Métabolisme des carbohydrates Chez la levureExemple du Galactose

Mécanisme impliqué dans l’expression coordonnée des gènes Gal

Johnston, M. A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 51, 458-76. (1987).

Etude des régulations transcriptionnelles1980-2000

- Génétique : identification des facteurs protéiques

- Gels retards, Empreintes à la Dnase etc. : identification des séquences de liaison.

- Expression d’un gène rapporteur sous le contrôle des séquences promotrices.

- Mutagenèse dirigée.

Modèle : le contrôle de la transcription se réduit à des interactions entre

- facteurs de transcription (protéines diffusibles) et séquences promotrices (ADN).

- Facteurs de transcription et corégulateurs (Protéines).

La chromatine, substrat de la machinerie transcriptionnelle

Le nucléosome : unité élémentaire de la chromatine

ADN : 1,67 tours ; 147 paires de bases

Structure du nucléosome :

- très compacte (forte densité électronique)

- Environ 150 liaisons Hydrogène entre les histones et l’ADN

- Forte distorsion de la double hélice

Les conditions expérimentales sont très éloignées du contexte physicochimique de la chromatine.

Dans le noyau, la fibre chromatinienne s’organise pour former des structures encore plus compactes

Régulation de la transcription dans le contexte de la chromatine

- Recrutement des facteurs de transcription

- Recrutement et mobilité de l’ARN polymérase

Remodelage de la chromatine- ATP-Dépendant- ATP-Indépendant

ATP-DependantTransitoireLocal (promoteurs)Non diffusibleNon transmissible

ATP-IndependantStableDiffusible à l’échelle d’un locusTransmissible (épigénétique)

Mécanismes de remodelage de la chromatine

- Déplacement des nucléosomes- Complexes de remodelage(SWI/SNF, ISWI etc.)

- Remplacement des histones canoniques par des variants d’histones- Chaperons moléculaires

Mécanismes de remodelage de la chromatine

- Modifications post-traductionnelles des histones- Enzymes de modification

HAT: Histone Acétyl Transférases

HDAC: Histones DésACétylases

HMT: Histones Méthylases

Histone Déméthylase: (LSD1 : Lysine-specific demethylase)

Enzymes de modification des histones

Modifications post-traductionnelles des histones

Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).

Modifications post-traductionnelles des histones

Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).

La chromatine est une structure hétérogène:

Euchromatine:Gènes actifsPeu condensée (configuration ouverte)ADN peu ou pas méthylé (CpG)

Hétérochromatine constitutive:Régions intergéniques, ADN répétitif, centromèresCondensée (configuration fermée)ADN méthylé (CpG)

Hétérochromatine facultative:Gènes réprimésCondensée (configuration fermée)ADN méthylé (CpG)

Euchromatine

Hétérochromatine

Les différents états de la chromatine sont caractérisés par des marques épigénétiques spécifiques :

« Code Histones »

Interpréter le « Code Histones » :Les marques épigénétiques permettent le recrutement de

protéines effectrices qui modulent la structure de la chromatine.

Margueron, R., Trojer, P. & Reinberg, D. The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15, 163-76. (2005).

Etats de la chromatine

à l’échelle d’un locus

Exemple :

Les gènes de l’identité sexuelle

Chez la levure

Vengrova, S. & Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, 794-804 (2004).

Région Mat (mating type) chez Schizosaccharomyces pombe

Analyse moléculaire de la chromatine par immuno-

précipitation (ChIP)

HP

1Les gènes Mat réprimés sont enrichis en

HP1, une protéine spécifique de l’hétérochromatine

Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).

Les gènes Mat réprimés sont enrichis en H3K9 méthylée, une modification spécifique de

l’hétérochromatine

Les gènes Mat réprimés sont appauvris en H3K4 méthylée, une modification spécifique de

l’euchromatine

Grewal, S. I. & Elgin, S. C. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev 12, 178-87. (2002).

Comment ça marche ?

2

1

2 34

Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).

H3K9-Me(Clr4)

RecrutementDe Swi6

H3K4-Me

+

_ _?

Méthylation de H3K9Indépendante de HP1/SWI6

Méthylation de H3K9Dépendante de HP1/SWI6

Rôle de CenH et de HP1/SWI6

cenH est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de Swi6

Swi6 est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de CenH

Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). “Establishment and maintenance of a heterochromatin domain.” Science, 297(5590), 2232-7.

H3K9-Me(Clr4)

RecrutementDe Swi6CenH H3K9-Me

(Clr4)

Hypothèse:Etablissement de l’hétérochromatine à partir de CenH

Maintien et propagation dépendante de Swi6

Rôle de HP1/SWI6 dans la propagation de l’hétérochromatine

CenH, une séquence répétée homologue des séquences centromériques, agit comme un point de nucléation de l’hétérochromatine.

HP1/Swi6 est ensuite nécessaire à la propagation de l’hétérochromatine en cis

Mécanismes de propagation de l’hétérochromatine

Ura4-On Ura4-Off Stable

Transmission épigénétiqueVariegation en absence de cenH

Transmission épigénétique des états Ura4-on et Ura4-ff

Spores His2+/Ura4-onSpores His2-/Ura4_off

Transmission des marques épigénétiquesSpécifiques des souches Ura4-On et Ura4-Off

Dans les souches Ura4-On, l'hétérochromatine est rétablie en présence d'un excès de Swi6 mais pas de Clr4

Ura4-on Ura4-off

H3K9-Me(Clr4)

RecrutementDe Swi6CenH H3K9-Me

(Clr4)

H3K9-Me(Clr4)

ExcèsDe Swi6CenH H3K9-Me

(Clr4)

XX X

X X

La machinerie d'ARN-interférence (RNAi) est nécessaire à la répression transcriptionnelle et à

l'établissement de l'hétérochromatine

Ago1 = ArgonauteDcr1 = DicerRdp1 = RNA-dep RNA-Pol

Construction Ectopique

Ade6 exprimé

Ade6 réprimé

TSA = TrichostatinInhibiteur des HDACs

La machinerie RNAi n'est pas nécessaire au maintien de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine

La machinerie RNAi est nécessaire à l'établissement de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine

Comment stopper l’hétérochromatine ?

Passées les bornes, y a plus de limite :Les Eléments Frontières ou Insulateurs

Des mécanismes similaires ont été mis en évidence chez la Drosophile…

Répression du gène White :- Associée à une propagation en cis de l’hétérochromatine, visible sur les chromosomes polythènes.- Stochastique (Concentration limitante d’un facteur de propagation ?)- Clonale (transmission à travers les mitoses).

Bigarrure à effet de position (PEV)

Grewal02

Chez la Drosophile aussi, l’établissement de l’hétérochromatine dépend de la

machinerie RNAi

… Et chez les mammifères

Maturation des Thymocytes

Thymocytes immatures Thymocytes matures

Expression des gènes Rag1, Rag2, Dntt

impliqués dans la recombinaison VDJ du récepteur TCR

Répression des gènesRag1, Rag2, Dntt

Modifications post-traductionnelles de la chromatine sur le gène Dntt (ChIP)

Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). “Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation.” Nat Genet, 36(5), 502-6. Epub 2004 Apr 18.

Propagation de l’hétérochrompatine sur le gène Dntt

Euchromatine Hétérochromatine

La répression du locus Dntt est corrélée à son association avec l’hétérochromatine

péricentromérique

Propagation de l’hétérochromatineEn trans ?

Ikaros

Liaison à l’ADN (ZF)

Cofacteur transcriptionnel spécifique de la lignée hématopoiétique

Activateur ou Répresseur

Répresseur des gènes Rag1/2 et Dntt pendant la maturation des thymocytes

Existe sous forme de complexe avec NuRD (nucleosome remodelling and deacetylation)

Ikaros -Satellites

IkarosHP1

Localisation d’Ikaros dans l’hétérochromatine péricentromérique

Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). “Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin.” Cell, 91(6), 845-54.

Lymphocytes BImmatures Matures

CD19

CD8

5

CD2

+

-

+

- -

+

+

-

Corrélation inverse entre l’expression des gènes et leur localisation à proximité des foyers Ikaros

IkarosFISH

(NuRD)

Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). “Assembly of silent chromatin during thymocyte development.” Semin Immunol, 17(2), 129-40.

Comment échapper à la répression ?

Le rôle des Enhancers

Promoteur -globine

+ Enhancer -globine

Enhancer du gène -Globine(lignée érythroïde)

Francastel, C., Walters, M. C., Groudine, M., and Martin, D. I. (1999). “A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin.” Cell, 99(3), 259-69.

T0 = Arrêt de la sélection néomycine (G418)--> FACS

5’HS2: Enhancer -GlobinPr: Promoteur -GlobinGeo: Fusion -Gal – Néo

Stratégie utilisée

En absence d’enhancer fonctionnel, le transgène est fortement réprimé lorsqu’il est intégré aux sites 6.2 et C30

La présence d’un enhancer fonctionnel retarde la répression du transgène

Site 6.2

Lorsque le transgène est actif, la chromatine est en configuration ouverte, même en absence d’enhancer fonctionnel

Sensibilité à la Dnase I

FACS

_ +

Position du transgène par rapport aux centromères

En Cis

TransgèneCentromèresDAPI

Position du transgène par rapport l’hétérochromatine péricentromérique

En Trans

FACS

_ +

TransgèneCentromèresDAPI

Enhancer fonctionnel: le transgène s’éloigne du centromère, uniquement lorsqu’il est exprimé.

Enhancer inactif: le transgène est au voisinage du centromère, même lorsqu’il est exprimé

FACS

_ +

PCH PCH PCH

PCH PCH PCH

E

E E

Répression stableDNAse HS-

Expression transitoireDNAse HS +

Expression transitoireDNAse HS +

Expression transitoireDNAse HS +

Répression transitoireDNAse HS-

?

PCH PCH PCH

E

E E

Expression transitoireDNAse HS +

Répression transitoireDNAse HS-

Où vont les gènes lorsqu’ils s’éloignent de l’hétérochromatine péricentromérique ?

La LCR (Locus Control Region) est nécessaire au recrutement du gène -Globine dans les usines de

transcription.

Cellules érythroïdes matures de foie foetalSouris WTSouris -LCR parrecombinaison homologue

WT

-LCR

Ragoczy, T., Bender, M. A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). “The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation.” Genes Dev., 20(11), 1447-57. Epub 2006 May 16.

Recrutement des gènes transcrits dans les usines de transcription.

Organisation et expression allélique des gènes du chromosome 7 dans les cellules érythroïdes de la Rate

Cellules érythroides de Souris

Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., and Fraser, P. (2004). “Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.” Nat Genet, 36(10), 1065-71. Epub 2004 Sep 7.

Expression allélique

Localisation dans les foyers RNAP-II

Hbb-b1RNAP-II

RNA FISH DNA FISH

Recrutement des gènes actifs dans les foyers de RNAP-II

Hbb-b1ErafRNAP II

Des gènes distants peuvent être recrutés dans les mêmes foyers de RNAP-II

Confirmation Biochimique : Chromosome Conformation Capture (3C)

Hbb-b1

dezaded

Hypothèse : le co-recrutement des gènes dépend de la distance qui les sépare

Délocalisation des gènes Hox

Cellules ES + RA

Expression des gènes du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). “Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.” Genes Dev, 18(10), 1119-30.

Etat de la chromatine sur le locus HoxB (ChIP) pendant la différenciation des cellules ES

Hoxb1 Hoxb9

L’acétylation de H3K9 ne permet pas d’expliquer l’activation séquentielle de Hoxb1 et Hoxb9

Hoxb1Hoxb9DAPI

Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules

ES

Hoxb1Hoxb9DAPI

Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules

ES

- RA + RA

Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

- RA + RA

Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

RA

Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules

ES

L’expression séquentielle des gènes Hox est corrélée à leur délocalisation

hors du territoire chromosomique

Des observations similaires ont été faites dans les embryons de souris

Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., and Bickmore, W. A. (2005). “Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.” Development., 132(9), 2215-23.

+ Rapamycin - Rapamycin

Voir bouger la chromatine

Chuang, C. H., Carpenter, A. E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont, A. S. (2006). “Long-range directional movement of an interphase chromosome site.” Curr Biol., 16(8), 825-31.

Le noyau est organisé en domaines fonctionnels :

Domaines activateurs : Euchromatine, usines transcriptionnelles - usines d’épissage

Domaines répresseurs : Hétérochromatine

Les gènes sont recrutés de manière coordonnée dans ces domaines.

Le recrutement des gènes dans ces domaines est couplé à des modifications post-traductionnelles des histones.

Ces modifications contribuent à la stabilité et à l’héritabilité (transmission épigénétique) de leur état (activé ou réprimé).

Etat de l’art

Rôle des modifications post-traductionnelles des Histones

Rendre les gènes plus accessibles aux facteurs de transcription?

Le facteur de transcription UBF1 (genes ribosomiques; RNA-Pol I) est rapidement remplacé

sur les chromosomes mitotiques

GFP-UBF1

Pas si simple…

Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang, S. (2005). “Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins.” J Cell Biol, 168(1), 41-54. Epub 2004 Dec 28.

Les modifications post-traductionnelles des histones sont-elles nécessaires à l’organisation

nucléaire de la chromatine?

Séquentialité des événements ?

Relations de causalité ?

Bibliographie

Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). “Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin.” Cell, 91(6), 845-54.

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Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). “Assembly of silent chromatin during thymocyte development.” Semin Immunol, 17(2), 129-40.

Turner, B. M. (2002). “Cellular memory and the histone code.” Cell, 111(3), 285-91.