Modulation de l’expression de gènes reliés à la · Figure 6 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des gènes codant pour les facteurs

Modulation de l’expression de gènes reliés à la

virulence et au stress chez Porphyromonas gingivalis

par les polyphénols du thé vert

Mémoire

Jade Fournier Larente

Maîtrise en microbiologie

Maître ès science (M.Sc.)

Québec, Canada

Jade Fournier Larente, 2014

II

III

RÉSUMÉ

Dans ce projet, la capacité des polyphénols du thé vert à moduler l’expression de

certains gènes chez Porphyromonas gingivalis, le principal agent étiologique de la

parodontite chronique, a été évaluée. Une analyse par PCR quantitative a démontré qu’à

des concentrations sous-inhibitrices, l’extrait de thé vert ainsi que l’épigallocatéchine-3-

gallate (EGCG) réduisent à différents degrés le niveau d’expression de gènes codant pour

d’importants facteurs de virulence chez P. gingivalis. Ces facteurs participent notamment à

la colonisation, l’acquisition des nutriments et la destruction tissulaire. De plus, les deux

composés ont augmenté le niveau d’expression du gène codant pour la protéine de

résistance au stress HtrA chez P. gingivalis. Les résultats de cette étude suggèrent que le

thé vert et l’EGCG pourraient contribuer à réduire la virulence de P. gingivalis, supportant

ainsi une potentielle utilisation pour la prévention et le traitement de la parodontite.

IV

V

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ .............................................................................................................................. III

TABLE DES MATIÈRES ..................................................................................................... V

LISTE DES FIGURES ....................................................................................................... VII

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................... IX

LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................... XI

REMERCIEMENTS ........................................................................................................... XV

1 INTRODUCTION ............................................................................................................ 1 1.1 Structure du parodonte ............................................................................................... 1 1.2 Maladies parodontales ............................................................................................... 2

1.2.1 Généralités .......................................................................................................... 2 1.2.1.1 Gingivite ...................................................................................................... 2 1.2.1.2 Parodontite ................................................................................................... 2

1.3 Étiologie des maladies parodontales .......................................................................... 5 1.3.1 Composante bactérienne ..................................................................................... 5

1.3.1.1 Parodontopathogènes ................................................................................... 5 1.3.1.2 Porphyromonas gingivalis ........................................................................... 6

1.3.1.2.1 Facteurs de virulence ............................................................................ 7 1.3.1.2.2 Mécanismes de réponse aux stress ...................................................... 10

1.3.2 Composante inflammatoire ............................................................................... 11 1.4 Polyphénols .............................................................................................................. 12

1.4.1 Généralités ........................................................................................................ 12 1.4.2 Classification .................................................................................................... 12 1.4.3 Thé .................................................................................................................... 14 1.4.4 Thé vert ............................................................................................................. 15

1.4.4.1 Composition ............................................................................................... 16 1.4.4.2 Effets bénéfiques sur la santé générale ...................................................... 17 1.4.4.3 Effets bénéfiques sur la santé buccale ....................................................... 17

1.4.4.3.1 Halitose ............................................................................................... 17 1.4.4.3.2 Carie dentaire ...................................................................................... 18 1.4.4.3.3 Parodontite .......................................................................................... 19

2 PROBLÉMATIQUE ....................................................................................................... 21 2.1 Hypothèse de recherche ........................................................................................... 21 2.2 Objectifs ................................................................................................................... 21

3 MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................ 23 3.1 Composantes à l’étude ............................................................................................. 23 3.2 Souche bactérienne et conditions de croissance ...................................................... 23 3.3 Détermination des concentrations minimales inhibitrices ....................................... 24 3.4 Traitements de Porphyromonas gingivalis .............................................................. 24

3.4.1 Évaluation de l’expression de gènes ................................................................. 25 3.4.1.1 Extraction de l’ARN .................................................................................. 25

VI

3.4.1.2 Évaluation de la pureté et de la concentration des ARN ........................... 25 3.4.1.3 Préparation des ADN complémentaires par transcriptase inverse ............ 26

3.5 Préparation des amorces .......................................................................................... 26 3.6 PCR quantitative ..................................................................................................... 27 3.7 Analyse statistique ................................................................................................... 29

4 RÉSULTATS ................................................................................................................. 31 4.1 Concentrations minimales inhibitrices .................................................................... 31 4.2 Expression des gènes codant pour les facteurs de virulence ................................... 31

4.2.1 Effet de l’extrait de thé vert .............................................................................. 31 4.2.2 Effet de l’EGCG ............................................................................................... 35

4.1 Expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA .................................... 39 4.1.1 Effet de l’extrait de thé vert .............................................................................. 40 4.1.2 Effet de l’EGCG ............................................................................................... 41

5 DISCUSSION ................................................................................................................ 43

6 ANNEXE ....................................................................................................................... 53

7 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................... 57

VII

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique des tissus de soutien de la dent (figure traduite et

adaptée de Encyclopædia Britannica, Inc. 2013). ................................................................... 1

Figure 2 : Représentation des complexes bactériens selon Socransky et collaborateurs (28).

................................................................................................................................................ 6

Figure 3 : Modes de production et composition en polyphénols des divers thés (figure

adaptée de Cooper et collaborateurs (80)). .......................................................................... 15

Figure 4 : Structure moléculaire de l’épigallocatéchine-3-gallate. ....................................... 16

Figure 5 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des

gènes codant pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis

ATCC 33277. ........................................................................................................................ 33


gènes codant pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des

mécanismes de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC

33277. ................................................................................................................................... 34

Figure 7 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du gène

codant pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. ................................................ 35

Figure 8 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression des gènes codant

pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis ATCC 33277. .....

.............................................................................................................................................. 37


pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des mécanismes

de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC 33277. ....... 38

Figure 10 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression du gène codant

pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. ............................................................ 39

Figure 11 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du

gène codant pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. .................... 40


pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. ........................................ 41

VIII

IX

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Classification des polyphénols. .......................................................................... 14

Tableau 2 : Composition de l’extrait de thé vert GT#9. ....................................................... 23

Tableau 3 : Amorces utilisées pour la quantification de l’expression des gènes chez P.

gingivalis par PCR quantitative. ........................................................................................... 28

X

XI

LISTE DES ABRÉVIATIONS

C

g

l

ADN

ADNc

ARN

ATCC

CD

CH3SH

CMI

CO2

DL-C

DNase

DO

EC

ECG

EGC

EGCG

EMMPRIN

g

GAPDH

GCG

GT9

h

H2

H2S

ICAM

IL

L

LPS

MAPK

METase

ml

mM

MMP

MOI

Degré Celsius

Microgramme

Microlitre

Acide désoxyribonucléique

ADN complémentaire

Acide ribonucléique

American Type Culture Collection

Cluster of differentiation

Méthyl mercaptan

Concentration minimale inhibitrice

Dioxyde de carbone

DL-Catéchines

Désoxyribonucléase

Densité optique

Épicatéchine

Épicatéchine gallate

Épigallocatéchine

Épigallocatéchine-3-gallate

Extracellular matrix metalloproteinase inducer

Gramme

Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

Gallate catéchine gallate

Green tea #9

Heure

Dihydrogène

Sulfure d’hydrogène

Intercellular adhesion molecule

Interleukine

Litre

Lipopolysaccharide

Mitogen-activated Protein Kinase

L-méthionine-α-deamino-γ-mercaptomethane-lyase

Millilitre

Millimolaire

Métalloprotéinase matricielle

Multiplicity of infection

XII

MTS

MTT

MUC-1

N2

NF-B

nm

pb

PCR

%

qPCR

THB-HK

TNF-

TREM-1

Unité

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-

(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium

3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide

Mucine-1

Diazote

Facteur nucléaire kappa B

Nanomètre

Paires de bases

Polymerase chain reaction

Pourcentage

Quantitative polymerase chain reaction

Todd Hewitt broth-hémine-vitamine K

Facteur de nécrose tumorale alpha

Triggering receptor expressed on myeloid cells-1

U

XIII

There are some bacteria that cause a disease, but there are some diseases that bring about

a condition that is ideal for the growth of some bacteria.

- Louis Pasteur -

XIV

XV

REMERCIEMENTS

J’adresse mes remerciements sincères à ceux et celles qui ont participé de près ou de loin à

la réalisation de ce projet.

Tout d’abord, à mon directeur de recherche Dr Daniel Grenier pour avoir été aussi présent,

pour son aide précieuse et pour le temps qu’il a bien voulu consacrer à répondre à toutes

mes questions et inquiétudes, sans lui, ce mémoire n'aurait jamais vu le jour.

Je voudrais également remercier les membres de mon comité aviseur, Dr Michel Frenette et

Dre Fatiha Chandad, pour leurs conseils qui ont été des atouts à l’élaboration et à la réussite

de ce projet.

Je voudrais exprimer ma reconnaissance envers mes collègues qui m’ont transmis leur

expertise et aider dans les moments d’incertitude. Je veux aussi vous dire merci de rendre le

laboratoire aussi vivant et chaque journée aussi agréable!

Un merci particulier à Laetitia Bonifait, qui a été mon mentor de microbiologie. Merci pour

les gants roses qui m’attendaient à mon arrivée au labo; j’avais les plus beaux pour faire

mes qPCR!

Merci à ma mère et ma sœur qui ont toujours été là pour moi, qui m’ont soutenue et

encouragée tout au long de mes études. Je tiens également à remercier mon copain pour sa

compréhension, son écoute et ses encouragements. J’y suis arrivée grâce à vous!

Enfin, je désire remercier mes amis pour leur présence et leur compagnie tant bien lors des

cours que dans les heures interminables d’étude et de travail!

XVI

1

1 INTRODUCTION

1.1 Structure du parodonte

Le parodonte représente l’ensemble des tissus entourant et servant au soutien des dents. Il

comprend différentes structures dont la gencive, l’os alvéolaire, le cément et le ligament

parodontal (1) (Figure 1). La gencive fait partie de la muqueuse buccale et représente la

structure visible entourant la dent. L’os alvéolaire sert au maintien de la dent dans l’arcade

maxillaire et forme l’alvéole dentaire (1). Le cément est une structure avasculaire et non

innervée qui tapisse la surface externe de la dentine au niveau de la racine et qui assure

l’attache des fibres du ligament parodontal. Ce dernier, aussi appelé desmodonte, se situe

entre les racines et l’os alvéolaire et assure l’ancrage de la dent dans l’alvéole dentaire (2).

Figure 1 : Représentation schématique des tissus de soutien de la dent (figure traduite et

adaptée de Encyclopædia Britannica, Inc. 2013).

2

1.2 Maladies parodontales

1.2.1 Généralités

Les maladies parodontales sont des maladies inflammatoires d’origine bactérienne affectant

les tissus entourant et supportant les dents. Elles représentent les principales affections de la

cavité buccale avec la carie dentaire. Les maladies parodontales constituent un problème de

santé important dans la population (3). Il en existe 2 principales, soit la gingivite et la

parodontite.

1.2.1.1 Gingivite

La gingivite est la maladie parodontale la plus répandue. Elle a une grande prévalence chez

les adultes et est ubiquitaire chez les enfants (4, 5). Environ 50% de la population nord-

américaine souffre de cette maladie et des proportions similaires ont été observées pour

d’autres pays (4). La gingivite correspond à une inflammation des gencives engendrant de

la rougeur, un gonflement et le saignement des gencives, le tout, ne menant pas à une perte

d’attache de la dent (6-8). Cette maladie est réversible, et ce, par une meilleure hygiène

buccale et dans certains cas un traitement dentaire. Cependant, lorsque non traitée, la

gingivite peut mener à une maladie parodontale beaucoup plus sévère, soit la parodontite

(6, 9).

1.2.1.2 Parodontite

La parodontite se définit comme une maladie inflammatoire sévère et progressive affectant

l’ensemble des structures de soutien de la dent. La prévalence varie selon le sexe, la race et

la région géographique. En Amérique du Nord, environ 40% de la population présente des

symptômes de parodontite et au niveau mondial entre 5 et 15% de la population est atteinte

d’une forme sévère de parodontite (4, 10). La parodontite progresse par phases cycliques de

recrudescence, de rémission et de latence qui sont en étroite relation avec l’efficacité de la

3

réponse immunitaire de l’hôte. Il existe différentes formes de parodontite, dont la

parodontite chronique et la parodontite agressive. La parodontite chronique affecte

principalement les adultes et les personnes âgées, et correspond à la forme la plus commune

de parodontites chez ces groupes d’âge (11). Elle peut être subdivisée en parodontite

généralisée ou localisée, selon son étendue. Le principal agent étiologique responsable de

cette forme est Porphyromonas gingivalis (9, 12). La parodontite agressive, quant à elle,

diffère de la parodontite chronique par sa prévalence très faible et son évolution très rapide.

Même si cette forme débute vers l’adolescence, elle n’est souvent cliniquement

diagnostiquée que vers les 20-30 ans (13, 14).

Plusieurs facteurs peuvent prédisposer un individu au développement d’une parodontite.

Comme déjà mentionné, les adultes et les personnes âgées sont principalement atteints, et

un homme s’avère plus propice qu’une femme au développement d’une parodontite (3, 15).

Également, une personne souffrant de diabète verra ses chances de développer la maladie

tripler comparativement à un non-diabétique (16, 17). D’autres problèmes de santé comme

l’obésité et le SIDA peuvent aussi être considérés comme étant des facteurs de risques pour

la parodontite (18-20). De plus, les fumeurs ont un risque plus élevé puisque la cigarette a

un effet immunosuppresseur, diminuant ainsi l’efficacité d’élimination des

microorganismes pathogènes, en plus d’augmenter l’adhésion des bactéries aux cellules

épithéliales (19).

Tel que mentionné précédemment, certaines maladies peuvent mener au développement de

la parodontite, toutefois, la parodontite peut elle aussi prédisposer au développement de

maladies. Par exemple, le diabète peut être à la fois une cause et une conséquence de la

maladie (21). De plus, la parodontite peut être responsable du développement de maladies

cardiovasculaires et de problèmes respiratoires, telle la pneumonie. Elle peut également

augmenter les risques de naissance prématurée et de bébés prématurés de petits poids (19).

La parodontite chronique découle souvent d’une gingivite non traitée. En effet, la plaque

dentaire, également connue sous le nom de biofilm dentaire (22), présente dans les sites

supragingivaux, ainsi que le tartre vont progresser sous la gencive provoquant ainsi la

4

destruction du ligament parodontal. Ce ligament étant attaché au cément, un détachement

de la gencive se produira, créant du fait même une poche parodontale (9). Lors de la

progression de la maladie, les populations bactériennes colonisant les sites sous-gingivaux

vont gagner en importance et intensifier la réaction inflammatoire. L’évolution de la

maladie va se faire progressivement et sur une longue période de temps au cours de laquelle

les populations bactériennes se modifieront. La microflore buccale, habituellement

constituée de bactéries anaérobies facultatives à Gram-positif, deviendra majoritairement

composée de bactéries anaérobies strictes à Gram-négatif, ce qui caractérise le passage vers

un état pathologique (23, 24). À plus long terme, s’il y a absence de traitement, l’os

alvéolaire pourra être affecté et se dégrader de telle sorte qu’il y aura perte de la dent.

Il est possible de traiter la parodontite, mais les dommages causés s’avèrent permanents. Le

traitement de la maladie doit être adapté selon l’individu, mais est réalisé suivant deux

étapes essentielles. La première étape consiste en un détartrage qui permet d’enlever la

plaque et le tartre s’étant formés dans la poche parodontale. La deuxième étape implique un

surfaçage radiculaire. Un polissage de la racine de la dent est réalisé afin de favoriser le

rattachement de l’épithélium à la dent et la guérison (12). Advenant que certains sites ne

répondent pas au traitement, une chimiothérapie peut être ajoutée pour l’élimination des

parodontopathogènes (12, 25). Par exemple, la doxycycline pourra être administrée

localement ou par voie systémique, alors que la chlorhexidine sera administrée localement

(26). De plus, avoir recours à la chirurgie pourra corriger les défauts et permettre une

régénération osseuse (3). Le détartrage et le surfaçage radiculaire combinés avec des

mesures personnelles d’élimination de la plaque, comme le brossage et l’utilisation de la

soie dentaire, ont été prouvés comme permettant à eux seuls un retour vers une flore

normale, soit exempte de P. gingivalis (12). Une réduction de la quantité de P. gingivalis

des sites parodontaux est souvent indicatrice d’une résolution de la maladie (27).

5

1.3 Étiologie des maladies parodontales

1.3.1 Composante bactérienne

1.3.1.1 Parodontopathogènes

Les maladies parodontales sont des maladies d’origine polymicrobienne causées par un

groupe de bactéries appelées parodontopathogènes. Il a été découvert, grâce aux travaux

réalisés par Socransky et collaborateurs, que les parodontopathogènes présents dans les

sites sous-gingivaux se présentent sous forme de complexes bactériens (28) (Figure 2). Ce

groupe de chercheurs a décrit six complexes représentant la séquence de colonisation et

marquant le début de la maladie. À l’état sain, le complexe jaune regroupant les bactéries

du genre Streptococcus, le complexe mauve constitué des espèces Actinomyces

odontolyticus et Veillonella parvula, en plus du complexe vert comportant les bactéries du

genre Capnocytophaga ainsi que les espèces Eikenella corrodens et Aggregatibacter

actinomycetemcomitans (sérotype a), colonisent la surface de la dent avec les Actinomyces

(complexe bleu). Ces quatre complexes représentent les colonisateurs primaires. Le début

de l’état pathologique est marqué par l’apparition du complexe orange, comportant les

bactéries des genres Campylobacter, Fusobacterium, Eubacterium, Prevotella,

Peptostreptococcus et Streptococcus. Le complexe rouge représente les colonisateurs

tardifs et est associé, avec le complexe orange, aux stades avancés des parodontites. Le

complexe rouge est plus spécifiquement associé à la forme chronique et est composé de

trois bactéries soit P. gingivalis, le principal agent étiologique de la parodontite chronique,

Treponema denticola et Tannerella forsythia (28).

6

Figure 2 : Représentation des complexes bactériens selon Socransky et collaborateurs (28).

1.3.1.2 Porphyromonas gingivalis

P. gingivalis est une bactérie asaccharolytique à Gram négatif, anaérobie stricte, qui

morphologiquement se présente sous forme de coccobacille, d’environ 2 µm de longueur et

1 µm de diamètre, isolé ou en courte chaîne. Cette bactérie est souvent retrouvée dans les

sites sous-gingivaux de par la faible teneur en oxygène qui y est retrouvée. Comme

mentionné précédemment, P. gingivalis est l’un des principaux agents étiologiques

responsables de la parodontite, plus spécifiquement de la forme chronique. Sur gélose sang,

cette bactérie a la particularité de former des colonies à pigmentation noire résultant de

l’accumulation dans ses membranes de protoporphyrine dérivée de l’hémine contenue dans

le milieu (27). Ce sont les différents mécanismes de pathogénicité de cette bactérie qui lui

7

permettent de coloniser la cavité buccale, de contourner le système immunitaire et

d’engendrer la destruction tissulaire.

1.3.1.2.1 Facteurs de virulence

Les facteurs de virulence ont d’abord été décrits comme étant des composantes

bactériennes ayant un effet néfaste sur les cellules hôtes. La bactérie P. gingivalis possède

plusieurs facteurs contribuant à sa virulence lui permettant entre autres de : coloniser les

sites sous-gingivaux, provoquer la destruction tissulaire et contourner les systèmes de

défense.

Différents fimbriae (0.3 à 3 µm de longueur par 5 nm de largeur) se présentent de façon

péritriche à la surface de P. gingivalis. Les fimbriae majeurs de type I (FimA) se trouvant à

la surface de P. gingivalis permettent la colonisation des sites sous-gingivaux. Ils sont

responsables de l’adhérence initiale de la bactérie à l’intérieur de la poche parodontale,

c’est-à-dire à la surface de la dent ou au biofilm déjà présent. Le gène de FimA n’est

présent qu’en une seule copie sur le chromosome de la bactérie et la séquence protéique ne

présente pas d’homologie avec d’autres protéines fimbriales (29). Chez P. gingivalis, on

compte 6 génotypes de fimbriae appelés type I à V et Ib. À cause de leur longueur, les

fimbriae majeurs ont été proposés comme étant la première structure de la bactérie à entrer

en contact avec les surfaces et les colonisateurs primaires (29). En effet, FimA est

responsable de la coadhésion à différentes bactéries par l’entremise de différents récepteurs,

dont la glycéraldéhyde-3-phosphate (GAPDH) déshydrogénase chez certains streptocoques.

En plus des fimbriae majeurs, on retrouve également à la surface de la bactérie des fimbriae

mineurs qui permettent eux aussi la coadhésion aux bactéries déjà présentes (29-32). Ces

fimbriae proviennent du gène mfa1 codant pour la sous-unité protéique Mfa. Par ailleurs,

les fimbriae majeurs stimulent les cellules de l’hôte et déclenchent une réponse

inflammatoire. En réponse au fimbriae, les cellules épithéliales et les monocytes vont

sécréter des cytokines pro-inflammatoires via l’activation du CD14 et de la voie NF-B

(29). Il a été démontré que la production de cytokines par les cellules dendritiques est

grandement diminuée lorsque P. gingivalis n’exprime pas de fimbriae majeur (33).

8

Des protéines membranaires, comme les hémagglutinines (HagA à E) contribuent

également à l’établissement de la bactérie dans les sites sous-gingivaux (34). Ces protéines

permettent la liaison de la bactérie à des récepteurs, comme les oligosaccharides présents

sur les cellules humaines. Elles permettent l’adhésion de la bactérie à la surface des

érythrocytes pour faciliter l’acquisition de nutriments. En effet, l’inactivation des gènes

hagA, hagB et hagC a démontré une diminution de l’activité d’hémagglutination de la

bactérie (35).

P. gingivalis possède également des facteurs contribuant à l’inactivation des mécanismes

de défense de l’hôte et à la destruction tissulaire, soit les protéinases. Ces dernières

appartiennent à la famille des cystéines protéinases et se retrouvent à la surface de la

membrane de P. gingivalis ou sont sécrétées sous forme soluble (36). P. gingivalis possède

trois protéinases majeures, aussi connues sous le nom de gingipaïnes, possédant une

activité amidolytique pour des acides aminés spécifiques. L’Arg-gingipaïne A et B (RgpA,

RgpB) clivent la région carboxy-terminale des résidus arginine alors que la Lys-gingipaïne

(Kgp) clive la région carboxy-terminale des résidus lysine (37). RgpA ainsi que Kgp

possèdent des domaines hémagglutinines qui contribuent à la colonisation de la cavité

buccale par P. gingivalis (38). Les adhésines des Rgp permettent l’adhésion de P.

gingivalis aux cellules épithéliales alors que leurs domaines catalytiques permettent la

désorption des bactéries (39). Une étude a démontré que des mutants n’exprimant pas

certaines protéinases montraient une capacité atténuée à former des biofilms (40, 41).

De plus, les protéinases ont la capacité de dégrader des protéines structurales comme le

collagène de type I, III, IV et V, la fibronectine et les laminines (42). En effet, les Arg-

gingipaïnes sont des collagénases responsables de la dégradation du collagène de type I.

Des essais réalisés ont démontré que leur inactivation entraînait une perte de la capacité de

P. gingivalis à dégrader le collagène de type I. C’est la forme associée à la membrane de

ces protéases qui est responsable de la dégradation la plus efficace de ces fibres de

collagène (43). La destruction tissulaire qui marque la progression de la parodontite résulte

de la dégradation de la protéine constituant majoritairement les tissus parodontaux par les

protéases, soit le collagène de type I. Les protéases contribuent également au saignement

9

lors du sondage par la dégradation du fibrinogène (38). La dégradation de la fibronectine

par les protéases de P. gingivalis permet aussi d’exposer des récepteurs présents à la

surface des cellules, soit les cryptitopes. Ces récepteurs n’étant habituellement pas

disponibles vont permettre l’attachement de la bactérie et ainsi contribuer à la capacité

d’adhérence de P. gingivalis (44).

Certaines immunoglobulines, en plus des cytokines et du CD14 à la surface des monocytes,

peuvent être dégradés par les protéinases, contribuant ainsi à la progression et au maintien

de P. gingivalis à l’intérieur de la poche parodontale (45-50). La cascade du complément

est un mécanisme de défense déclenché par les cellules de l’hôte en réponse à la présence

de microorganismes dans le but de les éliminer. Cependant, les protéases de P. gingivalis

protègent la bactérie contre cette cascade en dégradant les facteurs du complément comme

le facteur C3 (38, 51). Le complément, bien que son activation permette d’éliminer les

organismes pathogènes, peut moduler une destruction tissulaire s’il n’est pas régulé

correctement. Le CD46, un cofacteur membranaire, permet entre autres la régulation du

complément en inactivant les facteurs d’activation. Or, les protéases de P. gingivalis

peuvent cliver le CD46 de la surface des cellules provoquant ainsi son relâchement et

prévenant l’inactivation des molécules du complément favorisant ainsi la progression de la

maladie (52). Les protéases de P. gingivalis interviennent, également, dans l’acquisition de

nutriments. Elles peuvent dégrader la transferrine, une protéine riche en fer et présente en

grande quantité dans le liquide créviculaire, afin de fournir une source de fer à la bactérie

(53). En effet, des mutants de P. gingivalis pour les Arg- et Lys-gingipaïnes n’étaient plus

en mesure de dégrader la transferrine (53). Les protéases de P. gingivalis engendrent

également la sécrétion de cytokines proinflammatoires par les macrophages. En effet, la

stimulation de ces cellules avec les Arg-gingipaïnes active la voie de transduction de signal

de la MAPK p38 (Mitogen-activated Protein Kinase) entraînant la sécrétion de TNF- et

d’IL-8 (54).

Finalement, l’hémolysine est responsable de l’acquisition d’une source de fer. Elle permet à

P. gingivalis de lyser les érythrocytes, libérant ainsi l’hémoglobine ce qui fournit l’hémine

nécessaire à la croissance de la bactérie (35, 51).

10

Les bactéries à Gram-négatif, dont P. gingivalis, possèdent à leur surface du

lipopolysaccharide (LPS), une composante qui fait partie intégrale de leur enveloppe

externe. La structure du LPS est divisée en trois parties soit le lipide A, l’antigène O et le

polysaccharide central. Le LPS joue un rôle majeur dans le développement des maladies

parodontales et le lipide A est la partie principalement responsable de la stimulation du

système immunitaire. Le LPS de P. gingivalis induit notamment la sécrétion de diverses

cytokines et peut activer la voie RANK/RANKL contribuant ainsi à la progression de la

maladie (55, 56).

1.3.1.2.2 Mécanismes de réponse aux stress

Les bactéries possèdent différents mécanismes leur permettant de survivre à des situations

de stress. Selon le stimulus, une réponse différente peut être déclenchée. Par exemple,

OxyR, une protéine tétramérique se liant à l’ADN, présente entre autres chez Escherichia

coli et P. gingivalis, est activée en présence d’H2O2 (57). Cette protéine induit la

transcription de différents gènes nécessaires à la bactérie pour la résistance au stress

oxydatif (57, 58). De plus, cette même protéine est activée chez P. gingivalis lorsque la

bactérie est cultivée dans un milieu limité en hémine (59). Lorsque mise en présence

d’oxyde nitrique, la protéine HcpR (hybrid cluster protein), une enzyme redox, est

exprimée par P. gingivalis. Elle permet de réduire l’hydroxylamine produite à partir de

l’oxyde nitrique ou du nitrite en eau et en ammoniaque (60).

Également, la protéine HtrA (high temperature requirement A) possède 2 fonctions lui

permettant de jouer un rôle lors de stress. À température élevée, HtrA joue le rôle de sérine

protéase alors qu’à basse température elle est une protéine chaperonne (61). En situation de

stress, il devient essentiel pour la survie des bactéries de dégrader les protéines

endommagées qui s’accumulent. HtrA est responsable de la dégradation de ces protéines.

Chez les bactéries à Gram-négatif, HtrA est une protéine périplasmique (62). Elle est

présente chez plusieurs espèces bactériennes et possède différentes fonctions. Par exemple,

chez Bordetella pertussis, elle sert de chaperonne à son adhésine principal lors de sa

sécrétion alors que chez Listeria monocytogenes elle permet de résister aux changements de

11

pH (63). Également, HtrA confère à Legionella pneumophila une résistance à la

phagocytose par les macrophages et une protection contre les antibiotiques à

Staphyloccocus aureus (63). Chez P. gingivalis, HtrA est responsable de la résistance au

stress oxydatif et n’intervient pas dans la protection lors des changements de pH et de

l’augmentation de température (62, 63).

1.3.2 Composante inflammatoire

Bien que la présence d’un biofilm bactérien dans les sites sous-gingivaux soit un facteur

essentiel pour le développement de la maladie, il ne peut, à lui seul, provoquer la

destruction tissulaire caractéristique de la parodontite. En effet, une réaction inflammatoire

destructrice induite par l’agression bactérienne est déclenchée et contribue au

développement de la maladie.

Chez un individu sain, une réponse immunitaire et inflammatoire basale est toujours

présente puisque les cellules sont constamment stimulées par la présence de la microflore

buccale (64, 65). Une proportion de bactéries sera éliminée par la salive et par le

mouvement ascendant du fluide créviculaire, mais bon nombre de celles-ci demeurent en

contact avec l’épithélium de la gencive (66). Ce dernier représente la première ligne de

défense rencontrée par les bactéries et est responsable de la sécrétion de β-défensines

reconnues pour leurs propriétés antimicrobiennes. Les β-défensines sont retrouvées en

grande quantité dans la région de la gencive en contact direct avec les parodontopathogènes

(67). De plus, le système immunitaire de l’hôte reconnaît des motifs moléculaires des

microorganismes menant à la production de diverses molécules, dont les E-sélectines, la

molécule d’adhésion intracellulaire (ICAM) et l’interleukine (IL-8) afin de recruter des

neutrophiles au site d’infection où se retrouvent les bactéries parodontopathogènes (68). Le

système de défense est donc en mesure de contrôler la prolifération bactérienne et

d’empêcher l’invasion tissulaire par les bactéries. Cependant, lors d’un débalancement, par

exemple une déficience momentanée du système immunitaire, les mécanismes de défense

de base ne suffisent plus et les bactéries sont en mesure de proliférer et d’envahir les tissus

sous-jacents. Le système immunitaire se retrouve alors stimulé de façon trop importante,

12

entraînant ainsi une réponse immunitaire anormale. Ce phénomène engendre la libération

d’une grande quantité de molécules pro-inflammatoires au site d’infection qui

s’accumulent, provoquant alors une réponse inflammatoire destructive par l’hôte.

Plus spécifiquement, les cytokines, incluant l’IL-1β, l'IL-6, l’IL-8 et le facteur de nécrose

tumorale (TNF)-α, ont grandement été associées à la progression de la maladie (66). Elles

sont retrouvées en quantité importante dans les sites sous-gingivaux en phase active de la

maladie et leur sécrétion est entre autres responsable du recrutement des cellules

immunitaires, au site de l'inflammation (56). De plus, la sécrétion des cytokines et des

médiateurs de l'inflammation favorise la production excessive de certaines

métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9), provoquant par le fait

même la dégradation du collagène, de la fibronectine et de la laminine, et une destruction

osseuse caractéristique de la maladie parodontale (8, 22, 56, 69-73).

1.4 Polyphénols

1.4.1 Généralités

Les polyphénols sont des composés naturellement retrouvés dans le règne végétal ; ils sont

en grande partie responsables des propriétés organoleptiques en plus d’assurer une

protection contre les rayons ultraviolets, les microorganismes pathogènes, et les prédateurs

(74, 75). Les polyphénols, reconnus pour leur fort potentiel antioxydant, sont consommés

dans l’alimentation courante et apportent de grands bienfaits pour la santé humaine. Les

proportions ainsi que la nature des polyphénols varient grandement d’un végétal à l’autre

(76).

1.4.2 Classification

La structure moléculaire des polyphénols comprend plusieurs groupements aromatiques,

des phénols, auxquels sont attachés des groupements hydroxyles. Jusqu’à présent, la

13

structure et les caractéristiques de plus de 8 000 polyphénols ont été répertoriées (77, 78).

La classification de ceux-ci est basée sur divers critères tels leur provenance, leur fonction

biologique ainsi que leur squelette de carbone (79). Plus spécifiquement, les polyphénols

sont d’abord classés selon leur appartenance à la classe des flavonoïdes ou des non-

flavonoïdes, puis divisés en sous-classes (Tableau 1) (79).

14

Tableau 1 : Classification des polyphénols.

Classes Sous-classes Exemple de composés

Flavonoïdes

Flavanones Naringénine

Flavones Lutéoline

Isoflavonoïdes Glabridine

Flavonols Quercétine

Myricétine

Flavanols

Monères Catéchine

Polymères

(Tannins)

condensés

Constitué de sous-

unités catéchines ou

épicatéchines

hydrolysables Constitué d’acide

gallique ou éllagique

Anthocyanines Cyanidine

Chalcones Butéine

Non-

flavonoïdes

Acides phénoliques Acide gallique

Eugénol

Stilbènes Resvératrol

Lignanes Magnolol

Honokiol

Coumarins Collinine

Lacinartine

1.4.3 Thé

Le thé, Camellia sinensis, est le breuvage le plus consommé dans le monde après l’eau.

C’est un composé naturel dans lequel de grandes quantités de polyphénols sont présentes.

Les polyphénols retrouvés dans le thé ainsi que leurs proportions varient entre les différents

types de thés. Ces différences sont principalement reliées à leur mode de préparation. Les

thés peuvent être fermentés, partiellement fermentés ou non-fermentés (80). Les méthodes

15

de production de thés ainsi que les types de polyphénols qu’ils renferment sont présentés

dans la Figure 3.

Figure 3 : Modes de production et composition en polyphénols des divers thés (figure

adaptée de Cooper et collaborateurs (80)).

1.4.4 Thé vert

Le thé vert est un thé non-fermenté provenant de feuilles matures qui, une fois récoltées,

sont traitées à la vapeur afin de prévenir la fermentation, puis séchées (80, 81). Chaque

année, environ 2.5 millions de tonnes de thé sont produites et le thé vert en constitue

environ 20% (82). Le Japon, la Chine, l’Inde et certains pays du Moyen-Orient représentent

les plus grands consommateurs de thé vert (80).

16

1.4.4.1 Composition

Plusieurs facteurs influencent la composition du thé, notamment le climat, les saisons et le

degré de maturation des feuilles (83). Le thé contient de la théanine, un acide aminé dérivé

de la glutamine et propre au thé. Une faible quantité de caféine, environ 3%, est également

présente en plus de différents composés incluant des polyphénols, des protéines, des lipides

et de la chlorophylle (83). Les polyphénols qui composent principalement le thé vert font

partie de la classe des flavonoïdes, plus précisément des catéchines. Les catéchines sont des

composés hydro-solubles, incolores qui confèrent l’astringence au thé (83). Il existe 6

catéchines différentes parmi lesquelles 4 sont plus abondantes dans le thé vert;

l’épicatéchine (EC), l’épicatéchine gallate (ECG), l’épigallocatéchine (EGC), et

l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) (Figure 4) (84, 85). L’EGCG est considéré comme le

composé le plus bioactif du thé vert (86) et constitue la catéchine retrouvée en plus grande

proportion. Les catéchines sont des isomères avec une configuration trans alors que

l’épicatéchine est un isomère de configuration cis (79).

Figure 4 : Structure moléculaire de l’épigallocatéchine-3-gallate.

17

1.4.4.2 Effets bénéfiques sur la santé générale

Au cours des dernières années, plusieurs études ont été réalisées, démontrant les effets

bénéfiques du thé vert et de ses composantes sur la santé générale. En effet, plusieurs

études ont apporté des preuves appuyant un effet anti-cancer de ces composés, notamment

en regard du développement du cancer du poumon, du foie, du sein et de la prostate (87-

91). Une étude réalisée chez le rat a aussi démontré des effets anti-thrombotiques associés

aux catéchines du thé vert (92). Ce dernier, de par son potentiel antioxydant, peut

également prévenir le développement de certaines maladies induites par le stress oxydatif

comme les maladies cardio-vasculaires, en plus d’avoir un effet sur les fonctions

plaquettaires (93-97). De plus, les polyphénols du thé vert offrent un potentiel pour la

prévention et le traitement de certaines maladies inflammatoires comme l’arthrite, en

diminuant la production de cyclooxygénase-2 et de TNF- dans les articulations

arthritiques (98, 99). Ces polyphénols peuvent également contrôler l’obésité en inhibant la

prolifération des adipocytes et leur différentiation en cellule 3T3-L1, en plus d’augmenter

l’oxydation des graisses et le niveau d’adiponectine (100-102).

1.4.4.3 Effets bénéfiques sur la santé buccale

1.4.4.3.1 Halitose

L’halitose, communément appelée mauvaise haleine, est principalement causée par la

présence de composés sulfurés volatils (CSV) générés par la transformation d’acides

aminés contenant du soufre par certaines espèces bactériennes se trouvant à l’intérieur de la

cavité buccale (103). Les deux principaux composés responsables de l’halitose sont le

sulfure d’hydrogène (H2S) et le méthyl mercaptan (CH3SH) (6, 104). L’élimination des

bactéries par le brossage quotidien des dents et de la langue permet de diminuer la sévérité

de l’halitose, tout comme l’utilisation de produits antimicrobiens ou de produits capables de

convertir les CSV en composés non-odorants (105). Le thé vert fait partie des produits

capables de tels effets (106, 107). L’utilisation du thé vert sous forme de rince-bouche a été

démontrée comme ayant un impact sur la quantité de CSV présent (103). De plus, l’ajout de

18

catéchines à des gommes à mâcher réduit la quantité de méthanethiol, un composé

contribuant également à l’halitose (6, 108). Des essais in vitro ont également démontré la

capacité d’un extrait de thé vert à diminuer la quantité de H2S et de CH3SH au niveau de la

cavité buccale (109). De plus, l’expression du gène mgl et l’enzyme L-méthionine-α-

deamino-γ-mercaptomethane-lyase (METase), impliqués dans la production de CH3SH par

P. gingivalis, ont pu être inhibé en présence de concentrations sous-inhibitrices d’EGCG

(110).

1.4.4.3.2 Carie dentaire

La carie dentaire est une maladie multifactorielle qui se développe par la présence de

bactéries cariogènes, notamment Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus. C’est la

maladie la plus répandue des tissus calcifiés des dents (111). L’alimentation joue un rôle

important dans le développement de cette maladie et certains aliments peuvent contribuer

ou encore prévenir son développement (112). Une étude utilisant un rince-bouche à base de

thé vert a pu établir un lien entre la diminution du nombre de pathogène causant la carie

dans l’environnement buccal et l’utilisation de ce rince-bouche (113). Plusieurs équipes de

chercheurs ont aussi démontré un effet antibactérien du thé vert sur la principale bactérie

responsable de la carie dentaire, S. mutans (114-116). S. mutans ainsi que d’autres

microorganismes ont la capacité de produire des acides comme sous-produits de la

fermentation des sucres, plus spécifiquement le saccharose. Par la production d’acides, une

déminéralisation de l’émail de la dent peut se produire et entraîner le développement de la

carie dentaire. Or, par le rinçage de la cavité buccale avec l’EGCG, il a été démontré qu’il

est possible de réduire la quantité d’acide produite par les bactéries (117). De plus,

l’EGCG, à des concentrations sous-inhibitrices, a engendré une inhibition chez S. mutans

de l’expression du gène gtf codant pour la glucosyl transférase qui est impliquée dans la

formation du biofilm (118). L’ajout de polyphénols du thé dans des sucreries et dans des

gommes à mâcher a démontré un effet inhibiteur sur la formation de plaque dentaire ainsi

que sur le développement de la carie dentaire (6).

19

1.4.4.3.3 Parodontite

Comme décrite précédemment, la parodontite est une maladie inflammatoire destructrice

qui s’attaque aux structures de soutien de la dent. Les deux composantes étiologiques de la

maladie se doivent d’être contrôlées pour prévenir efficacement la maladie. D’une part, il

est primordial de limiter la colonisation de la cavité buccale par les bactéries

parodontopathogènes. D’autre part, la présence de bactéries parodontopathogènes engendre

une réponse inflammatoire menant à la production de cytokines et de MMPs qui

contribuent au développement de la maladie (8). L’EGCG peut avoir un effet direct ou

indirect sur la voie NF-B et ainsi réduire, voire inhiber la production de certaines

cytokines. Cela a pour effet de diminuer la réponse inflammatoire, entre autres par

l’inhibition de la production de l’IL-1 responsable de la production des MMPs qui

engendrent la destruction de la matrice extracellulaire (116). Plusieurs études ont déjà

évalué la capacité de l’EGCG à réduire la destruction osseuse médiée par les MMPs (119).

Plus spécifiquement, l’étude a montré qu’en plus d’inhiber l’expression de l’ARNm de la

MMP-9, l’EGCG permet aussi d’inhiber la formation d’ostéoclastes (119). D’autres études

viennent appuyer les effets de l’EGCG sur les MMPs et les ostéoclastes (120, 121). Une

étude sur le thé vert a démontré qu’il est possible, par l’utilisation locale de bandelettes

saturées de thé, de réduire la profondeur des poches parodontales ainsi que le nombre de

bactéries anaérobies à pigmentation noire (122). Lombardo Bedran et collaborateurs ont

démontré que le thé vert et l’EGCG augmentent l’expression des gènes codant pour les -

défensines ainsi que la production de celles-ci par les cellules épithéliales buccales (123).

Ils ont aussi démontré que le thé vert et l’EGCG prévenaient la dégradation des -

défensines par les protéases de P. gingivalis. Une autre étude a également rapporté les

effets anti-protéases du thé vert, en plus de propriétés antibactérienne, anti-adhérence et

anti-inflammatoire sur la bactérie P. gingivalis (124).

20

21

2 PROBLÉMATIQUE

Les maladies parodontales telle la parodontite représentent un problème de santé important

dans la population. Leur développement est multifactoriel et fait intervenir des facteurs de

l’hôte, microbiologiques et environnementaux. Malgré les connaissances déjà acquises sur

ces maladies, beaucoup reste à découvrir. En effet, les mécanismes de pathogénicité ainsi

que la réponse de l’hôte face aux microorganismes demeurent encore peu connus. Une

réponse inflammatoire initiée par les cellules épithéliales et les macrophages au niveau du

parodonte engendre une destruction importante du tissu de soutien de la dent et cette

réponse est amplifiée par un contact prolongé avec les bactéries parodontopathogènes,

incluant P. gingivalis. Cette bactérie joue un rôle majeur dans l’initiation et la progression

de la parodontite, c’est pourquoi un contrôle efficace de celle-ci est associé à une

amélioration des conditions de la pathologie. Les traitements aux antibiotiques actuellement

utilisés pour éliminer les bactéries parodontopathogènes amènent de bons résultats, mais

contribuent cependant à l’apparition de résistances bactériennes aux antibiotiques.

L’identification de nouveaux composés capables d’agir sur la prolifération ou sur

l’expression des facteurs de virulence de P. gingivalis s’avère donc d’intérêt.

2.1 Hypothèse de recherche

Les polyphénols du thé vert ont la capacité de moduler l’expression de gènes reliés à la

virulence et au stress chez la bactérie parodontopathogène P. gingivalis.

2.2 Objectifs

- Vérifier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression des gènes codant pour

certains facteurs de virulence chez P. gingivalis;

- Vérifier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression du gène codant pour la

protéine de stress HtrA chez P. gingivalis.

22

23

3 MATÉRIEL ET MÉTHODES

3.1 Composantes à l’étude

L’EGCG a été acheté de la compagnie Sigma-Aldrich Canada Co. (Oakville, ON, Canada)

et l’extrait de thé vert GT#9 (BCY-CT002) a été acheté de la compagnie Gosun

Biotechnologies Co., Ltd. (Hangzhou Zhejiang, Chine). La composition de l’extrait de thé

selon les analyses de la compagnie est présentée dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Composition de l’extrait de thé vert GT#9.

Composé Pourcentage

Polyphénols totaux 98.42 %

Catéchines totaux 82.60 %

EGCG 47.92 %

EGC 7.56 %

DL-C 2.16 %

EC 6.19 %

GCG 4.54 %

ECG 14.23 %

Caféine Max 1.0 %

Les solutions concentrées de l’extrait de thé vert et de l’EGCG ont été préparées à

10 mg/ml dans de l’eau distillée puis stérilisées par filtration (0.2 µm). La solution d’EGCG

a été entreposée à -20C et la solution d’extrait de thé vert a été préparée chaque semaine et

conservée à 4C.

3.2 Souche bactérienne et conditions de croissance

La souche bactérienne utilisée dans cette étude a été P. gingivalis ATCC 33277 (American

Type Culture Collection, Manassas, VA, Etats-Unis). Cette souche a été cultivée dans un

24

milieu Todd Hewitt broth (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)

supplémenté d’hémine (10 µg/ml) et de vitamine K (1 µg/ml) (THB-HK) à 37°C durant

18 h ou 24 h en anaérobiose (75% N2 ; 10% H2 ; 15% CO2).

3.3 Détermination des concentrations minimales inhibitrices

La densité optique à 660 nm (DO660) d’une culture fraîche de P. gingivalis (24 h) a été

mesurée, puis la culture a été centrifugée à 10 000 x g pendant 15 minutes. Par la suite, le

culot bactérien a été resuspendu dans du milieu THB-HK frais à une DO660 de 0.2. Dans

une microplaque 96 puits (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA) ont été déposés 100 µl de la

suspension bactérienne et 100 µl de dilutions sérielles (1:2) (2 mg/ml à 3.9 µg/ml) de

l’extrait de thé vert et d’EGCG préparé dans le milieu THB-HK. La plaque a été incubée

pendant 24 h à 37°C dans une chambre anaérobie. La DO660 finale a été mesurée et la

concentration minimale inhibitrice (CMI) correspondait à la plus faible concentration

capable d’inhiber totalement la croissance bactérienne.

3.4 Traitements de Porphyromonas gingivalis

Des milieux THB-HK (40 ml) ont été ensemencés avec différents volumes d’inoculum (1 à

100 µl) d’une culture fraîche de P. gingivalis. Après 18 h, la DO660 de chaque culture a été

mesurée. Pour le traitement, une culture de P. gingivalis en début de phase exponentielle

montrant une DO660 autour de 0.2 a été utilisée. Un millilitre de cette culture a été déposé

dans des microtubes stériles de 1.5 ml en présence de concentrations croissantes d’extrait

de thé vert et d’EGCG, 0 à 125 µg/ml et 0 à 62.5 µg/ml, respectivement. Les cultures ont

été incubées en anaérobiose à 37°C durant 8 h, après quoi les étapes pré-congélation de la

trousse RNAprotect (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada) ont été réalisées et les

échantillons ont été congelés à -20°C jusqu’à l’extraction-purification de l’ARN.

25

3.4.1 Évaluation de l’expression de gènes

3.4.1.1 Extraction de l’ARN

L’extraction-purification de l’ARN bactérien a été réalisée suivant les protocoles #4 (lyse

enzymatique et digestion à la protéinase K) et #7 (purification de l’ARN par le RNeasy

mini kit) fournis avec la trousse RNAprotect (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada).

À la suite du traitement de P. gingivalis aux polyphénols, les échantillons ont été traités

avec la solution RNAprotect permettant la protection de l’ARN. Après cette étape, les

échantillons ont pu être conservés à -20°C jusqu’à l’extraction-purification de l’ARN.

Après la décongélation des échantillons, une lyse bactérienne par lysozyme (15 mg/ml) et

une digestion des protéines par la protéinase K (2 mg/ml) ont été réalisées simultanément

durant une période de 10 minutes à la température de la pièce (volume final 900 µl). Par la

suite, 500 µl d’éthanol 100% ont été ajoutés au 900 µl d’échantillon pour permettre la

précipitation des protéines. Les échantillons ont été déposés sur une colonne (incluse dans

la trousse) puis lavés. La DNase I (0.34 unité Kunitz/µl) a été ajoutée à la colonne pour

permettre la digestion de l’ADN. Finalement des lavages ont été effectués puis l’ARN a été

élué avec de l’eau ne contenant pas de nucléases. Les étapes suivant l’extraction ont été

effectuées dans la même journée afin d’éviter les pertes d’ARN par la congélation-

décongélation. Les ARN ont été conservés à -80°C.

3.4.1.2 Évaluation de la pureté et de la concentration des ARN

Avant la synthèse des ADN complémentaires (ADNc), la qualité, la pureté et la

concentration des ARN ont été établies. Les ratios 260/280 et 260/230 déterminés à l’aide

du Nanodrop (Themo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) ont permis d’évaluer la

pureté des ARN. Suivant les normes, les échantillons d’ARN ayant des ratios situés entre

1.8 et 2.0 ont pu être considérés purs. L’appareil Experion™ Automated Electrophoresis

System (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) avec la trousse RNA stdSens

26

analysis (Bio-Rad Laboratories) ont été utilisés suivant le protocole du manufacturier pour

déterminer la qualité des ARN grâce au gel virtuel obtenu après le traitement des

échantillons. La concentration en ARN des échantillons a aussi été déterminée par

Experion™ Automated Electrophoresis System.

3.4.1.3 Préparation des ADN complémentaires par transcriptase inverse

La préparation des ADNc a nécessité 1 µg d’ARN dans un volume total de 10 µl. À l’ARN

ont été ajoutés 1 µl d’hexamères aléatoires (50 µM) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN,

USA) ainsi que 1 µl de dNTPs (10 mM) (Life Technologies Inc., Burlington, ON Canada).

Cette préparation a été incubée pendant 5 minutes à 70°C, puis mise sur glace pour un autre

5 minutes avant l’ajout des réactifs suivants : 4 µl du tampon RT 5X (Life Technologies

Inc.), 2 µl de dTT (0.1 M) (Life Technologies Inc.), 1 µl de RNase out (200 U/µl) (Roche

Diagnostics) et 1 µl de transcriptase inverse M-MLV (200 U/µl) (Life technologies Inc.).

Les échantillons ont ensuite été placés dans un thermocycleur pendant 10 minutes à 25°C,

50 minutes à 37°C et 15 minutes à 70°C, pour terminer à 4°C. Les ADNc ont été conservés

à -20°C et dilués d’un facteur 5 avant leur utilisation.

3.5 Préparation des amorces

Dans la présente étude, les gènes codant pour les protéases (RgpA, Kgp), les

hémagglutinines (HagA, HagB), le fimbriae (FimA), l’hémolysine (Hem) et la protéine de

stress (HtrA) ont été étudiés. Le gène codant pour l’ARN ribosomal 16S a servi de contrôle.

Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 3. À la réception, les amorces ont été

réhydratées dans de l’eau sans nucléases (Sigma-Aldrich Canada Co.) à une concentration

finale de 50 µM et conservées à -80°C. Les amorces ont été combinées (sens et anti-sens) et

amenées à une concentration de 10 µM. Avant l’utilisation des amorces, un gradient de

température a été réalisé pour déterminer la température d’hybridation optimale de chaque

paire d’amorces et pour s’assurer de l’absence d’auto-hybridation.

27

3.6 PCR quantitative

Le CFX96™ Real-Time System C1000™ thermal cycler (Bio-Rad Laboratories) a servi

pour l’analyse qPCR. Un volume de 25 µl par réaction a été utilisé. Chaque réaction a été

préparée avec 5 µl d’ADNc, 1 µl d’amorces (sens/anti-sens), 6.5 µl d’eau sans nucléases

(Sigma-Aldrich Canada Co.) et 12.5 µl du supermix IQ SYBR Green (Bio-Rad

Laboratories).

Le cycle qPCR utilisé a consisté en une première étape de 5 minutes à 95°C, suivie d’une

dénaturation de 1 minute à 95°C, d’une hybridation de 1 minute à 60°C et d’une élongation

de 30 secondes à 72°C. Les résultats obtenus ont été normalisés en fonction du gène de

référence soit l’ARNr 16S.

28

Tableau 3 : Amorces utilisées pour la quantification de l’expression des gènes chez P. gingivalis par PCR quantitative.

Gènes Locus Amorces (5’---> 3’)

Longueur du

fragment

Sens Anti-sens

Fimbriae fimA 180 CAGCAGGAAGCCATCAAATC CAGTCAGTTCAGTTGTCAAT 140 pb

Protéases rgpA 1970 GCCGAGATTGTTCTTGAAGC AGGAGCAGCAATTGCAAAG 256 pb

kgp 1728 AGCTGACAAAGGTGGAGACCAAAGG TGTGGCATGAGTTTTTCGGAACCGT 186 pb

Hémagglutinines hagA 1733 ACAGCATCAGCCGATATTCC CGAATTCATTGCCACCTTCT 188 pb

hagB 1904 TGTCGCACGGCAAATATCGCTAAAC CTGGCTGTCCTCGTCGAAAGCATAC 176 pb

Hémolysine hem 1511 GAAGCCTTGTTCTCCTCA CAATGAATATGCCGGTTTCC 167 pb

Protéine de stress htrA 0637 GAGAGTGGGTATTGGCCGTA CCCGTTTGGCTGTAGATCAT 232 pb

ARNr 16S

TGTAGATGACTGATGGTGAAA ACTGTTAGCAACTACCGATGT 138 pb

29

3.7 Analyse statistique

La moyenne l’écart-type des trois réplicas a été calculée et le test t de Student a été utilisé

pour les analyses statistiques avec une valeur de p 0.05 considérée comme statistiquement

significative.

30

31

4 RÉSULTATS

4.1 Concentrations minimales inhibitrices

Pour la détermination des concentrations minimales inhibitrices, P. gingivalis a été mis en

culture en présence de concentrations croissantes d’extrait de thé vert et d’EGCG. La

densité optique de la culture a été mesurée après 24 h d’incubation et les valeurs ont été

comparées aux contrôles (absence de composés), ce qui a permis d’évaluer l’inhibition.

Pour l’extrait de thé vert, la plus petite concentration capable d’inhiber totalement la

croissance (CMI) a été de 125 µg/ml et pour l’EGCG de 62.5 µg/ml.

4.2 Expression des gènes codant pour les facteurs de virulence

4.2.1 Effet de l’extrait de thé vert

Dans un premier temps, l’effet de l’extrait de thé vert sur l’expression de gènes codant pour

les facteurs de virulence de P. gingivalis a été évalué. Pour réaliser cette expérience, une

culture de P. gingivalis en début de phase exponentielle a été mise en présence de

concentrations croissantes d’extrait de thé vert se situant entre 0 et 125 µg/ml pour une

période de 8 h en anaérobiose. La durée de l’incubation a été sélectionnée à la suite d’essais

préliminaires ayant évalué des temps entre 15 minutes et 24 h. L’ARN a ensuite été purifié

et quantifié afin de synthétiser les ADNc en vue de réaliser des qPCR.

Les résultats présentés ont été regroupés selon le rôle des différents facteurs de virulence de

P. gingivalis dans le processus pathogénique de la maladie parodontale, soit les facteurs de

colonisation qui regroupent les gènes codant pour le fimbriae (FimA) et les

hémagglutinines (HagA et HagB), les facteurs contribuant à l’inactivation des mécanismes

de défense de l’hôte et à la destruction tissulaire qui incluent les protéases Arg-gingipaïne

(RgpA) et Lys-gingipaïne (Kgp), et les facteurs permettant l’acquisition d’une source de fer

soit l’hémolysine.

32

D’une part, pour les facteurs de colonisation, une diminution significative et dose-

dépendante de l’expression des gènes a été observée pour l’ensemble des concentrations

d’extrait de thé vert testées (Figure 5). En effet, à la concentration la plus faible, une baisse

de 20% de l’expression des hémagglutinines a été observée alors que pour le fimbriae, la

diminution de l’expression était de 60%. À la plus forte concentration, soit 125 µg/ml, une

diminution de 53% a été observée pour le fimbriae et de 60% pour les hémagglutinines.

D’autre part, en ce qui a trait aux deux protéases, une tendance similaire a été notée, soit

une diminution dose-dépendante de l’expression des gènes allant jusqu’à un maximum

d’environ 70-75% à une concentration de 125 µg/ml (Figure 6). À la concentration la plus

faible, une diminution se situant entre 35-40% a été obtenue pour les deux protéases. De

plus, pour l’Arg-gingipaïne (RgpA), la diminution obtenue s’est avérée significative à

toutes les concentrations testées alors que pour la Lys-gingipaïne (Kgp), seules les

concentrations de 75 µg/ml et 125 µg/ml ont engendré une diminution significative de

l’expression.

Enfin, en ce qui concerne l’hémolysine, une inhibition dose-dépendante de l’expression du

gène a, tout comme pour les autres facteurs, été observée (Figure 7). Également, une baisse

significative de l’expression du gène, soit d’environ 70%, a été notée à la concentration la

plus élevée soit 125 µg/ml.

33


gènes codant pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis

ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés

selon la moyenne l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de

Student (* : p < 0.05 par rapport au contrôle de 0 µg/ml ; † : p < 0.05 par rapport aux

concentrations 75 et 100 µg/ml).

34


gènes codant pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des

mécanismes de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC

33277. Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon

la moyenne l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* :

p < 0.05).

35

Figure 7 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du gène

codant pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés

avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne l’écart-type. L’analyse

statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).

4.2.2 Effet de l’EGCG

Les traitements avec l’EGCG ont été réalisés avec des concentrations allant de 0 à

62.5 µg/ml et selon les mêmes conditions que pour l’extrait de thé vert. Les résultats sont

de nouveau regroupés selon la fonction des gènes à l’étude.

Tout comme l’extrait de thé vert, l’EGCG a engendré une diminution dose-dépendante de

l’expression des gènes codant pour les facteurs de colonisation (Figure 8). Cependant, la

diminution observée s’est avérée inférieure à celle obtenue pour le thé vert et l’effet dose-

dépendant était moins important. Une diminution significative d’environ 60% a été

observée pour le fimbriae à 50 µg/ml et pour l’hémagglutinine A à 62.5 µg/ml.

36

D’autre part, pour l’expression des gènes codant pour les protéases, la même tendance a été

obtenue (Figure 9). Pour le gène rgpA, la diminution observée a été significative à toutes

les concentrations testées et a atteint un maximum de 60% avec l’EGCG à 62.5 µg/ml. Un

effet dose-dépendant a été obtenu pour le gène kgp et une diminution significative de 50% a

été atteinte à 62.5 µg/ml.

Finalement, l’EGCG a engendré une diminution dose-dépendante pour le gène codant pour

l’hémolysine (Figure 10). Aucune diminution significative n’a été observée et le niveau

d’expression le plus bas a été noté à 50 µg/ml qui correspond à une diminution de 40% de

l’expression.

37


pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis ATCC 33277.

Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la

moyenne l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p

< 0.05 par rapport au contrôle de 0 µg/ml ; † : p < 0.05 par rapport à la concentration de 50

µg/ml).

38


pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des mécanismes

de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC 33277. Les

résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne

l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).

39


pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés avec le

gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne l’écart-type. L’analyse statistique

a été effectuée avec le test t de Student à p < 0.05.

4.1 Expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA

Pour faire suite à l’évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur

l’expression des facteurs de virulence, des traitements de P. gingivalis ont également été

réalisés afin d’évaluer la réponse de la bactérie au stress. Ceci a été possible en mesurant

l’expression du gène codant pour la protéine HtrA après une exposition de P. gingivalis aux

composés pour une période de 2 h. La procédure des traitements tout comme les

concentrations des composés ont été les mêmes que celles décrites précédemment. L’ARN

a ensuite été purifié, quantifié et les ADNc synthétisés pour la réalisation des qPCR.

40

4.1.1 Effet de l’extrait de thé vert

Suivant l’exposition de P. gingivalis aux concentrations croissantes d’extrait de thé vert,

une augmentation dose-dépendante de l’expression du gène codant pour la protéine de

stress HtrA a été observée (Figure 11). Cette augmentation s’est avérée significative à partir

d’une concentration 75 µg/ml. À la CMI soit 125 µg/ml, une expression relative 6 fois

plus élevée que celle du contrôle a été notée.

Figure 11 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du

gène codant pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats

ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne l’écart-

type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).

41

4.1.2 Effet de l’EGCG

Tout comme l’extrait de thé vert, l’EGCG a augmenté l’expression du gène codant pour la

protéine de stress HtrA (Figure 12). Cette augmentation est significative à 50 et 62.5 µg/ml

et est dose-dépendante. À ces concentrations, l’expression du gène a été augmentée environ

2.5 fois par rapport au contrôle. L’EGCG a démontré un effet moindre comparativement à

l’extrait de thé vert, mais induit tout de même une condition de stress chez P. gingivalis. De

plus, dans le cas des 2 composés, les concentrations se rapprochant de la CMI ont causé les

plus fortes augmentations d’expression.


pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été

normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne l’écart-type.

L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).

42

43

5 DISCUSSION

Les affections parodontales sont des maladies inflammatoires affectant les tissus de soutien

de la dent. Ce sont des infections polymicrobiennes rencontrées chez une grande proportion

de la population, et plus fréquemment chez les adultes (4). Au-delà de 700 espèces

bactériennes différentes sont présentes à l’intérieur de la cavité buccale. Toutefois, ce n’est

pas l’intégralité de ces bactéries qui sont responsables du développement des maladies

parodontales. En effet, seules certaines d’entre elles ont pu être associées à l’état

pathologique. Notamment, les bactéries du complexe rouge, soit P. gingivalis, T. forsythia

et T. denticola, sont reconnues comme les agents étiologiques de la parodontite chronique

(28, 125). Lors du développement de cette maladie, la présence du biofilm bactérien dans

les sites sous-gingivaux constitue un facteur essentiel, mais n’est pas responsable à lui seul

de la destruction tissulaire caractéristique de la parodontite. En effet, une réponse immuno-

inflammatoire incontrôlée en réponse à l’agression bactérienne est déclenchée et permet la

progression de la maladie.

Au cours de la dernière décennie, bon nombre d’études ont été menées sur les composés

naturels en vue de leur utilisation comme solution alternative aux médicaments

conventionnels pour le traitement de diverses affections. En effet, plusieurs composés

naturels ont des propriétés bénéfiques pour la santé humaine et auraient le potentiel d’être

utilisés dans le traitement de diverses maladies, incluant les maladies parodontales. Des

produits comme la canneberge, le curcuma, les agrumes ou encore les huiles essentielles

ont fait l’objet d’études démontrant le potentiel prometteur de ces composés (126-129).

Dans le cadre de ce projet, la capacité d’un extrait de thé vert et de sa composante

principale, l’EGCG, à moduler l’expression de certains gènes chez P. gingivalis a été

évaluée. Plusieurs effets bénéfiques du thé vert et de l’EGCG ont déjà été rapportés dans la

littérature, notamment leur potentiel antioxydant, leur effet anti-inflammatoire et leur

propriété anti-cancer (87-91, 93-97). De plus, certains de leurs effets en regard des

problèmes buccaux, ont déjà été évalués. Par exemple, les polyphénols du thé vert peuvent

neutraliser les composés sulfurés volatils causant l’halitose (105-107). De plus, ils peuvent

inhiber les propriétés d’adhérence et la croissance de certaines bactéries comme S. mutans

44

et P. gingivalis, les principaux agents responsables de la carie dentaire et de la parodontite

chronique, respectivement. Malgré ces découvertes, les mécanismes responsables de ces

effets ne sont toujours pas clairement élucidés. De plus, peu d’études ont à ce jour évalué

l’effet des polyphénols du thé vert et de l’EGCG sur l’expression de différents gènes

bactériens.

Dans ce projet, la bactérie P. gingivalis a été étudiée. Ce choix a été justifié par le fait que

cette espèce bactérienne est le principal agent étiologique de la parodontite chronique. De

plus, P. gingivalis produit plusieurs facteurs de virulence qui lui permettent de coloniser et

survivre à l’intérieur de la poche parodontale, tout en contribuant à la destruction tissulaire.

Dans un premier temps, une évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert, sur la croissance

de P. gingivalis a permis de démontrer qu’à une concentration minimale de 125 µg/ml, ce

composé inhibe totalement la croissance de la bactérie. Dans une autre étude utilisant le

même extrait de thé vert, une CMI (200 µg/ml) comparable à la nôtre avait été obtenue

(124). Dans cette étude, d’autres extraits de thés (blanc, noir et Oolong) avaient également

été testés et des CMI du même ordre de grandeur avaient été obtenues. Pour l’EGCG, une

concentration minimale de 62.5 µg/ml a permis d’inhiber complètement la croissance de P.

gingivalis. Il est estimé que dans une tasse de thé vert, soit 2.5 g de feuille de thé dans

200 ml d’eau, environ 90 mg d’EGCG s’y retrouvent, pour une concentration finale de

450 µg/ml d’EGCG (130). Considérant ces données, il est fort logique de penser que les

effets antibactériens liés à l’EGCG puissent se produire in vivo. D’autres études ont

démontré que l’EGCG a également un effet sur la croissance d’autres bactéries buccales

comme S. mutans et S. sobrinus (114). Divers mécanismes pourraient expliquer l’inhibition

de la croissance observée. Par des essais de diffusion sur milieu gélosé, Yi et collaborateurs

ont démontré que l’EGCG inhibe la croissance de Pseudomonas aeruginosa. Une analyse

par microscopie électronique leur a permis de constater que l’EGCG entraîne une perte

d’intégrité de la membrane externe chez la bactérie, inhibant ainsi la croissance bactérienne

(131). Une seconde étude a démontré que l’EGCG inhibe la dihydrofolate réductase chez

Stenotrophomonas maltophilia, ce qui entraîne, entre autres une perturbation de la synthèse

d’ADN et empêche la prolifération de la bactérie, ainsi que sa croissance (132). Une

45

inhibition de cette enzyme a également été rapportée lors d’une étude réalisée chez E. coli

(133).

L’adhérence primaire de P. gingivalis à l’intérieur de la cavité buccale fait intervenir entre

autres les fimbriae majeurs de type I (FimA) exprimés à sa surface. Ils sont essentiels à

l’adhérence de la bactérie à la surface de la dent puisqu’ils permettent la coadhésion aux

bactéries déjà présentes et l’adhésion aux surfaces (29-32). On retrouve également des

hémagglutinines qui permettent la liaison de la bactérie à des récepteurs, comme les

oligosaccharides présents sur les cellules humaines et qui permettent notamment l’adhésion

de la bactérie à la surface des érythrocytes (35). Dans ce projet, l’évaluation de l’effet de

l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des gènes codant pour les fimbriae et

pour les hémagglutinines a permis de démontrer que, même à de faibles concentrations

(50 µg/ml), l’extrait de thé vert diminue significativement l’expression de ces gènes.

Également, l’effet observé s’est avéré dose-dépendant. L’EGCG est apparu également

efficace, engendrant une diminution significative à 50 µg/ml pour le fimbriae et 62.5 µg/ml

pour l’hémagglutinine A. L’effet de ces composés sur l’adhérence de P. gingivalis aux

cellules épithéliales buccales a déjà été étudié par d’autres groupes de chercheurs. Sakanaka

et collaborateurs ont rapporté que l’EGCG était en mesure de bloquer presque

complètement l’adhérence de P. gingivalis aux cellules épithéliales à une concentration de

250 µg/ml (134). Plus récemment, notre équipe a démontré que l’extrait de thé vert, tout

comme des extraits de thés noir, blanc et Oolong, diminuait à plus de 60% l’adhérence de

la bactérie aux cellules épithéliales à une concentration de 25 µg/ml (124). Il a été proposé

que les composantes du thé se lieraient spécifiquement ou non-spécifiquement à des

molécules de surface de P. gingivalis empêchant ainsi son adhérence aux cellules

épithéliales buccales. En effet, diverses études ont démontré la capacité de liaison des

polyphénols à des constituants membranaires (135, 136). Une étude sur les mécanismes

d’action de l’EGCG chez E. coli a démontré par microscopie électronique que le composé

se fixait à la membrane externe. Plus spécifiquement, l’EGCG se liait aux résidus arginines

de la porine OmpG, bloquant ainsi le canal OmpG responsable du transport de petites

molécules hydrophiles (135). Une étude portant sur le virus de l’influenza a démontré que

l’EGCG se lie aux hémagglutinines du virus bloquant ainsi sa capacité d’adhésion aux

46

cellules (136). Ces études permettent de suggérer que l’inhibition de l’adhérence serait due

à la liaison des composés à des constituants membranaires. Toutefois, notre étude est la

première à rapporter un mécanisme d’inhibition impliquant une modulation de l’expression

de gènes laissant place à l’hypothèse que la diminution de la propriété d’adhérence, comme

il a été démontré dans une étude antérieure, pourrait également résulter d’une diminution de

l’expression des gènes.

Dans un deuxième temps, l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des

gènes codant pour les protéases a été étudié. Nous avons démontré que l’exposition de P.

gingivalis à des concentrations croissantes de ces deux composés engendre une diminution

significative et dose-dépendante de l’expression des gènes rgpA et kgp codant pour une

Arg- et une Lys-gingipaïne, respectivement. Les protéases étant essentielles à plusieurs

fonctions physiologiques et pathologiques chez P. gingivalis, différents groupes de

chercheurs ont étudié les conséquences associées à une inactivation de ces gènes (rgpA,

rgpB, kgp). Grenier et collaborateurs ont démontré qu’un mutant de P. gingivalis déficient

pour la production de protéases devenait plus susceptible à l’action du complément et

voyait sa capacité d’hémagglutination aux érythrocytes, sa capacité à proliférer

efficacement dans le sérum humain et son pouvoir hémolytique diminués significativement

(41). Une autre étude a démontré que l’inactivation du gène kgp entraînait une perte de la

pigmentation des colonies de P. gingivalis sur gélose sang et une diminution des activités

hémagglutinine et hémolytique de la bactérie (137). Pathirana et collaborateurs ont

démontré, grâce à un modèle murin, que des mutants pour les protéases (RgpA, RgpB et

Kgp) de P. gingivalis voyaient leur virulence diminuée. En effet, la capacité des mutants à

coloniser la surface de la dent, à déclencher une réponse inflammatoire et à engendrer une

résorption osseuse étaient affectées négativement (138). Un autre groupe de chercheurs,

ayant démontré une perte de l’activité protéolytique chez des mutants de P. gingivalis, a

voulu vérifier la virulence de ces mutants dans un modèle murin. Lorsqu’injecté chez la

souris, les mutants de P. gingivalis ont démontré une virulence atténuée (139). Considérant

les résultats des études précédentes, la capacité des polyphénols du thé vert à diminuer

l’expression des gènes codant pour les protéases pourrait donc avoir plusieurs

conséquences sur P. gingivalis.

47

De plus, Okamoto et collaborateurs ont démontré que les catéchines du thé vert,

principalement les gallates, diminuaient significativement l’activité catalytique des

protéases de P. gingivalis (140). Il a également été rapporté que les catéchines du thé vert

inhibaient les activités protéolytiques de P. gingivalis, de façon similaire à ce qui avait été

observé pour la doxycycline et les dérivés non-antimicrobiens modifiés de la tétracycline

(141). En plus d’avoir un effet sur les protéases bactériennes, les polyphénols du thé vert

affectent également l’activité des MMPs et leur production par les cellules de l’hôte. En

effet, l’EGCG peut inhiber à la fois l’activité des MMPs et l’expression du gène codant

pour certaines d’entre elles (119, 121, 142)

Une diminution de l’expression de FimA et des protéases par les polyphénols du thé vert

pourraient également contribuer à réduire l’inflammation, car ces facteurs de virulence ont

la capacité d’induire la production de cytokines entre autres par les monocytes et les

macrophages (29, 54, 56).

Bien que les protéases de P. gingivalis puissent contribuer à l’hémolyse des érythrocytes

(143), il a été démontré qu’une activité hémolytique est toujours présente malgré

l’inactivation des gènes codant pour les protéases (137). Ceci résulte du fait que P.

gingivalis possède une hémolysine aussi impliquée dans la lyse des érythrocytes. Notre

analyse des effets du thé vert et de l’EGCG sur le gène de l’hémolysine (hem) montre que

son expression est modulée négativement de façon dose-dépendante par les deux composés.

L’extrait de thé vert a engendré une diminution significative de l’expression du gène à la

CMI (125 µg/ml), mais un tel effet n’a pas été observé pour l’EGCG. Une étude réalisée

chez S. aureus a démontré que l’expression des gènes codant pour l’-toxine (possédant

une activité hémolysine) (hla et agrA) était diminuée par la licochalcone A (licA), un

polyphénol de la famille des chalcones. De plus, à des concentrations sous-inhibitrices, licA

est en mesure de diminuer jusqu’à 95% la production d’-toxine chez cette bactérie. (144).

Cette étude suggère que la diminution de l’expression du gène de l’hémolysine pourrait être

en lien avec une diminution de l’activité hémolytique de la bactérie. Il serait donc

intéressant d’analyser la modulation de ce pouvoir hémolytique chez P. gingivalis pour

mettre en corrélation les effets observés. D’autres produits naturels tels que le menthol,

48

l’eugénol et la naringénine ont également la capacité d’inhiber l’expression du gène codant

pour l’-toxine chez S. aureus (145-147).

Des études réalisées chez d’autres bactéries, buccales et non-buccales, ont démontré une

inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la virulence par les polyphénols du thé

vert. Ainsi, Lee et collaborateurs ont démontré que l’EGCG réduit l’expression des gènes

(eae, escN, espA, sepZ et tir) responsables du quorum sensing chez E. coli O157:H7 (148).

L’EGCG, à des concentrations sous-inhibitrices, a également engendré une inhibition chez

S. mutans de l’expression du gène gtf codant pour la glucosyl transférase qui est impliquée

dans la formation du biofilm (149). Un autre groupe de chercheurs a démontré que l’EGCG

inhibait l’expression de gènes codant pour des facteurs de virulence de S. mutans, soit

atpD, eno, ldh et aguD (118).

Après avoir étudié la modulation de l’expression des gènes codant pour les facteurs de

virulence majeurs de P. gingivalis, une analyse de la modulation du gène codant pour la

protéine de résistance au stress HtrA a été réalisée. Nous avons déterminé que l’expression

de ce gène est augmentée de manière dose-dépendante par l’extrait de thé vert et l’EGCG.

Plus spécifiquement, l’expression du gène était environ 6 fois plus élevée que pour le

contrôle lorsque la bactérie était en présence de 125 µg/ml de l’extrait de thé vert. Pour

l’EGCG, un niveau d’expression 2.5 fois supérieur au contrôle a été observé à 62.5 µg/ml.

Dans les résultats décrits précédemment, l’EGCG engendrait un effet généralement

inférieur à celui obtenu avec l’extrait de thé vert, et ce, pour tous les gènes analysés. Le thé

vert ayant démontré un meilleur effet, il semble logique d’observer un niveau de stress plus

élevé chez la bactérie. D'après une analyse de la littérature, notre étude est la première à

rapporter l’effet des polyphénols du thé vert sur l'expression de gènes codant pour la

protéine HtrA. Toutefois, Kang et collaborateurs ont démontré que l’expression du gène

htrA chez S. mutans était augmentée lorsque la bactérie était placée en milieu acide (150).

Ils ont également démontré par l’utilisation d’un mutant déficient pour le gène htrA que la

capacité de croissance de la bactérie était diminuée. Dans le même ordre d’idée, lors de

l’étude d’un mutant de P. gingivalis déficient pour la protéine HtrA, il a été démontré que

ce dernier était plus sensible au stress oxydatif que la souche sauvage (62). HtrA étant une

49

protéine de résistance au stress, l’augmentation de l’expression de son gène codant suggère

que P. gingivalis est en situation de stress lorsque mise en présence des polyphénols du thé

vert. Une étude réalisée chez P. aeruginosa a par ailleurs démontré que les polyphénols du

thé vert peuvent induire un stress oxydatif chez cette bactérie. Cela a pour effet d’engendrer

une augmentation de l’expression de plusieurs gènes liés au stress oxydatif comme katB,

sodM, ohr, lexA et recN (151).

Plusieurs études ont évalué l’effet du thé vert et de l’EGCG sur la croissance de P.

gingivalis et l’activité de certains de ses facteurs de virulence (124, 134, 140). Cependant,

aucune étude n’a été menée en regard de l’effet de ces composés sur l’expression de gènes

chez P. gingivalis. Notre étude est donc la première à identifier le thé vert et l’EGCG

comme étant des composés en mesure de diminuer de manière significative et dose-

dépendante l’expression des gènes codant pour : les facteurs de colonisation (FimA, HagA

et HagB), les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des

mécanismes de défense de l’hôte (RgpA et Kgp); et l’hémolysine chez cette bactérie. De

plus, une augmentation de l’expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA chez

P. gingivalis a été démontrée pour la première fois lors de cette étude. Des études à venir

permettront d’identifier les mécanismes impliqués dans l’inhibition des gènes à l’étude.

En conclusion, ce projet nous a permis de générer des données préliminaires permettant de

supporter le potentiel préventif et thérapeutique du thé vert et de sa composante principale,

soit l’EGCG. En effet, les résultats obtenus montrent que ce sont des composés

antibactériens capables de diminuer l’expression des gènes codant pour les facteurs de

virulence majeurs de P. gingivalis. Cette bactérie étant le principal agent étiologique de la

parodontite chronique, les propriétés de ces produits pourraient s’avérer utiles en regard de

la prévention et du traitement des maladies parodontales. Nos résultats ajoutent un nouvel

aspect sur les modes d’action possibles des polyphénols du thé vert pour la santé

parodontale. Plusieurs propriétés des polyphénols du thé vert sont déjà connus, par exemple

leur effet anti-inflammatoire ou leur capacité à stimuler la production de -défensines par

les cellules épithéliales (123). Des études chez le rat ont également démontré que les

polyphénols du thé vert sont dotés de propriétés permettant de réduire la résorption osseuse

50

(119-121). Dans le même ordre, Yoshinaga et collaborateurs ont démontré qu’un extrait de

thé vert était capable de diminuer la perte d’attache ainsi que le niveau de résorption

osseuse chez le rat lorsque stimulé avec le LPS de E. coli (152). Un autre groupe de

chercheurs a démontré que l’administration d’EGCG dans un modèle de parodontite chez le

rat engendre une diminution de l’expression de l’IL-6 et du TNF ce qui a mené à une

diminution de l’activité des ostéoclastes et donc une diminution de la destruction osseuse

(153). Enfin, une étude dans un modèle murin a également permis de démontrer que les

catéchines du thé vert sont en mesure d’inhiber la production d’IL-1, la résorption

osseuse, ainsi que l’ostéoclastogenèse lors d’une parodontite induite par une injection de

LPS de E. coli (154).

À l’heure actuelle, le thé vert est déjà utilisé comme additif dans divers produits d’hygiène

buccale tels que le rince-bouche, le dentifrice et même la gomme à mâcher (Listerine

natural green tea, Pepsodent et Mega-T). Cependant, aucune information précise

relative à la quantité de thé vert et au pourcentage d’EGCG ni même relative à l’efficacité

des composantes du thé vert une fois ajouté à ces produits ou aux interactions qu’elles

pourraient avoir avec les autres molécules de ces produits n’est disponible ou même

connue. Des études supplémentaires sont donc nécessaires pour s’assurer de l’efficacité des

produits. À plus long terme, l’utilisation du thé vert et de l’EGCG à des fins de prévention

ou de traitement des affections buccales pourrait être envisageable. L’introduction de ces

composés naturels dans un gel, une fibre ou encore une bandelette pour une application

locale comme il est actuellement possible de faire avec la tétracycline, le métronidazole et

la chlorhexidine pourrait permettre un meilleur contact des parodontopathogènes avec les

composés bioactifs (8, 122).

En perspective, bien que P. gingivalis soit un parodontopathogène important, il n’en

demeure pas moins que T. denticola et T. forsythia sont deux autres agents pathogènes

d’importance dans la parodontite chronique puisqu’elles sont également des membres du

complexe rouge. Il serait donc justifié d’évaluer l’effet du thé vert et de l’EGCG sur

l’expression des gènes codant pour leurs facteurs de virulence. Également, il pourrait

s’avérer pertinent d’étudier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression de la

51

leucotoxine, le facteur de virulence principal d’A. actinomycetemcomitans responsable de la

forme agressive de la parodontite.

52

53

6 ANNEXE

Au cours de mes études de deuxième cycle, d’autres expériences se rapportant à la

problématique des maladies parodontales ont été réalisées. Plus spécifiquement, ces

expériences ont été menées sur une lignée de cellules épithéliales et une lignée de

monocytes, dans le but d’analyser l’expression de certaines protéines ayant un rôle à jouer

dans la réponse inflammatoire. Les résultats mentionnés dans la présente section n’ont pas

été inclus dans le mémoire.

Dans un premier temps, une expérience visant à étudier la modulation de l’expression du

gène codant pour la protéine de surface, EMMPRIN (Extracellular matrix

metalloproteinase inducer) chez la lignée de cellules épithéliales buccales GMSM-K a été

réalisée. L’EMMPRIN, aussi appelée CD147, est une glycoprotéine transmembranaire qui

active la production de MMPs par les cellules épithéliales et les fibroblastes. L’objectif

était de vérifier la capacité du thé vert à diminuer l’expression de cette protéine en vue

d’abaisser la réponse immuno-inflammatoire. Tout d’abord, un test de viabilité cellulaire

soit le test du MTT a été réalisé pour déterminer la plus forte concentration de l’extrait de

thé vert qui permettait de conserver la viabilité cellulaire. La concentration obtenue était de

100 µg/ml. Par la suite, des stimulations des cellules épithéliales avec le LPS de P.

gingivalis, un extrait sonique et des cellules de P. gingivalis ATCC 33277 ont été

effectuées afin d’obtenir une condition pour laquelle il y avait augmentation de l’expression

de la protéine. Cependant, malgré plusieurs essais réalisés pour différents temps (1 h à

48 h) et avec plusieurs concentrations de ces stimulants, il a été impossible d’obtenir un

niveau d’expression élevé de façon reproductible. Cette trop grande variabilité des résultats

n’a donc pas rendu possible l’analyse de la modulation de l’expression du gène codant pour

l’EMMPRIN chez les cellules épithéliales par les polyphénols du thé vert.

Par la suite, chez la même lignée cellulaire, la protéine MUC-1 a été étudiée dans le but

encore une fois d’atténuer la réponse immuno-inflammatoire. Cette protéine de surface a un

rôle protecteur grâce à sa capacité à lier les agents pathogènes afin de prévenir leur contact

avec les cellules épithéliales buccales. Pour cette expérience, les cellules ont été mises en

54

présence de 100 µg/ml d’extrait de thé vert et d’EGCG, après quoi, une analyse par qPCR a

été réalisée afin d’analyser le niveau d’expression du gène codant pour la protéine. Une

augmentation de l’expression environ 4 fois supérieure au contrôle a été obtenue pour les

deux composés. Cependant, aucune autre analyse supplémentaire n’a été réalisée.

Finalement, une lignée de cellules monocytaires (U-937) a été étudiée. Ces cellules,

qu’elles soient ou non différenciées en macrophages, expriment à leur surface la protéine

TREM-1 (Triggering receptor expressed on myeloid cells-1). L’activation de TREM-1

engendre la formation d’un complexe avec DAP12 qui mène à la libération de médiateurs

de l’inflammation comme le TNF-α et l’IL-8. Un test de viabilité de type MTS a été réalisé

sur les monocytes afin de déterminer les concentrations maximales d’extrait de thé vert et

de l’EGCG à utiliser pour éviter une perte de viabilité cellulaire. La concentration identifiée

pour les 2 composés était de 100 µg/ml. Des stimulations de 2, 4 et 6 h avec des MOI (25 et

100) de P. gingivalis ont été réalisées. Cependant, aucun résultat représentatif démontrant

une modulation significative de l’expression n’a été obtenu dû à une trop grande variabilité.

Des expériences contribuant à la réalisation de deux autres projets en vue de publications

ont également été réalisées. Pour le premier projet, des traitements de P. gingivalis suivant

la même procédure et les mêmes conditions que pour nos essais avec l’extrait de thé vert et

l’EGCG ont été réalisés, mais en utilisant le rhein, un anthraquinone isolé de la rhubarbe.

Des analyses en qPCR ont été effectuées pour évaluer l’effet sur l’expression des gènes

codant pour les facteurs de virulence majeurs préalablement analysés dans ce mémoire.

Article : Jabrane Azelmat, Jade Fournier-Larente, Daniel Grenier, The anthraquinone

rhein exerts synergistic antibacterial activity in association with metronidazole or natural

compounds and attenuates virulence gene expression in Porphyromonas gingivalis. En

cours de rédaction.

Pour le second projet, S. moorei, une bactérie à Gram-positif qui a été associée à l’halitose,

a été étudiée. Des résultats déjà obtenus démontraient que l’extrait de thé vert et l’EGCG

inhibaient son activité -galactosidase. Nous avons donc réalisé des analyses en qPCR afin

de déterminer si l’expression du gène codant pour cette enzyme était inhibée. Les CMI

55

étant connues, nous avons réalisé des traitements avec les composés suivant la même

procédure que pour P. gingivalis et avons démontré une diminution de l’expression du gène

de la -galactosidase. Article : Marie-Pierre Morin, Telma Bedran, Jade Fournier-

Larente, Bruno Haas, Jabrane Azelmat and Daniel Grenier, Green tea extract and its

major constituent epigallocatechin-3-gallate inhibit growth and halitosis-related properties

of Solobacterium moorei. Soumis pour publication à BMC Complementary and Alternative

Medicine.

56

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Modulation de l’expression de gènes reliés à la · Figure 6 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des gènes codant pour les facteurs