OBJECTIF

• VACCINER LES LAPINS SAUVAGES CONTRE LA VHD,

• SANS AVOIR À LES CAPTURER.

• Sans oublier les lièvres contre l’EBHS

Pistes déjà explorées

• 1/ Production de capsides sans noyaux (vaccin commercial)

- Valable pour les élevages

• 2/ Recombinants Myxo-VHD (Ecole Véto Toulouse et équipe espagnole)

- Efficacité terrain non prouvée (mauvais choix de départ)- L’ONC aujourd’hui à des a priori contre de telles recherches si

elles étaient tentées par Bio-Espace, après les avoir soutenues lorsqu’elles étaient menées par les équipes citées ci-dessus

• 3/ contre l’EBHS rien.

Notre approche ?

Elle consiste à vouloir obtenir un virus atténué de la VHD, et à l’utiliser comme vaccins.

• (analogue à notre stratégie myxo)

naturelle

Pourquoi une telle stratégie ?

• 1/ Il n’existe pas de solutions au problème posé

• 2/ Notre approche est cohérente avec l’air du temps,

• 3/ Elle n’est scientifiquement pas utopique.

En effet, Le virus naturellement atténué de la VHD existe.

• Travaux des Italiens (Capucci et al)

• Intéressant,

• Mais virus trop atténué

• Difficilement multipliable.

• Mais conclusion, il existe, et on en connaît le code.

Virus de la VHD

détails

Virus de la Myxomatose 2OO nmADN double brin161 773 Paires de bases

Virus de la VHD

40 nm

ARN simple brin

7437 bases

125 fois moins volumineux que celui de la myxo

Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .

• Forme géométrique

Icosahedre (20 faces)

• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).

• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.

Voyons comment un virus tue.

Il se réplique dans certaines cellules. Pour rentrer il utilise ses sites de reconnaissance situés sur la capside.

(suite)

• Il se multiplie dans le foie, nécrose cet organe et détruit les facteurs de coagulation.

• En même temps il agresse les parois des capillaires.

• La conséquence c’est l’hémorragie.

Défenses du lapin.

Le lapin crée des anticorps contre ces virus

Virus VHD

Le système immunitairedu lapin

crée des anticorps

Le virus emprisonnépar les anticorps est éliminé

L’anticorps se lie à quoi ?

• Aux protéines de la capside.

Importance de la capside,

• Dans un virus pathogène, les protéines (VP60) de la capside ont 579 AA.

• Dans un virus naturellement atténué (celui de Capucci), les protéines (VP60) de la capside ont 576 AA.

• Le premier tue, le second protège.

Peut on produire le virus trop atténué de Capucci, ou un autre

encore plus intéressant ?

pas de façon classique

mais en faisant de la mutagénèse dirigée.

C’est notre programme de recherche.

Mutagénèse dirigée

L’objectif est de modifier la structure de la capside, tout en

gardant le virus entier.

Virus pathogène de la VHD

• Capside, constituée de la même protéine (579 aminoacides) repétée plusieurs fois.

• code ARN 7437 b, à l’intérieur.

Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)

Il est fragile.

Nous l’avons traduit en ARN double brin, plus stable pour l’étudier et le modifier.

• Code ADN à double brin

VHD souche Pascal

• 1/ Foie de lapin envoyé par Pascal.

• 2/ Extraction de l’ARN viral

• 3/ Transcription en ADN

• 4/ Lecture du code

• Résultats :

Les 3960 premières pb de notre virus de la VHD

Les 3477 pb suivantes.au total 7437 pb

Dans les conditions naturelles la capside se forme dans les cellules par lecture du code

Nous avons

• Identifié et isolé la seule partie du code qui exprime la protéine VP60.

Les 3960 premières pb du virus de la VHD

• Elle n’est pas là.

En rouge les 1737 pb du gène codant pour la VP60

Elle est là.

• Le code VP60 de notre virus pathogène (Pascal)

• À celui du virus non pathogène de Capucci.

• Résultat :

Nous avons comparé,

• Dans les 840 premières pb, l’alignement est identique

• On note une différence entre 900 et 960 pb

• On note une différence entre 900 et 960 pb

• Rien à la fin

Traduit en code AA, cela donne

Comparaisons entre

• VHD non pathogène (Capucci)

• VHD pathogènes souches – France– Espagne– Italie– Allemagne

Et la souche EBHS pathogène pour le lièvre

Conclusions

• Peu de différences

Comment intervenir

• Pour modifier ces codes, et rendre moins pathogènes ces virus qui tuent les lapins et les lièvres.

Genome viral completExtrait du foie d’un lapinEnvoyé par Pascal. Vecteurs de clonage

(ou plasmides) DNA 3000 Pb

Capables de vectoriserles DNA

Ligation de l’ ADN du génomeavec le vecteur de DNA

plasmide recombiné

Incorporation dans une bacterie

Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide.

Processus général de clonage d’un génomeProcessus général de clonage d’un génome

Clonage d’un Clonage d’un gènegène

Genome viral completExtrait du foie d’un lapinEnvoyé par Pascal. Vecteurs de clonage

(ou plasmides) DNA 3000 Pb

Capables de vectoriserles DNA

Ligation de l’ ADN du génomeavec le vecteur de DNA

plasmide recombiné

Incorporation dans une bacterie

Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide.

fraction du génomeCorrespondant à la VP60

Nous avons cloné le gène de la protéine VP60 (traduit en langage ADN), nous l’avons incorporé dans un plasmide,

et l’avons multiplié dans une bactérie.

Nous allons faire la même chose pour le génome complet du virus de la VHD

Nous allons voir comment il est possible de

remplacer certaines lettres d’un code par d’autres lettres plus intéressantes.

GTT

CAA

TTA

AAT

5'

5'

3'

3'

1/ On veut remplacer trois lettres, GTT etleur complémentaires CAA par 3 autres

2/ On constrit des amorces 3/ Elles se lient spontanément à la matrice:

GTT

CAA

TTA5' 3'

AAT5'3'

4/ On copie par la technique PCR

TTA

AAT

GTTCAA

TTA

AAT

5/ On digère les originaux par des enzymesde restriction qui digèrent les plasmides bactérienssans toucher à ceux créés par la PCR.

6/ Et on a ainsi remplacé 3 lettrespar 3 autres dans le code ADN, et 1 AA dans la future protéine .

Que faire d’un génome modifié, inséré dans un plasmide.

Il faut l’introduire dans une cellule pour que celle-ci redonne le virus reconstruit.On parle alors de transfection, par

opposition à infection.

• Le piège à éviter lors de ces transfections,

• C’est la digestion des plasmides par des enzymes particulières dès l’entrée dans la cellule.

Comment éviter ces enzymes

• En protégeant les plasmides par des macromolécules spéciales.

Un plasmide c’est un polyanion.On le protége avec un polycation

à condition que ce dernier ne soit pas toxique pour la cellule

- -

-

--

-

- -

-

--

-

+ +

+ ++

+

++ +

Ces molécules existent

• Nous sommes en train d’en créer d’autres.

+ +

+

Certaines sont linéaires

OO

O

OOO

OO

O

D’autres sont sphériques

Etapes nécessaires pour Etapes nécessaires pour livrer efficacement les livrer efficacement les

plasmides.plasmides.

Nucleus

Nuclear

Import

Complexes DNA Protégés, vers des cellules cibles.

Conclusion• Nous avons, en 7 mois :• 1/Analysé exhaustivement la littérature, et affiné notre

stratégie de recherche.• 2/ Isolé le virus de la VHD, • 3/Analysé son code génétique.• 4/ Comparé celui-ci à celui du virus naturellement

atténué de Capucci• 5/ Comparé à celui de l’EBHS du lièvre• 6/ Isolé le gène de la VP60, et cloné celui-ci dans un

plasmide.• 6/ Créé des molécules de transfection, et les avons testé

parmi d’autres.• 7/ Abordé la recherche de cellules permissives.

Merci à tous

Pour votre patience

et pour votre attention.