Mémoire de magister Le Fruit de Pistachier de l’Atlas

Devant le jury :

�Mr BRAHIMI.A Maître de Conférences (U.Djelfa) Président �Mr SAIDI.M Professeur (U.Ouargla) Examinateur �Mr LAHRECHE.M Maître de Conférences (U.Djelfa) Examinateur �Mr YOUSFI .M Maître de Conférences (U.Laghouat) Encadreur

Année Universitaire 2009/2010

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N° d’ordre : ……….. CH/2009

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وزارة ا��ـم ا�� وا�ث ا��

Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

�� ز �ن ��ر ا��Université Ziane Achour de Djelfa

Faculté des Sciences Département de Chimie

Mémoire de magister Pour l’obtention du titre de Magister en Chimie

Option : Chimie des Substances Naturelles

Présenté et soutenu publiquement par : Benahmed Ziyad

Le : 12 /11/2009

Le Fruit de Pistachier de l’Atlas : Composition en

acides gras, tocophérols et activité antioxydante

Remerciements

Ce travail à été réalisé dans le laboratoire des sciences fondamentales à la faculté des sciences et des sciences de l’ingénieur de l’université de Laghouat, dirigé par le Professeur Djamel Djamel Djamel Djamel

Benbertal. Benbertal. Benbertal. Benbertal. Je vous remercie de m’avoir accueilli au sein de votre laboratoire.

C’est avec beaucoup de gratitude que je remercie le Docteur YOUSFI MohamedYOUSFI MohamedYOUSFI MohamedYOUSFI Mohamed pour

m’avoir accueillie dans son laboratoire, sans qui ce travail n’aurait pas été possible, et avec qui j’ai pu avoir de passionnantes discussions scientifiques. En plus de ses qualités scientifiques. J’ai découvert une personne profondément humaine qui se bat pour ses idées sans jamais renoncer. Chaque discussion avec lui est remontant idéal contre les baisses de motivation ! Qu’il trouve ici l’expression de ma profonde gratitude pour m’avoir guidé tout au long de cette recherche.

J’aimerais remercie Monsieur le Docteur BRAHIMI AliBRAHIMI AliBRAHIMI AliBRAHIMI Ali d’avoir accepté de présider le jury de

ce travail.

Je tiens à adresser mes vifs remerciements et l’expression de mon profond respect à Monsieur M.SAIDIM.SAIDIM.SAIDIM.SAIDI, Professeur à l’université Ouargla pour l’honneur qu’il nous a fait en acceptant

d’examiner notre travail et de faire le déplacement à Djelfa pour participer au jury. Mes vifs et sincères remerciements vont également à Monsieur Docteur M.LAHRM.LAHRM.LAHRM.LAHREEEECHECHECHECHE, Maître de

conférences à l’université Djelfa, pour l’honneur qu’il nous a fait d’accepter de juger notre travail et d’apporter sa vision comme un spécialiste éminent en produit naturel.

Je remercie vivement : Dr A. Djeridane, qui eu la lourd tache de suivre tout le temps mon travail. Je lui exprime toute ma reconnaissance pour son aide scientifique et pour ses conseils qui ont toujours été très précieux particulièrement sur le terrain.

Un grand merci au Dr MMMMelleelleelleelle BELHADJ.S,BELHADJ.S,BELHADJ.S,BELHADJ.S, Maître de conférences à l’université Djelfa,

pour son aide et ses conseils ainsi pour le temps qu’elle m’a consacré dans mes travaux.

J’adresse également mes remerciements au Docteur M. Charef pour ses conseils fréquents et avisés. Son esprit de synthèse et son érudition restent pour moi un exemple à suivre

Un merci collectif à tous les enseignants de la post-graduation de chimie Organique Appliquée de l’université de Djelfa, ainsi que tous ceux qui ont participé prés ou de loin à la réalisation de ce travail.

Je ne saurais oublier toute ma famille, particulièrement mes parents, qui m’ont toujours soutenu et encouragé dans cette longue et pénible épreuve que représente ce mémoire et mes amis Lamouri Lotfi et Auar Mabrouk. Derdour Maamar.

à mes chers parents ;

à mes sœurs ;

à mes frères ;

à toute ma famille ;

à mes amis ;

pour leur présence de tous les moments,

pour le soutien qu’ils m’ont apporté,

avec toute mon affection et ma reconnaissance.

Liste des abréviations

ATémoin : Absorbance de solution de DPPH en absence de l’extrait

AEchantillon : Absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait

ABTS : Acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)

A- : L’anion ascorbate

AH: Radical ascorbyle

ADN: Acide Désoxyribonucléique

AGPI: Acide gras polyinsaturé A4: Echantillon des fruits immatures de la région Laghouat

A5: Echantillon des fruits immatures de la région Laghouat

Aco- : L’anion ascorbate

AlCl 3 : Chlorure d’aluminium

ARP: Puissance antiradicalaire

BHA: Butylehydroxyanisole

CCM : Chromatographie couche mince

CPG: Chromatographie phase gazeuse

CHS: Chalcone synthase

ClO- : L’anion hypochlorite

DMPD: le balayage du radicale cation N, N' –p-di-méthylique-phénylénediamine

D3: Echantillon des fruits immatures de la région Hassi R’mel

D4 : Echantillon des fruits immatures de la région Hassi R’mel

DPPH:1,1-Diphényl-2-Picryl –Hydrazyl

E2: Echantillon des fruits immatures de la région Aïn Oussera



EC50: Efficient concentration

EDRF : Endothelium relaxng factor

F4: Echantillon des fruits immatures de la région AïnOussera

F8: Echantillon des fruits de la région Aïn Oussera

FID : Détecteur à ionisation de flamme FL-OH: Flavonoïdes

GSH : γ-glutamyl-cystéinyl-glycine

GSSG : Gluthation-disulfure

H2O2: Peroxyde d’hydrogène

HO. : Radical hydroxyle QSAR : Quantitative Structure-Activity Relationship

MA: Echantillon des fruits matures de la région Laghouat

MB: Echantillon des fruits immatures de la région Hassi R’mel

MF: Echantillon des fruits immatures de la région Aïne Oussera

NO. : L’oxyde nirtique

1O2: L’oxygène singulet

O2.- : L’anion- radical superoxyde

ORAC: capacité d’absorbance du radical de l’oxygéne

PAL: Phénlanine Amonia

PLC: Photochemiluminescence

PP: Polyphénol

PIEGE : Paramètre total d’antioxydant de radical piégeage

pH: Potentiel d’hydrogène

PI: Pouvoir d’inhibition en %

R. : Radical

ROO. : Radical de peroxyle

RO. : Radical alcoxyle

RPE : Résonance paramagnétique électronique

SOD : Superoxyde dismutase

TOH: Tocophérol

TEAC: Trolox Equivalent Antioxydant Capacity

TBA: Thiobarbutrique

TBA-MA: Thiobarbiturique-malonaldéhyde

Tr : Temps de rétention

Trolox : un analogue de vitamine E [ Acide 6-hydroxy-2,5,7,(amidinopropane)]

UV : Ultra-violet

VEAC: Vitamine E Equivalent Antioxydant Capacity

Sommaire INTRODUCTION ...............................................................................................................................1

CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIE

1. Introduction... ........................................................................................................................... ..3

1.1. Caractéristiques botaniques du Pistachier de l’Atlas ... ................................................ ..3

1.2. Propriétés de l’arbre.. ....................................................................................................... .4

1.2.1. Utilisation... .............................................................................................................. .4

1.2.2. Travaux antérieurs sur le Pistachier de l’Atlas ... ................................................... 5

2. Généralités sur les lipides ....................................................................................................... ..6

2.1. Définition. ................................................................................................................... ..6

2.1.1. Etudes des constituants de lipide. ................................................................................... ..6

2.1.2. Les acides gras... ..................................................................................................... ..7

2.1.2.1. Classification des acides gras... ............................................................................... .8

2.1.3. Glycérides... ............................................................................................................... 9

2.1.4. Tocophérols.. ........................................................................................................... ..9

2.1.4.1. Structure chimique... ............................................................................................ ..10

2.1.5. Stérols. ..................................................................................................................... ..10

2.1.5.1. Définition et structures ......................................................................................... ..10

2.2. Rôle Biologique des lipides .................................................................................... 11

3. Les différentes classes de composés phénoliques…………………………………………...12

3.1. Introduction... .................................................................................................................. ...12

3.2. Découverte des flavonoïdes. ........................................................................................... ...14

3.2.1 Définition flavonoïdes .................................................................................................... ...15

3.2.1.1 Biosynthèse. ............................................................................................................ ..16

3.2.1.2 Structure chimique et classification... .................................................................... ...17

3.2.1.3 Propriétés biologiques des flavonoïdes.. .............................................................. ...17

4. Radicaux libres oxygénés.......................................................................................................... .18

4.1. Introduction ... .................................................................................................................. ..18

4.1.1 Principaux radicaux libres et leur origine.. ......................................................... ...18

4.1.1.1. Rôle pathogène des radicaux libres………………………………………………..19

4.2. Les antioxydants ... ............................................................................................................. ..21

4.2.1. Moyens de défenses endogènes... ........................................................................... ...21

4.3. Les antioxydants exogènes de faible masse moléculaires..... ............................... ...22

4.3.1. L’α-tocophérol (vitamine E)...... ............................................................................... ..22

4.3.1.1. La vitamine C... .................................................................................................... ....22

4.3.1.2. Les métaux de transition... ................................................................................... ....23

4.3.2. Les dérivés phénoliques issus des végétaux... ...................................................... ..23

4. 3.2.1. Flavonoïdes.. ......................................................................................................... ...23

4.4. Les méthodes d’évaluations de l’activité antioxydante .......................................... ..24

CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES D’ANALYSE

1. Matériel végétal. ....................................................................................................................... .25

1.1. Lieux et climat de région de la collecte des échantillons ..................................................... 26

1.1.1 Echantillonnage ……………………………………….……………………………....26

2. Méthode. ............................................................................................................................. ..27

2.1. Méthode d’extraction des lipides.. ................................................................................. ..27

2.1.1 Extraction solide-liquide ................................................................................................. ..27

2.1.1.1 Macération ................................................................................................................ .28

2.2. Analyse des acides gras. ................................................................................................. ..28

2.2.1. Préparation des esters méthyliques.. ...................................................................... ..28

2.3. Analyse des tocophérols par HPLC. .............................................................................. ..29

3. Extraction et analyse quantitative des composés phénoliques .............................................. ..29

3.1. Tourteaux.. ...................................................................................................................... ...30

3.2. Méthode d’extraction des composés phénoliques ......................................................... ..30

3.2.1 Extraits delipidés ............................................................................................................ ...30

3.3. Analyse quantitative .......................................................................................................... 30

3.3.1 Analyse quantitative des composés phénoliques .......................................................... ..30

3.3.1.1 Dosage des phénols totaux ..................................................................................... ..30

3.3.1.2 Dosage des flavonoïdes.. ........................................................................................ ..31

4. Evaluation de pouvoir antioxydant des extraits de Pistachier d’Atlas .................................. 32

4.1. Test chimique DPPH... .......................................................................................... ...32

4.2. Test chimique de Molybdate Phosphate ................................................................ ..35

4.3. Test d’ABTS. .......................................................................................................... ..36

CHAPITRE III RESULTATS ET DISCUSSION

1. Résultats de l’analyse quantitative... ........................................................................................ .38

1.1. Analyse quantitative des lipides... ................................................................................... ..38

1.1.1. Teneur en lipides. .................................................................................................... ...38

1.1.1.1. Composition acides gras de l’huile du fruit de Pistachier de l’Atlas ......................40

1.1.1.2. Dosage des tocophérols.. ...................................................................................... ..42

2. Composés phénoliques ... .......................................................................................................... .45

2.1. Teneur en composés phénoliques... ................................................................................. ..45

2.1.1. Teneur en flavonoïdes. ........................................................................................... ...48

3. Résultats de l’étude du pouvoir antioxydant... ...................................................................... …53

3.1 Test chimique DPPH... .......................................................................................... …53

3.2. Test chimique de Molybdate Phosphate ................................................................ ...61

3.3. Test d’ABTS. .......................................................................................................... ...69

CONCLUSION .. ............................................................................................................................ ...74

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... ................................................................................ ...77

ANNEXE ... ..................................................................................................................................... ...83

Introduction Introduction Introduction Introduction

Introduction

1

L’L’L’L’étude des constituants des plantes médicinales se justifie par les services qu’elles

rendent dans une multitude d’affections chroniques. Elles assurent une médicamentation

plus douce dans des maladies à évolution assez lente. Permettant une utilisation prolongée,

évitant les effets indésirables. Au contraire, la chimiothérapie constitue un traitement assez

brutal, utile principalement dans les affections aigues, avec des effets secondaires imprécis.

LaLaLaLa découverte de nouvelles propriétés pharmacologiques et l’extraction de nouveaux

principes actifs (alcaloïdes, hétéroside, lactones, flavonoïdes, stéroïdes. etc…), contribuent

au développement de la médecine par les plantes. Ces découvertes ont montré qu’il avait de

nombreuses possibilités thérapeutiques dans le règne végétal.

AAAActuellement, , , , plus de 50% des médicaments et les quasi-totalités des substances

anticancéreuses (ellipicène , celiptium , pervenche , tropicale , .etc.) sont issues de plantes

ou dérivées, presque tous les médicaments dit << majeurs>> résultant d’une recherche,

parfois très anciennes sur les plantes.

LLLLes plantes médicinales sont employées en nature ou sont utilisées comme matière

première pour l’extraction de principes actifs. Elles peuvent servir de models pour la

synthèse. Les molécules naturelles peuvent aussi être retouchées par l’homme pour être

améliorées.

DDDDans les zones arides et semi arides steppiques de l’Algérie, la liste des plantes

médicinales entrant dans ce cadre est exhaustive et comme elles sont utilisées sous forme de

tisane, extrait ou préparation complexe, il reste difficile de définir les molécules

responsables de l’action bien que certaines effets pharmacologiques prouvés sur l’animal

aient été attribués à des composées tels que les alcaloïdes et dérivées, des terpènes, stéroïdes

et composées phénoliques (flavonoïde).

LLLL’intérêt que nous portons à l’extraction et l’identification des composées lipidiques,

terpéniques et phénoliques vise principalement à valoriser les plantes médicinales locales.

PPPPar l’étendue des domaines de recherche impliqués actuellement, nous nous sommes

intéressés dans ce travail à la comparaison entre différents individus de Pistachier de

l’Atlas : Pistacia Atlantica Desf (famille Anacardiacée) issus d’une population femelle de

trois régions du Sud Algériene (Laghouat, Hassi R’mel, Aïn Oussera), selon deux

marqueurs bio-organiques lipides et polyphénols) choisis d’après l’étude phytochimique

déjà réalisée.

Introduction

2

Dans le laboratoire des sciences fondamentales de l’université de Laghouat [1]. Suivi d’une

étude de l’activité antioxydante de ces extraits.

LLLLe choix de ce travail est basé sur :

LLLLe fait que cet arbre est très rependu dans toutes les régions steppiques et

présahariennes de l’Algérie, ainsi, cette espèce est utilisée en Algérie comme antiseptique,

antifongiques, et dans des maladies abdominales [2].

DDDDe même, aucun travail n’a été consacré sur l’activité antioxydante des fruits sur les

extraits (lipides, tourteaux), en plus certaines classes des polyphénols et lipides sont connus

par leur activité antioxydante.

DDDDans le cadre de cette étude les capacités matérielles mises à notre disposition, nous

ont permis de mettre en place une stratégie de recherche pour l’études phytochimique de

douze individus de l’espèce étudiée et de tester l’activité antioxydante in vitro des extraits

lipidiques et delipidés des fruits de la plante.

AAAA travers ce travail, nous s’intéressons dans un premier temps à donner quelques

connaissances bibliographiques de la plante investiguée : structure et propriétés des deux

classes de molécules : lipides et polyphénols, et un aperçu scientifique sur l’activité

antioxydante.

PPPPar la suite, nous étudions la quantification et l’identification des fractions lipidiques

et la teneur de tourteaux et de lipide en polyphénols totaux et en flavonoïdes.

DDDDans un second lieu, on s’intéresse à l’étude de l’activité antioxydante des extraits

obtenus en adaptons trois tests chimiques. Le choix de tests est fixé sur une analyse

mesurant le pouvoir des extraits de balayer le radical stable DPPH. et le radical cation

ABTS•+ et une technique mesurant la capacité réductrice du Molybdate de phosphate

comme tests chimiques.

Chapitre IChapitre IChapitre IChapitre I AperçuAperçuAperçuAperçussss Bibliographies Bibliographies Bibliographies Bibliographies

Chapitre I : Aperçus Bibliographiques

3

1. Introduction

Le Pistachier de l’Atlas (Pistacia Atlantica Desf.), elbetoum, botma, betouma ou

btouma en Arabe local et lgth en berbère. Le nom commun de cette espèce se rapporte aux

montagnes d’Atlas ou cette espèce se développe. Cet arbre est également connu comme

pistachier sauvage, faux pistachier, fruit globuleux, petits rouge –brun, renfermant une

graine verte. Les fruits sont appelés Elkhodiri par les populations locales, appellation due à

la prédominance de la couleur verte foncée à maturité.

Espèce nord-africaine endémique, relativement commune dans toute l’Algérie (avec

une prédilection pour les lieux arides), mais moins répandue dans le Sahara : Hoggar,

Tassili. Le betoum est considéré comme un puisant astringent, cela est du à sa forte teneur

en tanins. En outre, son écorce exsude une oléo-résine très odorante [3,4].

1.1 Caractéristiques botaniques au Pistacia Atlantica

Nom commun : Pistachier.

Nom latin : Pistacia atlantica Desf, proche Pistacia vera, Pistacia chinensis

Famille : Anacardiaceae.

Catégorie : arbre dioïque.

Port : arrondie à ramification étalée, jeune le rameau est rougeâtre.

Feuillage : caduc, composé, imparipenné ; 3 à 5 folioles ovales-acuminées, tomenteux

puis coriace à l’âge adulte.

Floraison : en été en panicule de petites fleurs apétales (1 à 3) et 1 à 5 sépales.

Pollinisation effectuée par le vent. Fruits récoltés en septembre-octobre.

Couleur : vert brunâtre.

Croissance : lente et ne produit qu’à partir de 5- 7 ans.

Hauteur : 10 à 12 m.

Plantation : à l’automne ou au printemps.

Multiplication : par bouture.

Sol : tous mais bien drainé.

Emplacement : au soleil.

Pays d’origine : Méditerranée orientale (Grèce et Turquie).

Entretien : arroser pour augmenter la production, tailler pour faciliter la récolte [3].


4

1.2. Propriétés de l’arbre

Le bétoum est un bel arbre, qui existe à l’état disséminé dans la région de Djelfa

(Senalba, Aïn Oussera, Messaâd), Laghouat (partie sud) et Ghardaïa (dans l’oued m’zab)

[5,6]. Il présente un intérêt tout particulier, parce qu’avec l’arganier, c’est le seul arbre qui

s’accommode de l’étage climatique aride et peut vivre dans les conditions écologiques les

plus sévères. En raison de sa rusticité, de la caducité de ces feuilles qui produisent de bons

sols forestiers, de sa résistance à la sécheresse et de ses faibles exigences pluviométriques. Il

est très utile pour recevoir la greffe de Pistacia verra. Les arbres greffés sont d’une grande

vigueur, très rustiques et d’une longévité remarquable [7]. Il peut y être cultivé et supporter

les vents forts et les longues périodes de sécheresse. Les principaux facteurs qui contribuent

à sa dégradation sont l’exploitation forestière ; les incendies de forêt et l’action des

animaux. En Algérie, le Pistacia atlantica est trouvée en association avec Zizphus lotus qui

protège ces nouveaux plantes contre les animaux et les vents violents. L’utilisation de la

culture reste faible malgré son potentiel d’adaptation aux conditions arides du milieu. Les

conditions climatiques de la plupart des régions agricoles montagneuses et semi-arides de

notre pays sont favorables à son extension [3].

1.2.1. Utilisation

Cet arbre peut présenter plusieurs utilisations :

-Utilisation Médicinales

Très utile comme antiseptique, antifongique, et dans des maladies abdominales [2].

-Utilisation comestibles

Le fruit donne une excellente huile de table est obtenue à partir des graines qui

contiennent environs 52% d’huile [8].

-Utilisation locales

Les fruits de cet arbre (El khodiri) sont des drupes comestibles de la grosseur d’un

pois, légèrement ovales et aplaties, utilisées à des fins culinaires et médicinales. Ils sont

riches en huile dense très énergétique. L’huile est souvent mélangée aux dattes écrasées et

peut être consommée à toute heure de la journée avec du petit lait. L’huile a un gout très

proche de celui du beurre, elle est très appréciée dans la région. Les graines sont séchées,

écrasées ou moulues et ramassées avec de l’eau sucrée et consommée en boulette ou bien

séchées et croquées telles quelles comme cacahuètes. L’écorce produit une résine – mastic

qui exsude naturellement de façon abondante par temps chaud. Les populations locales s’en


5

servent pour usage médical. Le suintement du tronc donne ' l’encre rouge des tolbas ', il est

utilisé, également, pour la tannerie des peaux. Jadis, l’arbre fournit un bois d’artisanat et

toutes les espèces du pistachier constituent un apport en fourrage considérable pour

l’alimentation du bétail surtout en automne. Cette essence peut entrer dans le cadre de la

lutte contre la désertification utilisée pour la fixation des dunes, comme brisevents [3].

1.2.2. Travaux antérieurs sur Pistacia Atlantica Desf

L’analyse phytochimique des différentes parties de l’arbre de Pistachier de l’Atlas a

été l’objet de quelques études via la composition du fruit en acides gras, en acides amines,

en éléments minéraux et le dosage quantiatif des protéines, des fibres de l’amidon [8,9].

En outre une étude plus récente sur les extraits phénoliques de cinq différentes parties

de l’arbre de Pistachier de l’Atlas à savoir : les feuilles, les écorces, les gales, les fruits et la

partie dégradée de l’arbre (champignon). Les résultats ont montré que les différents extraits

sont riches en composés phénoliques à l’exception des extraits des écorces. L’analyse de

l’activité antioxydante, de ces dernières et l’application des techniques spectrale ont permis

de mettre en évidence de deux produits à structure phénolique responsable de cette activité

[1]. Peu de travaux ont été consacrés à l’étude comparative des populations des Pistacia

Atlantica, on trouve l’étude comparative de la micro-morphologie de l’épiderme des feuilles

dans huit populations de Pistacia atlantica Desf issus de différentes régions algériennes

[10],qui montre l’existence d’une variabilité qui pourrait être due aux conditions

écologiques. Par ailleurs, aucune référence bibliographique concernant la comparaison des

populations du Pistachier de l’Atlas à travers leurs métabolites n’a été trouvée : la teneur de

fruit en composés phénoliques de même pour la teneur des tourteaux en polyphénols et

flavonoïdes, ainsi aucune référence bibliographique ne montre que l’activité antibactérienne

et antileishmanienne de l’arbre a été étudiée.


6

2. Généralités sur les lipides

2.1. Définition

Les lipides constituent un groupe hétérogène de substances insolubles dans l’eau mais

solubles dans les solvants organiques (alcool à chaud, éther, chloroforme, benzène). La

structure de base est l’acide gras, composés d’une chaîne hydrocarbonée de diverses

longueurs, terminée par un radical acide (COOH). En fait la grande majorité des lipides

alimentaires est sous forme de glycérides (ester de glycérol et l’acide gras), qui sont les

principaux vecteurs des acides gras. Les autres lipides sont des molécules plus complexes :

phospholipides, cholestérol, sphingolipides et cérides [11].

2.1.1. Etude des constituants de lipide

Une réaction importante pour la caractérisation rapide des lipides dans aliment est la

réaction de saponification

Les lipides étant en majorité des esters d’alcools et d’acides gras, acides organiques

hydrophobes, leur formation et leur dégradation se font selon une réaction (1) lente et

réversible.

R-COOH + R’-OH R-COO-R’+ H-OH (1)

Pour quantifier les esters lipidiques dans un aliment, la réaction d’hydrolyse est

insuffisante puisqu’elle conduit à un équilibre

Par contre, l’action d’une base forte sur les lipides décompose totalement un ester en

alcool et en sel d’acide gras, appelé savon

La réaction (2) de saponification est la suivante :

R-COO-R’ + NaOH ROO Na +R’OH (2)

En pratique, en comparant un dosage de lipides totaux d’un aliment et un dosage par

saponification, on trouve bien 98 à 99 % de triacylglycérols. Les fractions de 1 ou 2 %

restantes sont l’ «insaponifiable », ainsi qualifiée puisqu’elle n’est pas transformée par

l’action de basses l’«insaponifiable », contient essentiellement les alcools libres (glycérol,

cholestérol, sistérols chez les végétaux) [12].

estérification

Hydrolyse


7

2.1.2. Les acides gras

La plupart ont une forme linéaire répondant à la formule générale : CH3(CH2) n-COOH

ou n est de 2 à 20, rarement plus (tableau I). Les acides gras se distinguent par nombre de

caractères :

� La longueur de chaîne, répertoriée par le nombre d’atome de carbone

(pratiquement toujours en nombre pair). Les plus répondus chez l’homme ont

16 et 18 carbones.

� L’absence ou la présence de doubles liaisons entre les carbones situés au sien

de la chaîne

� La configuration spatiale de la chaîne des acides gras non saturés, distinguant les

formes cis les plus répandues dans la nature, et les formes trans (figure n°1),

présentes en faible quantité dans certains produits animaux, mais qui peuvent

être le résultat de transformations industrielles des graisses.

Figure n°1: Schéma illustrant l’isomérie spatiale des acides gras insaturés [13].


8

� La position de la première double liaison par apport au CH3 terminal détermine

la classification physiologique des acides gras (classification en ω,ou en n-).On

définit ainsi des familles d’acides gras ayant chacune une position particulière de

cette première double liaison : en ω3, ω6, ω7, ω9.

2.1.2.1. Classification des acides gras

Les acides gras sont classés en quatre groupes essentiels selon leur structure chimique

Tableau I : Principaux acides gras [11].

Dénomination commune Dénomination simplifiée

Acides gras saturés

Butyrique C4 : 0

caproïque C6 : 0

Caprylique C8 : 0

Caprique C10 : 0

Laurique C12 : 0

Myristique C14 : 0

Palmitique C16 : 0

Stéarique C18 : 0

Arachidique C20 : 0

Acides gras monosaturés

Palmitoléique C16 : 1ω7

Oléique C18 : 1 ω9

Erucique C20 : 1 ω9

Acides gras polyinsaturés de la famille ω6

Linoléique C18 : 2 ω6

Arachidonique C20 : 4 ω6

Acides gras polyinsaturés de la famille ω3

Linolénique C18 : 3 ω3

Ecosapentaénoïque (EPA) C20 : 5 ω3

Docosahexaénoïque C22 : 6ω3


9

2 .1.3. Glycérides

Les glycérides sont des lipides simples aussi appelés graisses. Ce sont des esters du

glycérols et d’acides gras (un, deux ou trois acides gras). Selon le nombre d’acide gras

combinés au glycérol, on distingue les monoglycérides, les diglycérides et les triglycérides

(figure n°2). Les triglycérides sont les constituants principaux des graisses animales et

végétales (plus 95 %). Les mono et diglycérides sont beaucoup moins abondants que les

triglycérides [14].

sn-2 ou β-monoglycèride sn-1,3 ou α,α' diglycèride Triglycèride

Figure n°2 : Représentation schématique des glycérides

2.1.4. Tocophérols

2.1.4.1. Structure chimique

Ces composés sont de 8-méthylchromane-6 ols substitués en position 1 par un groupe

méthyle une chaîne de polyisoprénique de seize atomes de carbone saturés tocophérol T ou

tri insaturés tocophérols T3 (figure n°3). Cette famille comprend quatre substances α-

tocophérol, β- tocophérol, γ- tocophérol et δ- tocophérol [15], l’alpha tocophérol est plus

fréquent et le plus actif biologiquement et le béta et gamma tocophérol représente une

activité vitaminique réduite (respectivement 30 et 15% environ de l’activité de l’alpha

tocophérol) [16]


10

O

R1

OH

R2

CH3

CH 3

R

1 2

345

6

7

89

10

a

bR

Structure Chaîne R1 R2

α tocophérol A CH3 CH3

α tocotreinol B CH3 CH3

β tocophérol A CH3 H

β tocotreinol B CH3 H

γ tocophérol A H CH3

γ tocotreinol B H CH3

δ tocophérol A H H

δ tocotreinol B H H

Figure n°3 : Structure moléculaire des tocophérols et tocotriénols [15]. 2.1.5. Stérols

2.1.5.1. Définition et structures

Les stérols sont des stéroïdes dérivent des triterpénes, formant ainsi tout un groupe

d’alcools solide, ils sont également un constituant essentiel des membranes cellulaires, on

les trouve aussi bien chez les animaux que dans les végétaux.

Les stérols comportent au niveau de leurs structures un hydroxyle en position C-3

d’orientation β, éventuellement des doubles liaisons. En général ils comportent une double

liaison entre les atomes de carbone C-5 et C-6 ainsi q’une chaîne latéral rattachée au

sommet C-17 du noyau polycyclique dérivé du phénanthrène [17,18].

Tous les stérols ont un en commun le même noyau (figure n°4) et il différent par la

chaîne latérale.


11

Figure n°4 : Noyau stérol

Les jonctions trans. .Dans les trois cycles A, B, C produisent une molécule rigide

(figure n°5)

Figure n°5 : Stéréochimie de noyau de stérols

2.2. Rôle Biologique

Les lipides jouent un rôle capital pour tous les organismes vivants.

• Ils représentent environ 20% du poids du corps

• Chaque gramme de lipide peut donner une énergie supérieure ou égales à 9 Kcal/gr

lipide

• Ils ont un rôle de précurseurs : stéroides, vitamines, prostagladines

• Les plaques d’athérome constituées de dépôt lipidique entrainent le durcissement des

artères (athérosclérose)

• Une consommation trop importante de lipides favorise les maladies telles que

l’obésité, le diabète, l’hypercholestérolémie [19].


12

3. Les différentes classes de composés phénoliques

3.1. Introduction

Les composés phénoliques forment un très vaste ensemble de substance qu’il est

difficile de définir simplement. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la

présence d’au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupe

hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, ou hétéroside [20].

Parmi les composés phénoliques, dont plus 8000 sont connus, les flavonoïdes, les

quinones phénoliques, les lignanes, les xanthones, les coumarines et d’autres classes existent

en nombres considérables (tableau II) [21].

Tableau II: Les principales classes composés phénoliques

Nombre

de

Carbone

Squelette de

base

Classe

Exemple

6 C6 Phénols simples Catéchol 1

7 C6- C1 Acides phénoliques Acide salicylique 2

8 C6- C2 Acétophénones 3-acetyl-6-

méthoxybenzaldéhyde 3

9

C6- C3

- Acide hydroxycinnamique

- Phénylpropénes

-Coumarines

-Isocoumarines

- Acide caféique 4

-Eugénol 5

Ombelliférone 6

-6,7-Diméthyoxy 8-hydrox- 3-

méthyle isocoumarine 7

10 C6- C4 Naphtoquinones Juglone 8

13 C6- C1- C6 Xanthones 1,2,3,7-tetraméthoxy

xanthones 9

14 C6- C2- C6 -Stilibéne

1- Anthraquinones

-Acide hunularique 10

-Emodine 11

15 C6- C3-C6 Flavonoides Quercetine 12

18 (C6- C3)2 lignanes Podophyllotoxine 13

30 (C6- C3-C6)2 Biflavonoides Kayaflavone 14


13

Figure n°6 : Structures chimiques de quelques composés phénoliques

1 2 3

4 5 6

7 10

8 9


14

Figure n°6 : Structures chimiques de quelques composés phénoliques

Le groupe le plus vaste et plus répandu des phénols est celui des flavonoïdes [22], le

terme '' flavonoïdes'', est utilisé pour la première fois par Geissman et Hinreiner [23].

3.2. Découverte des flavonoïdes

L’intérêt nutritionnel pour les flavonoïdes date de la découverte de la vitamine C , à la

suite des travaux de Szent Gyorgyi en 1938. Le scorbut expérimental cède à l’ingestion de

jus d’agrumes mais résiste à la seule administration d’acide ascorbique. Plus pratiquement,

les symptômes hémorragiques de scorbut liés à la fragilité des vaisseaux sont guéris par des

extraits de Paprika et du jus de citron alors que l’acide ascorbique seul est inefficace. Les

11 12

13

14


15

analyses chimiques ont montré que la fraction active était de nature flavonoïque.

Cette action des flavonoïdes sur la perméabilité vasculaire a été appelée propriété

vitaminique P (P étant la premiére lettre du mot perméabilités). Cette notion de vitamine P

n’existe plus à l’heure actuelle puisqu’elle ne correspond pas à la définition classique des

vitamines : par contre, les flavonoïdes sont considérés comme des micronutriments

importants puisqu’ils peuvent jouer des rôles antioxydants ou posséder des propriétés

biologiques diverses [24].

3.2.1. Définition flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des substances naturelles issues des plantes présentes dans tout le

règne végétal. Ce sont des pigments responsables de la coloration des fleurs, des fruits et des

feuilles. Ils sont universellement présents dans la cuticule foliaire et dans les cellules

épidermiques des feuilles, et sont susceptibles d’assurer la protection des tissus contre les

effets nocifs du rayonnement UV.

Les flavonoïdes sont des dérivés du noyau Flavone ou 2-Phényl-Chromone portant

des fonctions phénols libres, éthers ou glycosides

Figure n°7 : Noyau Flavone Le noyau Flavone est lui-même un dérivé du noyau Flavane de base :

Figure n°8 : Noyau Flavane

Les flavonoïdes sont donc des polyphénols complexes dont la structure est constituée de

deux noyaux aromatiques (noyaux Aet B) et d’un hétérocycle oxygéné (cycle C) [24]


16

3.2.1.1. Biosynthèse

Hydrates de carbones Phénylalanine 4-Coumaroyl-CoA AcétylCoA MalonylCoA Calchone synthétase+réductase Calchone synthétase 4,2’,4’,6’ tétrahydroxychalcone 4,2’,4’tétrahydroxychalcone CHALCONE Chalcone Chalcone Isomérase Isomérase

Flavanone 5-désoxyfavanone FLAVANONE ISOFLAVONE FLAVONE Dihdroflavonol Dihydroflavonol réductas FLAVONOL 3,4dihydroxyflavane et 3 hydroxyflavone flavonol Synthéase TANINS CONDENSES ANTHOCYANES

Figure n°9 : Schéma illustrant la biosynthèse des Flavonoïdes [25]


17

3.2.1.2. Structure chimique et classification

Les flavonoïdes sont des hétérosides, c’est-à-dire des dérivés de génines sur lesquelles

un ou plusieurs oses sont griffés. La liaison GENINE –OSE existe grâce à la réunion, soit

d’un hydroxyle phénolique, soit d’un hydroxyle de l’hétérocycle oxygéné, soit d’un –CH

avec l’hydroxyle hémiacétalique du des oses (s). On obtient alors des O-Hétérosides ou des

C- Hétérosides

O-hétéroside C-hétéroside

Rutine Saponarine

Figure n°10: Structure chimique de 2 flavonoïdes : la rutine et la Saponarine

Les C-hétérosides semblent intéressants en thérapeutique. La rupture de la liaison

GENINE-OSE est plus difficile dans le cas des C-hétérosides que dans celui des O-

hétérosides [24].

3.2.1.3. Propriétés biologiques des flavonoïdes

De nos jours, les propriétés des flavonoïdes sont largement étudiées dans le

domaine médical ou on leur reconnaît des activités anti-virales, anti-tumorales, anti-

inflammatoires, anti-allergiques et anti-cancéreuses [25]. Les flavonoïdes peuvent aussi

empêcher le diabète ou du moins le réduire en inhibant l’enzyme aldose réductase. Ong et

Khoo ont reporté que la myricétine possède un effet hypoglycémiant chez des animaux

diabétiques .Certains flavonoïdes peuvent entraver l’athérosclérose et par conséquent

réduisent le risque des maladies cardiovasculaires [26].


18

4. Radicaux libres oxygénés

4.1. Introduction

Dans les molécules, les atomes sont assemblés par des liaisons covalentes établies par

la mise en commun d'électrons de spins opposés. Tout apport d'énergie suffisant est

susceptible d'entraîner la rupture de ces liaisons et donc de donner naissance à des entités

chimiques qui possèdent un électron non apparié, dit « célibataire », sur une orbitale

externe. Ces entités chimiques sont appelées radicaux libres. Parmi les espèces

radicalaires les plus intéressantes se trouvent les formes activées de l'oxygène. La

réactivité particulière de l'oxygène est due à la structure bi radicalaire de la molécule. En

effet, si l'oxygène moléculaire est très stable vis- à-vis des substances à électrons

appariés, la molécule réagit énergétiquement avec les radicaux libres.

Les radicaux libres sont issus du métabolisme physiologique mais ils peuvent aussi

être, produits lors de « déviations » du métabolisme cellulaire [27].

4.1.1. Principaux radicaux libres et leur origine

• L’anion- radical superoxyde (O2.-

) est issu de la réaction de l’oxygène avec

un électron, souvent au niveau de la chaîne de transport d’électrons de la

membrane mitochondrial (l’électron est alors transféré par l’intermédiaire d’un

radical semi-ubiquinone ) ou au cours de la lutte des leucocytes contre les

bactéries et les virus.

• Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) provient d’une réaction entre deux anions

superoxyde qui met fin au processus radicalaire. Il s’agit d’un oxydant

beaucoup moins puissant, mais on considère qu’il joue avec ce dernière un rôle

important dans le stress oxydatif car ils diffusent facilement à travers les

membranes vers des organites vulnérables des cellules comme le noyau ou la

mitochondrie.

• L’anion hypochlorite (ClO-) est produit à partir du peroxyde d’hydrogéne par

la méloperoxydase (MPO). Il n’est présent que lors d’infections et peut

participer au stress oxydatif lié à celles-ci

• Le radical hydroxyle (HO.) est le produit de la réaction du peroxyde

d’hydrogène avec des ions métalliques comme par exemple Fe2+ (réaction de

Fenton). C’est l’espèce chimique la plus réactive et elle joue un rôle majeur


19

dans la peroxydation lipidique et la destruction du matériel génétique.

• L’oxygène singulet ( 1O2 ) est produit en présence de rayonnement UV ou par

les leucocytes. Il est à l’origine du vieillissement cutané, de la cataracte, de la

dégénérescence maculaire liée à l’âge et de certains cancers de la peau.

L’oxyde nirtique (NO.), produit par la NO synthéase, est un vasodilatateur

physiologique (on l’appelle par fois EDRF : endothelium relaxng joue aussi un

rôle messager interneuronal. Il peut avoir un rôle néfaste [28].

Figure n°11 : Représentation schématique de la synthèse et de la dégradation des ERO [27].

4.1.1.1. Rôle pathogène des radicaux libres

Toxicité cellulaire des radicaux libres : principales cibles radicalaires.

� ADN : les radicaux libres peuvent induire des effets mutagènes ou l’arrêt des

réplications de l’ADN. Ils agissent en provoquant des altérations de bases, des

pontages ADN-protéine ou des ruptures de brins [30].

� Les macromolécules : les radicaux libres sont également responsables

d’inactivation enzymatique en particulier des sérine-protéases, d’une

fragmentation des macromolécules (collagène, protéoglycannes, acide

hyaluronique), de formation de dimères ou d’agrégats protéiniques dans les

membranes cytoplasmiques. Les acides aminés les plus sensibles à leur action


20

sont le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la méthionine, la cystéine.

� Les lipides : ils sont une cible privilégiée des radicaux libres qui provoquent

l’oxydation des acides gras polyinsaturés (AGPI) des phospholipides

membranaires. Le phénomène d’auto-oxydation ou peroxydation lipidique

consiste en attaque par un radical libre, d’origine exogène ou endogène, de

dérivés lipidiques.

Figure n °12 : Schéma illustrant la réaction de la peroxydation lipidique : Les étapes

encadrées sont celles ou sont celles ou la réaction radicalaire peut être interrompue : [27]

En vert : la réaction s’arrête par de deux couplage de deux radicaux ou par

intervention d’un antioxydant briseur de chaine sans conséquence néfaste

En rouge : l’hydroperoxyde formé, instable, se dégrade en aldéhyde de l’odeur liée

au rencaissement, qui, in vivo, peuvent provoquer des lésions sur d’autres

molécules.


21

4.2. Les antioxydants

Les antioxydants peuvent être définis comme les substances qui, présentent à faibles

concentration par rapport à un substrat oxydable, sont capables de ralentir ou d’inhiber

l’oxydation de ce substrat. Cette définition fonctionnelle s’applique à un grand nombre de

substances, comprenant des enzymes aux propriétés catalytiques spécifiques, mais aussi de

petite molécules hydro-ou liposolubles [30].

4.2.1 Moyens de défenses endogènes

Pour protéger ses tissues contre toute agression radicalaire, l’organisme humain

posséde des systémes enzymatiques, tels que :

• Les superoxyde dismutases (SOD) : sont des métalloprotéines catalysant la

dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène.

• Les glutathion peroxydases : font partie d’un système complet qui joue un

rôle important dans le mécanisme d’élimination du peroxyde d’hydrogène. Elle

nécéssitent la présence de glutatthion réduit (GSH), donneur d’électron. Le

glutathion oxydé (GSSG) produit est à nouveau réduit par la glutathion

réductase utilisant le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit

(NADPH) comme donneur d’électron.

• Le catalase : catalyse la dismutation du peroxyde d’hydrogène en eau et

oxygène moléculaire [31].

Figure n°13 : Représentation schématique des différents systèmes antioxydants

enzymatiques [31].


22

4.3. Les antioxydants exogènes de faible masse moléculaires

De nombreuses molécules issues de notre alimentation : vitamines, nutriments,

composés naturels,… sont considérés comme des antioxydants. Notons à titre d’exemples,

les plus courants [29].

4.3.1. L’α-tocophérol (vitamine E)

Est un antioxydant ayant pour rôle de stopper la chaîne de réaction de peroxydation

des lipides en capturant un radical lipidique peroxyle (LOO.). La vitamine E devient alors à

son tour une espèce radicalaire, moins réactive que le radical LOO. Qui peut être pris en

charge par une autre molécule antioxydante tell que la vitamine C, le glutathion [31].

Figure n°14: Structure du tocophérol et interaction avec le peroxyle lipidique [32].

4.3.1.1. La vitamine C

Est un antioxydant majeur présent dans tous les organes. Excellent donneur d’électron

l’anion ascorbate AH- piège les radicaux et donne un radical ascorbyle A-, La vitamine C

peut être régénérée par d’autre antioxydant [31].


23

Figure n° 15: Oxydation de l’acide ascorbique et dégradation du dérivé déhydroascorbate

[32].

4.3.1.2. Les métaux de transition

Sont essentielles pour certaines enzymes antioxydantes. En effet, le cuivre, le zinc et le

manganèse entrent dans la composition du site actif des différentes superoxydes dismutases.

Le sélénium est présent sous forme de sélénocystéine dans les sélénoprotéines telles que la

glutathion peroxydase [31].

4.3.2. Les dérivés phénoliques issus des végétaux

4.3.2.1. Flavonoïdes

Les flavonoïdes (FL-OH) sont thermodynamiquement capables de réduire les radicaux

libres oxydants comme le superoxyde, le peroxyle, hydroxyle, l’alloxyle par transfert

d’hydrogène [33].

Figure n°16 ; Piégeage des radicaux libres(R.) par les flavonoïdes [33].

D’autres études ont montré que les flavonoïdes sont aussi des bons inhibiteurs des

enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la xanthine oxydase, la

cyclooxygénase et la lipooxygénase [34]


24

4.4. Les méthodes d’évaluations de l’activité antioxydante

Les méthodes d’évaluation du caractère antioxydant peuvent être qualitatives ou

quantitatives. Les méthodes qualitatives, utilisées pour repérer l’activité antioxydante de

composés, sont relativement peu nombreuses et font intervenir en général, la coloration ou

la décoloration d’un réactif spécifique en présence d’agents antioxydants. Une des méthodes

les plus utilisées pour la détection d’antioxydants est la chromatographe sur couche mince

(CCM), qui donne naissance à des réactions colorées en présence de tels composés [35].

D’autres méthodes, moins pratiques, nécessitent la pulvérisation successive de deux

solutions différentes. Une phase reversée de chromatographie (chromatographie sur couche

mince), a été proposée par Glavind et Holmer [36].Combinée avec la détection visuelle pour

l’évaluation de l’activité de balayage de radical libre des fractions antioxydantes en

employant 1,1-Diphényl-2-Picryl –Hydrazyl (DPPH).

En ce qui concerne l’évaluation quantitative de l’activité antixydante, beaucoup de

méthodes peuvent être appliquées pour estimer directement l’activité antioxydante. La

génération de radical libre est directement reliée avec l’oxydation dan les nourritures et les

systèmes biologiques. Les méthodes principales comportent le balayage des radicaux de

superoxyde (O2.), le balayage de peroxyde d’hydrogène (H2O2), le balayage d’acide

hypochloreux (HOCl) [37]. Le balayage du radical d’hydroxyle (OH.), ou le balayage du

radical de peroxyle (ROO.). Parmi ces méthodes, nous citons ceux qui emploient l’azo-

composant pour produire des radicaux de peroxyles, tels que la méthode de PIEGE

(paramètre total d’antioxydant de radical piégeage) [38]. La méthode ORAC (capacité

d’absorbance du radical de l’oxygéne) [39]. La méthode d’ABTS (le balayage du radical

cation 2,2’-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) [40]. Le balayage du radical stable

1,1-Diphényl-2-Picryl –Hydrazyl (la méthode DPPH) [41].la méthode de DMPD (le

balayage du radicale cation N, N' –p-di-méthylique-phénylénediamine) [42],ou la méthode

photochemiluminescence (PLC) [43].

Actuellement, une des méthodes analytiques les plus communes pour déterminer

l’oxydation des lipides est l’analyse de TBA [44].qui mesure un complexe thiobarbiturique-

malonaldéhyde (TBA-MA) avec un maximum d’absorbance à 593 nm. La méthode TBA a

certaines limitations dans des systèmes de nourriture. Le TBA réagit non spécifiquement

avec des composés tels que les sucres, l’acide ascorbique, et les produits non enzymatiques

de brunissement souvent actuels en nourritures.

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre IIIIIIII Matériel et MéthodesMatériel et MéthodesMatériel et MéthodesMatériel et Méthodes

Chapitre II : Matériel et Méthodes

25

1. Matériel végétal

Nous s’intéressons dans notre étude à une partie de l’arbre les fruits. Le tableau III

regroupe les caractéristiques de distinction entre les individus ainsi la description de leurs

échantillons de fruit.

Tableau III : Cartérstiques de distinctions les échantillons de Pistachier de l’Atlas


26

1.1. Lieu et climat des régions de la collecte des échantillons

Les douze échantillons de Pistachier de l’Atlas sont récoltés de la région de Laghouat

(A4, A5, MA), de la région Hassi R’mel (D3, D9, MB), et d’Aïn Oussera (E2 F4, E5, F8, E10,

MF) au cours du mois d’Août 2006.

Les situations géographiques de ces situations figurent dans le tableau IV

Tableau IV : Géographie des stations de récoltes [45].

Région Altitude Latitude Longitude Etage bioclimatique

Laghouat 750m 33° 47' N 02° 52' E Semi-arides

Hassi R’mel 774m 32°.95' N 03°.18' E Semi-arides

Aïn Ouassera 649m 35° 33' N 02°3l' E Semi-arides

1.1.1. Echantillonnage

Les fruits sont collectés de plusieurs arbres situés dans trois différentes régions à

savoir ; région de Laghouat, région de Hassi R’mel et la région de Ain Oussera. Les fruits

sont divisés en deux groupes ; les fruits matures de couleur verte ou noir et les fruits

immatures de couleur rouge. Pour chaque échantillon de fruit nous avons attribués un code.

Les codes attribués aux fruits sont :

Les fruits matures

MA : la région de Laghouat

MB : la région de Hassi R’mel

MF : la région d’Aïn Oussera

Pour les fruits immatures

(A4, A5) : La région de Laghouat

(D3, D9) : la région de Hassi R’mel

(E2, E5, E10, F4, F8) : la région d’Aïn Oussera

Notre démarche expérimentale est résumée à travers le diagramme (voir l’annexe I)


27

2. Méthodes

Ces méthodes sont consacrées à l’application des méthodes permettant d’extraire et de

quantifier les composés lipidiques et phénoliques des fruits de Pistachier de l’Atlas d’une

part et d’évaluer le pouvoir antioxydant de ces extraits d’autre part.

Notre étude à été surtout guidée par trois idées majeures suivantes :

1- L’analyse des fractions lipidiques en acide gras et leurs teneurs en

tocophérols

2- La quantification de nos extraits (lipidiques et délipidés) en composés

phénoliques totaux et en flavonoïdes par des simples méthodes basées sur

la spectrophotométrie UV-Visible

3- Dans l’optique de découvrir de nouvelles molécules possédant une activité

antioxydante pour lutter contre les radicaux libres responsables de la

dégradation des cellules vivantes, nos extraits ont été testés par leur effet

antioxydant dans des systèmes modèles.

2.1. Méthodes d’extraction des lipides

2.1.1. Extraction solide-liquide

L’extraction solide-liquide est l’opération fondamentale qui a pour but d’extraire, de

séparer de dissoudre soit par macération soit par percolation d’un liquide, un ou plusieurs

composants (liquide ou solide) mélangés à un solide C’est une opération de transfert ou

d’échange de matière entre une phase solide, qui contient la matière à extraire et une phase

liquide, le solvant d’extraction [46].

Au cours de ce travail nous avons utilisés une technique d’extraction dont les plus

importantes c’est l’extraction par macération à température ambiante.


28

2.1.1.1. Macération

50 g de la poudre végétale est macérée à température ambiante avec 100 ml dans de

l’hexane comme solvant pendant 48 heures à l’obscurité, l’extrait est filtré et le résidu

obtenu est repris pour une deuxième dans 50 ml du même solvant pendant 72 heures dans

les mêmes conditions, après une filtration et séchage sur du sulfate de sodium anhydre,

l’hexane est évaporé sous pressions réduite à 40°C [47]. Les extraits lipidiques obtenus

sont pesés, la teneur en huile de chaque échantillon est calculée selon la relation (1).

2.2. Analyse des acides gras

Les acides gras étant les constituants essentiels des glycérides c’est par leur

connaissance que l’analyse peut déterminer les caractéristiques d’identité des corps gras

selon :

� La présence ou non de certains acides gras

� Les proportions des acides gras entre eux

Les acides gras peuvent être analysés sous forme libre, mais généralement se sont

analysés après leur transformation en leurs esters méthyliques d’acides gras (EMAG)

qui sont plus volatils.

2.2.1. Préparation des esters méthyliques

Les techniques de préparation des ester méthyliques sont relativement nombreuses

Nous avons choisie la méthode de remplacement décrite par l’Association Française de

Normalisation (AFNOR). Cette méthode comporte deux étapes consistent à préparer les

EMAG, puis les analyser par CPG [48].

� Saponification

On pèse environ 0,5 g de l’échantillon de chaque huile, on introduit la prise d’essai

dans un ballon de 250 ml, on ajoute environ 10 ml du méthanol et 10 ml d’hydroxyde de

potassium méthanolique (KOH/CH3OH, 1N), porté a l’ébullition sous réfrigérant à reflux.

Masse de l’extrait x 100 Teneur = % (1)

Masse de la prise d’essai (matière végétale)


29

La solution doit devenir limpide pendant 15 a 20 minutes. On refroidit le ballon, et puis on

transvase le contenu du ballon dans une ampoule à décanter de 125 ml, on rince le ballon

avec 20 ml de hexane et les verser dans l’ampoule, on ajoute 20 ml d’eau distillée avec

agitation puis on laisse décanter, on obtient deux phases une organique et l’autre aqueuse,

les esters méthyliques se rassemblent dans la phase organique, on récupère cette phase qui

contient les EMAG puis on extrait la phase aqueuse une seconde fois par 20 ml de hexane.

On fait réunir les deux extraits organiques et on les lave 3 fois avec 20 ml d’eau pour

éliminer les traces de la base, on laisse la solution organique décanter, puis on la sèche avec

quelques grammes de sulfate de sodium anhydre Na2SO4.

Les esters méthyliques sont obtenus après évaporation du solvant sous pression réduite,

puis ils sont solubilisés dans 0.5 mL d’éthyle éther puis conserver au froid à 6°C

L’analyse des acides gras après estérification a été réalisée par chromatographie en

phase gazeuse. Lors de cette analyse, nous avons utilisé un appareil chromatographique de

type Delsi Instruments Chromatographe (annexe IX).

2.3. Analyse des tocophérols par HPLC

Le dosage des tocophérols individuels a été effectué par chromatographie liquide à

haute performance [47,49]. Lors de cette analyse, nous avons utilisé un appareil

chromatographique de typeWISP710 waters (annexe IX). Nous avons effectué l’analyse

directement sur l’huile. Pour cela, on pèse une quantité bien connue de chaque extrait

lipidique de nos échantillons puis solubilisée dans un volume de 1 ml de pentane.

L’identification des différents tocophérols présents dans l’huile de fruit de Pistachier de

l’Atlas est faite par la co-injection des tocophérols étalons (α, β, γ et δ). Rappelons ici que la

colonne inverse utilisée dans la séparation ne peut pas séparer les deux isomères β et γ. Un

étalonnage externe nous a permis de quantifier chaque tocophérol dans les différents

échantillons d’huiles.


30

3. Extraction et analyse quantitative des composés phénoliques

3.1. Tourteaux

Les tourteaux sont les résidus solides obtenus après l’extraction de l’huile des graines

ou des fruits oléagineuses. Ce sont les co-produits. Ils sont utilisés en alimentation animale.

Ils constituent la 2éme classe d’aliments les plus importants après les céréales. En effet ils

représentent la principale source de protéines en alimentation animale [50].

3.2. Méthode d’extraction des composés phénoliques

3.2.1. Extraits délipidés

- procédure expérimentale

A partir d’une quantité bien déterminée 2 g de matière végétale delipidès macérées

dans 100ml de méthanol pendant 24 heures à l’obscurité et à température ambiante. Après

une filtration, on obtient l’extrait méthanolique qui est évaporé à sec sous vide à 40°C pour

l’élimination du méthanol. Chaque résidu est repris dans 15 ml méthanol pur et conservé à

moins 10 °C [51].

3.3. Analyse quantitative

3.3.1. Analyse quantitative des composés phénoliques

3.3.1.1. Dosage des phénols totaux.

Le dosage des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée de Singleton et

Ross en (1965) avec le réactif de folin-ciocalteu [52]. Le réactif est formé d’acide

phosphotungestique H3PW12O40 et d’acide phosphomolybdique H3PMo12O40, qui sont

réduits lors de l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de

molybdène (Mo8O23), ce qui nous aide à doser les phénols dans le visible à une longueur

d’onde de l’ordre 760nm. Dans cette méthode on a utilisé l’acide gallique comme un phénol

standard (étalon).


31


Une courbe d’étalonnage standard a été obtenue à partir des solutions d’acide gallique

à différentes concentrations massiques .A l’aide d’une micropipette, 100 µL de chaque

solution ainsi préparée ont été introduits dans des tubes à essai, suivis de l’addition de 500

µl du réactif de Folin-Ciocalteu (10% dans l’eau distillée). 2ml de carbonate de sodium

(4%m/v) ont été ajoutés, puis les solutions sont maintenues à l’obscurité pendant 30 minutes

à la température ambiante. L’absorbance de chaque solution a été déterminée à 760nm

contre un blanc sur un spectrophotomètre de Shimadzu 1601.

L’analyse quantitative des phénols totaux des extraits lipidique (diluée dans l’éthanol)

a été réalisée par la même procédure.

3.3.1.2. Dosage des flavonoïdes

La quantification des flavonoïdes a été effectuée par une méthode adaptée par

Lamaison et Carnat (1991) en utilisant une solution méthanolique ou éthanolique de

trichlorure d’aluminium comme réactif [53].

Lors de cette réaction les flavonoïdes réagissent avec ce réactif en formant un

complexe jaune et qui absorbe dans le visible à une longueur d’onde de 430nm. Dans cette

méthode, la rutine a été utilisée comme étalon (flavonoïde de référence).

-Procédure exprémentale

A partir d’une solution mère de la rutine, nous avons préparés des solutions filles de

concentrations différentes. A une quantité de 1ml de chaque solution ainsi préparée on ajoute

le même volume d’une solution alcoolique de 2% de trichlorure d’aluminium. Après

incubation à l’obscurité et à la température ambiante pendant 15min, l’absorbance du

mélange de la réaction a été mesurée à 430 nm contre un blanc en employant le même

spectrophotomètre utilisé précédemment. En utilisant les valeurs de l’absorbance ainsi

obtenues, nous avons tracé la courbe d’étalonnage de la rutine. La quantification des

flavonoïdes dans nos extraits a été déterminée en suivant le même protocole décrit lors de la

préparation de la courbe d’étalonnage de la rutine.


32

4. Evaluation de pouvoir antioxydant des extraits de Pistachier de l’Atlas

Il y a augmentation parallèle de l’intérêt croissant pour les antioxydants et de

l’utilisation des méthodes pour estimer l’efficacité de ces substances [37]. De nombreuses

méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’activité antioxydante des composés

phénoliques purs ou des extraits. La plupart de ces méthodes sont basées sur la coloration ou

la décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel [54]. Dans notre étude nous avons

utilisé trois différents tests chimiques à savoir : le test DPPH, c’est le test le plus

fréquemment rencontré dans la littérature, le test molybdate phosphate pour évaluer le

pouvoir réducteur des extraits et enfin le test ABTS

4.1. Test du DPPH

- principe du test

Ces dernières années, un intérêt grandissant porté aux substances potentiellement

antioxydantes est apparu en vue de prévenir notamment les effets délétères des radicaux

libres formés de façons endogènes dans l’organisme ou bien issues de processus physiques,

notamment de la radiolyse de l’eau

Parallèlement à cela, de nombreuses méthodes se sont développées permettant

d’évaluer les capacités antioxydantes des composés naturels ou bien issus de la synthèse

chimique. L’une d’entre elle, couramment utilisée, fait appel à l’utilisation d’un radical libre

stable, le (1,1-Diphényl-2-Picryl -Hydrazyl) (DPPH).

La stabilité de ce radical résulte de la délocalisation importante de l’électron

célibataire sur la totalité de la molécule (figure n°17). D’autre part, cette délocalisation est

à l’origine de la coloration violette en solution éthanolique ou méthanolique caractérisée par

une bande d’absorption dans le visible à 517 nm [55].


33

Figure n°17: Structure chimique du radical 1,1-Diphényl-2-Picryl -Hydrazyl et de sa

forme réduite [41].

-principe

Le principe de ce test est le suivant ; l’addition du radical DPPH. à une solution

éthanolique contenant un composé potentiellement antioxydant et pouvant céder un atome

hydrogène entraîne une diminution de la coloration violette caractéristique de l’apparition de

la forme réduite de DPPH.

Simultanément il se forme un autre radical, lui-même pouvant engendrer des réactions

secondaires, notamment des dimérisations. Au terme de la réaction, il persiste une légère

coloration jaune due au groupement picryle résiduel.

Si nous représentons le radical DPPH. par Z

. et la molécule donneuse d’hydrogène

par AH, la réaction peut s’écrire de façon suivante :

Certaine molécules peuvent donner deux atomes d’hydrogène, c’est le cas de l’acide

ascorbique (vitamine C). Deux molécules de DPPH. sont donc réduites par une molécule

d’acide ascorbique


34

-Principe RPE

Basée sur les principes de la mécanique quantique, la technique consiste à mesurer

l’absorption d’une onde électromagnétique traversant une solution soumise à un champ

magnétique.

Figure n° 18: Evolution du spectre RPE du radical DPPH en fonction de la

concentration antioxydant X [56].


On mélange 1ml de chaque extrait lipidique (dilué dans de l’éthanol) avec 1ml avec un

1 ml d’une solution de DPPH. (250 µM) préparée dans l’éthanol. Le mélange réactionnel a

été bien mélangé et incubé à l’obscurité pendant 30 min à une température ambiante pour

que la réaction s’accomplisse. L’absorbance a été mesurée à une longueur d’onde de 517 nm

contre un blanc.

L’activité antioxydante de nos extraits exprimée en EC50, ce paramètre a été

apparemment introduit par Brand Williams et ses collaborateurs et a été en suite employé

par plusieurs groupes de chercheurs pour présenter leurs résultats, il est définit comme étant

la concentration efficace du substrat qui cause la perte de 50% de l’activité de DPPH.

Un autre paramètre exprime la puissance antiradicalaire a été calculé à partir du

premier paramètre noté '' ARP'' puissance antiradicalaire noté '' ARP'' égale à 1/EC50 plus

ces valeurs ne tendent pas et s’éloignent du zéro plus la puissance antioxydant augmente

[57]. Egalement nous avons testé la vitamine C, la vitamine E et BHA (des antioxydants

commerciaux pris comme antioxydants de référence).


35

4.2. Teste Molybdate Phosphate

L’analyse de Molybdate Phosphate est un essai direct qu’on l’emploi principalement

pour mesurer la possibilité et la puissance des antioxydants non enzymatique.

Cette méthode dépend de la réduction du Molybdate (VI) au Molybdate (V) en

présence des extraits ou des composés purs et la formation d’un complexe de Molybdate

Phosphate de couleur verte, qui est détecté par spectrophotométrie en mesurant le

changement de l’absorbance 695 nm [58].

L’analyse de molybdate phosphate est réalisée en suivant protocole décrit comme suit :

On prépare 100ml d’un mélange des trois solutions suivants :

� 0.6 M acide sulfurique

� 28 mM phosphate sodium

� 4 mM molybdate ammonium [58].

200 µl de chaque extrait lipidique ou phénolique dilué sont ajouté à 2 ml de la solution

précédente. Le mélange est placé dans un bain marie à une température de 50 C° pendant 90

min, après refroidissement l’absorbance est mesurée à 695 nm.

L’évolution de l’activité antioxydante de nos extraits est comparée par rapport à la

vitamine E qui utilisée comme antioxydant dans l’industrie agroalimentaire.

Il est nécessaire de mettre en évidence l’efficacité de cet antioxydant de référence à ce

test et cela en traçant une courbe d’étalonnage de la vitamine E. Une courbe d’étalonnage a

été établie pour des différentes concentrations de vitamine E afin d’exprimer le pouvoir

antioxydant de nos extraits en VEEAC (vitamine E Equivalent Antioxydant Capacity).


36

4.3. Test d’ABTS

L’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) est également un radical

libre et stable. Il est très utilisé pour évaluer le pouvoir antioxydant des fluides biologiques,

des mélanges complexes ou bien des composés purs. Ce radical est capable de réagir avec

des antioxydants classiques de type phénols thiols mais aussi avec tout composés donneur

d’hydrogène ou d’électron [59, 60]. Ce radical cation est facilement formé par oxydation en

présence de persulfate de potassium pour donner une solution colorée en vert-bleu. D’autres

oxydants peuvent être utilisés tels que le dioxyde de manganèse (MnO2). Le radical formé

est stable avec des coefficients d’extinction molaire élevés à 415 nm, 650 et 734 nm. La

concentration de ce radical peut être déterminée en mesurant l’absorbance à ces longueurs

d’ondes. L’addition d’un antioxydant à une solution de ce radical cation entraîne la

réduction de ce radical et une diminution de l’absorbance à 415 nm , cette diminution

dépend de l’activité antioxydante des composés testés mais souvent aussi du temps et de la

concentration [61].

Figure n°19: Structure du L’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) :

forme réduit ABTS, forme radical cation ABTS•+

-principe

Ce test est basé sur une propriété intrinsèque de la molécule d’ABTS. En effet, en

présence de radicaux hydroxyles l’ABTS est oxydé en un radical ABTS•+ (après

l’arrachement d’un électron e- à un atome d’azote). En présence de Trolox (ou antioxydant

donneur de H•) l’atome d’azote concerné piège un H• conduisant à l’ABTS) ce qui entraîne

la décoloration de la solution (figure n°20)


37

Figure n°20 : Formation et piégeage du radical ABTS•+ par un antioxydant [62].

-procédure expérimentale

Le radical cation ABTS•+ est produit en faisant réagir 100µl d’ABTS [2,2'-azino-bis

(3-éthylebenzothiazoline-6- sulfonique)] de 20 mM avec 15µl de H2O2 de 1 mM et 100µl

de peroxydase de 0,02 mg/ml (préparée dans un tampon phosphate à un PH=5), le mélange

est complété par une solution tamponnée de phosphate de pH=6,8.

Pour déterminer le pouvoir antioxydant exprimé en TEAC (Trolox Equivalent

Antioxydant Capacity) de nos extraits, une courbe d’étalonnage de Trolox est préalablement

préparée. La courbe d’étalonnage du trolox a été préparée en traçant le pourcentage

d’inhibition en fonction de la concentration du trolox. Pour ce faire à une quantité de 100µl

de la solution du trolox déjà introduite dans une cuvette, on ajoute 1 ml du radical cation

ABTS•+ initial, pour aboutir à un taux d’inhibition d’absorbance de 20- 80%. La diminution

de l’absorbance à 415 nm est déterminée à un intervalle de temps régulier de 0 à 5 min par

différence avec une cuvette de référence contenant la solution d’ABTS•+ sans antioxydant.

Pour les extraits le même procédure déjà mentionné en remplaçant la quantité du trolox par

les extraits étudiés.

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre IIIIIIIIIIII Résultats et discussion Résultats et discussion Résultats et discussion Résultats et discussion

Chapitre III : Résultats et discussion

38

1. Résultats de l’analyse quantitative

1.1. Analyse quantitative des lipides

1.1.1. Teneur en lipides

La teneur en huile dans les fruits de Pistachier de l’Atlas ainsi l’aspect des huiles sont

mentionnés dans le tableau V. Les huiles obtenues des fruits immatures de Pistachier de

l’Atlas ont une couleur rouge orangé, par contre la couleur des huiles extraites des fruits

matures est jaune claire. Ces huiles ont une odeur agréable et se solidifient partiellement à

la température ambiante, et cela est peut être due à l’existence des acides gras saturés dans

la composition des huiles en proportion un peu élevée. A la lumière de ces résultats, on

remarque que les teneurs en huile dans les fruits de Pistachier de l’Atlas étaient largement

variable (3,81 et 15,92% pour les fruits immatures et 24,63 à 29,30 % pour les fruits

matures), et lisiblement montré dans (figure n°21).

Tableau V : La teneur des échantillons des graines de Pistachier de l’Atlas en huile

Echantillons Couleur de

l’huile

Teneur en

huile

(%)

E2 Jaune claire 15,30



F4 Jaune claire 13,50

F8 Jaune foncé 12,40

D3 Jaune claire 3,81

D9 Jaune claire 12,20

A4 Jaune claire 7,61

A5 Jaune foncé 7,80

MA Jaune orange 24,76

MB Jaune orange 24,63

MF Jaune orange 29,30


39

Figure n°21 : Les teneurs des lipides obtenus par macération

Les teneurs en huiles dans les fruits matures sont très voisines et plus importantes que

dans les fruits immatures de Pistachier de l’Atlas.

Les fruits de la région Aïn Oussera présentent la teneur la plus élevée (29,30 %), par

rapport aux deux autres régions Hassi R’mel et Laghouat qui présentent des teneurs

inférieures à 14 % ce qui confirme que l’origine de la région influe beaucoup sur la teneur

en huile dans les fruits de Pistachier de l’Atlas.

Si nous comparons nos résultats par rapport à ceux cités dans la littérature [63], on

peut dire que les fruits matures de Pistachier de l’Atlas sont riches en matière grasse. Toutes

fois les teneurs obtenues de la région Aïn Oussera sont très proches aux huiles végétales

alimentaires comme les huiles : olive, tournesol, soja et arachide (20-42 %) et donc on peut

classer ces graines parmi les graines riches en matières grasses.


40

1.1.1.1. Compositions en acides gras de l’huile du fruit de Pistachier de l’Atlas.

L’identification des pics représentatifs des esters méthyliques à été réalisée en utilisant

des substances de références (esters méthyliques) et ceci par comparaison des temps de

rétention de chaque pic du chromatogramme avec ceux obtenus par les étalons, (figure n°22

et l’annexe II).

Figure n°22 : Chromatogrammes des EMAG des huiles (MA, MB)

de Pistachier de l’Atlas


41

A partir des chromatogrammes des EMAG des différents échantillons d’huile, nous avons

dressé le tableau II qui indique les proportions relatives des divers esters méthyliques

d’acides gras obtenus par saponification d’huile de fruit de Pistachier de l’Atlas est

estérification par le méthanol.

Nous observons que les échantillons d’huile du fruit de Pistachier de l’Atlas contiennent huit

acides gras habituellement rencontrés dans les huiles végétales, on l’occurrence les acides :

myristique, palmitique, palmitiolèique, stéarique, oléique, linoléique, linolénique et

arachidique.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau VI.

Tableau VI : Composition en acides gras des huiles des fruits de Pistachier de l’Atlas.


42

Les huiles des fruits de Pistachier de l’Atlas (matures et immatures) sont caractérisées

par leurs richesses en acides gras mono- et di-insaturés. Les acides gras insaturés

représentent (81,67 % pour les extraits lipidiques immatures et 82 % pour les extraits

matures). L’acide oléique est le plus important suivi de l’acide linoléique. Parmi les acides

gras saturés, on enregistre la présence de l’acide palmitique à une proportion assez élevée

15,5% pour les extraits matures et 9,6% pour les extraits lipidiques immatures, ainsi que la

présence de l’acide stéarique mais avec des proportions faibles 3,2% pour les extraits

matures et 5,5% pour les extraits lipidiques immatures.

Si l’on compare la nature et la composition en acides gras dans l’ensemble des extraits

lipidiques, on note une similitude du point de vu qualitatif. Toutes fois, les acides gras

saturés en particulier l’acide palmitique sont en proportion plus importante dans les extraits

matures.

En comparant les résultats de nos analyses avec ceux collecté par UCCIANI [8], nous

remarquons que la teneur en acides gras insaturés dans les l’huiles étudiées est très proche

de celle du fruit de Pistachier Lentisque d’origine française.

1.1.1.3. Dosage des tocophérols

L’identification des tocophérols (α, β, γ, δ) présents dans les huiles étudiées est faite

par comparaison des temps rétentions ( tR ) avec ceux des solutions standards éthanoliques

de tocophérols commerciaux [47],(figure n°23 et l’annexe III).


43

Figure n°23 : Chromatogrammes HPLC des tocophérols standard et des huiles (D9 et MA)

de fruits Pistachier de l’Atlas


44

Tableau VII : Quantité de tocophérols individuels en (µg/g) dans les huiles des fruits

du Pistachier de l’Atlas

Echantillons [α] (µg/g) [β + γ ] (µg/g) [δ] (µg/g) Total (µg/g)

E2 38,14 193,6 2,56 234,36

E5 77,32 205,76 4,08 287,17

E10 47,82 156,41 0,84 205,08

F4 59,91 174,18 2,58 236,68

F8 66,07 220,92 5,94 292,95

D3 266,31 215,47 9,47 491,26

D9 115,05 196,73 1,70 313,49

A4 217,78 145,58 1,07 364,43

A5 115,05 196,73 1,07 313,49

MA 11,54 98,21 0,32 110,08

MB 80,75 80,14 0,20 161,09

MF 51,85 89,09 0,61 141,56

L’analyse des tocophérols des différents échantillons d’huile des fruits de Pistachier de

l’Atlas par CLHP fait apparaître une très forte prédominance des isomères α et (β+γ).

Les résultats obtenus montrent que la teneur de l’huile du fruit de Pistachier de l’Atlas

en tocophérols totaux est importante surtout si en compare cette teneur par rapport à d’autres

huiles végétale comme l’huile d’amande (236µg/g), et l’huile d’olive (200µg/g) [64].

Par ailleurs les huiles extraites des fruits de la région de Hassi R’mel sont plus riches en

tocophérols pour les deux groupes de fruits matures et immatures que ceux de Laghouat et

d’Aïn Ouassera. La variation de la teneur en tocophérols entre les différents individus est

importante. Pour les extraits immatures cette variation présente un étendu de (286,176 µg/g),

cependant cette dernière est moins importante pour les fruits matures, avec un étendu de

(51,019µg/g). Il faut noter que les fruits immatures sont plus riches en tocophérols que les

fruits matures.

La synthèse des différents résultats pour l’analyse des lipides montre nettement que la

teneur en lipide et celle des fractions insaponifiable (tocophérols) est un caractère spécifique

pour chaque individu


45

2. Composés phénoliques

Les extraits des composés phénoliques obtenus à partir des tourteaux présentent un

aspect d’une poudre de rouge- jaunâtre pour les fruits immatures et marron pour les fruits

matures à l’exception de l’extrait de fruit mature MA qui a une couleur violette.

2.1. Teneur en composés phénoliques totaux.

La teneur en composés phénoliques de chaque extrait a été calculée à partir de la

courbe d’étalonnage de l’acide gallique (figure n°24), et exprimée en milligrammes par

gramme de la matière sèche en équivalent en acide gallique.

Figure n°24 : La courbe d’étalonnage de l’acide gallique


46

Les résultats obtenus sont exprimés dans le tableau VIII

Tableau VIII: Quantité en phénols totaux des différents échantillons

Extrait délipidé (tourteaux)

Extrait lipidique (huile brute)

Echantillons mg/g Echantillons mg/g

E2 47,30 E2 0,48

E5 76,00 E5 6,54

E10 42,27 E10 3,37

F4 75,80 F4 1,78

F8 78,81 F8 5,09

D3 87,30 D3 7,80

D9 44,60 D9 8,07

A4 86,36 A4 6,03

A5 87,60 A5 2,92

MA 52,84 MA 12,90

MB 33,92 MB 7,80

MF 41,67 MF 9,83

On remarque d’après les résultats consignés dans le tableau ci-dessus que la quantité

des composés phénoliques dans les extraits des tourteaux est très importante (33,92 à 87,60

mg/g) par rapport à celle des extraits des lipides (0,48 à 12,90 mg/g).Ce résultat est en

accords avec d’autres travaux sur des graines oléagineuses déjà étudiées comme le

tournesol et le soja [65], on peut dire que les tourteaux du Pistachier de l’Atlas constituent

une source prometteuse en composés phénoliques.

Du point de vu comparative, les extraits de Laghouat sont plus riches en composés

phénoliques pour les deux parties (tourteaux, lipides) que ceux de Hassi R’mel et d’Aïn

Oussera à l’exception des extraits lipidiques immatures où la valeur moyenne est de l’ordre

de 4,48 mg/g relativement faible devant les échantillons de Hassi R’mel.


47

Les extraits lipidiques des fruits matures sont plus riches en composés phénoliques par

comparaison aux fruits immatures et cela est peut être due à la proportion élevée d’huile dans

les fruits matures de l’arbre. Les diverses conditions thermiques pourraient engendrer des

modifications importantes dans la concentration finale en composés phénoliques [66,67].

En revanche les teneurs en phénols totaux dans les tourteaux des fruits immatures

présentent des valeurs plus importantes que dans les tourteaux des fruits matures la seule

explication revient à la biosynthèse des composés phénoliques, les enzymes clés sont PAL

(Phénlanine Amonia Lyase) et la chalcone synthase (CHS). Les activités enzymatiques ces

deux enzymes diminuent pendant la maturation de la graine [68,69].

La variation de la teneur en composés phénoliques entre les différents individus dans

les deux groupes d’extraits (lipide et tourteaux) est importante. Pour les extraits des

tourteaux cette variation présente un étendu de 53,35 mg/g (on remarque que la valeur

maximale et la valeur minimale sont enregistrés par deux individus de la même région de

Hassi R’mel), mais les étendus réels des individus de la région de Laghouat et de Aïn

Oussera sont respectivement 34,7273 mg/g et 37,145mg/g.

Par ailleurs, en ce qui concerne les extraits lipidiques la variation est moins importante

l’étendu est de 12,404 mg/g, mais on remarque que les extraits lipidiques matures présentent

des valeurs très voisines.

En fin il faut noter que la quantité des phénols totaux dans les extraits lipidiques

déterminée par spectroscopie UV-visible en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteux qui est

réduit en présence des composés phénoliques est trop élevée par rapport à la quantité des

tocophérols individuels calculée par CLHP. Cette grande différence est peut être due au fait

que les huiles des fruits de Pistachier de l’Atlas contiennent en plus des tocophérols et des

composés phénoliques de structures chimiques différentes à part les tocophérols comme les

hydroxybenzoiques, les hydroxycinnamiques, les flavonoïdes et autres.


48

2. 1.1. Teneur en flavonoïdes

La quantité des flavonoïdes dans nos extraits a été déterminée à l’aide de la courbe

d’étalonnage de la rutine prise comme flavonoïde étalon (figure n ° 25)

Figure n°25 : La courbe d’étalonnage de la rutine

Les résultats obtenus exprimés en milligrammes par gramme de la matière sèche en

équivalent de la rutine, ainsi que le pourcentage en flavonoïdes par rapport aux teneurs en

phénols totaux, sont regroupés dans le tableau IX.


49

Tableau IX: Quantité en flavonoïdes de différents échantillons

Extraits des échantillons délipidés

Extraits des échantillons lipidiques

Echantillons mg/g Taux

%

Echantillons mg/g Taux

%

E2 11,58 47,30 E2 0,40 31,50

E5 17,05 22,43 E5 0,66 10,17

E10 11,63 27,51 E10 1,59 47,41

F4 49,88 65,81 F4 1,25 70,12

F8 16,09 20,42 F8 1,49 29,28

D3 23,26 26,66 D3 3,08 39,58

D9 09,35 20,96 D9 1,19 14,47

A4 12,48 14,45 A4 0,47 07,58

A5 24,75 26,26 A5 0,91 31,30

MA 08,71 16,48 MA - -

MB 07,331 21.61 MB 0,643 08,05

MF 10,30 24,73 MF 0.93 09,46

L’analyse de l’ensemble des résultats obtenus (tableau IX) montre clairement que les

extraits délipidés d’Aïn Oussera (matures ou immatures), sont plus riches en flavonoïdes et

présentent une valeur moyenne de l’ordre 17,77 mg/g.

Par ailleurs en ce qui concerne les extraits lipidiques, on remarque que les individus

(matures et immatures) de Laghouat surtout les fruits noirs sont très pauvres en cette classe

de composés phénoliques devant les extraits d’Aïn Oussera et Hassi R’mel. En revanche les

extraits lipidiques immatures de cette dernière présentent la teneur la plus élevée la valeur

moyenne est de l’ordre 2,13 mg/g.

Pour une meilleure représentation nous présentons nos résultas dans les histogrammes

ci-dessous. Dans un souci de simplification, les différents individus ont été classés par ordre

décroissant en teneur des composés phénoliques totaux.


50

Nous présentons alors, (figure n°26,27) les différentes valeurs du contenu en phénols

totaux et en flavonoïdes pour chaque extrait. Il est clair à partir de ces histogrammes que les

quantités des phénols totaux et les flavonoïdes ne varient pas dans le même sens à titre

d’exemple, on remarque que le pourcentage en flavonoïdes dans l’extrait délipidé F4 est plus

important que dans les autres extraits alors qui n’est pas l’extrait le plus riche en composés

phénoliques totaux. La même remarque peut-être faite sur les extraits lipidiques.

Figure n°26 : Comparaison entre les teneurs en phénols totaux et en flavonoïdes des extraits

délipidés de fruit de Pistachier de l’Atlas

Figure n°27 : comparaison entre les teneurs en phénols totaux et en flavonoïdes des extraits

Lipidiques de fruit de Pistachier de l’Atlas.


51

A la lumière de ces résultats, on déduit que la variation de la teneur en flavonoïdes

d’un individu à l’autre que se soit mature ou immature est moins importante par rapport a

celle des phénols totaux l’étendu pour l’extraits délipidés de la région de Laghouat est de

16,044 mg/g alors que l’étendu pour les extraits de la région du Hassi Remel est de 30,578

mg/g, pour les extraits de la région d’Aïn Oussera cette valeur et de 39.578 mg/g.

Par ailleurs pour les extraits lipidiques des fruits, la variation de la teneur en

flavonoïdes a comme étendu, 2.67mg/g pour la série des échantillons, 0,443mg/g pour

l’échantillon de Laghouat et 1,08545 d’Aïn Oussera, la teneur maximale est toujours

présentée par les extraits lipidiques de Hassi R’mel qui est égale à 2,441 mg/g.

Les extraits des tourteaux sont riches en flavonoïdes par comparaison aux extraits

lipidiques. En revanche si on parle du taux de flavonoïdes par rapport aux teneurs en

phénols totaux, la teneur en flavonoïdes dans les extraits phénoliques des tourteaux et les

extraits lipidiques présente une variation importante d’un individu à un autre. Ces variations

ont un étendu de 51,36 % dans les extraits des tourteaux pour l’ensemble des individus,

quand aux extraits lipidiques cette valeur est de 70,12%.

Au cours de cette étude, nous avons montré que les teneurs en phénols totaux dans les

fruits de Pistachier de l’Atlas présentaient un fort déterminisme génétique et

environnemental, et cela comme il est mentionné dans la littérature [70,71]. Cependant,

d’après les travaux préliminaires de Yousfi et al. [1], qui avaient signalé une grande

différence de teneur en composés phénoliques totaux entre les tourteaux et les lipides du

fruit de Pistachier de l’Atlas. Face à la demande actuelle d’une maitrise des teneurs et

compositions dans la graine, avec une utilisation très différente de deux sous partie de la

graine, l’étude de la compartimentation des phénols entre les lipides et les tourteaux s’est

imposé [72]. Les tourteaux présentent, en fait une teneur beaucoup plus élevée et très

variable que les lipides. Ainsi bien que les flavonoïdes dans les tourteaux des fruits de

Pistachier de l’Atlas représentent un taux de 14,45 à 65,81 % de la teneur des phénols

totaux. Cette importante variation est peut-être due aux différentes conditions

environnementales des régions de prévenance des fruits de Pistachier de l’Atlas. Nous avons

pu aussi montré que les lipides et les tourteaux n’étaient pas soumis de la même manière à

l’influence des facteurs environnementaux .L’effet de la température sur la teneur en

polyphénols dans les graines oléagineuses reste controversé, mais dans tous les cas, la


52

variation de la température de nuit ou de jour sur les tourteaux des fruits immatures présente

les teneurs en polyphénols les plus importantes par apport aux fruits matures, et inversement

proportionnelle pour les extraits lipidiques.

Les teneurs en phénols totaux dans les lipides et dans les tourteaux sont cependant

aussi sous un fort contrôle génétique lorsque l’on compare des variétés de la même région,

les teneurs en phénols ne sont pas strictement corrélées, Comme exemple on prend les

échantillons de la région d’Aïn Oussera

La quantité en composés phénoliques totaux dans les extraits lipidiques sera bien

inférieure à celles dans les tourteaux. On peut émis l’hypothèse d’une importation des

polyphénols de d’autres parties de la graine, cependant, étant donné les différences de

profils, il est peu probable qu’elles sont masqués par des grosses molécules lors de

l’extraction des lipides. De plus les enzymes nécessaires à la synthèse des polyphénols ont

été seulement dans l’embryon, mais les résultats publiés ne séparent pas les tourteaux et les

lipides de la même graine [73], au vu de nos résultats, il semble très probable que l’embryon

synthétise leur propre polyphénols, par contre, la provenance des polyphénols lipidiques est

moins certaines et cela est peut être due de l’accumulation transitoire des polyphénols dans

le tégument.


53

3. Résultats de l’étude du pouvoir antioxydant

3.1. Test chimique DPPH

Les mesures de la diminution de l’absorbance du radical DPPH provoquée par la

présence des extraits après 30 minutes ont permis de déterminer le pouvoir antioxydant des

différents extraits. Le pouvoir d’inhibition (PI) a été exprimé en présence de différentes

dilutions (PI% en fonction de la concentration après 30 min d’incubation à température

ambiante à l’obscurité). Les dilutions sont effectuées de sort que le coefficient de

corrélation (R2) de ces tracés soit supérieur à 0,90. Le pouvoir d’inhibition est calculé à

partir de la relation suivante.

PI(%)= [1-(A extraits /A témoin)] x100

PI(%) : pouvoir d’inhibition en %

A extraits : absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait.

A témoin : absorbance de la solution de DPPH en absence de l’extrait.

Les graphes (voir l’annexe IV) représentent la variation du pourcentage du pouvoir

antioxydant (PI%) en fonction de la concentration de chaque extrait delipidè ou lipidique.

L’efficacité antioxydante des extraits phénoliques testés exprimée ensuite par le

paramètre EC50 « efficient concentration » qui représente la concentration de l’inhibiteur

nécessaire pour diminuer 50% des radicaux libres dans le milieu réactionnel. Les valeurs de

EC50 sont déterminées pour chaque extrait phénolique a partir des représentations

graphiques %inhibition = f (concentrations d’extrait), (annexe IV). De même, nous avons

calculé un autre paramètre qui exprime la puissance antiradicalaire et qui est calculé à

partir du premier paramètre(EC50) noté ''ARP égal 1/ EC50 [57]. De même, nous avons

calculé l’EC50 des antioxydants de référence la vitamine E, la vitamine C et le BHA

(l’annexe IV) à fin de les comparer avec ceux des extraits lipidiques et délipidés. Les

valeurs calculées d’EC50 (mg/ml) pour les différentes concentrations des extraits sont

regroupés dans le tableau X.


54

Tableau X : Les valeurs d’EC50et ARP des extraits lipidiques et délipidés par le test du

DPPH



Echantillons EC50

(mg/ml)

ARP

Echantillons EC50

(mg/ml)

ARP

E2 0,11 8,85 E2 4,44 0,22

E5 0,11 9,09 E5 2,31 0,43

E10 0,11 8,77 E10 5,43 0,18

F4 0,11 8,70 F4 4,72 0,21

F8 0,11 8,77 F8 4,24 0,23

D3 0,08 12,40 D3 2,81 0,35

D9 0,11 09,34 D9 2,27 0,36

A4 0,10 10,52 A4 3,68 0,27

A5 0,08 12,34 A5 4,18 0,23

MA 0,11 8,62 MA 1.63 0,61

MB 0,16 6,37 MB 1.66 0,60

MF 0,12 8,13 MF 1.85 0,54

Vitamine E 0,28 3 ,54 Vitamine E 0,28 3 ,54

Vitamine C 0,037 27,25 Vitamine C 0,037 27,25

BHA 0,04 25,25 BHA 0,04 25,25

Puisque les valeurs d’EC50 présentent les concentrations d’inhibiteurs nécessaires pour

balayer 50% des radicaux libres et qui sont inversement proportionnelle à l’activité

antioxydante, d’après le classement croissant schématisé dans les figures ci-dessous


55

Figure n°28 : Classement croissant des extraits délipidés selon leurs EC50

Figure n°29 : Classement décroissant des extraits délipidés selon ARP


56

Figure n°30 : Classement croissant des extraits lipidique selon leurs EC50

Figure n°31: Classement décroissant des extraits lipidiques selon leurs ARP


57

On remarque que l’ensemble des extraits délipidés (matures et immatures) ont un

pouvoir antioxydant supérieurs au extraits lipidiques, de même les extraits délipidés

dévoilent des capacités antiradicalaires très importantes par rapport à la vitamine E mais

inférieure à ceux des antioxydants de référence (vitamine C et BHA).

D’après les résultats du classement croissant des extraits phénoliques délipidés de

chaque région selon leur valeur moyenne d’EC50, on remarque que ce classement varie dans

le même sens dans les deux cas (extraits matures, extraits immatures) dont les extraits

immatures sont toujours les plus puissants, ce résultat peut être expliqué par deux

phénomènes à savoir :

-La présence de composés ayant les mêmes structures chimiques dans les extraits

matures et immatures mais à forte abondance en ces dernières.

- La présence de teneur en eau libre dans les tourteaux immatures qui est nécessaire à

l’activité biologique où elle inhibe les réactions de composés à caractère hydrophobe, ou les

réactions de Maillard et par ailleurs augment la réactivité des composés solubles comme

(les sucres, les alcools, les groupes hydrophobe …) qui mobilisent ces composés pour piéger

les radicaux libres, par contre les tourteaux matures perdent leur eau libre dans la dernière

phase de déshydratation qui aboutit à la maturité physiologiques.

Du point de vu comparative, les tourteaux (matures et immatures) des fruits de

Pistachier de l’Atlas de Laghouat sont classés premiers comme antioxydants, c’est- à-dire ils

sont les plus riches en molécules antioxydantes par rapport aux extraits des deux autres

régions.

Par ailleurs, le classement croissant des extraits lipidiques selon leurs EC50est différent

dans les deux cas (extraits matures, extraits immatures) mais les extraits lipidiques matures

sont plus puissants (la valeur moyenne de ARP des extraits matures 2 fois plus grand que

immatures)

En se basant sur les résultats obtenus, on peut conclure que les extraits lipidiques

matures sont plus riches en espèces antioxydantes par rapport aux extraits immatures,

notamment les extraits de la région de Laghouat.


58

L’activité antioxydante des lipides peut être due aux teneurs en tocophérols totaux ou

aux phytostérols dans la fraction insaponifiable. Plus les extraits lipidiques sont riches en

ces dernières plus EC50 diminue plus l’extrait est antioxydant.

Tous les extraits lipidiques (matures et immatures) montrent une capacité

antiradicalaire très faible par rapport aux composés phénoliques de références (vitamine C,

BHA et vitamine E), à titre d’exemple la puissance antiradicalaire ''ARP '', de la vitamine C

est 99 fois plus grande que la valeur moyenne des extraits lipidiques immatures. En

revanche tous les extraits matures sont 46 fois moins efficaces que la vitamine C.

Nous avons également, tracé pour les différents extraits les courbes représentants la

relation entre les valeurs d’EC50 et les teneurs en phénols totaux et en flavonoïdes (figure

n°32).

Figure n°32 : Corrélation entre le pouvoir d’inhibition (EC50) et la teneur en phénols totaux


59

Dans le cas des extraits lipidiques une corrélation significative a été observée (R2 =

0,754) entre les valeurs d’EC50 et la quantité en phénols totaux, cette coordinance confirme

que l’activité antioxydante dépend principalement à la fraction minoritaire surtout les

composés phénoliques ce qui est confirmé par la littérature que les polyphénols d’origine

naturel sont des capteurs puissants de radicaux [74].En revanche, de mauvaises corrélations

ont été détectées entre les valeurs d’EC50 avec les teneurs en tocophérols (α, β, γ, δ). Les

coefficients de corrélation calculés sont inférieurs à 0,2 (annexe VI). La seule explication de

cette indépendance peut être interprétée par l’existence de certains composés phénoliques

individuels responsables de cette activité.

Par contre cette corrélation est moyenne dans le cas des extraits délipidés (R2 = 0,562)

malgré que les extraits délipidés aient des teneurs plus importantes que les extraits

lipidiques cette indépendance peut être interpréter par l’existence des polyphénols qui ont

des propriétés cellulaire nom antioxydante [75,76], ou l’activité antioxydante des

polyphénols délipidés dépend essentiellement à l’accumulation des sucres solubles lors de

la maturation interfère directement avec les protéines et limite l’interaction avec les

polyphénols , cet effet peut entraîner de protège les polyphénols et gène ainsi l’arrachement

des protons pour neutraliser les radicaux libres.

Figure n°33: Représentation schématique de l'encapsulation d'un polyphenol par les

polysaccharides [77].


60

En se basant sur la corrélation obtenus, on peut conclure que l’activité antioxydante

des extraits délipidés est due à l’existence de certaines molécules qui synergies avec les

polyphénols qui peuvent survenir entre eux lesquels contribuent à la capacité globale des

extraits à piéger des radicaux libres.

En revanche des mauvaises corrélations ont été détectées entre les valeurs d’EC50

avec les teneurs et le taux des flavonoïdes des extraits lipidiques et délipidés (annexe VI).

Les coefficients des corrélations calculées sont inférieurs à 0,008, une explication simple de

cette variation c’est que l’activité des flavonoïdes dépend essentiellement de leurs structures

individuelles et de leurs taux dans l’extrait.et aussi le milieu réactionnel du test utilisé pour

évaluer l’activité antioxydante car le test DPPH est classé comme un test pour les milieux

réactionnels des systèmes apolaires.

La position de la double liaison dans le cycle C ainsi que le nombre et/ou la position

des groupements hydroxyles (OH), sont les éléments les plus importants pour expliquer

l’augmentation ou la diminution de l’activité antiradicalaire de nos extraits phénoliques

(figure n°34) .

Figure n°34 : Elément essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoïdes [33].


61

3.2. Test chimique de Molybdate Phosphate

L’évaluation de l’activité antioxydante de nos extraits à été déterminée à partir d’une

courbe d’étalonnage de la vitamine E (figure n°35), exprimée en VEEAC (vitamin E

Equivalent Antioxydant Capacity) pour chaque extrait.

Figure n°35 : La courbe d’étalonnage de la vitamine E

Les courbes donnant le pouvoir antioxydant exprimé en fonction de la variation de

l’absorbance en fonction de l’inverse du nombre de dilution pour les extraits lipidiques et

délipidés sont présentées dans les (figures n° 36,37et 38)


62

Figure n°36 : Courbes représentants l’activité antioxydante des extraits lipidiques

immatures mesurée par le test de Molybdate Phosphate


63

Figure n°37 : Courbes représentants l’activité antioxydante des extraits délipidiés

immatures mesurée par le test de Molybdate Phosphate


64

Figure n°38 : Courbes représentants l’activité antioxydante des extraits matures mesurée

par le test de Molybdate Phosphate


65

Figure n°39: Courbes représentants l’activité antioxydante des antioxydants de

références le BHA et la vitamine C par le test de Molybdate Phosphate

Les pentes tirées à partir de ces tracées, nous aide à déterminer un nouveau paramètre

appelé VEEAC (vitamine E Equivalent Antioxydant Capacity).Ce paramètre est nécessaire

pour estimer le pouvoir antioxydant de nos extraits par rapport à la vitamine E pris comme

un antioxydant de référence. Les résultats obtenus sont mentionnés dans le tableau XI.


66

Tableau XI: les valeurs de VEEAC des extraits (lipidiques et délipidés) déterminées

par le test de Molybdate Phosphate



Echantillons VEEAC (mM) Echantillons VEEAC (mM)

E2 0.04 E2 5,73

E5 0,05 E5 8,80

E10 0,04 E10 9,15

F4 0,05 F4 7,45

F8 0,05 F8 5,53

D3 0,06 D3 5,80

D9 0,07 D9 5,62

A4 0,05 A4 6,31

A5 0,04 A5 9,15

MA 0,09 MA 26,44

MB 0,06 MB 16,30

MF 0,05 MF 16,82

BHA 9,83 BHA 9,83

Vitamine C 16,24 Vitamine C 16,24

L’analyse de l’ensemble des résultats obtenus (tableau XI) montre clairement que les

extraits lipidiques que se soit matures ou immatures présentent un pouvoir réducteur plus

important par rapport à ceux des extraits délipidés.

Par ailleurs pour les extraits lipidiques, on note que les extraits matures (surtout les

extraits de la région de Laghouat) possédant un pouvoir antioxydant très intéressant que les

extraits immatures. L’explication qui peut être retenue, c’est que ces dernières renferment

des molécules ont un potentiel réducteur (capacité antioxydante) plus important.


67

On remarque que tous les extraits lipidiques matures testés présentent une activité

réductrice nettement supérieure à celle de la vitamine C et le BHA prises comme des

antioxydants de références.

Selon les résultats obtenus, on peut dire que quel que soit les régions des extraits

lipidiques immatures étudiés le potentiel réducteur est bien inferieur à ceux de la vitamine

C et le BHA.

Les extraits délipidés (matures ou immatures) découvrent un pouvoir réducteur très

faible en possédant des valeurs de VEEAC très proches et sont inférieures aux antioxydants

de références à titre d’exemple la vitamine C et le BHA sont 255 fois et 155 fois plus

puissant que les extraits délipidés respectivement. On peut conclure que ces extraits peuvent

renfermer des substances possédants un potentiel donneur d’électrons assez faible.

Nous avons essayé de trouver une corrélation linéaire entre les valeurs de VEEAC de

chaque extrait lipidique avec leur contenue en composés phénoliques totaux, en flavonoïdes

et en tocophérols. Nous avons trouvé un coefficient de corrélation de l’ordre de 0,54 entre

les valeurs de VEEAC et la teneur en tocophérol totaux (figure n°40). Tandis que, des

mauvaises corrélations ont été enregistrées dans les autres cas (annexe VII).

Figure n°40 : Corrélation entre le VEEAC et la teneur en tocophérols totaux dans les

extraits lipidiques.


68

La seule explication de l’indépendance de l’activité réductrice aux phénols totaux et

flavonoïdes de nos extraits peut être interpréter par l’existence de certaines molécules

individuelles autres que les ployphénols et les flavonoïdes responsables des cette activité à

titre d’exemple, les extraits délipidés des fruits de Pistachier de l’Atlas présentent des

valeurs de VEEAC très inférieures à celles des extraits lipidiques mais les teneurs en

phénols totaux et en flavonoïdes dans les extraits délipidés sont 10 à 16 fois plus

supérieures que dans les extraits lipidiques. Cependant, on peut émit l’hypothèse que cette

différence provienne uniquement à la nature des antioxydants. Antioxydants certaines

liposolubles (stérols, tocophérols, β-carotène, lycopéne…) probablement à des teneurs très

importantes dans la fraction minoritaire de lipide qui permettent de créer une véritable

fondation avec les ployphénols ou aux autres antioxydants développent entre eux des actions

de type complémentaire pour découvrir leur activité réductrice.

Figure n°41: Proposition de schéma rendant compte de l’interdépendance des antioxydants [78].

Par ailleurs, en ce qui concerne les antioxydants hydrosolubles « polyphénols » qui

sont très prépondérants dans les tourteaux, il semble très probable besoin à d’autres

antioxydants ou des co-facteurs pour exprimer leur potentiel antioxydant.


69

3.3. Test chimique d’ABTS

Plusieurs facteurs doivent être pris en considération lors de mesure du potentiel des

antioxydants. En tout premier lieu, il faut déterminer avec de plus de précision possible la

nature des molécules qui procurent une action antioxydante à l’échantillon. De même, il faut

savoir si les antioxydants sont solubles dans les lipides ou dans l’eau. Par exemple, le test

d’ABTS convient très bien de nos extraits délipidés. C'est-à-dire que cette dernière

appropriée a la matrice hydrosoluble. Pour cette raison on évitera l’utilisation la méthode

d’ABTS aux extraits lipidiques [79].

Les essais nous ont permis d’estimer le temps total de l’expérience à 5 min, temps au

bout duquel, on ne note plus d’évolution significative de la valeur de la densité optique. La

décoloration du radical ABTS•+ est mesurée à 415 nm par spectrophotométrie à un

intervalle de temps régulier en présence et en absence des extraits antioxydants.

Le pouvoir total antioxydant est d’abord été exprimé en pourcentage d’inhibition en

fonction de l’inverse du facteur de la dilution d’après les tracés, % inhibition= f (1/nd) en

présence des mêmes dilutions. Les dilutions ont été effectuées de sorte que le coefficient de

corrélation (R2) de ces tracés soit supérieur à 0,95 (voir l’annexe V).

Les pourcentages d’inhibition ainsi déterminés, nous aident à calculer le paramètre

TEAC des antioxydants présents dans les extraits exprimés en µM en équivalent de Trolox.

Une courbe d’étalonnage a été établie pour différents concentrations de Trolox à fin de

déterminer les valeurs de TEAC de nos extraits.

Figure n°42 : La courbe d’étalonnage du Trolox


70

Ainsi, dans notre étude nous avons déterminé l’activité antioxydante en employant un

temps réactionnel de 5 min, ce qui donne des valeurs de TEAC relativement faibles [55].

L’ensemble des résultats obtenus pour les valeurs de TEAC est rapporté dans le

tableau XII :

Tableau XII: les valeurs de TEAC des différents extraits délipidés

Les échantillons

TEAC (mM)

TEAC (µmol/g)

E2 0,030 0,23

E5 0,023 0,17

E10 0,022 0,16

F4 0,036 0,27

F8 0 ,030 0,23

D3 0,037 0,28

D9 0,034 0,25

A4 0,026 0,20

A5 0,027 0,20

MA

0,083

0,62

MB

0,065

0,50

MF

0,063

0,48

Vitamine E

2,60

296,91

Acide ascorbique

5,00

579,16

BHA

0,93

108,21


71

Puisque le TEAC représente la concentration du Trolox donnant le même pourcentage

d’inhibition du radical cation équivalent à 1mM de l’extrait antioxydant [80]. On déduit que

les extraits délipidés matures dévoilent les activités antioxydantes les plus intéressantes

(comme dans le test au Molybdate Phosphate ).

Egalement, les résultats obtenus montrent clairement l’existence de deux familles de

composés phénoliques différentes thermodynamiquement. Par ailleurs un composé peut

réduire le radical cation ABTS•+s’il a un potentiel redox inférieur à celui-ci (0,68V) [81]. Ce

qui nous aide à conclure que les extraits matures contiennent des composés phénoliques ont

de bas potentiels redox par rapport à celles extraits immatures.

En revanche les valeurs de TEAC obtenues de manière générale sont beaucoup plus

faibles que lors du test au Molybdate Phosphate. Ces valeurs confirment la plus grande

sensibilité du test à ABTS•+.

Selon les résultats fournis dans le tableau précédent les extraits immatures présentent

des valeurs de TEAC très voisines mais renferment des teneurs en polyphénols et

flavonoïdes différentes, également l’extrait mature de la région de Laghouat exhibe une

valeur de TEAC plus supérieure que l’extrait d’Aïn Oussera, malgré que ce dernier a une

teneur en composés phénoliques totaux très importante que le premier. A l’issus de ces

résultats, on peut conclure que l’activité antioxydante n’est pas liée directement au contenu

en composés phénoliques mais à la nature des molécules individuelles présentes dans

l’extrait.

Les extraits délipidés que se soit matures ou immatures ont un pouvoir antioxydant

très faible par comparaison aux antioxydants de référence (vitamine E, vitamine C et le

BHA), à titre d’exemple le TEAC de la vitamine C est respectivement 70 à 168 fois plus

supérieurs que les extraits matures et immatures est cela peut être expliqué par la faible

solubilité de nos extraits dans le milieu réactionnel.

De même, nous avons fait figurer les courbes correspondantes à la relation qui relie

les valeurs TEAC avec celles d’EC50 et VEEAC.


72

Figure n°43 : Relation entre les valeurs de TEAC avec celles d’EC50 et VEEAC

des extraits délipidés


73

Une corrélation significative a été observée (R2 = 0,620) entre le test TEAC et VEAC

cette coordinence entre ces deux tests, peut être interpréter, soit que les composés

phénoliques présents dans les extraits ayant le même mode d’action vis-à-vis la réduction

Mo(IV) à Mo(V) et le même effet sur la capture du radical ABTS• + c’est-à –dire, que

l’activité antioxydante des ces substances est assurée par la donation des électrons.

Par contre cette corrélation est faible entre le test d’ VEEAC et le test au DPPH ce qui

est évident, car dans le test du pouvoir réducteur les extraits agissent comme donneurs

d’électrons, par contre dans le test de DPPH ils semblent d’être des donneurs de protons.

En revanche La mauvaise corrélation entre EC50 et TEAC confirme que les extraits

déshuilés montrent leurs faibles activités concernant le balayage des radicaux libres

aussitôt leur pouvoir insuffisant de réduire le radical cation ABTS• + .

En effet, les paramètres qui peuvent agir sur les capacités antioxydantes des extraits

dans les trois tests sont le pH, la solubilité, la concentration, la structure, la taille et le

potentiel oxydo-réducteur. La présence de certains agents (Co-facteurs) qui peuvent agir en

synergie avec les composés phénoliques.

Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion

Conclusion

74

La présente étude a pour objectif l’étude des fruits de Pistachier de l’Atlas provenant

de trois régions de Sud algérien (Laghouat, Hassi R’mel et Aïn Oussera) à travers leurs

teneurs en en lipides, et en composés phénoliques puis l’étude l’activité antioxydante de ces

extraits lipidiques et phénoliques.

En effet les résultats d’extraction montrent que les fruits de Pistachier de l’Atlas sont

très riches en lipides à l’exception des fruits immatures. L’analyse de ces huiles nous a

permis de mettre évidence sa composition en différents constituants biochimiques tels que

la composition en acide gras et en tocophérols. La composition en acide gras des différents

échantillons d’huile de fruits (matures et immatures) du Pistachier de l’Atlas est caractérisée

par une proportion élevée en acides gras insaturés 82%, ce qui nous permis de classer

l’huile de Pistacia Atlantica parmi les huiles végétales de types Olé-linoléique.

L’analyse de la fraction insaponifiable de lipide montre que la teneur en l’huile du

fruit du Pistachier de l’Atlas en tocophérols totaux est importante. Les fruits de Pistacia

Atlantica immatures sont plus riches en tocophérols totaux que les fruits matures.

Les résultats obtenus dans l’analyse quantitative des composés phénoliques

(polyphénols totaux et flavonoïdes), nous laissent à constater que la graine est une source

prometteuse de composés phénoliques surtout les tourteaux. La variation de la teneur en

polyphénols totaux entre les différents individus est importante pour les extraits délipidés,

au contraire cette variation pour les échantillons des extraits lipidiques. En parallèle cette

variation pour la teneur en flavonoïdes d’un individu à l’autre que se soit lipidique ou

délipidé est moins importante par rapport à celle des phénols totaux. En conséquence la

quantité de différents composés phénoliques existants dans les extraits lipidiques et

délipidés constitue un caractère spécifique pour chaque individu de Pistacia Atlantica.

De point vue comparatives les graines de Pistacia Atlantica de Laghouat sont plus

riches en composés phénoliques surtout les extraits délipidés.

Les lipides et les flavonoïdes sont des bons marqueurs bio-organique pour l’étude de

variabilité biogénétiques de Pistacia Atlantica

Conclusion

75

L’évaluation de l’activité antioxydante s’est portée sur l’application d’une analyse in

vitro, comprenant un balayage du radical stable DPPH. et le radical ABTS•+ ainsi

l’estimation du pouvoir réducteur comme des techniques chimiques.

Dans le test DPPH l’ensemble des extraits délipidés et surtout le type immatures est

plus actifs par rapport aux extraits lipidiques. Ce résultat et prévu car les composés

phénoliques présentent une activité antiradicalaire certaines. Dans le cas des lipides, nous

avons trouvés une corrélation linéaire entre les valeurs d’EC50 et la teneur en composés

phénoliques (R2=0,754) donc l’activité antioxydante des lipides dépend principalement de

ces composés antioxydants et de leurs concentrations.

En revanche, le test Molybdate de phosphate montre clairement que les extraits

lipidiques pareillement les matures renferment des molécules ayant un potentiel réducteur

(capacités antioxydante) nettement supérieur à ceux des extraits délipidés que se soit

matures ou immatures. Par ailleurs les valeurs de VEEAC des extraits lipidiques et délipidés

ont été faiblement corrélées avec le contenu des composés phénolique. Cependant, la

corrélation était beaucoup inférieure entre l’activité réductrice et la teneur en flavonoïdes, ce

qui conduit à conclure que l’activité antioxydante mesurée par le test de Molybdate de

phosphate dépend également de quelques facteurs y inclut le taux de composés

responsables de cette activité et leur natures chimiques ainsi le mode d’action des substances

antioxydantes en face les radicaux libres.

Enfin l’étude de l’activité antioxydante en utilisant le test ABTS montre que les

extraits délipidés matures testés présentent une capacité de capturer des radicaux ABTS•+

très importantes par rapport aux extraits délipidés immatures.

De même on constate que les résultats des activités antioxydantes enregistrés avec

l’ABTS et ceux enregistrés avec le Molybdate de phosphate sont similaires et varient dans

le même sens. Néanmoins il y a une bonne corrélation (R2=0,620) entre les valeurs en

VEEAC et le TEAC des extraits délipidés suggèrent ainsi que les composés phénoliques

ayant le même mode d’action vis-à-vis la réduction Mo(IV) à Mo(V) et même effet sur la

capture du radical ABTS• + . C’est-à –dire, que l’activité antioxydantes des ces substances

sont assurée par la donation des électrons.

Conclusion

76

À notre connaissance, c’est pour la première fois que l’activité antioxydante in vitro

des composés phénoliques et notamment les extraits lipidiques des fruits de Pistachier de

l’Atlas a été étudiée, et pour cela on peut dire que ces résultats importants nous encouragent

de sélectionner cette plante comme une source prometteuse pour des études chimiques

approfondies afin de caractériser les molécules naturelles responsables à cette activité. De

nombreuses perspectives peuvent être envisagées :

� La multiplication du nombre d’essais in vitro vis –à vis d’autres pathologies

douloureuses, abdominales, inflammatoires et infectieuses.

� L’activité antioxydante issue des extraits naturels de plantes locales permettent

d’isoler et de caractériser d’éventuelles nouvelles molécules ou de trouver des

molécules déjà connus responsables à cette activité et qui pourront être

utilisées pour des études chimiotaxnomiques.

� De plus, la synthèse de ces nouveaux dérivés permettra de développer une

étude QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) plus approfondie et

donc d’établir des relations structure/ activité plus solide

� Il reste encore beaucoup de plantes locales utiles qui n’ont pas été analysées et

qui méritaient de l’être afin de déterminer leur potentialité dans les domaines

étudiés

Références Références Références Références

Bibliographiques Bibliographiques Bibliographiques Bibliographiques

Références bibliographiques

77

[1] Yousfi M., A. Djeridane, I. Bombarda, C Hamia, A. Duhem et E.M. Gaydou (Accepted : Feb 8 :2008 In press). Isolation and Characterization of the New Hispone Derivative From Antioxydant Extracts of Pistacia atlantica. Phytotherapy Research [2] Bellakhdar J., 1997. La pharmacopée marocaine traditionnelle. Medecine arabe ancienne et savoirs populaires. IBIS Press. P.764

[3] Belhadj S (2003). Les Pistachier Algérienne : Etat actuel et dégradation. Centre universitaires de Djelfa ; 107-109. [4] Baba Aissa F. (2000) Encyclopédie des plantes utiles : Flore d’Algérie et du Maghreb Ed : EDAS ; 217. [5] Hadj-hassan et M. kardouch (1995) Satus of Pistachier nut cultivation in Syria. Dans : First Internatinal Symposiumon Pistachio nut, Adana, Turquie.Kaska ,N., Kuden, A,B., Ferguson, L. et Michailides, T (éds). Acta Horticulturae, 419 : 221-227 [6] Monjauze A . (1980) Connaissance du bétoum Pistacia atlantica Desf. Biologie et foret. Revue Forestiére Français, 4 : 357-363. 913 [7] Monastra F, M. Rovira , Fj. Vargas, M . A. Romero , I. Battle, D. Rouskas et A. Mendes Gaspar (2003). Caractérisation isoenzymatique de diverses espèces du genre pistacia vera L. Ed : CIHEAM-Options Méditerranéennes ; 135 [8] Yousfi M., B. Ndjemi , R. Belal et D. Ben Bertal (2003). Etude des acides gras de huile de fruit de pistachier de l’Atlas algérien .OCL , 10 :1-3 [9] Danseshared A et Y . Anechchi (1980). Chemical Studies of the oil Pistacia Nuts Growing Wild in Iran. Oil Chem. Soc, 57 : 248-249 [10] Belhadj S., 2007. Etude Eco-Botanique de Pistacia atlantica DESF. (ANACARDIACEAE) en Algérie, préalable a la conservation des ressources génétiques de l’espèce et a sa valorisation. Thèse de Doctorat d’Etat en Sciences Agronomiques. Option, Ecologie Végétale. Uni. Tizi-ouzou. P. 200

[11] Bernard Jacotot, Bernard Campillo (2003). Nutrition humaine, Ed : Masson, Paris, 10-14 [12] Henri D. Jean-Louis, M.I.Malwiak, Leynaud-Rouaud, A. M, Berthier (1992) Alimentation et nutrition Humaines Ed : Masson, Paris, 140-142 [13] Brisson, Germain (1982) Lipides Et Nutrition Humaine: Analyse Des Donnees Recentes Sur Les Corps Gras Alimentaires Ed : Presses Université, Laval, 7 [14] Naudet M.(1992) .Manuel des corps gras, Tome1. Ed : Technique et documentation lavoisier, Paris . 42-45

[15] M. francois MORDRET, thèse de doctorat. (1971). Etude de l’insaponifiable des huiles de colza, soja et tournesol 54-55


78

[16] Maan,J.,Daridson,R.S.,Hobbes,J.B.,Banthorope, D.V.et Harborne, J.B.(1994). Natural Product :Their Chemistry and Biological Significance, Ed :Lavoisier , Paris ,75-90 [17] J.Guignard .(1974) ; Abrégé de biochimie à l’usage des en pharmacie, pp 179-183. [18] D.G. Cram et G.S Hammoud, Quatheir –villars (1968). chimie organique, 2éme Edition, pp. 918-930

[19] Oka T., F.J. Simpson, J.J. Cild et C.Mills (1972). Degradation of rutin by Aspergillus flavus. Purfication of the dioxygenase quercitinase. Can . J. Microbiol ., 17:11-118 [20] Harbone J.B. (1975). The Flavonoids, Mabry, TM., Mabry H. Eds: Chapman et Hall,London [21] Remesy C., Manach C., Demigne C., Texier O., Regerat. F. (1991). Intérêt nutritionnel des flavonoïdes. Méd. Nut. 32 (1) :17-27 [22] Agrawal P.K., Schneider H.J. (1983). Deprotonation-induced 13C NMR shifts in phenols and flavonoids. Tetrahedron Lett., 24 : 177-180

[23] Medic Sanic M, jasprica I, Smolcic Bubalo A et Mornar A. (2004) . Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoides and phenolic acids. Croatica chemica acta. 361-366. [24] Fulbert J.C. , Cals M.-J.. -Les Radicaux libres en biologie clinique. Pathol. Biol.(1992). 49(1), 66-77

[25] Cohen, H.,J., Chovaniec, M.E .(1978). Superoxide generation by digitonin stimulated guinea pig granulocytes. Abasis for continuous assay for monitorning superoxide production and for the study of activation of generating system, Journal. Clin .Invest .61, 1081-1087 [26] Singal P.K., Petkau A. Gerrard J.M., Mol. Cell. Biochem . (1988). Free Radicals in health and disease. 121-122

[27] Luc, G., Lecerf, J.M., Bard, J.M., Hachulla, E., Fruchart, J.C., Devulder, B. (1991).

Cholestérol et athérosclérose. Masson, collection Abrégés,

[28] Diliberto, F,J.,Dean, G., Carter, C., Allen, P.L (1982). Tissue, subcellular and sumitochondrial distributions of semidehydroascorbate reductase: possible role of semidehydroascorbate reductase in cofactor regeneration. J. Neurochem. 39- 563-568

[29] Chan A.C. Can. (1993). J. Physiol. Pharmacol. 71(9), 725-731

[30] Samuni A., Aronovitch J., Godinger D., Chevion M., Czapski G. Eur. (1983). J. Biochem. 137(1-2), 119-124

[31] Arteel G.E., Sies H. , (2001).Env. Toxicol. Pharmacol. 10(4), 153-158


79

[32] Van Acker S.A.B.E., D.J. van den Berg, M.N.J.L; Tromp, D.H Griffioen, W.P. van

Bennekom, W.J.F. van der Vijgh et A. Bast (1996). Structural aspect of antioxidant activity of flavonoids. Free Rad Biol Med., 20-313-342.

[33] Marfak A(2002). Radiolyse gamma des flavonoïdes. étude de leur réactivité avec les radicaux issus des alcools : formation depsides Sanchez-moreno.C, Methods used to Evaluate the free Radical Scavenging Activity in foods Biological Systems, Food Science and Techonology International, 3 :80

[34] Landolfi, R.; Mower, R.L.; Steiner, M. (1984), Modification of platelet function and arachidonic acid metabolism by bioflavonoids. Structure-activity relations. Biochem Pharmacol. 33:1525-1530.

[35] Li Piewu, Anu Hopia, Jar S, Teijo Yroenenad et Heikki Vuorela . (1999). TLCmethod for evaluation of free radical scavenging activity of rapeseed metal by video scanning technology , Chemistry an Nutrition, 10:123-187 [36] Glavind, J., and Holmer, G. (1967) J. Amer. Oil 29. Marsh, D., Watts,. J. Amer. Oil Chem. Soc. 44, pp. 539–542

[37] Sanchez ,Morenos. Y. Wang et al. (2002). J. Agric. Food Chem. 76, 270–276

[38] Brasseur L., P. Thérond et Legrand. A. (1995). Pouvoir antioxidant total du plasma, Act Pharm Biol Clin, 8 : 239-224

[39] Cao G.H., H.M. Alessio, et R.G.Cutel (1993).Oxygen –Radical Absorbency Capacity Assay for Antioxydants, Free Radic.Biol. Med, 14:303-311 [40] Duthie G.G., B.M. Gonzalez, P.C. Morrice. et J.R.Arthur. (1991). Free Rad. Res. Comms, 15, 35-40

[41] Molyneux P.(2004). The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antixydant activity. Songklanakarin J. Sci.Technol, 26(2): 211-219

[42] Li C., C.D. Oldham et S.W.N. May (1994). N-Dimethyl-1,4-phenylenediamine as an alternative reductant for peptidyglcyine –amidating mono-oxygenase catalysis, Biochem, J., 300:31-36

[43] Magin D.V.,G. lewin, I.N. Popov, D. I Zmailov Yu et A. Vladimirov Yu (2002). Photochemiluminescence as a tool to determine the antioxidant activity in biological systems, Mathematic modeling, 46: 419

[44] Ernster L et K. Nordenbrand (1967). Microsomal lipid peroxidation, Methods enzymol, 5 : 574-580

[45] http://www.visomap.com/place-fr/Hassi+er+Rmel/-690988

[46] Leybros J., Fremeaux P. Extraction solide-liquide-Aspects théoriques. Techniques de l’ingénieur (traité Génie des procédé), J 2780.


80

[47] Association Français de Normalisation (AFNOR) (1984). Recueil de normes français des corps gras, graines oléagineuses, produits dérives 3éme Ed : AFNOR,60.

[48] Hertog M.G.L et P.C.H.Hollman,(1992). Optimization of quantitative HPLC determination of potentially anticarinogenic flavonoides in vegetables and fruits. J.Agric Food Chem., 40:1591-1598 [49] Vipink . Garg an Willimar .Nes, (1985). Changes in ∆ 5 and ∆7 During Germination and Seedling Development of cucurbita maxima, Drexel University,Philadelphia

[50] Bureau J., 1994. Développer les connaissances sur les produits pour maintenir la compétitivité Oléoscope : In: Dossier l'utilisation des oléagineux dans l'alimentation animale, 10-11

[51] M. Yousfi, B. Djeridane A, Nadjemi, D. Boutassouna, P stocker et N. Vidal (2006). Antioxydant activity of som Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds. Foods chemistry , 97 (4) : 654-660 [52] Marin Naczk et Feredon Shahidi (2004). Extraction and analysis of phenolic in food Journal of Chromatography A, 1054:95-111

[53] Ki Won lee, Young Jun Kim, Hygon Joo Lee et Chang Yong Lee (2003). Cocoa Has More phenolic Phytochemicals and a Higher Antioxydant Capacity than Teas and Red Wine. J. Agric. Food Chem, 51: 7292-7295 [54] Charfi D, (2001).effet des eaux usées traitées sur les caractéristiques physico-chimiques du sol, la production et la composition minérale de quelques espèces végétales cultivees au périmétre d’el Hajeb (Sfax). Thése de doctorat en écologie végétale. COI /T.15/ Nc n° 2/Rév. 10 [55] ] Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E. and Berset, C. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie/Food Science and Technology, 28: 25-30.

[56] Cotelle, N.; Bernier, J.L.; Catteau, J.P.; Pommery, J.; Wallet, J.C.; Gaydou, E.M.(1996 ). Antioxidant properties of hydroxy-flavones, Free Radic. Biol. Med., 20: 35-43.

[57] Leitão et vilegac ( 2002).quick preparative separation of natural Naphthopyranones with antioxidant Activity by High-speed counter-current chromatography . Z.nNaturforesch 57c,1051-1055

[58] Pilar Prieto., Manuel Pineda., and Miguel Aguilar. (1998). Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant Capacity through the Formation of a Phosphomolybdenum [59] Rice-Evans C., Miller, N.J. (1994). Total Antioxidant Status in Plasma and Body Fluids. Methods Enzymol. 234, 279-293

[60] Rice-Evans C., Miller N.J., Bowell P.G., Bramley P.M., Pridham J.B. (1995). The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids. Free Radical Res. 22, 375-383


81

[61] Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.(1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med. 26 (9/10), 1231-1237

[62] Lien EJ, Ren S, Bui HH, Wang R. (1999). Quantitative structure-activity relationship analysis of phenolic antioxidants. Free Radic Biol Med 26 : 285-94 [63] Karleskind A. (1992). Manuel des corps gras. Edition Technique et Documentation Lavoisier, Paris, 116-226

[64] Marie Farine., J. Sonlier et Frederique Comes. (1986). Etude de la fraction glycéridiqye des huiles de graines de quelques rosaceae prunoides, J.A.O.C.S, Université de perpignan

[65] Liu K. Soybeans. (1999). Chemistry, Technology and utilization. 2nd ed. Aspen Publishers, Gaitherrsburg, MD

[66] Caldwell, C.R:Britez, S.J, Mirecki, R. M. (2005) . Effect of temperature, elevated carbon dioxide, and drought during seed development on the isoflavone content of dwarf soybean (Glycine max L. Merrill) grown in controlled environments. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(4): 1125-1129

[67] Kitamura, K, Agate, K, Kichuchi, A. Kudous, S. Okubo, K (1991). . Low isoflavone content in early maturing cultivars, so called summer-type soybean (Glycine max (L.) Merril). Japaneese Journal of Breeding, 41: 651-654.

[68] Posmyk., M., Bailly., Szafranska K., Janas, K.M., Corbineau F., (2005). Antioxidant enzymes and isoflavonoids in chilled soybean [Glycine max (L.) Merr.] seedlings Journal of Plant Physiology, 162: 403-412

[69] Campos-Vargas, R: Monogokazki, H, Suslow, T. Saltveit, M.E (2005). . Heat shock treatments delay the increase in wound-induced phenylalanine ammonia-lyase activity by altering its expression, not its induction in Romaine lettuce (Lactuca sativa) tissue. Physiologia Plantarum, 123: 82-91.

[70] Keung,W.M. (2003). Anti-dipsotropic isoflavones: the potential therapeutic agents for alcohol dependence. Medicinal Research Reviews, 23(6): 669-696 [71] Eldridge, A.C. and Kwolek, W. F. (1983). Soybean isoflavones: effect of environment and variety on composition. Journal of Agricultural and Food Chemisty, 31(2): 394-39

[72] Bureau J., 1994. Développer les connaissances sur les produits pour maintenir la compétitivité. Oléoscope, In: Dossier l'utilisation des oléagineux dans l'alimentation animale, 10-11 [73] Dhuaubhadel, S. Gijzen, M. Moy, P Farhangkhonee , M. (2007). Transcriptome analysis reveals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for isoflavonoid synthesis in soybean seeds. Plant Physiology, 143(1): 326-338


82

[74] Dugas, A.J.; Castaneda-Acosta, J.; Bonin, G.C.; Price, K.L.; Fischer, N.H. Winston, G.W. (2000). Evaluation of the total peroxyl radical-scavenging capacity of flavonoids: structure-activity relationships. J Nat Prod., 63: 327-31.

[75] Parkoj, Surhyj. . Chemopreventive potential of epigallocatechin gallate and genistein : evidence from epidemiological and laboratory studies. Toxicol Lett 2004 ; 150 : 43-56. [76] Bizerra, Oliveira, Mv, Badiae, E, Carbonneau, Ma, et al., . Potential anti-athérogenic cell action of the naturally occurring 4-O-methyl derivative of gallic acid on Ang II-treated macrophage

[77] Haslam E., Lilley T.H., Warminski E., Liao H., Cai Y., Martin R., 1991. Polyphenol complexation. A study in molecular recognition. In: Phenolic compounds in food and their effects on health. I. Analysis, occurance and chemistry, Ho C-T, Lee CY, Huang M-T, editors, Am. Chem. Soc., 8-49

[78] Blackhs. (2004) . Mechanisms of pro- and antioxidation. J Nutr : 134 : 3169S-3170S [79] Hamer, M. et Chida, Y. (2007) Intake of fruit, vegetables, and antioxidants and risk of type 2 diabetes: systematic review and meta-analysis. J Hypertens. 25(12):2361-9. Revue

[80] Re. R, Pellegrini. N. Prtoeggente. A, Pannala. A, Yang M, Rice Evans. C, (1999).Antioxidant activity applying an ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical Biol Med, Vol 8, N° 9-10, pp71-231.

[81] Nakamura Y., Tsuji S., Tonogal. (2003). Method for analysis of tannic acide and its metablites in biological samples : application to tannic acid metabolism in th rat, J. Agric. Food Chem, 51: 331-339

Annexe Annexe Annexe Annexe

Annexe

83

Annexe I Notre démarche expérimental est résumée à travers le diagramme comme suite (figure : )

Extraits lipidiques Extraits phénoliques

1-Dosage des Polyphénols 2-dosage des flavonoïdes

1-Analyse des acides gras 2-Dosage Tocophérols 2-Dosage des Polyphénols 3-dosage des flavonoïdes

Evaluation du pouvoir antioxydant 1-DPPH

2-Molybdate de phosphate 3-ABTS

1

1

Extraction

Séchage : à l’abri de la lumière du soleil et à température ambiante

Broyage avec un mortier manuel :

Obtention d’une poudre fine

Tamisage :

¢= 250µm

Pesé

Matière Végétale

Extraction des lipides à partir des fruits

Extraction des Polyphénols à partir des

tourteaux

2

2

Annexe

84

Annexe II Chromatogramme des EMAG des huiles de Pistachier de l’Atlas

F4

F8

A5

Annexe

85

D3

D9

E10

Annexe

86

E2

E5

MF

Annexe

87

Annexe III Chromatogramme de HPLC de tocophérols standard et d’huiles de Pistachier d’Atlas :

Annexe

88

Annexe

89

Figure n° : Chromatogramme de HPLC de tocophérols standard et d’huiles de

Pistachier d’Atlas

Annexe

90

Annexe IV

Les courbes représentants l’activité antioxydant Par le test DPPH

Figure n° : Courbes représentants l’activités antioxydantes des extraits lipidiques immatures

Par le test DPPH

Annexe

91

Figure n° : Courbes représentants l’activités antioxydantes des extraits delpidés immatures

Par le test DPPH

Annexe

92

Figure n° : Courbes représentants l’activités antioxydantes des extraits delpidés matures

Par le test DPPH

Figure n° : Courbes représentants l’activités antioxydantes des extraits lipidiques matures

Par le test DPPH

Annexe

93

Figure n° : Courbes représentants l’activités antioxydante des antioxydants de référence

Annexe

94

Annexe V

Courbes représentants l’activité antioxydant par le test d’ABTS

Figure n° : courbes représentants l’activité antioxydantes des extraits delipidiés

Immatures mesurés par le test d’ABTS

Annexe

95

Figure n° : courbes représentants l’activité antioxydantes des extraits delipidiés

matures mesurés par le test d’ABTS

Figure : courbes représentants l’activité antioxydantes des antioxydants de référence BHA,

vitamine E et vitamine C par le test d’ABTS

Annexe

96

Annexe VI

Figure n° : Corrélation entre le pouvoir d’inhibition (EC50) et la teneur en tocophérols totaux

Figure n° : Corrélation entre le pouvoir d’inhibition (EC50) et la teneur en flavonoïdes

Figure n° : Corrélation entre le pouvoir d’inhibition (EC50) et la teneur en flavonoïdes

Annexe

97

Annexe VII

Figure n : Corrélation entre le VEEAC et la teneur phénols totaux dans les extraits delipidés

Figure n : Corrélation entre le VEEAC et la teneur flavonoides dans les extraits delipidés

Annexe

98

Figure n : Corrélation entre le VEEAC et la teneur dans les extraits delipidés

Figure n : Corrélation entre le VEEAC et la teneur flavonoides dans les extraits lipidiques

Annexe

99

Annexe VIII Figure n° : Aire de reproduction de Pistacia Atlantica, (including P. mutica Fischer & C.A. Meyer).

Annexe

100

Annexe IX Caractéristiques de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) Chromatographie : Delsi Instruments Gaz vecteur : Hélium a une pression de 0,4 bar

Température de l’injecteur : 250°C

Volume injecté : 0,5 µl

Détecteur : Ionisation de flamme FID Colonne capillaire Méga 10 : (25 m x 0,25)

Programme de température de 150 à 250 °C à 2 °C /min

Caractéristiques de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) Chromatographie : WISP710 waters

Détecteur fluorimètrie : (λ émission = 298 nm et λ absorption = 330 nm). Température de l’injecteur : 30°C Volume injecté : 1 ml Colonne : RP18 (3,9x330 mm) Phase mobile : isocratique méthanol et de eau en proportion (95 :5 V/V).

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� � ا�j(�% :ا��ت ا�� 0ات ا-X#ر ا()� ��Gت - � �وGت -ا� 01��DTات -اD�� Q ا�!Oور ا�*�ة -ا($�� Résumé L’analyse biochimique des échantillons de fruits de Pistachier de l’Atlas provenant de trois régions (Laghouat , Hassi R’mel et Ain oussera ) présente un taux en lipide varie entre 3,81 à 29,80% avec une grande teneur en acides gras insaturés (oléo-linoléique). Le taux élevé de tocophérols est en moyenne de 360 µg/g dans les huiles. L’étude a été aussi poursuivie en dosant les extraits lipidiques et délipidés en composés phénoliques. Puis l’évaluation leurs activités antioxydante par trois tests chimiques DPPH, Molybdate de phosphate et ABTS.+ . La quantité des composés phénoliques dans les extraits délipidés et très importante (33,92 à 87,60 mg/g) par rapport aux extraits lipidiques (0,48 à 12,92 mg/g). D’après le test DPPH l’activité des extraits délipidés a exprimé par EC50 (0,08-0,19 mg/ml) montre une activité antiradicalaire plus importante comparativement aux extraits lipidiques (1,63-5,42 mg/ml). Par conséquence, les extraits lipidiques enregistré une activité réductrice supérieur à ceux extraits délipidés avec des valeurs de VEEAC compris entre (5,53 à 16,82 mM). Le test ABTS exprimé en TEAC (0,166 à 0,602 µmol/g) montre que les extraits délipidés présentent une capacité de capture des radicaux ABTS.+ très faible par rapport aux antioxydants de références (vitamine C et BHA). Les Mots clés : Pistacia Atlantica , lipides, tocophérols, acides gras, composés phénoliques, flavonoïdes,balayer les radicaux libres, activité antioxydante Abstract The biochemical analysis of samples of fruits of Pistacia atlantica collected from several trees located in three different areas (Laghouat , Hassi R’mel and Ain oussera ), shows a rate of lipid varies between 3,81 to 29,80 % with a high content of unsaturated fatty acids (oleo-linoleic). The level of tocopherols is on average 360 µg / g in oil. The study was also pursued by assaying the lipid extracts and oil-cake in phenolic compounds. Then the evaluation of their antioxidant by three different methods; DPPH, phosphomolybdenum and ABTS, The amount of phenolic compounds in the oil-cake extracts very high (33.92 to 87.60 mg / g) compared with lipid extracts (0.48 to 12.92 mg / g). In the DPPH system the antioxidant activity of oil cake extracts showed more efficient radical scavenging activity than lipid extracts, with EC50 values were (0,094 to 0,16 mg/ml). The capacity reduction assessed by the phosphomolybdenum method has been expressed as the VEEAC (mM) were (5,43 to 16,82) of lipid was superior to that oil-cake (0,04 to 0,09 mM). Values of ABTS method has been expressed as the TEAC (µmol/g) were (0,166 to 0,602) of oil cake ,all tested extracts were determined to be few efficient than synthetic antioxidant vitamin C and BHA at the ABTS assay. Key words: Pistacia Atlantica, lipids, fatty acid, tocopherols, polyphenols, flavonoids antioxidant activity, radical scavenging activity.

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Mémoire de magister Le Fruit de Pistachier de l’Atlas