Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne

Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne :

Les marqueurs bactériens :

Alain Rincé, Stéphanie La Carbona

Laboratoire de Microbiologie de l'EnvironnementUSC INRA 2017Université de Caen14032 CAEN Cedex, FRANCE

colloque qualité sanitaire des eaux de baignade et conchylicoles – Brest 29 octobre 2010

La qualité sanitaire (microbiologique) des eaux

= enjeu important

Contaminations fécales assez

fréquemment observées.

Discriminer les origines = important pour limiter ces

contaminations.

Ces pollutions fécales peuvent provenir d’une origine humaine (stations de traitement des eaux usées, fosses septiques)…

où de matières fécales d'animaux (élevages, animaux sauvages ou

domestiques).

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/Drinking_water.jpg

De nombreuses méthodes d’identification des sources de pollutions ont étédécrites.

Elles reposent sur :

- la détection de composés chimiques signant l’origine de la pollution

- la détection de virus ou bactériophages

- la détection de bactéries

Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.

Méthodes dépendantes de banques de données

Méthodes indépendantes de banques de données



Font appel à une culture des bactéries

Des bactéries sont isolées de différentes sources fécales d’origines

connues (fèces, lisiers, eaux-usées) et des échantillons à analyser (eaux,

sédiments, coquillages)

Les isolats sont individuellement analysés par des approches

phénotypiques ou génotypiques

Les isolats des échantillons àanalyser sont comparés à ceux provenant des sources fécales

d’origines connues (Banque de donnée)

Type bovinType humain Type ovin

Source(s) de pollution



Consistent à mettre en évidence des bactéries que l’on retrouve

spécifiquement dans les matières fécales d’une origine donnée

L’analyse peut faire appel ou non àune culture des bactéries

Depuis quelques années de nombreuses techniques basées sur la mise en évidence de marqueurs bactériens par amplification d’ADN et ne nécessitant pas de culture ont

été décrites.

originehumaine



Approches phénotypiques

ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques

CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone

FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras

Approches génotypiques

Ribotypage

rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés

PFGE : Electrophorèse sur gel en champs pulsé

DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant

AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés

RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe

ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques

Antibiotiques utilisés chez les humains et animaux différents

Escherichia coli et streptocoques fécaux.

Isolement de clones susceptibilité vis-à-vis d’une variété d’antibiotiques (différentes concentrations)

Les profils de résistance des souches des échantillons à analyser sont comparés à ceux provenant de bactéries isolées à partir des matières fécales des différentes sources humaines ou animales potentielles (banque).

Technique simple à mettre en œuvre et peu onéreuse

Spécifique de chaque région géographique.

les bactéries provenant de ces hôtes présentent des résistances différentes.

Méthodes dépendantes de banques de données :Approches phénotypiques

Méthode basée sur des différences dans la capacité des bactéries à utiliser des sources de carbone (ou d'azote) pour leur énergie et leur croissance.

Enterocoques et E. coli.

Isolement inoculation dans une microplaque 96 puits (substrats + réactifs)

Technique relativement simple à mettre en œuvre et peu onéreuse.


CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone


Différences de conditions environnementales

micro-organismes de sources différentes présentent des compositions en acides gras différentes.

Simplement analysés : extraction des lipides

trans-estérification pour former des esters méthyliques d'acides gras (FAME)

chromatographie en phase gazeuse

Les résultats génèrent pour chaque souche un profil FAME qui peut être comparé à ceux d’une banque.

FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras

Ribotypage

Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique.Plusieurs techniques :

- Ribotypage par hybridation de Southern blot.

Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques

Samadpour et al. 2005(empreinte d’environ quatre à douze bandes)

Hybridation/révélation

Purification d’ADN

Digestion

Transfert sur membrane

Electrophorèse

(sondes d'ADNr).

Ribotypage


Amplification par PCR d’ADNr

Digestion

Visualisation

Electrophorèse

Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique.Plusieurs méthodologies :

- Ribotypage par analyse de fragments de restriction d’ADNr amplifié.

rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés

Consiste à réaliser une PCR à l’aide d’un oligonucléotide correspondant à une séquence répétée sur le génome des bactéries.

REP-PCR : “Repetitive Extragenic Palindromic”ERIC-PCR : “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus éléments”BOX-PCR : “BOX elements” (combinaisons de boites A, B et C).


PCR

ElectrophorèseDombek et al. 2003

Numérisation

Analyseinformatique

Dombek et al. 2003


PFGE : Electrophorèse sur gel en champ pulsé

Utilisation d’enzymes de restriction qui coupent rarement sur le génome entier d’une bactérie.

Grands fragments d’ADN séparés par une électrophorèse (changement périodique de l’orientation du champ électrique).


Electrophorèse en champ pulsé

Numérisation

Analyseinformatique

Emprisonnement des bactéries dans des blocs d’agarose

Extraction de l’ADN

Digestion de l’ADN

++

++ ++

++

--

-- -

--

-

Champ électrique

1

Champ électrique

2

Changement régulier

++

++ ++

++

--

-- -

--

-

Champ électrique

1

Champ électrique

2

Changement régulier

Hager 2001

DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant :

Distinguer des bactéries sur la base de variations de séquences dans un fragment d’ADN.

La migration d’un fragment d‘ADN dans un gel d'acrylamide où il rencontre des conditions de plus en plus dénaturantes est fortement ralentie lorsqu’il commence à se dénaturer,

or la stabilité du double brin d’ADN dépend de sa séquence.


PCR

DGGE

D’Elia et al. 2007

AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés

Basée sur l’amplification sélective de fragments de restriction à partir d’une digestion totale de l’ADN génomique.


Ligation à des

adaptateurs

Digestionpar des

enzymes de restriction

Amplification

par PCR

Electrophorèse

RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe

Spectre de produits amplifiés caractéristique de l’ADN de départ (donc du microorganisme)

Un oligonucléotide arbitraire (ou 2) de petite taille ou dégénéré va s’hybrider au hasard à de multiples régions sur le génome de façon à générer de nombreux fragments.


PCR Electrophorèse




Méthodes basées sur la culture des bactéries

FC/SF : rapport Coliformes fécaux /Streptocoques fécaux

Bifidobactéries fermentant le sorbitol

Rhodococcus coprophilus

Streptococcus bovis

Analyses moléculaires

PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine

FC/SF : rapport Coliformes fécaux/Streptocoques fécaux

Le rapport coliformes fécaux/streptocoques fécaux proposé dès 1969.

Excréments humains CF>SFExcréments d’animaux SF>CF

Rapport CF/SF > 4 pollution d’origine humaineRapport CF/SF< 0,7 pollution d’origine animale

Peu fiable (différences du taux de survie ; variations en fonction du régime des individus)

Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur la culture de bactéries

Bifidobactéries fermentant le sorbitol

Bifidobactéries présentes dans les fèces de l'homme et des porcs et parfois dans celles d’autres espèces animales.

Les souches fermentant le sorbitol (ex Bifidobacterium adolescentis et B. breve) spécifiques de l’origine humaine.

Présence de Bifidobactéries fermentant le sorbitol pollution fécale d’origine humaine.

Facilement mises en évidence par culture sur un milieu HBSA (Human Bifid Sorbitol agar).

Rapport (Bif tot / Bif sorbitol+)

Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur la culture de bactéries

Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis

Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis : deux espèces spécifiques de l’origine animale.

Elles peuvent être mises en évidences en utilisant des milieux gélosés ou des tests en microplaques.

Cependant, les temps d’incubation pour Rhocococcus sont relativement longs.

PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine

Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur une amplification par PCR

PCR ou PCRq (amorces spécifiques)

FiltrationExtraction de l’ADN àpartir des micro-organismes retenus sur le filtre

Bactérie MarqueurBacteroidales

Enterococcus (E. faecium, E. faecalis, E. hirae)

Bifidobacterium (B. adolescentis, B. dentium B. catenulatum)

Escherichia coli

Faecalibacterium

Methanobacter smithii

HF134HF183BACHumBTBVHuBacBacHHuBac1HuM2HUM3Bf

espM66M67M68M77M81M10

Bi-ADOBi-DENBiATg

B2 VIII/O81

HFB

Mnif

Couples d’amorces décrits pour les différentes sources

HumainBactérie MarqueurBacteroidales

Enterococcus (E. mundtii, E. hirae)

Escherichia coli

Faecalibacterium

Methanobacter ruminantium

CF128CF193CowBac2BacRcowM2cowM3Rum2BacRumB1RumD1RumD2Bacbov1Bacbov2Bac2Bac3BoBac

M15M19M40M89M90M91M93M94

LTIIa

B2 VIII/O81

Mrnif

Ruminant (bovin)

Bactérie MarqueurBacteroidales DF475

BacCan

Chien

Bactérie MarqueurBacteroidales HoF597

HorseBac

ChevalBactérie MarqueurBacteroidales

Desulfovibrio

EF990

E2

Canard/oie


Enterococcus casseliflavus

EF990

M48

Cerf

Bactérie MarqueurCatellicoccus marimammalium

Gull2

Mouette


Bifidobacterium Thermacidophilum

Méthanogènes

PF163PigBac2Pig1BacPig2Bac

GE35/GE36

P23-2

Porc

Bactérie Marqueur12 marqueurs identifiés par métagénomique

Brevibacterium LA35

Poulet (volaille)

PCR ciblant une espèce bactérienne (ou une gène) spécifique d’une origine

Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur une amplification par PCR

Avantages:

- Ne fait pas appel à une culture des bactéries

- Ne nécessite pas de banque de donnée

- Très rapide, très facilement accessible

- Sensible (sinon possibilité de réaliser des enrichissements (culture, bioaccumulation ou “nested-PCR”))

- Nombreux marqueurs (et nombreuses cibles)

Limites :

- Présence d’inhibiteurs de la PCR

- Il faut s’affranchir des variations entre l’évolution des indicateurs de contamination fécale (ou les pathogènes) et les bactéries utilisées comme cibles.

- L’utilisation combinée de différents marqueurs = meilleure façon de prédire l’origine d’une pollution.

Documents

Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne