................................................................................................... 14

INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE .......................... 14

MILIEUX MICROBIOLOGIQUES ...................................................................................... 14 LA TECHNIQUE ASEPTIQUE ............................................................................................ 15

INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) ......................... 15 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES ....... 17

TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR CHANTILLONNER

LENVIRONNEMENT .......................................................................................................... 19 LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE ................................... 19

METTRE DES BACTRIES SUR GLOSE : TALEMENT ............................................. 19 ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMDIATION .......................................... 21

VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE ..................... 22 DNOMBRER LES BACTRIES ........................................................................................ 23 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) ...... 23

MORPHOLOGIES CELLULAIRES ..................................................................................... 25

LABO NO 3 ................................................................................................................................... 26

DNOMBRER LES BACTRIES .............................................................................................. 26 COMPTES VIABLES ............................................................................................................ 26

LES COMPTES LES PLUS PROBABLES ........................................................................... 27 COMPTES DIRECTS ............................................................................................................ 28

COMPTE LES PLUS PROBABLES ..................................................................................... 30 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM ............................... 34

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RSISTANTE ............ 36 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES .......................... 37

LABO NO 4 ................................................................................................................................... 39

LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTRIES DU SOL ......................................... 39 BACTRIES DU SOL ........................................................................................................... 40

LES BACTRIES DANS DU COMPOST ............................................................................ 41 COMPTE DE BACTRIES AROBIES HTROTROPHES ............................................ 41

COMPTE DE BACTRIES ANAROBIES HTROTROPHES ...................................... 41 COMPTE DE BACTRIES GRAM NGATIVES ET POSITIVES .................................... 42 CYCLE DE L'AZOTE............................................................................................................ 43 BACTRIES QUI FIXENT L'AZOTE .................................................................................. 44 BACTRIES NITRIFIANTES .............................................................................................. 44 L'ASSIMILATION DU CARBONE ...................................................................................... 45


3

BACTRIES QUI DGRADENT L'AMIDON .................................................................... 45

BACTRIES QUI DGRADENT LA GLATINE .............................................................. 46 ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS ............................................ 49

LABO No 5 ................................................................................................................................... 51

DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM POSITIVES ........................................... 51 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS ....................................................... 51 MORPHOLOGIE COLONIALE ........................................................................................... 51 COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 51 MTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES .............................................. 52

FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU

D'ACTOINE ......................................................................................................................... 53 URASE ................................................................................................................................. 53 L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE ................................ 54

UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES

EXOCELLULAIRES ............................................................................................................. 54

RDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE ................................................................... 54 TOLRANCE DES CONCENTRATIONS LEVES DE SELS .................................... 55

CYTOCHROME OXYDASE ................................................................................................ 56 LA MOTILIT BACTRIENNE .......................................................................................... 56 CATALASE ........................................................................................................................... 57

IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS; FAMILLES DES

MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE .................................................. 58

Les Micrococcaceae ............................................................................................................... 58 Les Streptococcaceae ............................................................................................................. 58 DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NGATIF ................................ 59

HMOLYSE SANGUINE ..................................................................................................... 59

BILE-ESCULINE ................................................................................................................... 60 SENSIBILIT LA BACITRACINE ET LOPTOCHINE ............................................. 60 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE .......................................................................... 61

GLOSES DE MANNITOL + SELS .................................................................................... 61 AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER ................................................ 61

SENSIBILIT LA NOVOBIOCINE ................................................................................. 61 COAGULASE ........................................................................................................................ 67

TEST DE COAGULASE SUR LAME .................................................................................. 67 LABO N

O6 .................................................................................................................................... 69

CONTRLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE .............................................................. 69 COMPOSS ANTIBACTRIENS - ANTIBIOTIQUES ...................................................... 69 ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER ...................................................................... 69

DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE ..................................................... 70 DSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES ............................................................................ 72

L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS ........................................................................... 72 DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE ..................................................... 75 L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS ........................................................................... 76 CINTIQUE DE MORTALIT ............................................................................................ 76

LABO NO

7 ................................................................................................................................... 78 MICROBIOLOGIE DE LEAU ET DES ALIMENTS................................................................ 78


4

QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU ..................................................................... 78 MICROORGANISMES INDICATEURS DUNE CONTAMINATION FCALE ............. 78 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES ........ 79 TEST DE COLIFORME PRSOMPTIF ............................................................................... 79

ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE LEAU POUR DES COLIFORMES ...... 81 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES

FECAUX ................................................................................................................................ 81 TEST DES ENTROCOQUES ............................................................................................. 82 QUALIT MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS .......................................................... 83

SALMONELLOSE ................................................................................................................ 83 BACTRIES GRAM NGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES ................. 85 TEST DE COLIFORME CONFIRM ................................................................................... 87 STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU EN ONTARIO ............ 87 ESSAI DE SALMONELLA CONFIRM ............................................................................. 88 STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU ........................ 88

COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION DINCONNUS GRAM NGATIFS ......... 89 LABO N

O8 .................................................................................................................................... 91

DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM NGATIVES ........................................ 91 Les Enterobacteriaceae .......................................................................................................... 91 Les Pseudomonaceae ............................................................................................................. 91

Les Nesseriaceae .................................................................................................................... 91 DIAGNOSTIQUE DINCONNUS GRAM NGATIFS ....................................................... 92 COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 92 OXYDASE ............................................................................................................................. 92 CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY ..................................................................... 92

L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE ..................... 92

URASE ................................................................................................................................. 92 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) ............................................. 93 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE DHYDROGNE, DINDOLE ET LA MOTILIT .. 94 PRODUCTION DE H2S ......................................................................................................... 94 MOTILIT ............................................................................................................................. 94

PRODUCTION D'INDOLE SUITE LA DGRADATION DU TRYPTOPHANE .......... 94 LES DCARBOXYLASES DORNITHINE ET DE LYSINE ............................................. 94 API 20E SYSTME ENTEROBACTERIACEAE ................................................................ 95

LABO NO 9 ................................................................................................................................. 104

HMATOLOGIE/ SROLOGIE ............................................................................................... 104 SROLOGIE MICROBIENNE ........................................................................................... 104 ELISA ................................................................................................................................... 104

L'HMATOLOGIE .............................................................................................................. 108 COMPTE DE GLOBULES ROUGES ................................................................................. 108

L'HMATOCRITE .............................................................................................................. 110 VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) ....................................................................... 111 LES LEUCOCYTES ............................................................................................................ 112


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Horaire Labo 1 Dilutions et concentrations 11 et 13 sept.

Labo 2 Introduction au travail dans le labo de microbiologie 18 et 20 sept.

Labo 3 Compter les bactries 25 et 27 sept.

Labo 4 Les milieux de croissance et les bactries du sol 2 et 4 oct.

EXAMEN DE MI-SESSION 11 oct.

Labo 5 Diagnostic bactrien Bactries Gram positives 16 et 18 oct.

SEMAINE DTUDE 21 au 27 oct.

Labo 6 Contrle de la croissance microbienne 30 oct. et 1 nov.

Labo 7 Microbiologie de leau et des aliments 6 et 8 nov.

Labo 8 Diagnostic bactrien Bactries Gram ngatives 13 et 15 nov.

Labo 9 Hmatologie/Srologie 20 et 22 nov.

EXAMEN PRATIQUE 29 nov.

EXAMEN FINAL 1 dec.


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BARME

Quiz 5

Devoirs 20

Examen de mi-session 30

Examen pratique 15

Examen final 30


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LABO NO 1

DILUTIONS ET CONCENTRATIONS

Jour 1

Une proprit trs importante au sujet des solutions qui doit tre adresse cest la concentration. En gnral, la concentration indique la quantit dun solut dans une quantit donne dune solution. Pour travailler avec des concentrations, vous devez comprendre la distinction entre le

solut, le solvant et la solution.

Puisque diffrentes quantits de soluts peuvent tre dissoutes dans une solution, la concentration

est une proprit variable. Nous avons donc besoin dune faon numrique pour indiquer comment concentre est une solution. Une varit de diffrentes faons existent pour calculer et exprimer

les concentrations des solutions.

Ceci peut tre fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les

deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres la faon que les

composs chimiques ragissent entre eux (moles).

Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront prsents. Elles incluent le

pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la

molarit (lutilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume. Vous obtiendrez de lexprience avec plusieurs des faons dtablir la concentration dune solution. Vous pouvez prparer une solution partir des matires brutes et mesurer chacune des

composantes qui doivent tre prsentes dans la solution. Vous pouvez prparer une solution en

diluant une solution prexistante.

POURCENTAGE

Lutilisation des pourcentages est une faon commune dexprimer la concentration dune solution. Cest une approche simple qui indique la quantit dun compos par 100. Les pourcentages peuvent tre calculs en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une faon, que vous

connaissez, sans doute, dexprimer les concentrations est le pourcentage par volume. Une autre faon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre faon est un hybride appel le pourcentage

par poids/volume.

Le pourcentage par volume est habituellement utilis quand la solution est prpare en

mlangeant deux liquides.

Par exemple, lalcool friction est habituellement 70% par volume dalcool isopropyl. Ceci veut dire que 100 ml de solution contient 70 mL dalcool isopropyl. Ceci veut aussi dire quun litre (ou 1000 ml) de cette solution contient 700 mL dalcool isopropyl et assez deau pour complter le volume un total de 1 litre ou 1000 ml.

Pourcentage par volume = volume du solut

volume de solution x 100


8

Le pourcentage par poids est une faon dexprimer la concentration dune solution comme le poids du solut/poids de la solution.

Pourcentage par poids = Poids du solut

Poids de la solution x 100

titre dexemple, considrons une solution de 12% NaCl par poids. Une telle solution

aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100

grammes de solution. Pour prparer une telle

solution, vous pourriez peser 12 grammes de

NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes deau, afin que la masse totale de la solution soit de

100 grammes. Puisque les masses sont

conserves, les masses des composantes de

la solution sadditionneront la masse totale de la solution.

12 % NaCl solution = 12 g NaCl

100 g solution

12 g NaCl

(12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution

Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse dune solution, vous devez diviser la masse du solut par la masse de la solution (la somme combine de la masse du solut et

du solvant) et ensuite multiplie par 100 pour la changer en pourcentage.

POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME

Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le

pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantit de solut en grammes, mais mesure

la quantit de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle

contient 5 g de NaCl pour chaque 100 ml de solution.

Pourcentage par volume = Poids du solut (en g)

Volume de solution (en mL) x 100

Cette faon est la manire la plus couramment utilise dans ce cours pour exprimer les solutions

en pourcentages.


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MOLARIT

Une autre faon dexprimer une concentration sappelle la molarit. La molarit cest le nombre de moles de solut dissout dans un litre de solution. Les

units sont donc moles par litre, plus prcisment,

cest les moles de solut par litre de solution.

Molarit = moles de solut

litre de solution

Plutt dcrire moles par litre, labrviation M est utilise pour ces units. Alors, quand vous voyez la lettre M cela signifie molarit et reprsente moles par litre (pas seulement moles). Vous

devez faire trs attention de distinguer entre moles et molarit. "Moles" est une mesure de la

quantit que vous avez dune composante; "molarit" mesure la concentration de la composante. Alors quand un problme vous est donn, qui stipule que la concentration dune solution est 0.1 M, ceci veut dire quelle possde 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que cest 0.1 mole.

POIDS/VOLUME

Cette faon dexprimer une concentration est trs semblable celle des pourcentages et reprsente une des faons les plus populaires utilises par les biologistes molculaires. Contrairement au

pourcentage, la concentration est exprime par quelconque volume lutilisateur dsire utiliser. Plus communment, ces concentrations sont exprimes par une unit de mesure. Par exemple, par 1 ml

ou 1 L ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions reprsentent la masse dun solut dans une quantit donne de la solution. Par exemple, une solution qui est une concentration de 1mg/ml

contient 1mg de solut dans 1 ml de solution.

La formulation des dilutions est essentielle dans tous les domaines des sciences ainsi que dans la

vie de tous les jours. Les dilutions servent rduire de faon prcise la concentration d'lments,

soit chimiques ou vivants, se retrouvant en solution. Par exemple, si vous dsirez rduire la

concentration de matires grasses dans du lait de 3.5% 0.35%, vous devrez effectuer une dilution

de facteur 10. La comprhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La

concentration, le facteur de dilution, et la dilution.

La concentration se dfinit comme la quantit d'un compos pour un volume total de solution.

Puisqu'une quantit peut tre exprime de plusieurs faons, les concentrations sont exprimes

comme l'unit de mesure de la quantit du compos/volume total et final.

Ex. Gram/Litre

Molcules/Litre

Moles/Litre

Nombre d'organismes/Litre

Etc.


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Le facteur de dilution reprsente la multiple arithmtique par laquelle une concentration initiale

doit tre divise afin d'obtenir la concentration finale. Par exemple, si une solution contient 30

grammes de cafine par 1L de solution et que vous dsirez rduire la concentration de cafine

0.3 Gramme/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, le facteur de dilution.

Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de dterminer un facteur de dilution.

Le facteur de dilution = Concentration initiale

Concentration finale

La dilution reprsente la fraction du compos tant examin. Par exemple, dans le problme

prcdent, une dilution de 1/100 a t effectue. La dilution est exprime comme une fraction de 1

sur le facteur de dilution.

Afin de correctement prparer des dilutions, vous devez apprendre utiliser les pipettes de faon

approprie. Voici quelques directives gnrales :

Choisir la pipette dont la capacit se rapproche le plus du volume dsirez. Par exemple, pour

faire la mesure de 0.1ml il est prfrable dutiliser une pipette de 1.0 ml plutt quune de 10ml.

Minimiser le nombre de pipetages afin de minimiser les chances de faire des erreurs. Par

exemple, si vous dsirez distribuer 1 ml dans dix prouvettes il est prfrable de pipetter 10ml une

fois et de distribuer 1 ml dix fois plutt que de pipetter 1 ml dix fois et de distribuer 10 fois.

Changer de pipette pour chaque solution diffrente.

Faire des transferts en srie : quand vous faites des transferts en srie telle que pour les dilutions

en srie, il nest pas ncessaire dutiliser plusieurs pipettes. Utiliser les directives suivantes afin de minimiser le nombre de pipettes utilises :

Passer dune concentration plus leve une solution de concentration plus faible : Pipeter le volume dsir de la source puis livrer la nouvelle prouvette ( A dans limage ci-dessous). Rincer la pipette de haut en bas plusieurs fois (dans A dans limage ci-dessous). Pipetter le volume dsir de cette prouvette ( A ) puis livr dans la prochaine prouvette ( B ). Rpter

cette procdure de A B avec la mme pipette.

A B C

So

urc

e

A B C

So

urc

e

Livrer puis rincer la pipette dans cette prouvette avant de faire

la prise du volume dsir de cette nouvelle solution.


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Passer dune concentration moindre une solution de concentration plus leve : dans ce cas-ci le pipetage et plus facile. Utiliser tout simplement la mme pipette pour le transfert du

volume voulu dune solution de concentration moindre une solution de concentration plus leve. Aucun quilibrage ou de rinage nest requis dans ce cas-ci.

Calcul des dilutions en srie

Les dilutions sont essentiellement des fractions et suivent donc les mmes principes arithmtiques.

Ceci tant dit, la dilution (ou la fraction) indique quelle fraction du total est reprsente par le

compos tant dilu.

Ex. Vous dsirez diluer une solution par un facteur de 4. Pour ce faire, la fraction est donc 1/4; c.-

-d. quun quart du volume total doit tre reprsent par la chose tant dilu. Donc, deux fractions qui sont gales, par exemple 2/4 et 4/8 reprsentent les mmes dilutions et facteurs de dilutions.

Prparation des dilutions : Les choses que vous devez dterminer avant de prparer une dilution

sont quel est le volume total final que je dsire, quel est le facteur de dilution dsir et quelle est la

concentration finale que je dsire (si celle-ci est connue).

Par exemple, je dsire avoir un volume final de 50 ml et un facteur de dilution de 4X. La fraction

dsirez est donc 1/4 o le dnominateur reprsente le total. Puisque je dsire un volume final de

50ml, 1/4 du 50 doit tre le compos tant dilu; donc 12.5. Ce que ceci signifie est que 1/4 =

12.5/50. Donc pour prparez cette dilution vous ajouteriez 12.5 ml de la solution tre dilu dans

(50 ml -12.5 ml = 37.5 ml) de solvant.

Si vous connaissez la concentration finale que vous dsirez, vous pouvez utiliser la formule

suivante pour dterminer quel volume de la solution mre de diluer :

Les dilutions en sries sont toutes simplement des dilutions squentielles o la solution mre

utilise pour chaque dilution reprsente la dilution prcdente. La dilution finale pour la srie est

le produit de chacune des dilutions individuelles.

Dil. finale = Dil.1 X Dil. 2 X Dil. 3 etc.

Concentration que vous voulez

Concentration que vous avez

X Le volume final dsir = Le volume de la solution

mre ajouter au mlange


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LES DILUTIONS EN SRIE: PRPARATION POUR LE LABO No2

La semaine prochaine, vous diluerez des chantillons d'eau pour dterminer le nombre de

bactries. Votre matriel initial sera de l'eau d'un cours d'eau navigable que vous devrez diluer par

105X. Celles-ci doivent reprsenter des dilutions de 10X. Rdiger une mthode sur la faon dont

celles-ci doivent tre prpares. Utilisez des schmas et des instructions dtailles qui pourront

tre suivis par tout tudiant.

Matriaux

prouvettes striles

Eau strile

chantillon deau

PRPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS

Pour vous familiariser avec la formulation de divers milieux de croissance, vous devrez prparer

diffrents milieux de croissance qui seront utilisez pour certaines expriences au labo no4.

RECETTES

Milieu dammonium Milieu dessai de fixation dazote Ammonium sulfate 2.0g

MgSO4 4mM

NaCl 0.002g/ml

K2HPO4 7mM

CaCO3 0.5% (m/v)

Microlments 1X

Eau 1L

Glucose 1% (m/v)

CaCl2 5mg/ml

K2HPO4 7mM

MgSO4 4mM

Microlments 1X

Eau 1L

Complter et soumettre le tableau suivant Milieu dammonium

Ingrdient Conc. stock Conc. Finale Quantit

Ammonium Sulfate - 2g/L

MgSO4 20% (m/v) 4mM

NaCl 20% (m/v) 2.0mg/ml

K2HPO4 0.5M 7mM

CaCO3* - 0.5% (m/v)* Eau - - Complter 200 ml

* Ajouter aprs la strilisation

Milieu de fixation dazote

Ingrdient Conc. stock Conc. Finale Quantit

Glucose - 1% (m/v)

CaCl2 10% (m/v) 5mg/ml

K2HPO4 10% (m/v) 7mM MgSO4 1M 4mM

Microlments* 100X 1X

Eau Complter 200 ml *Microlments: 100 X (0.1% FeSO4 + 0.05% Na2MoO4); Ajouter aprs la strilisation


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Jour 2

Complter et soumettre pour la fin de cette priode de laboratoire la

partie I du premier devoir.


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LABO NO 2

INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE

Jour 1

Plusieurs faits doivent tre considrs avant de se lancer dans ltude des microorganismes. Premirement, les microorganismes sont trs petits. Ainsi, moins qu'un trs grand nombre de

cellules (de l'ordre de plusieurs millions) ne soient prsentes dans un petit secteur, les

microorganismes ne peuvent pas tre observs lil nu. Dans leurs milieux naturels, non seulement le nombre de microorganismes est-il relativement bas, mais en outre plusieurs espces

cohabitent habituellement au mme endroit. Par exemple, le bout de vos doigts est probablement

recouvert dau moins dix diffrentes espces microbiennes des niveaux relativement bas (de l'ordre de quelques centaines quelques milliers). De plus, les conditions optimales requises pour

la croissance d'une espce microbienne donne (par exemple les exigences d'alimentation, de

temprature, de pH, etc.) sont extrmement diverses. En tenant compte de ces caractristiques, les

microbiologistes ont dvelopp plusieurs stratgies aptes permettre l'tude des microorganismes.

MILIEUX MICROBIOLOGIQUES

Il est habituellement peu pratique d'tudier un microorganisme dans son environnement naturel.

Par exemple, il serait impensable dexaminer l'effet d'un antibiotique nouvellement dvelopp sur la croissance d'un pathogne bactrien chez ltre humain. En outre, l'effet sur lespce bactrienne vise serait difficile interprter compte tenu de l'htrognit des populations

bactriennes prsentes. Par consquent, des mthodes ont t tablies pour croitre les bactries en

laboratoire en utilisant une varit de milieux de croissances, synthtiques ou non.

Les milieux de croissances sont disponibles sous forme liquide, semi-solide ou solide. Des

milieux de culture semi-solides et solides sont obtenus en ajoutant au milieu de croissances

liquides des agents de solidification. L'agent de solidification le plus commun est lAgar, un polysaccharide driv dune algue. LAgar possde plusieurs proprits avantageuses : 1) il est facilement liqufiable par un chauffage 100C dans une solution aqueuse, 2) sa forme liquide est

maintenue des tempratures aussi basses que 45C, 3) il se solidifie des tempratures en

dessous de 45C et enfin, 4) la plupart des bactries ne le digrent pas. Un autre agent de

solidification est la glatine. Son utilisation est moins commune puisque plusieurs espces

bactriennes la digrent.

Les milieux de culture liquides sont souvent appels "bouillons de culture". Les milieux solides

peuvent tre soit sous la forme de gloses ou de pentes. Tous les milieux de culture doivent

inclure les substances nutritives ncessaires pour la croissance et la survie bactrienne. D'autres

conditions, comme la temprature et la prsence ou l'absence d'oxygne, sont contrles par des

quipements spciaux, comme un incubateur temprature contrle. L'utilisation de conditions

appropries permet au microbiologiste de croitre et de maintenir les espces bactriennes l'tude.


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LA TECHNIQUE ASEPTIQUE

Dans le domaine de la microbiologie, la technique aseptique est une des procdures utilises par

les microbiologistes afin de prvenir la contamination de soi-mme, ce qui pourrait mener une

infection, la contamination de lenvironnement dans lequel ils travaillent et la contamination des matriaux ou des spcimens avec lesquels ils travaillent. Elle est utilise dans tous les cas o un

transfert de cultures ou de milieu microbiologique est impliqu. Lutilisation de la flamme dun bruleur Bunsen est centrale lexcution de cette technique. Vous utiliserez cette technique tout au cours de la session et il est donc important pour vous de la maitriser.

La technique aseptique vous sera dmontre pour lutilisation de la boucle dinoculation, des pipettes et de ltaleur de verre.

INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement)

Les stries peuvent tre faites partir de milieu solide ou liquide, contrairement aux talements qui

sont toujours faits partir dun milieu liquide. Linstrument utilis dans ce cas-ci est la boucle dinoculation, qui est essentiellement un fil de fer utilis pour faire la prise de bactries. Ne pas confondre cet instrument avec laiguille dinoculation qui possde une extrmit droite plutt quune boucle.

Matriaux

Glose dE.coli Une glose TSA

Une pente TSA

Mthode

1. Avant dutiliser la boucle, elle doit tre strilise. Pour ce faire, placer la boucle dans la flamme du bruleur Bunsen jusqua ce quelle devienne rouge. Permettre la boucle de refroidir pour une minute avant de lutiliser. NE PAS LA DPOSER SUR LA TABLE.

2. Une fois refroidie, ramass des bactries de la culture sur glose fournie. Attention de ne pas en ramasser trop.

3. Maintenant, strier la surface dune nouvelle glose telle quillustre 4. Rpter pour inoculer la pente telle quillustre.


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5. Placer vos chantillons lendroit dsign pour quils soient incubs 37oC jusqu' la prochaine priode de labo.

Glos

e

Pente


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INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES (Individuellement)

Faire des stries pour colonies simples est une mthode plus labore de stries utilise pour gnrer

des cultures pures o seulement quun organisme est prsent. Il existe plusieurs mthodes diffrentes pour gnrer des cultures pures. Ces mthodes reposent gnralement sur le principe

de dilutions pour isoler l'organisme dsir de tous les autres. Prenons par exemple une population

de millions d'individus partir de laquelle vous ne voudriez en choisir qu'un seul. Si vous pouviez

diviser la population de telle faon ce qu'il y ait dans un secteur que quelques individus, il vous

serait plus facile de choisir et disoler l'individu qui vous intresse. Comme mentionne ci-dessus, la dilution dune culture htrogne de dpart gnre habituellement des cultures pures. Les stries pour colonies simples permettent daccomplir cela.

La procdure est essentiellement comme suit : initialement, des bactries sont ramasses dun bouillon ou dun milieu solide avec la boucle dinoculation. Les bactries sont ensuite stries sur une rgion de la glose, ainsi l diluant. La boucle et ensuite striliser encore une fois puis utilise

pour strier une nouvelle rgion de la glose en ramassant des bactries de la strie originale, la

diluant donc encore plus. (Voir la figure ci-dessous). Notez : vous devez striliser la boucle

entre chaque srie de stries et vous ne devez pas retourner la source.

Faires des tries de gauche droite pour recouvrir approximativement de la glose.

Restriliser la boucle densemencement et la refroidir en touchant une partie libre de la

glose.

Tourner la glose de 90o. Faire des stries de de la glose en commenant par des stries

qui traverse les stries originales au moins deux fois. Striliser la boucle densemencement

encore une fois.

Rpter une troisime fois.


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Matriaux

Bouillon de culture mixte

Glose dE.coli 2 gloses TSA (Jour 1)

Mthode

1. Telle que prcdemment, laide de la boucle dinoculation strile ramasser un peu de bactries de la culture sur glose fournit et strier la glose TSA comme illustre dans le

premier panneau de la figure sur la page prcdente. SRILISER VOTRE BOUCLE aprs

cette srie de stries initiale.

2. Faire une deuxime srie de stries avec la boucle strile telle quillustre. 3. Rpter autant de fois que possible en vous assurant de striliser la boucle entre chaque srie

de stries pour isoler des colonies simples.

4. Sur une nouvelle glose, rpter la procdure pour lisolation de colonies simples partir de bouillon de culture mixte.

5. Placer les deux isolations pour colonies simples lendroit dsign pour quelles soit incubes 37

oC jusqu' la prochaine priode de labo.


19

TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR CHANTILLONNER

LENVIRONNEMENT Dans l'exercice suivant, vous initierez un projet long terme concernant la biormdiation.

Chaque anne, environ 100 millions de gallons de ptrole sont dverss dans l'environnement.

Heureusement, en plus de l'intervention humaine, l'environnement contient des milliards de micro-

organismes qui travaillent dbarrasser l'eau de cette huile. Ces organismes microscopiques sont

appels bactries olophiles ou microbes qui consomment l'huile (OEM). Ce sont des bactries

qui utilisent normalement des huiles dans l'environnement comme source de nourriture.

Lassainissement est dfini comme un processus utilis pour rendre l'environnement scuritaire par labsorption, la destruction, la neutralisation ou la fabrication de contaminants inoffensifs. Le processus d'utilisation de microbes pour dcomposer les substances dangereuses (telles que le

ptrole) en leurs lments fondamentaux non toxiques est un exemple de biormdiation. Dans les

prochaines semaines, nous allons tenter d'enrichir pour, d'isoler, et partiellement identifier certains

de ces OEM.

LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE (Groupes de 2)

Des techniques microbiologiques de base seront utilises pour poser des questions sur les

bactries prsentes dans un cours d'eau et de dterminer si les rsultats obtenus sont les mmes sur

diffrents milieux.

Matriaux

chantillon d'eau d'un cours d'eau navigable (emplacement indiqu)

Eau strile

Tubes striles

PRPARATION DE VOS DILUTIONS

Mthode (voir la mthode labore la semaine dernire)

1. Utiliser un maximum de 0,5 ml de votre chantillon d'eau pour prparer une srie de dilutions de facteurs 10 jusqu' un facteur de dilution finale de 10

5 X.

METTRE DES BACTRIES SUR GLOSE : TALEMENT

Contrairement aux stries, ltalement est seulement utilis avec des liquides. Il permet de rpandre les bactries de faon gale sur la surface dune glose. Par contre, contrairement aux stries, cette mthode ne permet pas des dilutions dtre faites sur la glose elle-mme. Donc, si des dilutions sont requises, celles-ci doivent tre faites au pralable. Linstrument utilis est un taleur de verre communment appel bton de hockey . Tout comme avec la boucle, ltaleur doit tre strilis pralablement chaque utilisation.

Bton de

hockey


20

o STRILISATION DE LTALEUR Afin de striliser ltaleur, ce dernier est tremp dans lthanol, allum, puis on laisse bruler lthanol. Ne pas garder ltaleur dans la flamme, car il deviendra trop chaud! On permet ensuite ltaleur de refroidir, puis il est utilis pour taler lchantillon de bactries sur la surface de la glose.

Matriaux

Dilutions deau prpares prcdemment 6 Gloses TSA (Groupes pairs)

6 Gloses TSA + 0.1% glycrol (Groupes impairs)

Mthode

1. tiqueter de faon approprie 6 gloses TSA. 2. Transfrer et taler 0.1ml de chacune de vos dilutions, incluant lchantillon non dilu, aux

gloses correspondantes. 3. Amener toutes vos gloses lendroit dsign pour quelles soient incubes 28oC jusqu' la

prochaine priode de labo. Incuber vos gloses dans lorientation inverse.

thanol

Tremper ltaleur

dans lthanol Allumer lthanol taler les bactries Permettre lthanol

de bruler


21

ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMDIATION

Matriaux

chantillon deau dune voie navigable Engrais pour plantes

Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de mas (Gr. 5-8), huile darachides (Gr. 9-12), et huile diesel (Gr.13-16)

Flacon de 250ml

1% (m/v) Solution de chlorure de triphenyltetrazolium (TTC)

Mthode

1. Ajouter 50 ml de lchantillon deau dune voie navigable au flacon de 250ml. 2. Ajouter de lengrais de plantes pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v). 3. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0.01% (m/v). 4. Ajouter approximativement 10ml de lhuile assigne au flacon. La quantit exacte nest pas

importante, mais vous dsirez avoir une quantit qui est suffisante afin dobtenir une fine couche dhuile qui recouvre la surface.

5. tiqueter de faon approprie votre flacon avec votre numro de groupe, votre section et le type dhuile.

6. Faire et enregistrer vos observations quant lapparence du mlange. Soyez aussi dtaill que possible.

7. Amener le flacon lendroit dsign pour quil puisse tre incub avec agitation la temprature de la pice (groupes pairs) ou 4

0C (groupes impairs).

8. Faire les taches suivantes daprs cet horaire dans les semaines suivantes.

Labo 3 25 & 27 sept. Retirer 1ml et faire un entreposage long terme

Labo 4 2 & 4 oct. Retirer 1ml et faire un entreposage long terme.

Inoculer nouveau milieu avec chantillon de 10ml

Labo 5 16 & 18 oct. Retirer 1ml et faire un entreposage long terme

Labo 6 30 oct. & 1 mai Retirer 1ml et faire un entreposage long terme

Labo 7 6 & 8 nov.

faire des comptes viables sur tous les chantillons incluant celui prlev cette semaine

Choisir et strier pour colonies simples le type de colonie prdominant obtenu lors du dernier

prlvement

Faire une coloration de Gram sur le type de colonie prdominant obtenu lors du dernier prlvement

Soumettre une proposition des tests a faire pour lidentification du genre

Labo 8 13 & 15 nov.

Faire une deuxime coloration de Gram sur lisolation de colonies simples

Faire un deuxime striage pour colonies simples

Prparer des cultures en bouillon partir du deuxime striage pour colonies simples

Labo 9 20 & 22 nov. Faire les tests proposs pour lidentification du genre


22

Jour 2

STRIES POUR COLONIES SIMPLES

1. Obtenir et examiner vos gloses sur lesquelles vous avez fait vos stries pour colonies simples. Avez-vous obtenu des colonies isoles?

2. Demander un aide enseignant dvaluer vos stries pour colonies simples. 3. Comparer vos stries pour colonies simples aux stries rgulires et vos pentes.

VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE

Lidentification prliminaire des microorganismes peut tre fonde sur la morphologie coloniale. Chaque colonie simple reprsente une population de cellules bactriennes originaire d'une seule et

unique cellule qui, aprs de multiples cycles de division cellulaire, a gnr une colonie de

cellules sempilant les unes sur les autres selon une forme caractristique au type bactrien (tout comme un amas de bananes a une apparence diffrente dun amas de pommes de terre). La morphologie d'une colonie bactrienne est une fonction de plusieurs facteurs tels que la forme de

la cellule, sa taille et sa physiologie. Il est aussi important de noter que les colonies d'un type

bactrien donn ont souvent des couleurs, des textures et des odeurs distinctes.

Aprs une priode d'incubation approprie de vos comptes viables, vous devriez pouvoir voir des

colonies typiques de bactries. Remarquez la grande varit de couleurs, de formes et de textures

qu'assument les colonies de diffrentes espces. Rfrez-vous la figure ci-dessous pour

distinguer les morphologies des colonies observes. Ceci vous permettra d'obtenir une estimation

prliminaire du nombre d'espces qui se retrouvaient dans vos chantillons.

lvation

Convexe Bomb leve Bossue Cratre

Forme

Circulaire Irrgulire Filamenteuse Rhizode


23

DNOMBRER LES BACTRIES

Le but de cet exercice tait d'utiliser des techniques microbiologiques de base pour rpondre aux

questions suivantes:

Combien de bactries et d'espces diffrentes est-ce quil y a dans la voie navigable? Est-ce que les rsultats obtenus sont les mmes sur diffrents milieux?

cet effet, obtenir vos talements deau et compter le nombre de bactries obtenues. Choisissez la dilution la plus approprie (pas trop ou trop peu de colonies, idalement environ 100 - 300).

Enregistrez vos comptes de colonies et enregistrer les sur le chiffrier Excel l'ordinateur au

podium. Vous aurez besoin des donnes de toute la classe pour votre devoir.

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2)

Les cellules microbiennes sont incolores et donc difficiles visualiser. Donc, plusieurs mthodes

de colorations ont t dveloppes pour visualiser et classifier les microorganismes. Les types de

colorations sont gnralement classifis comme simples ou diffrentiels. Dans le cas des

colorations simples, un seul colorant non spcifique et non discriminatoire, tel que le bleu de

mthylne, est utilis afin dexaminer les morphologies et les agrgations cellulaires bactriennes au microscope. (Voir la figure sur la page 26)

Matriaux

Lames de microscope

Pipettes Pasteurs

chantillons environnementaux

Colorants

Mthode

1. Prparer des frottis de trois diffrentes colonies de votre chantillonnage environnemental. Utiliser une boucle densemencement strile pour transfrer des bactries (TRS PEU) une goutte deau dpose sur une lame de microscope.

2. Suspendre les bactries dans la goutte deau et taler sur une petite surface de la lame. 3. Laisser les frottis sasscher compltement lair sur votre table de travail.


24

4. Fixer vos frottis bactriens la chaleur en les passants rapidement dans la flamme du brleur Bunsen. Ne chauffez pas trop vos lames!! Les bactries brles ne se colorent pas bien.

5. Assembler votre station de coloration comme suit : Tapis de papier absorbant (ct plastique en dessous)

Contenant pour la coloration ( Gladware )

6. Dposer vos lames au-dessus des ouvertures du contenant Gladware . Ajouter une goutte dun des colorants suivants chacun de vos frottis.

Bleu de mthylne

Cristal violet

Safranine

7. Laisser le colorant sur les frottis pour approximativement 30 secondes. 8. Rincer lexcdant du colorant avec de l'eau distille. 9. Asscher en tamponnant la lame entre les couches de papier absorbant. 10. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegarder.

Jetez vos solutions des colorations dans les tonneaux fournis cet effet.

NE PAS DVERSER LES COLORANTS DANS LES VIERS

Prsentation PowerPoint

1. Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo de la prsentation doit inclure un titre, les noms de tous les membres du groupe, le numro du

groupe et la date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :

2. Un exemple de chacune des colorations simples avec les diffrents colorants incluant les informations suivantes (3 images)

Type de coloration et le colorant utilis

Morphologie cellulaire

Agrgation cellulaire

Grossissement


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MORPHOLOGIES CELLULAIRES

Neisseria

Micrococci Micrococci


26

LABO NO 3

DNOMBRER LES BACTRIES

Jour 1

Il existe plusieurs faons dobtenir une estime du nombre de bactries dans un environnement donn. Parmi la plus commune est le compte viable que vous avez vu la semaine passe. Le

compte viable dtermine le nombre de bactries vivantes dans un chantillon. Cette mthode

ncessite la croissance des bactries sur un milieu appropri jusqu l'obtention de colonies simples. Puisqu'on prsume quune colonie simple est le fruit d'une cellule unique, le nombre de colonies reprsente le nombre de bactries viables prsentes dans l'chantillon. De plus, suite

leurs croissances, le chercheur peut valuer le nombre de diffrentes espces prsentes daprs les diffrentes morphologies observes. Il existe plusieurs variantes des comptes viables. Un des

critres qui dicte le choix de la mthode est la source de lchantillon. Par exemple, est-ce que vous dsirez chantillonner une surface, un chantillon solide, ou un chantillon liquide?

COMPTES VIABLES (Groupes de 2)

Matriaux

Bouillon de culture dE.coli 6 prouvettes de 10ml

100 ml de saline physiologique (0.9% m/v)

16 gloses TSA

Mthode

1. Prparer des dilutions en srie dans de la saline physiologique (SP) de la culture dE.coli telle quillustre ci-dessous :

2. taler 0.1ml de chacune des dilutions (10-2-10-9) sur des gloses TSA tiquetes de faon approprie.

3. Rpter ltape 1 sur un deuxime jeu de gloses. 4. Placer vos gloses dans le sac fourni cet effet. Fermer le sac avec du papier collant sur

lequel est indiqu votre nom et numro de groupe.

5. Incuber les gloses 28oC.

2

H2O

Cu

ltu

re

mic

rob

ien

ne

0.1mL

4.5

mL

TS

B

9.9

mL

SP

0.1mL

9.9

mL

SP

9.9

mL

SP

0.1mL

9.0

mL

SP

1.0mL 1.0mL 9.0

mL

SP

9.0

mL

SP

1.0mL


27

LES COMPTES LES PLUS PROBABLES (Groupes de 2)

Une variante des comptes viables dpend de la probabilit pour dterminer le nombre de bactries

dans un chantillon. Comme les comptes viables, cette mthode ncessite la croissance dans un

milieu appropri. Mais, contrairement aux comptes viables, la dtection est fonde sur la prsence

ou labsence de croissance ou la production dun sous-produit.

Matriaux

chantillon deau dune voie navigable Eau strile

18 X 5 ml de bouillon TSB

3 prouvettes striles

Mthode

1. Prparer les dilutions suivantes de votre chantillon deau dune voie navigable dans un volume final de 10ml deau : 10-2, 10-4 and 10-6.

2. tiqueter 6 jeux de 3 tubes contenant 5ml de TSB 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6. 3. Transfrer 0.1ml de lchantillon deau non dilu aux trois bouillons TSB tiquets 10-1. 4. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB tiquets 10-2. 5. Transfrer 0.1ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB tiquets 10-3. 6. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB tiquets 10-4. 7. Transfrer 0.1ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB tiquets 10-5. 8. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-6) aux trois bouillons TSB tiquets 10-6. 9. Incuber vos tubes 28oC.


28

Y

Y

COMPTES DIRECTS (Groupes de 2)

Comme le nom lindique, un compte direct implique lnumration directe du nombre de microorganismes prsents dans un chantillon, sans avoir les faire crotre a priori. Il est

important de noter qu'un compte direct ne permet pas de distinguer les microorganismes vivants

de ceux qui sont morts.

Pour obtenir une estimation rapide et prcise du nombre de cellules dans un chantillon donn, on

peut faire un compte direct. Ceci est accompli en utilisant une lame spciale possdant une cavit

laquelle un volume de liquide connu peut tre appliqu. La cellule de comptage d'une lame

dhemacytomtre standard possde deux cellules de comptage identiques burines dans le verre, qui sont constitues de neuf carrs aux dimensions de 1 mm

2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la

figure). Lorsque la lame d'hemacytomtre est recouverte d'une lamelle, l'espace libre disponible

est dune profondeur de 0.1 mm. Le volume de chaque carr est donc de 0.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'chantillon dnombrer est appliqu, les cellules sont visualises et numres. Les

cellules dans chacun de trois carrs de tailles moyennes sont comptes. La moyenne est ensuite

calcule et le nombre total de cellules dans l'chantillon original est dtermin.

Exemple de calcul:

Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrs indpendants, l'on a une moyenne de 10

bactries par carr. Ce nombre quivaut avoir

10 bactries/0.1 mm3 ou 10 bactries/0.0001 cm3 ou 10 bactries /0.0001 ml

La concentration totale de bactries dans l'chantillon examin est donc de 1 X 105/ml.

Hmacytomtre


29

Matriaux

Suspension de levure

Lame dhmacytomtre Eau strile

Tubes

Pipettes Pasteurs

Mthode

1. Prparer les dilutions suivantes de la suspension de levure : 10-1, 10-2, et 10-3. Assurez-vous de bien mlanger la suspension avant de faire vos prlvements.

2. Remplir la cellule de comptage de la lame dhmacytomtre avec un chantillon de la dilution la plus leve (voir limage ci-dessous ou demander un aide enseignant de vous le dmontrer). Assurez-vous de bien mlanger la suspension avant de faire vos

prlvements.

3. Compter le nombre de cellules dans chacun de trois carrs de la taille indiqu par un Y dans limage sur la page prcdente.

4. Si le nombre de cellules est trop petit, recommencer avec la dilution prcdente. Si le nombre de cellules est trop lev, prparer une dilution plus leve dun facteur de 10.

5. Enregistrer les donnes suivantes sur le fichier Excel au podium lavant :

Groupe Dilution No de cellules Dimensions du carr N

o de cellules/ml original


30

Jour 2 COMPTES VIABLE

1. Obtenir vos gloses sur lesquelles vous avez fait ltalement de vos dilutions dE.coli. 2. Compter le nombre de colonies sur les gloses qui possdent entre 30-300 colonies. 3. Rpter ltape 2 avec votre deuxime jeu de gloses.

COMPTE LES PLUS PROBABLES

Afin de comprendre la thorie du nombre le plus probable (NPP), pensez des dilutions en srie

de facteurs 10 qui sont faites avec des chantillons de 1ml de chaque dilution inocul dans

diffrents tubes qui contiennent un milieu donn.

Aprs lincubation, les bouillons sont observs pour la prsence ou labsence de croissance. Thoriquement, si au moins un organisme tait prsent dans nimporte lequel des inocula, une croissance visible devrait tre observe pour ce tube. Si le bouillon inocul partir de la dilution

10-3

dmontre de la croissance, mais que le bouillon inocul partir de la dilution 10-4

nen dmontre pas, il est donc possible de dire quil y avait plus de 1X103 organismes par ml de lchantillon original, mais moins que 1X104 par ml.

Les bactries ne sont que rarement, ou mme jamais, distribues de faon uniforme dans un

chantillon. Par exemple, si un chantillon de 10ml contient un total de 300 organismes, pas toutes

les aliquotes de 1 ml contiendront 30 organismes; certains contiendront plus ou moins de 30

organismes, mais en moyenne tous les dix aliquotes dans lchantillon entier de 10ml sera 30. Ceci est tout aussi vrai pour nimporte lesquelles des dilutions desquelles des inocula sont pris.

Pour augmenter la prcision statistique de ce type de test, plus dun bouillon est inocul pour chaque dilution. Le NPP standard utilise un minimum de 3 dilutions et 3, 5 ou 10 tubes par

dilution. Aprs lincubation, le patron de tubes positifs et ngatifs est not, puis un tableau de NPP standardise est consult afin de dterminer le nombre le plus probable dorganismes (qui causent les rsultats positifs) par unit de volume de lchantillon original.

Dans lexemple suivant, un jeu de 3 tubes de bouillons est inocul avec 1 ml partir de chacune des dilutions de facteur 10.

Aprs lincubation, le nombre de tubes qui dmontre de la croissance est enregistr. un certain point, les dilutions sont si leves, quaucun organisme ne se retrouvait dans linoculum


31

(enregistr comme ngatif). Afin destimer le nombre dorganismes par ml dchantillon qui serait responsable du patron de croissance observe, les observations faites dans une srie de trois

dilutions successive sont utilises daprs les critres suivants :

Cas 1. Une ou plusieurs des dilutions dmontrent toutes des tubes ngatifs; une extinction est

observe. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilu) qui donne des rsultats ngatifs

dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4

dans lexemple ci-dessus). Vrifier que les prochains jeux de dilutions aprs la srie choisie (10

-4 dans lexemple ci-dessus), dmontre tous une

extinction (0 de 3).Choisir les trois jeux de dilutions prcdente (10-1

, 10-2

et 10-3 dans lexemple

ci-dessus). (Tableau: ex. a et b).

Cas 2. Une extinction nest pas observe dans toutes les prochaines sries de dilutions qui nont pas t choisies. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilu) qui donne des rsultats ngatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10

-4 dans lexemple ci-dessus). Vrifier

que les prochains jeux de dilutions aprs la srie choisie (10-4

dans lexemple ci-dessus), dmontre tous une extinction (0 de 3). Choisir les trois jeux de dilutions prcdentes (10

-1, 10

-2 et 10

-3 dans

lexemple ci-dessus). Si une extinction nest pas observe dans le prochain jeu de dilutions non slectionn (c.--d. Il y a encore des tubes positifs dans les dilutions plus leves non choisies)

additionner les rsultats positifs de ces dilutions plus leves aux rsultats pour le jeu de dilutions

le plus lev choisis (ex. c).

Cas 3. Les dilutions ntaient pas suffisamment leves pour dmontrer une extinction. Si le nombre de dilutions testes ntait pas suffisamment lev pour pouvoir choisir trios dilutions aprs lesquelles une extinction est observe, alors choisir les trois dilutions les plus leves (ex.

d).

Cas 4. Aucune des dilutions ne dmontre toute des tubes positifs. Choisir les trois dilutions

les plus faibles (moins dilu; ex. f). Si des rsultats positifs sont observs dans les dilutions plus

leves qui nont pas t choisies, additionnez ces rsultats positifs de ces dilutions plus leves aux rsultats de la dilution la plus leve choisie (ex. e).


32

Tableau

Exemple 100 10

-1 10

-2 10

-3 10

-4

Combinaison

de positifs NPP/ml

a 3 3 1 0 0 3-1-0 4.6

b 2 3 1 0 0 3-1-0 0.36

c 3 2 2 0 1 3-2-3 2.9

d 3 3 3 3 2 3-3-2 11

e 0 0 1 0 0 0-0-1 0.03

f 2 2 1 1 0 2-2-2 0.35

Une fois quun jeu appropri de dilutions a t choisi, les rsultats de ces trios jeux sont utiliss pour dterminer le NPP dans le deuxime jeu de tubes partir du tableau de NPP standard sur la

prochaine page.

noter:

Des quantits autres quun millilitre peuvent tre inocules. Par exemple, une inoculation de 0.1 ml dune dilution de 103 est quivalente une inoculation de 1 ml dune dilution de 10

4.

La quantit de milieux dans le tube na aucune importance puisque la mme croissance serait observe dans tous les cas.


33

Tableau de NPP trois tubes N

o de tubes positifs

dans: NPP de linoculum du 2

e jeu de tubes

No de tubes positifs

dans: NPP de linoculum du 2

e jeu de tubes 1er

Jeu

2e

Jeu

3e

Jeu

1er

Jeu

2e

Jeu

3e

Jeu

0 0 0 24

Vos Rsultats:

o Enregistrer vos rsultats pour vos NPP:

Groupe 10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Combinaison

de positifs NPP/ml


34

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM (Groupe de 2)

Prcdemment, vous avez fait des colorations simples qui vous ont permis de comparer les tailles,

les formes et les agrgations cellulaires. Plusieurs autres mthodes de colorations ont t

dveloppes qui se disent diffrentielles. Ces mthodes colorent les bactries de faon

diffrentielle en fonction de diffrentes proprits de la cellule.

Le docteur Christian Gram a dvelopp une technique de coloration diffrentielle, la coloration de

Gram. La coloration de Gram permet non seulement d'observer la forme et la taille des bactries,

mais aussi de les classifier dans un de deux groupes: Gram positif ou Gram ngatif.

La technique de coloration de Gram utilise quatre composs chimiques: Le violet de cristal, un

colorant primaire qui teint bleu toutes les cellules sans distinction, L'iode de Gram, qui sassocie avec le colorant primaire agissant comme un mordant, Lthanol, qui cause la dshydratation des parois cellulaires et le Safran, un colorant qui teint rouge toutes les cellules sans distinction.

Lajout squentiel de ces 4 composs aura pour effet de colorer en mauve (Gram positif) ou en rouge (Gram ngatif) les bactries, selon leur espce.

Le potentiel diffrentiel de la coloration de Gram est une fonction de la composition des parois

cellulaires des bactries. Typiquement, les bactries Gram positives possdent des parois

cellulaires trs paisses, composes de 10-20 couches de peptidoglycanes contenant trs peu de

lipides. Les bactries Gram ngatives ont plutt des parois cellulaires relativement minces

constitues de 1-3 couches de peptidoglycanes avec un contenu lev de lipides. Ltape critique dans la technique de coloration de Gram, qui lui confre ses proprits discriminatoires, est le

rinage l'thanol. Dans le cas dorganismes Gram positifs, la paroi des cellules est trs facilement dshydrate en raison de son faible contenu de lipides: ces cellules ont tendance

conserver le complexe d'iode de Gram/violet de cristal. Par contre, la paroi des organismes Gram

ngatifs nest pas facilement dshydrate par l'thanol en raison de sa haute teneur en lipides, ce qui lui permet de conserver une grande permabilit. Ainsi, le traitement l'thanol russit laver

efficacement les complexes d'iode de Gram/violet de cristal, rendant les cellules incolores. Ces

cellules deviennent donc rouge suite leurs contre coloration avec le Safran.


35

Matriaux

Lames de microscope

Culture en bouillon de S. aureus et dE. coli NPP des chantillons deau Colorants

Mthode

1. Prparer des frottis fixs la chaleur de chacun des bouillons de culture fournis. 2. Prparer des frottis fixs la chaleur de la dilution la plus leve et de la dilution la plus

faible de lessai de NPP qui a dmontr de la croissance. 3. Colorer avec le violet de cristal pour une minute. 4. Laver soigneusement lexcdant du colorant avec de leau distille. 5. Appliquer l'iode de Gram pour une minute. 6. Laver soigneusement lexcdant diode de Gram avec de l'eau distille. 7. Laver soigneusement lthanol 95% en appliquant le solvant goutte goutte jusqu ce que

lafflux dalcool soit incolore. 8. Laver lexcdant d'thanol avec de l'eau distille. 9. Contre-colorer avec le Safran durant 45 secondes. 10. Laver lexcdant de colorant avec de leau distille. 11. Asscher la lame l'aide de papier bilbueu. 12. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegard.


36

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RSISTANTE (Groupe

de 2)

La coloration acido-rsistante est une autre procdure de coloration spcialise. Cette technique

est particulirement utile pour colorer des bactries ayant des constituants semblables de la cire

dans leurs parois cellulaires. Les microbes de ce type incluent plusieurs pathognes de ltre humain, comme les Mycobacteriaceae dont certains membres causent la tuberculose et la lpre.

La haute teneur en acide mycoque, une composante semblable la cire, des parois cellulaires des

les rend littralement impermables aux colorants. Cependant, une fois que le colorant a pntr,

il ne peut pas tre facilement retir par des dcolorants tels que lthanol. Le principe de la technique est de rendre les bactries permables au colorant et ensuite de vrifier leur rsistance

une dcoloration ardue. Ces objectifs sont atteints en employant la fuchsine de carbol comme

colorant primaire. Ce compos, tant miscible dans les lipides, pntre facilement la couche

cireuse des Mycobactries. De par leur couche cireuse, les bactries rsistent au dur traitement de

dcoloration subsquent effectu avec de l'alcool acide.

Matriaux

Lames de microscope

Culture sur pentes de B. subtilis et de M. smegmantis

Carbol Fuschine de Kinyoun

Alcool acide

Mthode

1. Prparer un frottis fix la chaleur de chacune des cultures bactriennes. 2. Inonder les frottis avec fuchsine de carbol pour 5 minutes. 3. Rincer avec de leau distille. 4. Dcolorer avec de lalcool acide jusqu' ce quil ny a pu de colorant. 5. Rincer avec de leau distille. 6. Contre colorer avec du bleu de mthylne pour 30 secondes. 7. Rincer le colorant avec de l'eau distille. 8. Asscher la lame l'aide de papier bilbueu. 9. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegard.


37

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES

Les cellules d'espces bactriennes appartenant aux genres Bacillus et Clostridium peuvent

prendre la forme de cellules vgtatives qui sont mtaboliquement actives ou la forme de spores

qui sont mtaboliquement inactives. Les spores reprsentent une forme cellulaire dormante qui

possde un grand niveau de rsistance des conditions environnementales extrmes telles que la

chaleur et la scheresse. Quand les conditions environnementales deviennent dfavorables la

poursuite de la croissance des cellules vgtatives, celles-ci initient la sporogense pour gnrer

une nouvelle structure intracellulaire, lendospore. Lendospore, telle que la semence dune plante, est recouverte de plusieurs couches successives qui lui confrent une grande rsistance.

ventuellement, lendospore est relche comme entit indpendante de la cellule vgtative, sous la forme dune spore. Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables la croissance, les spores germent et reprennent la forme de cellules vgtatives.

La rsilience des spores les rend rsistantes aux mthodes de coloration standard, ce qui ncessite

l'utilisation d'une mthode de coloration spcialise. En bref, la coloration des spores se fait de la

faon suivante. Les cellules sont traites avec un colorant primaire, le vert de malachite. Comme

les spores sont impermables, le colorant est appliqu en chauffant le frottis, de faon augmenter

la permabilit des spores. Suite cette tape, la cellule vgtative et la spore sont colores en

vert. Le frottis est ensuite rinc leau pour enlever lexcdant de colorant. Le vert de malachite ayant peu daffinit pour la cellule, les cellules vgtatives sont aisment dcolores alors que les spores demeurent vertes. Finalement, le frottis est contre-color avec le Safran, lequel ne colore

pas les spores, mais par contre, colore les cellules en rouge.

Voir la lame de dmonstration 1. Prparer des frottis fixs la chaleur. 2. Inonder les frottis avec le vert de malachite. 3. Faire bouillir sur la flamme du brleur de Bunsen pendant cinq minutes. Assurez-vous que le

colorant ne s'assche pas. Ajouter du colorant au besoin.

4. Rincer le frottis l'eau distille. 5. Contre-colorer avec le rouge de safran. 6. Rincer l'eau distille, puis asscher. 7. Examiner au microscope.


38


Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo de la prsentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numro du groupe

et la date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :

Une coloration de Gram de chacune des cultures en bouillon fourni. (2 images)

Une coloration de Gram partir des NPP (2 images)

Une coloration acido-rsistante de Mycobacterium smegmantis et de B. subtilis (2 images)

Chacune des images doit tre accompagne dune lgende approprie qui inclut linformation suivante :

o Genre et espce bactrienne (si connue) ou la source o Type de coloration utilis o Morphologie cellulaire o Agrgation cellulaire o Grossissement

Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit tre sauvegard sur le disque K:\

dans un fichier nomm comme suit : Colorations_Groupe (votre numro de groupe)

BIOREMDIATION (Partie 2)

Matriaux

Flacon de Bioremdiation

Glycrol

Tube capuchon bouton-pression

Mthode

1. Enregistrer toute observation en ce qui trait lapparence de votre culture de bioremdiation.

2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v). 4. Mlanger la culture au vortex pour vous assurez que le glycrol et bien dispers 5. tiqueter de faon approprie avec votre numro de groupe et la date.

6. Congeler 20 C pour un entreposage long terme.


39

LABO NO 4

LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTRIES DU SOL

Jour 1

Il existe plusieurs types de milieux microbiologiques, qui se classent comme tant complexe

dfini, diffrentiel ou slectif. Les milieux dfinis sont trs varis et diffrent beaucoup dans leurs

compositions. Ils peuvent contenir trs peu ou beaucoup dingrdients. Leur particularit est que la composition exacte du milieu et tous les ingrdients qui les composent sont connus. Par contre,

les milieux complexes sont crs partir dingrdients dont la composition exacte est inconnue; par exemple un milieu fait dextraits de buf. Dans les deux cas, ces milieux peuvent tre rendus soit diffrentiels ou slectifs. Les milieux diffrentiels possdent des composs qui permettent de

distinguer visuellement, habituellement par des changements de couleur, diffrents mtabolismes

bactriens. Par contre, les milieux dits slectifs contiennent des composs qui prviennent la

croissance de certains microorganismes.

La source de carbone et le mtabolisme par lequel celui-ci est utilis sont trs varis parmi

diffrentes bactries. En prsence de plus d'une source de carbones et de diffrentes conditions

environnementales, les bactries font des choix, d'aprs leurs capacits et leurs prfrences, du

type de mtabolisme utilis. Certaines bactries utilisent exclusivement un mtabolisme oxydatif,

qui require un capteur d'lectrons final inorganique, tel que l'oxygne. D'autres utilisent un

mtabolisme fermentatif qui require un capteur final organique.

Diffrents milieux de croissance diffrentiels ont t conus afin d'valuer le type de mtabolisme

utilis. Ces derniers incluent habituellement un indicateur de pH qui change de couleur en

fonction des sous-produits gnrs partir du mtabolisme et de la source de carbone utilise.

Gnralement, la prsence d'acide indique le mtabolisme d'un sucre par un mode oxydatif ou de

fermentation. Par contre, l'accumulation de sous-produits alcalins indique le catabolisme de

protines par un mode oxydatif.


40

BACTRIES DU SOL

Les bactries reprsentent les microorganismes les plus abondants dans les sols. Leurs nombres

peuvent atteindre 1 X 108 par g de sol. Elles peuvent tre gnralement classifies parmi les

catgories suivantes:

Les dcomposeurs : Ces bactries ont un rle important dans la dcomposition de matires

organiques. Les bactries du genre Bacillus et Pseudomonas sont des exemples de dcomposeurs.

Puisque la majorit des composs organiques initialement prsents dans les sols reprsente des

polymres complexes tels la cellulose ou l'amidon, plusieurs de ces bactries ont la capacit de

scrter dans leurs environnements des enzymes exocellulaires qui peuvent dgrader ces

polymres en unit plus facilement digrs.

Bactries qui fixent l'azote : Parmi ce type de bactries sont les Rhizobiums qui peuvent tablir

des relations symbiotiques avec les racines des plantes. Ces bactries font l'extraction de l'azote

gazeux de l'atmosphre qu'ils convertissent en une forme utilisable par les plantes. D'autres genres

bactriens, tels quAzotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Gluconobacter, Flavobacterium et Herbaspirillum fixent eux aussi l'azote, mais sont non symbiotiques.

Bactries nitrifiantes : Ces bactries changent l'ammonium (NH4+) au nitrite (NO2

-) et ensuite au

nitrate (NO3-) une source d'azote qui est prfre par la majorit des plantes.

Bactries dnitrifiantes: Ces bactries convertissent le nitrate l'azote gazeux. Celles-ci sont des

bactries qui vivent en absence d'oxygne; des anarobies.

Arobies et anarobies : La disponibilit d'oxygne tant trs variable dans les sols, les

exigences parmi les bactries et trs diverses. L'oxygne peut tre employ par quelques

organismes, tels que les tres humains et quelques espces bactriennes, comme capteur final

dlectrons dans la respiration en arobie. En ce qui trait leurs exigences, les bactries peuvent tre places dans des classes diffrentes daprs leurs capacits dutiliser l'oxygne comme capteur final dlectrons et leurs capacits de crotre en prsence d'oxygne.

Arobie strict Le besoin doxygne est absolu pour survivre.

Anarobie facultatif Le besoin d'oxygne est facultatif, mais la croissance en sa prsence est

optimale.

Anarobie Nutilise pas l'oxygne pour la croissance, mais peuvent crotre en sa prsence.

Anarobie strict Nutilisent pas loxygne pour la croissance et ne peuvent crotre en sa prsence.

La prsence ou labsence doxygne molculaire peut tre un facteur qui dterminera si une espce bactrienne peut crotre.

Arobie

strict

Anarobie

Facultatif

Anarobie Anarobie strict

Croissance en prsence dO2 + + + -

Croissance sans O2 - + + +

Capteur e final : O2 + + - -


41

LES BACTRIES DANS DU COMPOST (Groupe de 2)

Prparation de l'chantillon

Matriaux

Composte ( ct de la balance)

Bouteille de 250 ml qui contient 90 ml d'eau strile

Tube Falcon strile de 50 ml.

6 prouvettes striles

Eau strile

Mthode

1. Faire la pese d'un gramme de compost. 2. Ajouter le composte la bouteille d'eau strile. (Notez; ceci reprsente une dilution de 10-2). 3. Mlanger vigoureusement pour 1-2 minutes. 4. Laisser reposer pour 5 minutes sur votre table, puis rpter l'tape 3 une fois de plus. 5. Laisser reposer pour 10 minutes sur votre table. 6. Prudemment dverser approx. 20-30 ml du surnageant un tube Falcon strile de 50 ml.

viter autant que possible de rcolter du sdiment.

7. Prparer une srie de dilution dans 10 ml d'eau strile reprsentant les facteurs de dilutions suivantes 10

2X, 10

3X, 10

4X, 10

5X et 10

6X.

COMPTE DE BACTRIES AROBIES HTROTROPHES (Groupes pairs)

Matriaux

Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent

5 gloses TSA + 0.1% glycrol

Mthode

1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses TSA + 0.1% glycrol tiquetes de faon approprie.

2. Incuber 28oC.

COMPTE DE BACTRIES ANAROBIES HTROTROPHES (Groupes impairs)

Matriaux


5 gloses TSA + 0.1% glycrol

Mthode

1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses TSA + 0.1% glycrol tiquetes de faon approprie.

2. Incuber dans la cuve d'anarobie 28oC.


42

COMPTE DE BACTRIES GRAM NGATIVES ET POSITIVES

Afin d'obtenir une estimation de la distribution de bactries Gram ngatives et positives dans le

sol, nous utiliserons des milieux diffrentiels et slectifs; l'Agar de MacConkey et l'Agar CNA de

Colombie

L'Agar MacConkey est un milieu slectif et diffrentiel qui contient du lactose et des protines

en tant que sources de carbones potentielles. La slectivit de ce milieu est attribuable l'ajout du

cristal violet qui inhibe la croissance d'organisme Gram positif et des levures. L'aspect diffrentiel

du milieu permet de distinguer la fermentation du lactose par l'inclusion d'un indicateur de pH.

Les bactries qui fermentent le lactose sont rose, tandis que les non-fermenteurs sont incolores.

L'Agar CNA de Colombie est un milieu riche qui contient une combinaison de peptones

(peptides protiques) obtenues de tissus animaux et d'extrait de buf. De l'extrait de levure est inclus comme source des vitamines B. L'inclusion de l'acide nalidixique et du colistin rend ce

milieu slectif pour les bactries Gram positives. L'acide nalidixique bloque la rplication de

l'ADN tandis que le colistin perturbe la membrane plasmique d'organismes Gram ngatifs.

Matriaux


5 gloses MacConkey (Groupes pairs)

5 Glose CNA de Colombie (Groupes impairs)

Mthode (Groupes pairs)

1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 10-6) du compost sur des gloses de MacConkey tiquetes de faon approprie.

2. Incuber 28oC.

Mthode (Groupes impairs)

1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 10-6) du compost sur des gloses de CNA de Colombie tiquetes de faon approprie.

2. Incuber 28oC.


43

CYCLE DE L'AZOTE

Le cycle de l'azote implique cinq procds -- la fixation, l'absorption, la minralisation, la

nitrification, et la dnitrification -- qui sont tous entrains par des microorganismes.

La fixation (N2 NH4+) est un procd par lequel le N2 est converti en ammonium; compos

essentiel, car c'est la seule faon que les organismes peuvent obtenir d'azote directement de

l'atmosphre.

L'absorption de l'azote (NH4+ N organique) produit par les bactries est rapidement incorpore dans les protines et d'autres composs azots organiques par les plantes, les bactries

ou d'autres organismes.

La minralisation (N organique NH4+) survient souvent par la dcomposition. Quand les organismes meurent, des dcomposeurs tels que les bactries consument la matire organique et

convertissent des quantits importantes de l'azote dans l'organisme mort en ammonium. Sous la

forme d'ammonium, l'azote est disponible pour l'utilisation par les plantes ou pour tre transform

en nitrate (NO3-) par un procd appel la nitrification.

La nitrification (NH4+ NO3-) plusieurs bactries obtiennent de l'nergie en convertissant une partie de l'ammonium, qu'ils utilisent comme source d'lectrons, produits par la dcomposition au

nitrate.

La dnitrification (NO3- NO2-) est faite par les bactries dnitrifiantes qui convertissent le

nitrate (NO3-) en nitrite (NO2-) et dans certain cas de l'azote gazeux :

NO3- NO2- NO N2O N2.


44

BACTRIES QUI FIXENT L'AZOTE (Groupes impairs)

Matriaux


150ml de milieu dessai de fixation dazote 20 prouvettes striles

Mthode

1. Faire un compte NPP tel quindiqu ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu dessai de fixation dazote pour les dilutions de 100 10-3.

2. Incuber 28oC.

BACTRIES NITRIFIANTES (Groupes pairs)

Matriaux


150ml de milieu dammonium 20 prouvettes striles

Mthode

1. Faire un compte NPP tel quindiqu ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d'ammonium pour les dilutions de 10

0 10

-3.

2. Incuber 28oC.

chantillon de

compost

Volume dinoculum Vol. du milieu 5 tubes

Dilution finale

100 1.0 ml 5ml 10

-0

100 0.1 ml 5ml 10

-1

10-2

1.0 ml 5ml 10-2

10-2

0.1 ml 5ml 10-3


45

Amidon

ou

Cellulose

Amylase

ou

Cellulase

L'ASSIMILATION DU CARBONE

La grande majorit du carbone initialement disponible dans les sols est de sources vgtales et

reprsente des polymres de sucres, tel que la cellulose, composante des parois vgtale, et

l'amidon, forme principale de stockage des sucres chez les plantes. L'utilisation de ces composs

requiert la production et la scrtion d'enzyme exocellulaire qui ont pour but de faire la

dgradation de ces derniers en composs plus simples qui peuvent tre transports l'intrieur de

la cellule et mtaboliss. Ces enzymes sont donc trs communes chez les microorganismes

dcomposeurs.

BACTRIES QUI DGRADENT L'AMIDON (Groupes pairs)

Matriaux


5 Gloses d'amidon

Mthode

1. taler 0.1ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses damidon tiquetes de faon approprie.

2. Incuber 28oC.


46

BACTRIES QUI DGRADENT LA GLATINE (Groupes impairs)

Matriaux


Agar fondu de tryptone + 4% glatine

5 botes de Ptri

Bcher de 1L

Mthode

1. Laisser couler leau chaude du robinet jusqu' ce quelle atteigne la temprature maximale. 2. Remplir deau chaude approximativement moiti d'un bcher. 3. Obtenir 5 tubes dagar fondus de tryptone + glatine et les placer dans le bcher deau

chaude.

4. Transfrer 0.1ml de votre dilution de compost de 10-2 au premier tube dagar fondu. 5. Bien mlanger quelques secondes, puis verser dans une premire bote de Ptri tiquete de

faon approprie.

6. Rpter ltape 4-5 pour chacun des dilutions suivantes (10-3-10-6). 7. Laisser les botes de Ptri coules refroidir jusqu' la solidification de lAgar. 8. Incuber les gloses 28oC.


47

Jour 2

LES BACTRIES DANS DU COMPOST

Chaque groupe doit obtenir les comptes suivants et dterminer le compte bactrien/g de compost

original :

Compte htrotrophe en arobie

Compte htrotrophe en anarobie

Compte de bactries Gram positives

Compte de bactries Gram ngatives

NPP des bactries qui fixent l'azote

NPP des bactries nitrifiantes

Compte de bactries qui dgradent l'amidon Afin de dterminer quelles bactries dgradent l'amidon, inonder les gloses d'amidon

avec de l'iode de Gram. Liode de Gram ragit avec l'amidon gnrant une couleur bleue noir. En absence d'amidon, l'iode demeure bruntre. Compter les colonies qui dmontrent

un halo d'iode qui ne ragit pas avec l'amidon.

Compte de bactries qui dgradent la glatine Afin de dterminer quelles bactries dgradent la glatine, regarder pour des zones autour

des colonies. Compter les colonies qui dmontrent un halo nuageux autour delles.

COLORATIONS DE GRAM (Groupes de 4)

Faire des colorations de Gram et la prise de photo de la croissance obtenue pour les NPP des bactries qui fixent l'azote et les bactries nitrifiantes.

Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies qui dgradent l'amidon et de deux colonies qui dgradent la glatine.

Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies obtenues sur le compte htrotrophe en arobie et de deux colonies du compte htrotrophe en anarobie.


48

Tableau de NPP 5 tubes

noter : Les NPP sont donns par 100g ou 100ml dchantillon


49

ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS (Groupes de 2)

Matriaux

2 gloses TSA

Mthode

1. partir de la glose CNA, retrouver deux diffrentes colonies qui reprsentent des bacilles Gram positifs. Pour ce faire, faites des colorations de Gram de quelques colonies. Notez: ne

pas utiliser la colonie au complet, car vous devrez faire des stries pour colonies simples

des colonies choisies.

2. Prendre des photos des colorations de Gram des colonies choisies. 3. Faire des stries pour colonies simples sur des gloses TSA des colonies choisies. 4. Incuber 28oC.


Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo de

la prsentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numro du groupe et la

date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :

Coloration de Gram de bactries qui fixent l'azote. (1 image)

Coloration de Gram de bactries nitrifiantes. (1 image)

Colorations de Gram de bactrie qui dgradent l'amidon. (3 images)

Colorations de Gram de bactrie qui dgradent la glatine. (3 images)

Colorations de Gram d'inconnus bactriens isols d'une glose CNA (2 images)

Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit tre sauvegard sur le disque K:\

dans un fichier nomm comme suit : Colorations_Groupe (votre numro de groupe)


50

BIOREMDIATION (Partie 3)

Matriaux

Flacon de bioremdiation

Glycrol

Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de mas (Gr. 5-8), huile darachide (Gr. 9-12), et huile de diesel (Gr.13-16)

Engrais pour plantes

Flacon de 250ml

Tube capuchon Bouton-pression

1% (m/v) Solution de triphenyltetrazolium chloride (TTC)

Mthode

1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait lapparence de votre culture de bioremdiation.

2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v). 4. Mlanger la

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Manuel Micro 2012