Modèle drosophile (8 heures de cours)

I. Présentation du modèle Drosophile et de l’organe étudié a) Plan d’organisation b) Cycle de développement c) Présentation de l’oeil composé avec ses différents types cellulaires d) Biosynthèse et stockage des pigments de l’oeil

II. Isolement de mutants chez la drosophile

a) Comment les générer : notion de souche de référence, mutants spontanés et mutants induits ; différents types d’agents mutagènes

b) Transgenèse et mutagenèse par insertion d’éléments transposables : le transposon P

c) Les mutants de couleur de l’oeil

III. Caractérisation phénotypique et génétique des mutants a) Plusieurs gènes pour un même phénotype b) Un gène, de nombreux allèles : notion de série allélique c) Un gène, différents phénotypes affectant différents processus de

développement: notion de pléiotropie d) Interactions entre gènes différents : notion d’épistasie e) Cribles génétiques pour l’identification de suppresseurs et « enhanceurs »

IV. Identification des gènes ; de la cartographie génétique au clonage

a) Cartographie génétique b) Cartographie cytologique c) Cartographie physique d) Correspondances entre les trois cartes e) Clonage du gène

V. Etude fonctionnelle

a) Le mécanisme de phototransduction chez la drosophile et les vertébrés b) Les rhodopsines c) Etude des séquences cis-régulatrice du gène rh1 d) Etude d’un modèle drosophile de rétinite pigmentaire

Conclusion : La drosophile : un système modèle pour étudier les maladies humaines

Quelques références bibliographiques « Analyse génétique moderne » (A.J.F. Griffiths et al., Ed. De Boeck Université) « La drosophile : des chromosomes aux molécules » (J. Deutsch). Ed. Medecine Sciences, John Libbey Eurotext. Sites Web : http://genetique.snv.jussieu.fr/ (site des enseignements de génétique à l’UMPC) http://www.edu.upmc.fr/sdv/docs_sdvbmc/ (site de LV304 Biologie du Développement) http://flybase.bio.indiana.edu/ http://flymove.uni-muenster.de

Notions supposées acquises(cf programme de l'UE LV203 de l'UPMC)

Notions de gène, allèle, polymorphisme, mutation

Phénotype/Génotype

Mitose/Méiose

Ségrégation d'un couple d'allèles/ de 2 couples d'allèles au cours de la méiose

Indépendance génétique/liaison génétiqueIndépendance génétique/liaison génétique

Pourcentage de recombinaison

Distance génétique en CentiMorgan

1

2

3

4

5

X

lignée pilote (« driver »)

gène X

GAL4Protéine X

g

protéine Xexpression du gène X

X

UASGAL4GAL4

Le système UAS/GAL4

expression du gène Xsous le contrôle de GAL4

6

Gène de latransposase Marqueur

(w+…) Transgène

1.

PROTOCOLE DE TRANSGENESE A L’ELEMENT P 7

Pied gauchetronqué

Pied droit

tronqué

ORI AmpR

Plasmide « helper » Pied gauche Pied

droit

ORI AmpR

( )

Plasmide avec transgène

A P(lignée germinale)

embryons w-

X II III IVw-

X II III IVw-

w-

Adultes G0 •yeux blancs (lignée somatique w-)

•quelques adultes G0 à lignée germinale mosaïque (insertion au hasard du transgène dans certaines

cellules de la lignée germinale)

w-Transgène et w+

Adultes G0 croisés individuellement avec individus w2

w- Transgène et w+

...etcAdultes G0 croisés individuellement avec individus w-2.

G0 sans insertiondu transgène dans la

lignée germinale

100% descendants G1à œil blanc

G0 avec insertiondu transgène dans la lignée

germinale (5 à 10% des embryons injectés)

•Une majorité de descendants G1 à œil blanc•Quelques descendants G1 à œilà œil blanc •Quelques descendants G1 à œil rouge=individus transgéniques

w- Transgène et w+

X II III IVX II III IV

w-

w-

w-Transgène et w+ou

•Localisation du transgène•Obtention d’une lignée homozygote pour le transgène

w

etc...

PROTOCOLE DE MUTAGENESE PAR MOBILISATION D’ELEMENT P

8

X II III IV

y-y+

y-P helper Drop

(dominant)

X II III IV

Lignée 1[y+,Drp+]

Lignée 2[y-,Drp]

y--y+

X II III IV

[y+,Drp]

X II III IV

[y-,Drp+]

y--y+ P helper

DropDes évènements de transpositionpeuvent se produire dans la lignéegerminale de ces mâles: obtention de différents types de gamètes

y-

y--

[y-,Drp+] y-X II III IV

sans transposition

[y+,Drp+]avec transpositionsur le II, ou le III; ces nouvelles insertions sont stables (pas detransposase)

phénotypes de ces nouveaux mutants d’ insertions?

y-

y+

y+

y-

transposase)

9

10

11

12

a+ b+ a1 b1 a+ b+ a1 b1

Détection de la recombinaison chez les organismes diploïdes:croisement de type "back cross"

13

a+ b+

a1 b1

femelle F1

a1 b1

a1 b1

a+ b+ a1 b1X

X

a1 b1a+ b+X

a+ b+

a1 b1

femelle F1

a1 b1

a1 b1X

4 types de gamètes

a+ b+

a1 b1P1

P2

=1/4

=1/4

4 types de gamètes

P1

P2

>1/4

>1/4

a+ b+

a1 b1P P

a1 b+

a+ b1R1

R2

=1/4

=1/4a1 b1

descendance F2:

P2

R1

R2

>1/4

<1/4

<1/4 a1 b1

a+ b1

a1 b+

descendance F2:

R R

descendance F2:4 génotypes

a+ b+

a1 b1

a1 b1

1/4

1/4

desce da ce4 génotypes

a+ b+

a1 b1

a1 b1

>1/4

>1/4

=

=a1 b1

a+ b1

a1 b1

a1 b+

1/4

1/4a+ b1

a1 b1

a1 b+

a1 b1

<1/4=

a1 b

a1 b11/4

Recombinaison par brassageinterchromosomique

P=R

a1 b

a1 b1<1/4

Recombinaison par brassageintrachromosomique

("crossing over")P>R

=

14

15

16

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18

19

20

Schéma de la méthode de PCR inverse

w+

E t ti d l’ADN é iExtraction de l’ADN génomiquede la souche mutante obtenuepar insertion du transposon P

Digestion enzymatique de l’ADNgénomique (enzyme

w+

génomique (enzyme qui coupe 1 seule fois dans le

transposon)

Ligation

5U

Ligation

PCR avec les amorces 5L et 5Ulocalisées dans les séquences de P

w+5L

: ADN génomique

5L

Séquençage du produit de PCR(amorces 5L ou 5U)

Interrogation des banques de données pour l’identification des séquences génomiques à côté

5U

: ADN génomique

séquences génomiques à côté des séquences de P

Mécanisme de phototransduction chez la drosophile et les vertébrésd’après Montell (1999). Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 231-268

21

Les rhodopsines de drosophile

22

A

B

A. Structure de la rhodopsine 1. Les 5 cylindres représentent les 7 domainestrans-membranaires (TMD); le site d’attachement du rétinol est dans le 7ème TMD.B. Structure du cis- et du trans-rétinol.

Caractéristiques des 5 rhodopsines de drosophile

d’après Montell (1999). Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 231-268

Etude du promoteur du gène rh1 codant pour la Rhodopsine 1d'après Sheng et al. (1997) Genes and Dev. 11, 1122-1131

23

A. Le facteur de transcription Pax6 se fixe in vitro à l'élément P3 du promoteur de rh1

Drh-P3: promoteur de rh1

Drh-P3Mut: promoteur de rh1

Promoteur de rh1

Expériences de retard sur gel surles promoteurs Drh-P3 et Drh-P3Mutavec des doses décroissantes de Pax6;D di è M è

pmuté dans le site P3

D: dimère; M: monomère

Pax6

Sonde DrhP3 Sonde DrhP3-Mut

B. L’élément P3 fixant Pax6 est nécessaire pour réguler in vivo l'expression de rh1

Coloration au X-Gal de coupes de têtes de drosophile contenant les transgènes DrhP3-lacZ et DrhP3Mut-lacZ.Accolade: rétine; flèche: lamina (dans le lobe optique)

Etude d’un modèle drosophile de rétinite pigmentaired’après Galy et al. (2005) Hum. Mol. Genetics 14, 2547-2557

24

A. Phénotype de dégénérescence rétinienne induit par une mutation du gène rh1

Coupes transversales d’œil de drosophile sauvages (WT) ou transgéniques portant la construction P[rh1prom-Rh1P37H] (notée Rh1P37H), agées de 1 jour ou 21 jours. Les têtes de flèches indiquent les photorécepteurs R7.

B. Ce phénotype est supprimé par l’expression de la protéine anti-apoptotique p35

Coupes transversales d’œil de drosophile agées de 28 joursportant seulement la construction P[rh1prom-Rh1P37H] (A) ou les trois constructions P[rh1prom-Rh1P37H], P[rh1prom-Gal4] etP[UAS-p35] (B)

Tests de phototaxie (haut)Electrorétinogramme (bas)

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