Optimisation de la méthode de détection FISH

Cédric Longin, Claudine Degueurce, Frédérique Juillat,

Sandrine Rousseaux, Michèle Guilloux-Bénatier, Hervé Alexandre

Institut Universitaire de la Vigne et du Vin (Dijon)

SITEVI, Montpellier, 2017

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Projet National GNBrett

Axe 1

Biodiversité et

métabolisme

- Résistance au SO2

- Etude de l’état Viable Non

Cultivable (VNC)

Axe 2

Confrontation et amélioration

des méthodes de détection en

laboratoire

- Comparaison de kits qPCR

- Optimisation FISH-CMF

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OBJECTIFS

Cellules en suspension Brettanomyces bruxellensis En vin rouge

Sonde couplée à un fluorochrome

Oligonucléotides : Spécifiques des régions variables

de l’ARN ribosomal 26S de Brettanomyces

Cellules fluorescentes

MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF

Perméabilisation Fixation

Hybridation

Principe de la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH)

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- Teneur en ribosome cellulaire - Accessibilité du site cible de la sonde - Température d’hybridation (Röder et al., 2007)

- Perméabilité de la paroi cellulaire

MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF

Comment optimiser la méthode ?

Principe de la technique FISH

Perméabilisation au PBS-Triton dans le protocole actuel Vin rouge : polyphénols adsorbés au niveau de la paroi cellulaire.

Test éthanol comme désorbant

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

PBS 20% 30% 40%

Ab

sorb

ance

à 2

80

nm

Concentration en éthanol (%)

Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

0

1

2

3

4

5

6

PBS 20% 30% 40%

Log

cellu

les/

mL

Concentration en éthanol (%)

Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3

*

Meilleure désorption avec la concentration [C3] (v/v)

Aucun impact sur la perte cellulaire

Désorption des polyphénols et impact sur la population levurienne

[C1] [C2] [C3]

MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF

Ancien protocole FISH-CMF (Serpaggi et al., 2010)

Perméabilisation Fixation (24h)

Hybridation (16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 48 h)

Réduction du temps d’analyse

Nouveau protocole FISH-CMF Perméabilisation/fixation (30 min)

Hybridation ( 16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 18 h)

S. cerevisiae (Sc) non marquées

Sc marquées

B. bruxellensis (Bb) non marquées

Bb marquées

Discrimination spécifique des cellules de B. bruxellensis (>95%)

Marquage aspécifique de cellules de S. cerevisiae inférieur à 5%

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité

¾ Sc + ¼ Bb ½ Sc + ½ Bb ¼ Sc + ¾ Bb

En mélange les cellules de B. bruxellensis sont marquées spécifiquement

Présence de S. cerevisiae n’influence pas le marquage spécifique

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

y = 0,9896x + 0,1209 R² = 0,9895

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7

Mili

eu

ITV

lo

g U

FC/m

L

CMF (log cellules/mL)

Protocole optimisé FISH-CMF : limite de quantification

Limite de quantification : 102 cellules/mL

Amplification des cellules mortes par qPCR (Willenburg et Divol, 2012)

Cible = ADN

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

Quantification des cellules mortes par FISH-CMF : Stabilité des ARNr ?

Culture B.b

SO2 actif (2 mg.L-1)

= dose létale

+

FDA : Pas de viabilité Milieu sélectif : pas de cultivabilité

16 h après traitement SO2 6 j après traitement SO2

Stabilité des ARNr dans le temps ?

Réalisation du protocole FISH optimisé

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

Confirmation de la stabilité des ARN :

Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé

Culture B.b

+ RNAse Réalisation du protocole FISH optimisé

- RT-PCR (McKillip et al., 1998, Hierro et al., 2006)

- Northern blot (McKillip et al., 1998,

- FISH (Rathnayaka et Rakshit, 2010)

RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF

Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé + RNAse

+ SO2 actif (2 mg.L-1)

= dose létale

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Spécifique

Rapide : 48h 18h

Sensible (de 102 à 107 cellules/mL)

Méthode compétitive (peu coûteuse ≈ 6€)

Mais surestimation…

Double marquage FISH/viabilité des cellules de Brettanomyces

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Merci de votre attention

Pr Hervé ALEXANDRE Directeur de l’équipe VAlMiS

Dr Michèle GUILLOUX-BENATIER

Clément PETITGONNET Frédérique JULLIAT

Dr Cédric LONGIN