Marqueur VASP :Marqueur VASP :aspects méthodologiques,aspects méthodologiques,

validation technique validation technique

Pr L Camoin-JauPr J Sampol

Laboratoire d’Hématologie INSERM EMI 0019

Hôpital de la ConceptionMarseille*******

GEHT Paris 9 et 10 Octobre

ADPADP ACAC PGE1PGE1

AMPcAMPc

PKAPKA

VASPVASP VASP-PVASP-P

PPPP

ActivatedActivated

IIb -IIIaIIb -IIIa

complexcomplex

Fibrinogen bindingFibrinogen binding

Activated PlateletActivated Platelet

InactivatedInactivated

IIb-IIIaIIb-IIIa complexcomplex

No FibrinogenNo Fibrinogen bindingbinding

Resting PlateletResting Platelet

++--

++--

-- ++

Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-721-7

Platelet VASP-FCM Biocytex

Mesure de la capacité de l’ADP à inhiber

la phosphorylation de VASP

Principe

Marquage de VASP-P en immunofluorescence

indirecte après fixation et perméabilisation

Analyse en double couleur

Principe du test

Tube 1 Tube 2 Tube 3

10 µl de PGE1 10 µl sang citraté

10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté

Vortex – Incubation 10 min

Fixation 10 µlFixation 10 µl Vortex – Incubation 5 min

Perméabilisation cellulaire et immunomarquagePerméabilisation cellulaire et immunomarquage

10 µl Ac anti-VASP-P10 µl Ac anti-VASP-P 10 µl 10 µl Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-P 10 µl10 µl Contrôle isotypiqueContrôle isotypiqueVortex – Incubation 5 min

RévélationRévélation et contre-marquage plaquettaire et contre-marquage plaquettaire

10 µl10 µl Ig polyclonal –FITC – CD61 PEDilution

Lecture (2 h)

10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté

Analyse cytométrique

Protocole compensé

PositionnementPositionnement de la fenêtre de la fenêtre

d’analysed’analyse

Plaq

GB

Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition PGE1Condition PGE1

MFI Axe YMFI Axe Y

Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition Condition

PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y

Isotype contrôleIsotype contrôleCondition Condition

PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y

Analyse cytométrique

Protocole Non Compensé

PositionnementPositionnement de la fenêtre de la fenêtre

d’analysed’analyse

Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition PGE1Condition PGE1

MFI Axe YMFI Axe Y

Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition Condition

PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y

Isotype contrôleIsotype contrôleCondition Condition

PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y

Plaq

GB

Calcul de l’index de réactivité des récepteurs à

l’ADP

MFIc PGE1 – MFI c (PGE1 + ADP)

MFIc PGE1 X 100

Résultats préliminaires

AVEC compensation SANS compensation

Normaux (n=5) Plavix (n=3) Mauvais répondeurs

0

25

50

75

100

Ind

ex d

e r

éacti

vit

é

pla

qu

ett

air

e

nsns

Essais de répétabilitéProtocole non compensé

Test 1Test 1 Test Test 22

Test Test 33

Test Test 44

Test Test 55

MoyMoy CVCV

T1 7.8 8.24 8.39 8.26 8.2

T2 2.94 2.96 2.9 3.13 2.99

T3 1.9 2.03 2.06 2.17 2.02

Index de réactivité

%

82.4 85 86.7 84.2 84.3 84.584.5 1.91.9

Essais de répétabilitéProtocole compensé

Test 1Test 1 Test Test 22

Test Test 33

Test Test 44

Test Test 55

MoyMoy CVCV

T1 7.46 7.98 8.07 7.75 7.92

T2 2.28 2.39 2.42 2.44 2.27

T3 1.39 1.65 1.63 1.7 1.59

Index de réactivité

%

85.3 88.3 87.7 87.8 89.3 87.787.7 1.71.7

Application clinique

Mesure de la phosphorylation de Mesure de la phosphorylation de VASP chez des patients traités par VASP chez des patients traités par thiénopyridines ayant présenté ou thiénopyridines ayant présenté ou non une thrombose artérielle sub-non une thrombose artérielle sub-aiguë après ATCPaiguë après ATCP

Groupe I (n =16): patients avecavec une thrombose de stent sub-aiguë

Groupe II (n=30) : patients sanssans complication thrombotique

Données démographiques

Group SAT

(n=16)

Group No SAT

(n=30)

p

Fibrinemia (g/l) 4.5 1.5 3.8 1.3 ns

Platelets (G/l) 311 88 286 74 ns

Duration of thienopyridines

pretreatment (days)

4.4 1 7 7.6 7.4 ns

Eptifibatide before (%)

29.4 37.5 ns

Age 66 15 69 8 ns

Résultats

39.80%

63.30%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

No SAT SAT

p < 0.0001p < 0.0001

Conclusion

Trousse aujourd’hui disponible et

utilisable facilement

Indication :

suivi des traitements par

thiénopyridines

Relevance clinique reste à confirmer