Nicolas CHRETIEN BTSA ANABIOTEC

Maëlle GABORIEAU Session examen 2014Laurene VIAUD

Caroline VITRY

EPREUVE E7-2

M58

Mise en place d'un protocole expérimental pour ladétection de la loque américaine au sein des couvains des

abeilles

Epreuve E7-2 du M58 - Mise en place d'un protocole expérimental pour la détection de la loque américaine au sein du couvain des abeilles. 1/11

Introduction/Contexte

En été une ruche contient environ 40 000 abeilles. Afin de conserver la bonne santé de son rucherl’apiculteur doit contrôler ses ruches et l’un des fléaux des abeilles est la loque américaine qui fait desravages dans les colonies. Elle est causée par le Paenibacillus larvae, qui est un bacille sporulant. C’est unemaladie très contagieuse et à déclaration obligatoire qui est propre aux abeilles mellifères. Elle contamine enplus des abeilles, le matériel apicole qui doit être détruit afin d’éviter de contaminer d’autre ruches. Lesspores de la loque américaine sont ramassées par les ouvrières. Ils vont alors contaminer les parties buccalesdes ouvrières et se retrouvent ensuite dans la nourriture qui sera donnée aux larves en développement. Lesspores passent alors de spores à l’état végétatif et se multiplient dans les tissus des larves en créant desmilliards de nouvelles spores.

Une fois que l’alvéole a été operculée le couvain meurt. La larve infectée devient une masse gluante.Elle sèche, durcit et adhère au fond du couvain. Elle peut alors contenir 2,5 milliards de spores. En nettoyantles couvains les ouvrières vont se contaminer et répandre les spores dans les autres couvains propageant ainsil’infection. La colonie va alors décliner rapidement.

Pour pouvoir déceler cette maladie nous allons étudier la problématique suivante :

Mise en place d'un protocole expérimental pour la détection de la loque américaine au sein descouvains des abeilles chez des apiculteurs communaux.

Une contamination d’un rucher par la loque américaine est préjudiciable pour les apiculteurs puisquesi la loque américaine est détectée dans les ruches il faut alors détruire les colonies par incinération etdésinfecter tous les outils d’apiculture. Ce qui implique un coût pour l’apiculteur au niveau de la destructionde son rucher mais aussi une perte économique puisqu’il va perdre une grande partie de son miel et de sesabeilles qu’il va devoir remplacer afin de continuer son activité. Cependant même si la loque américaine estune maladie à déclaration obligatoire du fait de la rapidité avec laquelle elle se propage dans les différentsruchers, beaucoup d’apiculteurs dont les ruches sont contaminées par la loque américaine ne la déclare pas.Pour cette raison il est difficile de trouver des chiffres exacts concernant la perte économique relative à laloque américaine. Cependant en 1997 aux États-Unis la loque américaine à causée 5 millions de dollars dedommages aux apiculteurs. Afin d'aider à la détection de cette maladie, nous nous sommes intéressés à unpartenariat avec le Centre d'étude biologique de Chizé (CEBC) et des apiculteurs avec lesquels ils travaillentet ainsi réaliser plusieurs tests ADN et microbiologiques pour parvenir à une interprétation d'une possiblecontamination de rucher.

Pour prévenir de cette maladie on peut réaliser le test de la PCR. Celui-ci permettra grâce à desamorces de comparer si la bactérie Paenibacillus larvae est présente ou non dans le rucher et ainsi d'éviterqu'elle se propage.

On peut aussi utiliser l'électrophorèse. Elle a l'avantage de traiter simultanément plusieurséchantillons en même temps et de réaliser de fines séparations.

I/ Synthèse bibliographique

1 ) Cycle de vie de l'abeille

Le couvain est le mot pour désigner l'ensemble des membres d'une colonie d'insectes qui n'ont pasencore atteints leur état final. Ce mot s'applique à tout type d'insecte comme les fourmis et les abeilles avantleur éclosion. Le couvain est donc constitué des œufs, des larves et des nymphes. Les œufs et les larvesconstituent le couvain ouvert, car leurs alvéoles sont ouvertes. Les nymphes constituent le couvain fermépuisque leurs alvéoles ont été operculées.

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2 ) La loque américaine et sa propagation

La loque américaine ou « maligne » est causée par une bactérie nommée Paenibacillus larvae quis'attaque principalement au couvain. Son nom provient du fait qu'après que le bacille se soit mis à l’œuvre,cette teigne intervient et laisse un couvain en si mauvais état que l'on pourrait penser à des guenilles(loques). Les spores de la loque américaine, qui sont la forme dormante des bacilles, sont extrêmementrésistants et peuvent demeurer viables dans des ruches ou du matériel infectés pendant plus de 35 ans.

La loque américaine fait périr les larves et les décompose.

Deux symptômes très caractéristiques permettent de diagnostiquer cette maladie :

– Les larves malades sont gluantes. Si on les pique avec un bâtonnet, elles filent comme ducaoutchouc.

– Le couvain loqueux dégage une odeur de colle forte.

On peut montrer la propagation de l'agent pathogène grâce au schéma suivant :

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Contamination des ouvrières

Contamination de la larve par la nourricière (ouvrière) avantoperculation (la larve a moins

De 2 jours)

Multiplication de la bactériedans le tube digestif de la larve

puis dans l'ensemble de sonorganisme

Transformation de la nympheen une masse gluante après

operculation

Germination de la bactérie dansle tube digestif de la larve

Expulsion des nymphes contaminéespar paenibacillus larveae, par les

ouvrières

Contamination extérieurePar le vent,

l'environnement

Nous sommes partis de cette étape grâce aux échantillons

de couvain fournis par notre partenaire. Lors de la découpe dans le couvains

nous avons ensemencés les nymphe sous forme gluante

où l'on à retrouvé les spores bacillus.

Comment la loque américaine se propage à d'autres ruches ?

Plus qu'une contamination dite naturelle, la loque peut aussi se propager par :

– La rencontre des abeilles dans des ruches abandonnées qui peuvent être malade et donc vecteurpotentiel d'infection.

– Les apiculteurs contribuent également au développement de la loque américaine en laissant mourirruches et/ou en exposant un équipement usagé situé tout près de leur propre habitat, surtout en cas depauvre miellée.

– Le déplacement des ruches plusieurs fois par an dans différents endroits à la recherche de ressourcesnectarifères contribue à une contamination et donc à une propagation de la maladie.

– Le miel d'origine inconnue introduit dans le couvain pour nourrir les larves peut contenir la loqueaméricaine.

3 ) Mesures de prévention

La prévention constitue le meilleur moyen d'éviter une épidémie généralisée de loque américainedans une exploitation apicole. Il est primordial de dépister dès que possible une infection à la loqueaméricaine et de prendre immédiatement les mesures nécessaires pour empêcher la propagation.

Surveiller la santé des colonies est important. Il faut inspecter les couvains au moins deux fois parannée, au printemps et à l'automne.

Une désinfection soignée du matériel apicole doit être faite régulièrement

afin d'éviter les risques de loque américaine.

Actuellement, on considère aussi que la meilleure désinfection des ruches

(caisse, fond) est celle de la flamme et que le brûlage des panneaux de

bois doit aboutir pour une désinfection efficace à une coloration "pain

brûlé" du bois. Là encore, insister sur les coins, les fissures, la

crémaillère et les cavaliers d’écartement des cadres.

II/ Mise en place du projet

4 ) Démarche des recherches

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Afin de pouvoir réaliser notre projet nous avons dû commencer par une étape de recherche departenaires possibles pour toute acquisition d'échantillons ou encore de protocoles.

5 ) Choix des méthodes

Nos méthodes d'analyses ont été déterminées par l'inspiration d'un protocole de détection de la loqueaméricaine tiré du Manuel Terrestre de l'OIE 2008 nommé « Loque américaine des abeilles mellifères ».

a). En microbiologie

On choisit d'effectuer des isolements par écouvillonnage des larves mortes, filandreuses,caractéristiques de la maladie, sur géloses Mossel et Columbia au sang afin de retrouver nos bacilluscaractéristiques de la loque.

Nous avons aussi prévus un enrichissement dans un bouillon coeur-cervelle au cas ou les bacillus seretrouveraient en pauvre quantité.

Pour vérifier que nos bactéries retrouvées sont bien des bacilles à Gram positif, on effectuera par la suite descolorations de Gram.

b) En biologie

Afin de savoir si les bactéries retrouvées contiennent l'ADN de la loque américaine, on effectue toutd'abord une extraction d'ADN puis une PCR qui permettra l'amplification de l'ADN retrouvé et enfin uneélectrophorèse qui permettra de savoir si nos échantillons contiennent l'ADN de la loque américaine ou non.

Pour vérifier avant électrophorèse que nous avons bien récupéré de l'ADN, nous allons passer noséchantillons au spectrophotomètre UV.

III/ Budget

Lors de la réalisation de ce projet nous avons dû tenir compte du coût des consommables, du matériel, et des fluides. Notre total respecte le coût prévu pour chaque projet de M58.

IV/ Réalisation

6 ) Déroulement de notre semaine

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A la fin de la semaine de la réalisation nous avons repris contact avec M. DOUARRE et nous lui avonstransmis les résultats.

7 ) Protocoles opératoires

a) Microbiologie

La coloration de Gram s'effectue par la réalisation d'un frottis. Lorsque celui-ci est bien fixé à la lame, on va le passer dans différents bains de colorants : le cristal violet puis le lugol qu'on fixe à l'alcool et la safranine.

Après les colorations de Gram nous avons sélectionnés les bacilles à Gram positif et nous les avonsensemencés sur différentes géloses selon le protocole suivant :

Pour chaque bacilles Gram+ :

Gélose Columbia ANC : isolement puis incubation 48H à 37°C

Gélose Mossel : isolement puis incubation 48H à 37°C

Bouillon cœur-cervelle : ensemencement à l’oëse puis incubation 48H à 37°C

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Bacilles à Gram positif

b) Biologie

Extraction de l’ADN

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LEGENDE

Étapes pré-analytiques

Étapes analytique

Étapes post-analytiques

Hygiène et sécurité

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Récupérer la phase supérieure et del’inter-phase dans un nouveau micro

tube

Réalisation d’une suspension densedans 200 µL de liquide de lyse

Centrifugation 5 min à 10 000 rpm

Préparation du gel d’agarose,0,8g d’agarose dans 100mLde tampon TBE puis aprèsrefroidissement ajout de

Bromure d’éthidium

Éliminer l’isopropanol puis laver le culotd’ADN avec 500 µL d’éthanol à 70 % glacé

Ajouter 200 µL de phénol et 200 µL dechloroforme

Dénaturation, hybridation etélongation des brins d’ADN par PCR

Agitation sur vortex pendant 1 min

Vérification dumatériel

MétrologieMicro-pipettes :

- 200 µL- 300 µL- 500 µL- 50 µL

CentrifugeuseHotteÉtuve

Sous hotte avecgants et lunettes

Bromure d’éthidium àmanipuler sous hotteavec double paire de

gantsÉliminer l’alcool

Reprendre le culot sec dans 50 µL detampon TE.

Coulage des gels avec peigne

Sécher le culot d’ADN dans une étuve aumaximum à 60 °C

Centrifuger 10 minutes à 10 000 rpm

Révélation sousUV

Centrifuger 10 minutes à 10 000 rpm.

Ajouter 300 µL d’isopropanol, agiterpendant 15 secondesDéchets

Cônes de micro-pipettesChloroformePhénolIsopropanolÉthanol

Déchets biologiques

Bromure d’éthidium Poubelle spéciale

Électrophorèse 50mV pendant1H

Manipuler lesgels avec des

gants

Lecture etinterprétation des

résultats

Sous hotte avecgants et lunettes

Dépôt de 20 µL d’ADN dansles puits avec 5 µL de

tampon de charge

Conclusion sur leséchantillons

8 ) Les principes

Principe de l'extraction :

L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus.L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telle que la PCR. Ilexiste différents protocoles pour extraire l'ADN mais le principe est a peu près toujours le même tel que :

_ Lyse des cellules. On utilise un détergent afin de casser les membranes cellulaires nucléaires.

_ Élimination des protéines

_ Élimination des autres acides nucléiques (ARN...)

_ Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool

Principe de la PCR :

C'est une technique d'amplification d'ADN in vitro. Elle est composée de plusieurs cycles.Chaque cycle comporte 3 étapes distinctes :

• La dénaturation. Chauffage de l'ADN qui permet de séparer les deux brins qui le compose.

• L'hybridation. Amorces spécifiques des bacilles recherchées sont mis aux extrémités de laséquence recherchée.

• L'élongation. Grâce à l'action d'une ADN polymérase.

L'ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l'ADN au cours du cyclecellulaire, mais aussi lors de réparation et recombinaisons de l'ADN.

Les cycles sont répétés un très grand nombre de fois pour obtenir une multiplicationexponentielle des brins d'ADN. Un cycle dure environ une minute. Il y a trois températures de chauffagedifférentes afin de contrôler l’activité de l'enzyme au cours du cycle.

Principe de l’électrophorèse :

Technique utilisée pour séparer les acides nucléiques et les protéines. Cette séparation dépendde la charge et de la masse. Les molécules migrent en fonction d'un champ électrique grâce à une électrode(fil de cuivre transmettant le courant électrique). L'ADN étant chargé négativement va migrer vers l'anode(+).

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Il est nécessaire d'avoir un gel épais car l'ADN est très volatile donc il faut l'alourdir. Les puits doivent êtreprofond afin de déposer au mieux l'ADN. Et le tampon aqueux TBE est important pour le respect du pH, dela concentration en sel, etc

Pour obtenir une belle électrophorèse et d'observer au mieux l'ADN, le temps de migration est trèsimportant.

9 ) Résultats et Interprétations

a) Microbiologie

b) Biologie

Lors de notre extraction d'ADN sur les colonies prises sur PCA nous ne savons pas si réellement nousavons de l'ADN ou non. Pour s'en assurer on a alors passé nos échantillons au spectrophotomètre UV quinous a en effet confirmer la présence d'ADN dans nos échantillons.

1 er t est électrophorèse :

Cette première électrophorèse est un test préparatoire pour connaître nos données de migration (puissance eneV, temps, etc).

Le marqueur de poids moléculaire à laissé des traces et ne s'est pas déplacé correctement. Nous n'avons pasalors évalué les conditions idéales de migration mais le gel est correctement fait.

2 nd test électrophorèse :

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On observe une fluorescence dans les puits L1mo, A5, A2 et A4GJ. On suppose donc que l'ADN a étémultipliée avec les amorces spécifiques de la loque donc il s'agit très certainement du Paenibacillus larvaequi est présent sur nos échantillons.

3 ème test électrophorèse :

Seul le poids moléculaire tient compte d'une révélation fluorescente. Aucun échantillon déposé fluoresce. Onne retrouve alors aucun ADN caractéristique de la loque sur ses échantillons testés qui sont A4PB et L1BIP.

Voici les schémas des électrophorèses 2 et 3 :

Conclusion générale et Discussion

Parmi nos 8 échantillons de départ seulement 5 d'entre eux se sont révélés positifs à la maladie de la loque.Grâce aux électrophorèses nous pouvons dire que oui il y a présence de la loque américaine chez ces 5couvains testés car les amorces spécifiques de la loque se sont accrochées sur l'ADN des bactéries prélevées.

Nous ne pouvons pas quantifier cet ADN. Nos résultats ne sont pas non plus répétables et ils sont nonproductifs car nous avons réalisé une expérience expérimentale.

Mais nous confirmons qu'il y a bien présence de la loque américaine dans ces 5 couvains testés.

Pour appuyer et permettre une réelle analyse de nos résultats, il faudrait confirmer avec une autre techniquetelle qu' ELISA et pourquoi pas voir à changer les amorces pour une confirmation plus pointue.

Les conditions protocolaires seraient-elles aussi a revoir ? Cependant on peut aussi suggérer à garder lesmême amorces mais avec une restriction. Cette restriction serait possible que si au préalable on amplifie lazone de restriction de l'ADN. Il faudrait couper un morceau d'ADN pour comparer avec le bout de bandeamplifiée. L'utilisation d'un couple d'amorces serait aussi possible pour une prochaine analyse deconfirmation.

On rappelle que la maladie est à déclaration obligatoire. On réalise donc un bulletin d'analyse quenous envoyons à notre partenaire pour lui faire part de nos résultats et de l'interprétation que nous en faisons.

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Bibliographie

• Manuel Terrestre de l'OIE 2008 « Loque américaine des abeilles mellifères ».

• http://apiculture-populaire.com/loque-americaine.html

• Google image

• http://www.bibliomer.com/documents/fiches/fiche_ensavoirplus_lien_PCR_vf.pdf

• Anne Debroise, « les abeilles sont désorientées » La Recherche, 2013 novembre, numéro 481, page 111-112

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