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MEMOIRE
Présenté
A LA FACULTE DES SCIENCES
DE L’UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA
Pour l’obtention
Du
DIPLOME DE MAGISTERE EN BIOTECHNOLOGIE
SPECIALITE : EXPLOITATION DES INTERACTIONS PLANTES-MICROORGANISMES
Présenté par :
MELLE
SEKKOUR SONIA
Thème
Soutenu le devant la commission d’examen composée de :
Présidente : Mme FYAD LAMECHE Fatima Zohra, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.
Examinateur : Mr KIHAL Mabrouk, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.
Examinateur : Mr KACEM Mourad, Maître de conférences à l’université d’Oran Es-Senia.
Promoteur : Mr BEKKI Abdelkader, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.
Essai d’introduction d’un couple symbiotique Rhizobium-Acacia saligna
pour la revégétalisation de la Sablière de Sidi Lakhdar
(Wilaya de Mostaganem)
Remerciements
Ce travail de magister a été réalisé au laboratoire de Biotechnologie des Interactions Plantes- Microorganismes de l’université d’Oran Es Senia.
En tout premier lieu, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon encadreur Mr BEKKI A. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia), pour le temps, la patience et la confiance qu’il m’a accordé tout au long de ce travail et bien avant durant mes années d’étude d’ingénieur.
Je tiens à remercier également Mme BOUKHATEM F. (Chargée de cours à l’université d’Oran Es-Senia), pour tous ses conseils, ses remarques et pertinents commentaires tout au long de mon travail au laboratoire.
Mes remerciements vont également à Mme FYAD LAMECH F. Z. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia) pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury.
Je remercie également Mr KIHAL M. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia) et Mr KACEM M. (Maître de conférences à l’université d’Oran Es-Senia), pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail et pour avoir accepté de faire partie du jury.
Je tiens à exprimer ma gratitude à :
Mr ABDI directeur de recherche à l’INRA de Sidi Bel Abbes.
Mr RAHALI le conservateur des forêts de Mostaganem.
Mme BELHCAINE ingénieur au sein de la foresterie de Mostaganem. Mr CHENOUFI responsable de la pépinière à Mostaganem.
Mr MESILET le gérant de la Sablière de l’Ouest à Mostaganem.
Pour leur aimable collaboration, qui m’a facilité la réalisation de ce travail.
Je remercie aussi Mr Galiana A. chercheur au LSTM de Montpellier pour son aide dans la partie statistique.
Mes remerciements s’adressent également à Mme BOUCHENTOUF L. (Chargée de cours à l’université d’Oran Es-Senia) pour son aide dans la correction du mémoire.
Le dernier et non le moindre des remerciements, je le réserve à toute ma famille en particulier à ma mère, mon père, mes frères et ma sœur et mon fiancé et à tout mes amis et mes collègues au laboratoire qui n’ont cessé de me soutenir tout au long de ce travail.
MELLE
SEKKOUR SONIA
Résumé
Dans le but de sélectionner un couple symbiotique Rhizobium- Acacia saligna performant pour la revégétalisation de la Sabliere de l’Ouest situé dans la région de Mostaganem et la fixation des dunes littorales, 18 isolats ont été obtenus à partir des nodules racinaires d’Acacia saligna. Ces isolats présentent une morphologie comparable à celle des rhizobia connus, et une bonne résistance à la température jusqu’à 45°C, à la salinité jusqu’à 5% et au pH allant de pH 4 à pH 11, sur ceux 3 souches sont sélectionnées ASB13 (Rhizobium sp.), ASB5 (Sinorhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée) pour être utilisé comme inoculum sur la base de leur efficience en conditions contrôlées (capacité à former des nodules et à fixer de l’azote atmosphérique) et de leur résistance aux conditions extrêmes. Ces inocula performants en conditions de laboratoire sont inoculés à de jeunes plants en pépinière. Après 4 mois il a été noté l’effet positive des deux souches l’une appartient au genre Rhizobium sp. et l’autre au genre Sinorhizobium sp. sur la croissance des plants d’Acacia saligna, puis ces derniers sont transférés sur la sablière et sont divisés en deux lot, le premier réinoculé contrairement au second. Les souches sont jugées sur leur persistance sur le terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes. La souche qui appartient eu genre Rhizobium sp. a montré une efficacité très élevée pour la croissance et la nutrition azotée des jeunes plants d’Acacia saligna après 4 mois de transplantation sur site dégradé de la sablière. Mots clés : Revégétalisation, Sablière, Dunes littorales, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation. Summary In the purpose of selecting a symbiotic couple Rhizobium- Acacia saligna for the revegetalisation of the Sand pit located in Mostaganem and the fixing of the littoral dunes, 18 isolates were obtained from the root nodules of Acacia saligna. These isolates presented morphological characteristics comparable to known rhizobia, and a good resistant to the temperature until 45°C, salinity up to 5% and the p H going of pH 4 to pH 11, tree strains are selected ASB13 (Rhizobium sp.), ASB5 (Sinorhizobium sp.) and ASB7 (not identified) to be used as inoculum on the basis of their efficiency in controlled conditions (capacity to form nodules and to fix atmospheric nitrogen) and their resistance to the extreme conditions. These perform inoculates in conditions of laboratory are inoculated in young seedlings. After 4 months it was noted the positive effect of two strains on the growth of the seedlings of Acacia saligna in nursery, one of strains belongs to the kind Rhizobium sp. and the other to the kind Sinorhizobium sp. These seedlings of Acacia saligna are transferred on the sand pit and are divided into two batches, the first is inoculated second once but the second is not. Strains are judged on their persistence on the soil degraded to select the most performs. The strain Rhizobium sp. showed a very high effectiveness for the growth and the nutrition in nitrogen of the young seedlings of Acacia saligna after 4 months of transplantation on degraded site of the sand pit. Key Word: Revegetalisation, Sand pit, littoral Dunes, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation.
Sommaire
Sommaire
Chapitre I : Introduction
Introduction ………………………………………………………………………………
Chapitre II : Etude bibliographique
1. Généralités sur les rhizobiums…………………………………………………….. 1.1. Définitions et intérêts…………………………………………………………….. 1.2. Les principales caractéristiques……………………………………………………. 1.3. La taxonomie des BNL……………………………………………………….
2. Les légumineuses……………………………………………………………………. 2.1. Le genre Acacia……………………………………………………………………
2.1.1. Acacia saligna…………………………………………………………… 2.1.1.1. Description………………………………………………………….. 2.1.1.2. Exigences climatiques et édaphiques……………………………….. 2.1.1.3. Utilisations…………………………………………………………. 2.1.1.4. Symbiose fixatrice d’azote……………………………………….….
3. La symbiose Rhizobium-Acacia……………………………………………………….. 4. Les facteurs biotiques et abiotiques influant sur la nodulation ………………….
4.1. Les facteurs abiotiques…………………………………………………………….. 4.2. Les facteurs biotiques ………………………………………………………………
5. Inoculation des légumineuses………………………………………………………… 5.1. Quand est-il nécessaire d’inoculer ? ...................................................................
5.1.1. Le rendement de la légumineuse introduite……………………………… 5.1.2. Le facteur limitant est l’azote……………………………………………. 5.1.3. L’absence de souches spécifiques à la légumineuse introduite…………
5.2. Sélection des souches rhizobiennes…………………………………………….. 5.2.1 Infectivité……………………………………………………………………. 5.2.2 Efficience……………………………………………………………………. 5.2.3 Compétitivité………………………………………………………………… 5.2.4 Résistance à l’action létale de divers facteurs………………………………. 5.2.5 Persistance des souches dans le sol…………………………………………. 5.2.6 Adaptation au niveau de fertilité des sols…………………………………… 5.2.7 Stabilité des caractères génétiques…………………………………………. 5.3. Le choix de la plante hôte……………………………………………………….. 5.4. La qualité d’un inoculum …………………………………………………….. 5.5. Origine des échecs de l’inoculation……………………………………………
04 04 04 06 10 10 11 11 11 12 12 14 18 18 19 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 22 22 23 23 23 24
01
Page
Sommaire
Chapitre III : Matériel et méthodes
1. Matériel……………………………………………………………………. 1.1 Les isolats bactériens………………………………………………………. 1.2 Matériel végétal……………………………………………………… 1.3 Sol………………………………………………………………………
2. Méthodes………………………………………………………………….. 2.1 Analyses physicochimiques du sol………………………………………
2.1.1 Analyses physiques ………………………………………… Analyse granulométrique…………………………………. L’humidité………………………………………………. Mesure du pH…………………………………………….
2.1.2 Analyses chimiques ………………………………………… Mesure de la conductivité électrique……………………… Dosage du calcaire total…………………………………….. Dosage du calcaire actif…………………………………….. Carbone total et matière organique…………………………
2.2 Collection et isolement des souches bactériennes…………………… 2.2.1 Collection……………………………………………………… 2.2.2 Isolement des bactéries…………………………………..…
2.3 Purification et conservation………………………………………….. 2.3.1 Observation macroscopique………………………………… 2.3.2 Observation microscopique………………………………….. 2.3.3 Test de nodulation……………………………………………. 2.3.4 Conservation des souches…………………………………….
2.4 Effet des différents facteurs environnementaux……………………… 2.4.1 Effet de la température……………………………………… 2.4.2 Effet du pH …………………………………………………….. 2.4.3 Effet de la salinité…………………………………………….
2.5 Séquençage partiel du gène 16S……………………….……………… 2.6 Sélection de souches performantes…………………………………..
2.6.1 Inoculation des plantes en serre………………………………. 2.6.2 Estimation de la croissance…………………………………… 2.6.3 Analyse statistique……………………………………………..
2.7 Evaluation de la symbiose Rhizobium-Acacia saligna in situ………. 2.7.1 Inoculation des plants en pépinière………………………….. 2.7.2 Transfert des plants sur champs…………………………………
25 25 25 25 26 26 26 26 26 26 27 27 27 28 28 28 28 29 29 29 29 29 31 31 31 31 31 31 32 32 33 33 33 33 34
Sommaire
Chapitre V : Résultats et discussion
1. Analyse physicochimique du sol………………………………………… 2. Vérification de la pureté des isolats……………………………………….
2.1 Caractéristiques morphologiques et microscopiques des isolats……….. 2.2 Test de nodulation…………………………………………………..
3. Effet des différents facteurs sur la croissance des isolats……………. 3.1 Effet de la température………………………………………………... 3.2 Effet du pH……………………………………………………….… 3.3 Effet de la salinité……………………………………………………….
4. Séquençage partiel du gène 16S………………………………………….. 5. Inoculation des plantes en serre………………………………………….. 6. Inoculation en pépinière………………………………………………. 7. Transfert des plants sur champs…………………………………………
Chapitre VI : Conclusion et perspectives
Conclusion et perspectives…………………………………………………………. Références bibliographiques………………………………………………….
Chapitre IV : Etat des lieux
1. Etat des lieux- caractéristiques du site étudié………………………………. 1.1. Climat………………………………………………………………….. 1.2. L’historique botanique…………………………………………………
36 36 37
38 39 39 41 41 41 42 44 46 48 52 55
57 58
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau n°1 : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses)………………………………………………
Page 08
Tableau n°2 :
Les températures et la pluviométrie enregistrées les cinq dernières années dans la région de Mostaganem………………..
Page 37
Tableau n°3 :
Le résultat de l’analyse de l’homogénat de quatre échantillons de sol prélevés du site dégradé à 20 cm de profondeur…………
Page 38
Tableau n°4 :
Les résultats du test de nodulation, effet des différents facteurs édaphiques et le séquençage partiel du gène 16S des souches isolées……………………………………………………………
Page 47
Tableau n°5 :
Le pourcentage de survie et la hauteur moyenne des plants inoculés comparés aux plants témoin non inoculés……………..
Page 53
Liste des figures
Liste des figures
Figure 1 : La sablière de l’Ouest Sidi lakhdar (Mostaganem)…………………. Page 03 Figure 2 :
La fixation des dunes littorales dans la région de Bomo plage (Wilaya d’Oran) par l’introduction d’Acacia saligna………………
Page 03
Figure 3 :
Aspect des colonies de Rhizobium sur milieu YEM gélosé…………
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Figure 4 :
Arbre d’Acacia saligna………………………………………………
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Figure 5 :
Ecorce d’A. saligna…………………………………………………..
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Figure 6 :
Feuilles d’A. saligna…………………………………………………
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Figure 7 :
Fleurs d’A. saligna…………………………………………………...
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Figure 8 :
Gousses d’A. saligna………………………………………………..
Page 13
Figure 9 :
Association symbiotique entre bactérie et plante……………………
Page 16
Figure 10 :
Les étapes de formation de nodules………………………………….
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Figure 11 :
Foret d’A. saligna dans la région de Mostaganem…………………..
Page 25
Figure 12 :
Les graines d’A. saligna après trois jours de germination à l’obscurité à une température ambiante…………………………….
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Figure 13 :
Le site de la sablière avant le réaménagement………………………
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Figure 14 :
Protocole d’inoculation suivi in situ sur le site de la sablière………..
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Figure 15 :
Localisation de la sablière destinée à être revégétalisée……………..
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Figure 16 :
La légumineuse Retama raetam la plus dominante dans le site de la sablière avant l’exploitation du sable………………………………..
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Figure 17 :
Aspect macroscopique de la souche ASB11 sur milieu YEM après 72h d’incubation à 28°C……………………………………………..
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Figure 18 :
Aspect visqueux de la souche ASB3 après une semaine d’incubation sur milieu YEM à 28°C……………………………………………...
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Figure 19 :
Formation des nodules sur des racines d’A. saligna inoculées sur sable stérile après 48 jours de croissance dans la chambre de culture.
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Figure 20 :
Aspect de la souche ASB5 à pH 3 après 48h d’incubation à 28°C….
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Figure 21 :
Aspect de la souche ASB5 à pH 12 après 48h d’incubation à 28°C...
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Liste des figures
Figure 22 : La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM incubé pendant 48h à 28°C……………………………………………………………
Page 45
Figure 23 :
La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM salé à 2% (350Mmol) incubé pendant 48h à 28°C…………………………….
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Figure 24 :
La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM incubé pendant 48h à 28°C……………………………………………………………
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Figure 25 :
La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM salé à 3.5% (500Mmol) incubé pendant 48h à 28°C……………………………
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Figure 26 :
Effet de l’inoculation avec la souche ASB17 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé……………………………
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Figure 27 :
Effet de l’inoculation avec la souche ASB7 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé……………………………
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Figure 28 :
Effet de l’inoculation avec la souche ASB13 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé……………………………
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Figure 29 :
Effet de l’inoculation avec la souche ASB5 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé……………………………
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Figure 30 :
Effet souche sur le poids sec de la partie aérienne et la partie racinaire des plants d’A. saligna inoculées en pots après 4 mois de croissance……………………………………………………………..
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Figure 31 :
Effet de l’inoculation avec les différentes souches sur la croissance des plants d’A. saligna pendant 4mois en pépinière…………………
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Figure 32 :
La hauteur du plant témoin comparé à celui inoculé avec la souche ASB13................................................................................................
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Figure 33 :
Le taux de survie des plants inoculés avec les trois souches comparés aux plants témoin………………………………………….
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Figure 34 :
La plantation d’A. saligna suivant le protocole décrit auparavant…..
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Figure 35 :
Aspect des plants d’A. saligna inoculé avec la souche ASB13 (Sinorhizobium sp.) après 4 mois de croissance sur site de la sablière……………………………………………………………….
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I Introduction
Page 1
Introduction
La dégradation du sol peut être causée par l’abandon des carrières après une exploitation
anarchique et abusive. Malheureusement, ce phénomène est très fréquent en Algérie.
Les carrières doivent disposer d’un plan de réaménagement qui doit être réalisé sans délai dès
l’achèvement des opérations d’extraction.
L’exemple de la Carrière de l’Ouest de l’exploitation du sable qui est localisée dans le
Nord-Est de la région de Mostaganem (Figure 1), où le problème du déplacement des dunes
de sable cause des dégâts importants aussi bien pour le secteur agricole par l’envahissement
des terres arables, que pour le secteur urbain par l’ensablement des routes.
Le meilleur moyen pour remédier à tous ces problèmes et lutter contre l’érosion éolienne est
l’utilisation des systèmes fixateurs d’azote plante-microorganisme (Hatimi, 2001),
l’introduction d’une espèce d’Acacia Australienne, Acacia saligna dans le but de fixation des
dunes littorales à donner d’excellent résultats dans la région littorale de Bomo plage située à
la Wilaya d’Oran (Figure 2), c’est pourquoi il nous a semblé intéressant de mettre en place
des essais d’introduction de cette espèce dans le site de la sablière.
Dans ces sols pauvres ou dépourvus d’azote tels les sols dunaires, Acacia saligna est appelée
à jouer un rôle très important, elle présente un intérêt remarquable dans la fixation des dunes
du littoral grâce à la profondeur de son système racinaire, à sa croissance rapide et surtout à sa
capacité à s’associer avec des bactéries du sol du genre Rhizobium et à fixer l’azote
atmosphérique (Dommergues et al., 1999). Cependant, cela ne peut être obtenu qu’en
présence de souches efficientes et en nombre suffisant.
L’inoculation des graines d’Acacia en utilisant des souches effectives sélectionnées au
laboratoire est la méthode la plus convenable et la plus efficiente pour introduire une
population rhizobienne adéquate dans la rhizosphère de cette dernière, plusieurs études ont
rapporté que le rendement des légumineuses inoculées introduites augmente de plus de 25%
(Lal et Khanna, 1993 ; Ndoye et al., 1995).
C’est dans ce contexte que s’intègre notre travail. Il vise la sélection d’un couple
symbiotique Acacia saligna-Rhizobium performant destiné à la revégétalisation de la sablière
et à la lutte contre l’érosion éolienne. L’objectif de l’expérience était de comparer l’effet de
l’inoculation avec différentes souches sur la croissance et la fixation d’azote des plants
d’Acacia saligna en pépinière et sur champs.
Pour atteindre ces objectifs une étude du site dégradé de la sablière est réalisée afin de relever
les contraintes climatiques et édaphiques qui prévalent dans la région et qui peuvent entraver
I Introduction
Page 2
la croissance et la nodulation de l’Acacia introduit. S’ensuit un isolement et une sélection des
souches spécifiques à Acacia saligna selon deux critères : leur efficience (capacité à former
des nodules et à fixer l’azote atmosphérique) et leur résistance à la température, aux pH
extrêmes et à la salinité pour assurer leur survie dans les conditions naturelles.
Les souches sélectionnées au laboratoire sont inoculées à de jeunes plants en pépinière. Après
quatre mois de croissance le taux de survie des plants et leurs hauteur moyenne est calculé
pour relevé l’effet de l’inoculation sur la croissance des plants d’Acacia saligna en pépinière,
puis ces derniers sont transférés sur le site de la sablière et divisés en deux lots, le premier
réinoculé contrairement au deuxième. Les souches sont jugées sur leur performance sur le
terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes "in natura".
I Introduction
Page 3
Figure 1 : La Sablière de l’Ouest Sidi Lakhdar (Mostaganem) Photo prise lors d’une sortie de l’équipe de rhizobiologie
dans la région de Mostaganem (Novembre 2007)
Figure 2 : La fixation des dunes littorales dans la région de Bomo plage (Wilaya d’ Oran) par l’introduction de l’espèce
Acacia saligna
II Etude bibliographique
Page 4
1. Généralités sur les rhizobiums :
1.1. Définition et intérêt :
Rhizobium signifie étymologiquement « ce qui vit dans les racines »; ce sont des bactéries du
sol appartenant à la famille des Rhizobiaceae (classe des Proteobacteria), elles sont capables
de reconnaître, d’infecter et de noduler les racines des légumineuses pour établir une
interaction symbiotique dans le but de fixer biologiquement l’azote. L’infection se traduit par
la formation d’un organe appelé nodule, dans lequel elles vivent comme endosymbiotes et
réduisent l’azote atmosphérique en ammoniac (Schultze et Kondorosi, 1998 ; Albrecht et al.,
1999), forme facilement assimilable par les plantes, en échange la plante hôte procure à la
bactérie un microhabitat favorable et les substrats carbonés issus de la photosynthèse
(Dommergues et al., 1999).
Cette association est largement exploitée dans les pays où les sols sont très pauvres en azote et
l’utilisation des engrais azotés chimiques, très coûteuse (Leena, 2002).
Dans ce contexte l’association rhizobiums-légumineuses peut remplacer efficacement les
engrais azotés chimiques à la fois très onéreux et polluants (Canadian, 1993).
1.2. Les principales caractéristiques :
Les rhizobiums constituent 0.1 à 8 % de la flore bactérienne totale du sol (Sadorwsky et
Graham, 1998), ils se présentent sous forme de coccobacilles ou en bâtonnets réguliers de
0.6 à 0.8 µm de large sur 1 à 4 µm de long (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Vincent, 1974),
aérobies strictes (Pelmont, 1993), Gram négatives et asporulés (Jordan, 1984 ; Bekki, 1983),
généralement très mobiles quand elles sont jeunes grâce à la présence d’un seul flagelle
polaire ou 2 à 6 flagelles péritriches (Bergey’s, 1984).
Ces bactéries se trouvent soit à l’état libre ou à l’état symbiotique sous forme de bactéroïdes
avec une taille dix fois plus grande. Ces derniers ont une forme en X, Y et T (Dommergues et
Mangenot, 1970).
Sur milieu YEM gélosé (Vincent, 1970), ces bactéries forment des colonies de 2 à 4 mm de
diamètre après 3 à 5 jours d’incubation, de couleur blanchâtres ou beiges, circulaires,
convexes, semi translucides ou opaques, élevées et mucilagineuses (Figure 3).
Les rhizobiums sont des bactéries mésophiles, leur température optimale de croissance se
situe entre 25 et 30 °C (Elkan, 1992). Certaines espèces peuvent se développer à des
températures allant de 40,5 °C à 42 °C, c’est le cas de Rhizobium meliloti qui peut se
développer à 42 °C (Affianha et Alexander, 1992). D’autres souches isolées des légumineuses
ligneuses au Kenya, en Inde et au Pakistan peuvent croître à des températures variant entre
II Etude bibliographique
Page 5
44°C et 50°C (Zahran, 1999). Cependant, la température de croissance des rhizobiums varie
en fonction de l’espèce et de la région d’isolement (Cacciari et al., 2003).
Si la plupart des rhizobiums préfèrent la neutralité (Jordan, 1984), d’autres au contraire
tolèrent des pH très bas (Vincent, 1977), c’est le cas de Bradyrhizobium japonicum qui
supporte des pH de l’ordre de 3.5 à 4 (Dommergues et Mangenot, 1970).
D’autre part il a été montré que des souches de Rhizobium peuvent croître à des pH alcalins
allant jusqu’à 12 (Kulkarni et al., 2000).
Figure 3 : Aspect des colonies de Rhizobium sur milieu YEM gélosé. www.wou.edu/~boomers/research/MMLID.htm
II Etude bibliographique
Page 6
1.3. La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulants les Légumineuses) :
La taxonomie des Rhizobiaceae a connu de profonds remaniements au cours des dix dernières
années, du fait de l'abandon du spectre d'hôte comme important critère pris en compte pour la
définition des espèces et de l'adoption des critères généralement retenus pour la classification
bactérienne (Vandamme et al., 1996).
Dans la huitième édition de Bergey’s (1984), un seul genre de Rhizobium était décrit avec six
espèces en se basant sur le concept de groupe d’inoculation croisée. Cette notion de groupe
d’inoculation était fondée sur le caractère d’infectivité des souches c'est-à-dire de leur
aptitude à pénétrer dans la racine ou la tige de la légumineuse et y induire la formation d’un
nodule.
En 1982, Jordan classa les bactéries symbiotiques fixatrices de l’azote en deux genres
Rhizobium et Bradyrhizobium selon leur vitesse de croissance sur milieu synthétique.
L’isolement de rhizobiums associés aux légumineuses non-prises en compte auparavant, a
souvent conduit au bouleversement de la taxonomie des Rhizobiaceae. Ces modifications
constantes de la taxonomie ont conduit à la recherche des critères à prendre en compte pour la
description de nouveaux taxa. C’est ainsi qu’il a été proposé l’utilisation de la taxonomie
moderne qui se base sur plusieurs techniques moléculaires (Graham et al., 1991 ; Vandamme
et al., 1996), de chacune résulte des informations à des niveaux cellulaires différents
(protéines, acides gras, ADN…), elle est de ce fait appelée taxonomie polyphasique (critères
phylogénétiques, phénotypiques et génotypiques) (Zakhia et de Lajudie, 2006).
La combinaison de ces techniques a révélé à la fois des diversités génétiques au sein de
groupes de bactéries qui avaient été considérés comme homogènes et des relations entre des
groupes très éloignés.
Les chercheurs indiquent que la diversité des rhizobiums, comme celle de tous les autres
microorganismes est extrême (Prin et al., 1993), rappelons que « rhizobia » est un terme qui a
été donné aux bactéries du sol qui sont capables d’induire des nodules sur les légumineuses, et
d’y fixer l’azote atmosphérique en symbiose. Récemment ce terme a été substitué par le terme
de BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) (Zakhia et al., 2004). En effet, des bactéries
appartenant à différents genres et classes taxonomiques sont actuellement connues pour leur
capacité symbiotique. Ainsi, le genre Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium,
Ochrobactrum, Allorhizobium, Azorhizobium, Methylobacterium, Bradyhizobium,
Blastobacter, Devosia (classe des α-protéobactéries), Burkholderia et Ralstonia (classe des
β-protéobactéries) (Garrity et al., 2004) ainsi que certaines δ-protéobactéries
(Benhizia et al., 2004), forment actuellement l’ensemble des bactéries connues comme
II Etude bibliographique
Page 7
symbiotes de légumineuses (Weir, 2006), la taxonomie la plus récente des BNL (Bactéries
Nodulant les Légumineuses) est illustré dans le Tableau n°1.
II Etude bibliographique
Page 8
Tableau n°1 : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) (Weir, 2006) Rhizobium Rhizobium daejeonense Rhizobium etli Rhizobium galegae Rhizobium gallicum Rhizobium giardinii Rhizobium hainanense Rhizobium huautlense Rhizobium indigoferae Rhizobium leguminosarum Rhizobium loessense Rhizobium lusitanum Rhizobium mongolense Rhizobium sullae Rhizobium tropici Rhizobium undicola Rhizobium yanglingense
Frank, 1889
Quan et al., 2005 Segovia et al., 1993
Lindstrom, 1989 Amarger et al., 1997 Amarger et al., 1997
Chen et al., 1997 Wang et al., 1997 Wei et al., 2002
Frank, 1879; Frank, 1889 Ancien nom "Rhizobium huanglingense" Wei et al., 2003
Nouvelle espèce 3/11/06 Valverde, 2006 Vanberkum et al., 1998
Ancien nom "Rhizobium hedysari" Squartini et al., 2002 Martinez-romero et al., 1991
"Allorhizobium undicola" de Lajudie, 1998; Young et al., 2001 Tan et al., 2001
Mesorhizobium Mesorhizobium amorphae Mesorhizobium chacoense Mesorhizobium ciceri Mesorhizobium huakuii Mesorhizobium loti Mesorhizobium mediterraneum Mesorhizobium plurifarium Mesorhizobium septentrionale Meorhizobium temperatum Mesorhizobium tianshanense
Javis et al., 1997
Wang et al., 1999
Velazquez et al., 2001 "Rhizobium ciceri" Nour et al., 1994; Javis et al., 1997 "Rhizobium huakuii" Chen et al.,1991; Javis et al.,1997
"Rhizobium loti" Javis,1982; Javis,1997 "Rhizobium mediterraneum"Nour et al., 1995; Javis et al., 1997
de Lajudie et al., 1998 Gao et al., 2004 Gao et al., 2004
"Rhizobium tianshanense" Chen et al., 1995; Javis et al., 1997 Ensifer Ensifer abri Ensifer americanum Ensifer arboris Ensifer fredii Ensifer indiaense Ensifer kostiense Ensifer kummerowiae Ensifer medicae Ensifer meliloti Ensifer adhaerens Ensifer saheli Ensifer terangae Ensifer xinjiangense
Ancien nom Sinorhizobium Willems et al., 2002; Young, 2003
Ogasawara et al., 2003
Toledo et al., 2003 Nick, 1999 ; Young, 2003
"Rhizobium fredii" Scholla et al., 1984; Young, 2003 Ogasawara et al., 2003
Nick et al., 1999; Young, 2003 Wei et al., 2002; Young, 2003
Rome et al., 1996; Young, 2003 "Rhizobium meliloti" Dangeard, 1926; Young, 2003
"Sinorhizobium morelense" Wang et al., 2002; Young, 2003 "Sinorhizobium morelense" Wang et al, 2002; Young, 2003
de Lajudie et al., 1994; Young, 2003 Chen et al., 1988; Young, 2003
II Etude bibliographique
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Tableau n°1 (suite) : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses)
Bradyrhizobium Bradyrhizobium elkanii Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium liaoningense Bradyrhizobium yuanmingense Bradyrhizobium canariense
Jordan, 1982
Kuykendall et al., 1993
"Rhizobium japonicum" Kirchner, 1896; Jordan, 1982 Xu et al., 1995 Yao et al., 2002
Vinuesa et al., 2005 Azorhizobium Azorhizobium caulinodans Azorhizobium doebereinerae
Dreyfus et al., 1988 Dreyfus et al., 1988 "Azorhizobium johannae" de Souza, Moreira et al., 2006
Methylobacterium Methylobacterium nodulans
Jaurand et al., 2004 Burkholderia Burkholderia caribensis Burkholderia cepacia Burkholderia mimosarum Burkholderia phymatum Burkholderia tuberum
Vandamme et al., 2002 Vandamme et al., 2002
Nouvelle espèce 3/11/06 Chen et al., 2006 Vandamme et al., 2002 Vandamme et al., 2002
Cupriavidus Cupriavidus taiwanensis
Ancien nom "Wautersia" puis "Ralstonia"
Chen et al., 2001; Vandamme et Coenye, 2004
Devosia Devosia neptuniae
Rivas et al., 2003 Herbaspirillum Herbaspirillum lusitanum
Valverde et al., 2003 Ochrobactrum Ochrobactrum lupini
Trujillo et al., 2005 Phyllobacterium Phyllobacterium trifolii
Valverde et al., 2003
II Etude bibliographique
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2. Les légumineuses :
La famille des légumineuses (aussi appelées Fabacées), l’une des plus importantes du règne
végétal (16000-19000 espèces) comporte 750 genres différents (Dommergues et al., 1999).
Cette famille est connue pour les différents intérêts qu’elle offre :
- Utilisation en alimentation humaine et animale (graines, feuilles…).
- Amélioration de la fertilité du sol : par rotations ou culture mixte, en agroforesterie.
L’enfouissement des résidus de récolte ou des plantes entières de légumineuses riches en
azote permet d’accroitre la teneur en azote organique du sol. Les cultures qui succèdent aux
légumineuses peuvent ainsi bénéficier de l’azote fixé et libéré progressivement par la
décomposition des résidus enfouis dans le sol (Priefer et al., 2001).
- Augmentation de la couverture végétale pour lutter contre l’érosion et de ce fait la
désertification en plus de l’élévation du taux de la matière organique et enfin pour la
stabilisation et maintien des dunes.
- Réhabilitation écologique des sites dégradés, carencés, salés et milieux contaminés
(Requena et al., 2001).
- Revégétalisation des sites miniers après exploitation (Franco et de Faria, 1997).
- Phytostabilisation et bioremédiation (de Lajudie, 2006: communication personnelle).
En se basant sur les caractères floraux, la famille des légumineuses est subdivisée en trois
sous familles assez homogènes : les Papilionacées, les Césalpiniacées et les Mimosacées
qui comprend surtout les arbres des pays chauds, le genre Acacia en fait partie.
2.1 Le genre Acacia :
Le genre Acacia fait partie des légumineuses de la famille des Mimosacées. Il est composé de
1200 espèces réparties dans les différentes zones tropicales et subtropicales du monde
(Ndiaye et al., 2002). La plupart d’entre elles se trouvent dans les zones arides et semi arides.
Environ 850 sont endémique en Australie, 7 en Amérique du sud et 135 en Afrique, avec
quelque espèces qui se trouvent en Asie (Maslin et Striton, 1997).
En Algérie, les Acacia constituent une chaîne de forêts reliant les hauts plateaux et leurs
steppes (Tissouras, 2004).
Cet arbre souvent fixateur d’azote est appelé à jouer un rôle de premier plan en raison de son
adaptation aux milieux dégradés. Il constitue aussi une source fourragère non négligeable
(Dommergues et al., 1999).
II Etude bibliographique
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2.1.1. Acacia saligna
Appelé encore Acacia cyanophylla (Tackhlom, 1974), un arbre originaire du sud-ouest
d’Australie. Il a été introduit dans de nombreux pays hors de son aire naturelle, notamment en
Afrique du nord.
2.1.1.1. Description :
Un arbuste buissonnant, non épineux, multicaule, de 2 à 5 m de haut ; mais il peut également
se présenter sous la forme d’un arbre de 8 m de haut avec un seul tronc d’un diamètre
atteignant jusqu'à 30 cm (Figure 4).
L’écorce est lisse, de couleur rouge-brun au niveau des rameaux; sur les arbres âgés l’écorce
est gris-foncé et fissurée (Figure 5).
Feuilles: Phyllodes vert foncé à bleu-vert avec des nervures centrales très visibles, très
polymorphes, longs et étroits à lancéolés, droits ou falciformes, de 8 à 25 cm de long sur
0.4-0.2 cm de large, souvent plus grands à la base de l’arbre (Figure 6).
Fleurs: Jaune vif, groupées par 25-55 (jusqu’à 78) en glomérules sphériques de 5 à 10 mm de
diamètre portés par 2 à 10 pédoncules glabres, réunis en racèmes (Figure 7).
Fruits: Gousse étroites, de 4-6mm de large et 8-12cm de long, parfois légèrement arquées,
légèrement contractées entre les graines (Figure 8). Graines brun foncé à noir, brillantes, 5-6
mm de long sur 3.5 mm de large.
Longévité: Elle est de 7-15 ans avec des précipitations annuelles de 150-200 mm ; elle est
seulement de 5 ans si le sol est peu profond.
Propagation: Par graine, rejette aisément de souche et drageonne facilement, d’ou son intérêt
pour la fixation des dunes.
2.1.1.2. Exigences climatiques et édaphiques:
Acacia cyanophylla exige des précipitations annuelles de 300-1000 mm, il peut même
survivre à des précipitations annuelles inferieur à 200 mm (El Lakany, 1987). La température
moyenne du mois le plus chaud y est de 23 à 36 °C et la température du mois le plus
froid est de 4 à 9 °C. Acacia cyanophylla supporte des gelées très légères, mais souffre de
températures inférieures à -4°C (Crompton, 1992). Acacia cyanophylla n’a pas d’exigences
édaphiques particulières. Il se développe bien sur les sols sablonneux profonds. Il tolère les
sols salés et alcalins et a la réputation de bien résister aux embruns marins salés (Sheha,
1984).
2.1.1.3. Utilisation:
Acacia cyanophylla peut constituer des brise-vent efficaces en région semi-arides. Il a été
introduit avec succès pour la fixation des dunes dans différentes régions semi-arides.
II Etude bibliographique
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En Afrique du sud, Acacia cyanophylla a été très largement plantés et avec succès pour
stabiliser les dunes littorales. De plus sa propriété envahissante des zones littorales est due à
une excellente adaptation au climat, une fructification abondante et une grande aptitude à
drageonner. Il faut noter aussi qu’il présente de très faibles exigences nutritionnelles et un
bon potentiel fixateur d’azote (Witkowski, 1991a et b).
2.1.1.4. Symbiose fixatrice d’azote:
Rhizobiums compatibles: En 1961, Lange a rapporté que l’Acacia cyanophylla était nodulé
uniquement par des souches à croissance lente, des études plus récentes ont démontré que cet
arbre peut être nodulé par les deux types de souches : souches à croissance lente et celles à
croissance rapide (Marsudi et Glenn, 1999; Halimi et al., 2001). Cependant bien qu’Acacia
cyanophylla puisse former des nodules effectifs à la fois avec des rhizobiums à croissance
lente et à croissance rapide, il semble avec une préférence pour les Bradyrhizobium. Par
exemple, en Australie un grand nombre de légumineuses parmi eux les Acacia nodulent et
fixent l’azote essentiellement avec des rhizobiums du genre Bradyrhizobium (Lafay et
Burdon, 1998, 2001 ; Sprent, 2001).
Inoculation: Puisque l’effectivité des souches compatibles avec Acacia cyanophylla est très
variable, on peut supposer que dans certains sols, la proportion de rhizobiums compatibles
hautement effectifs est insuffisante: l’inoculation avec des souches sélectionnées et
compétitives est indispensable. Une deuxième raison pour inoculer Acacia cyanophylla est
que dans certains sols, notamment dans les sites arides, on ne trouve pratiquement pas de
rhizobiums compatibles avec Acacia cyanophylla (Dommergues et al., 1999).
Symbioses mycorhiziennes: On a montré expérimentalement qu’Acacia cyanophylla répond
positivement à l’infection par Glomus mosseae dans un sol déficient en phosphore (Nasr et
Diem, 1987). Mais lorsque la teneur du sol en phosphore assimilable atteint un certain seuil
(50 mg/kg), la croissance et la fixation de l’azote sont réduites par l’infection mycorhizienne
(Cornet et Diem, 1982 ; Nasr et Diem, 1987).
II Etude bibliographique
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Figure 4 : Arbre d’Acacia saligna Madau, 2005
Figure 5: Ecorce d’A. saligna Madau, 2005
Figure 7: Fleurs d’A. saligna Madau, 2005
Figure 6: Feuilles d’A. saligna Madau, 2005
Figure 8: Gousses d’A. saligna Madau, 2005
II Etude bibliographique
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3. La symbiose Rhizobium-Acacia :
Les rhizobia, comme on l’a vu précédemment sont des bactéries aérobies du sol appartenant à
la famille des Rhizobiaceae. Ces bactéries présentent la capacité de former une symbiose avec
des plantes de la famille des légumineuses dont l’Acacia, la légumineuse devient ainsi
indépendante de la fertilisation azotée.
En conditions limitant en azote combiné, les rhizobiums vont induire la formation de nodules
au niveau racinaire ou caulinaire des légumineuses. Ces nodules vont représenter de véritables
organes d’échange métabolique entre la bactérie et la plante.
Cette symbiose à bénéfice réciproque va permettre aux bactéries de profiter d’un micro
habitat exceptionnellement favorable; les légumineuses leur procurant un apport en substrats
carbonés issus de la photosynthèse. En échange, les bactéries vont fixer et réduire l’azote
atmosphérique en ammonium, directement assimilable par les plantes hôtes
(Broughton et al., 2003).
Ces interactions symbiotiques sont commandées par un échange de signaux entre les deux
partenaires (Mouchot, 2006) (Figure 9A et 9B).
Les bactéries s’approchent des racines par chimiotactisme, attirées par divers exsudats, et se
fixent à la surface racinaire à l’aide de protéines bactériennes adhésives ou de pilli. Elles se
multiplient et entament le processus de colonisation, selon diverses modalités allant de
l’entrée par des espaces intercellulaires (entre cellules corticales) à la pénétration par les poils
absorbants. Lors de la pénétration par les poils absorbants, ceux ci se courbent en crosse et
leur plasmalemme s’invagine pour former un canalicule tubulaire d’un diamètre de quelques
microns, rempli d’un mucilage polysaccharidique d’origine végétale: le cordon d’infection
(Duhoux et Nicole, 2004).
A la faveur d’une lyse localisée de la paroi, les bactéries colonisent ce cordon, qui croit,
progresse et se ramifie de cellule en cellule jusque dans le parenchyme cortical de la racine.
Les cellules de la plante reprennent leurs divisions et édifient une nodosité (Figure 10).
Au bout du cordon d’infection, les bactéries entrent dans les cellules en s’entourant d’une
membrane péribacteroïde, dérivée du plasmalemme elles se transforment alors en bactéroïdes
(augmentation de leur taille et déformation). Les bactéroïdes possèdent en effet une enzyme,
la nitrogénase qui catalyse la réduction de l’azote atmosphérique en azote ammoniacal
utilisable par les cellules végétales.
II Etude bibliographique
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Chez la bactérie existent des gènes, qu’on nomme gènes « nod » (Parnisk et Downie, 2003 ;
Perret et al., 2000). Le gène nodD code pour un apoactivateur de la transcription, la protéine
nodD, toujours synthétisée mais inactive.
Celle ci peut se lier à des molécules des exsudats racinaires : des flavonoïdes qui la rendent
capable d’activer les autres gènes nod, normalement silencieux (gènes nod inductibles). Les
produits de ces gènes nod ont des fonctions enzymatiques : ils synthétisent des petits
polymères de chitine, oligosaccharides. Ces oligosaccharides sont appelés facteurs nod, selon
le ou les types de facteurs nod qu’elle émet, une bactérie peut ou non être reconnue par une
légumineuse donnée. Des souches produisant différent facteurs nod peuvent donc interagir
avec diverses légumineuses.
II Etude bibliographique
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Figure 9: Association symbiotique entre bactérie et plante (Broughton et al., 2003) 9-A: Echange de signaux entre la bactérie et la plante 9-B: Formule chimique des Flavonoïdes
Flavonoïdes
Facteurs-Nod
II Etude bibliographique
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Poils absorbants
rhizobiums
Colonisation du poil absorbant
Courbure du poil absorbant
Pénétration par les poils absorbants
Formation des nodules
Figure 10 : Les étapes de formation de nodules. (Gage et Margolin, 2000)
b
a
c
d e
f
a, b, c, d et e : taille microscopique (microscope électronique). f : taille réelle.
II Etude bibliographique
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4. Les facteurs biotiques et abiotiques influant sur la nodulation :
4.1. Les facteurs abiotiques:
Le manque d’eau est le principal facteur limitant de la croissance et de la fixation
symbiotique d’azote dans les régions qui souffrent d’un climat aride et semi aride. Dans les
surfaces où l’évapotranspiration dépasse la pluviométrie, la salinité du sol pose un
problème sérieux, dû à l’accumulation du sel dans la couche superficielle du sol. Avec
l’effet combiné de la température ces facteurs peuvent avoir un effet destructif.
Les Acacia peuvent survivre dans ces conditions extrêmes grâce aux mécanismes associés
à la tolérance de la plante au manque d’eau, au sel et à la chaleur: quelques espèces
d’Acacia peuvent maintenir une absorption d’eau constante en développant des racines
profondes qui peuvent atteindre les niveaux humides du sol (Nilsen et al., 1983). Les
Acacia disposent aussi d’un mécanisme de réduction de la perte d’eau par la diminution de
la surface des feuilles : soit en limitant le développement des feuilles et /ou par la
sénescence des feuilles (Turner, 1986).
Les Acacia africains sont généralement à feuilles caduques qui laissent tomber leurs
feuilles durant la saison sèche.
Les Acacia australiens (Sous-famille hétérophyllum) produisent des feuilles bipennées
quand ils sont jeunes, à l’état adulte ces feuilles sont remplacées par des phyllodes
lignifiées accompagnées d’une cuticule épaisse. L’avantage de ces phyllodes réside dans
leur capacité à persister durant les longues périodes de sécheresse (Ullmann, 1989).
Cependant, les phyllodes peuvent répondre rapidement aux premières pluies et peuvent
commencer la photosynthèse sans utiliser les ressources en eau et en éléments nutritifs
pour produire un nouveau feuillage (Montagu et woo, 1999).
La fermeture du stomate est une autre méthode pour réduire la perte d’eau par la
transpiration (Turner, 1986), les Acacia ont une régulation stomatique quotidienne et
saisonnière (Nilsen et al., 1983, 1986 ; Ullmann, 1989 ; Montagu et woo, 1999).
La salinité réduit la photosynthèse et la croissance de la plante due aux effets complexes
des interactions osmotiques, ioniques et nutritionnelles qui reste encore peu connues
(Shannen, 1997). Chez les A. cyanophylla la salinité diminue la concentration des N, P et
K absorbés (Hatimi, 1999). La salinité du sol impose les effets spécifiques des ions sur la
plante, une haute concentration des ions (Na+, Cl-, SO4-2) s’accumule dans la cellule,
inactive les enzymes et inhibe la synthèse des protéines et la photosynthèse. La présence
d’une concentration élevée du sel dissous dans le sol engendre un potentiel osmotique
II Etude bibliographique
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négatif qui diminue le potentiel de l’eau. La balance générale de l’eau est cependant
affectée, le potentiel d’eau présent dans le sol et celui perdu par l’évaporation est
déséquilibré.
Pour lutter contre ces phénomènes plusieurs plantes sont capables d’un ajustement
osmotique (Taiz et Zeiger, 1998).
A une haute température la photosynthèse et la respiration sont inhibées, les plantes se
protègent de la température élevée par le même mécanisme de protection contre le manque
d’eau.
4.2. Les facteurs biotiques :
En plus des facteurs abiotiques qui inhibent la fixation symbiotique d’azote, d’autres
facteurs associés à la population bactérienne dans le sol peuvent avoir le même effet
(Räsänen, 2002).
L’absence de nodules effectifs sur les racines d’Acacia est due essentiellement à :
- Un sol pauvre en rhizobiums spécifiques à la plante hôte.
- Des souches indigènes induisent la formation de nodules ineffectifs.
- La formation de nodules est induite par les Agrobacterium.
L’absence totale des rhizobia dans un sol est très rare car les rhizobiums sont connus par
leurs capacités à persister dans un sol sous des conditions extrêmes même en absence de la
plante hôte (Barnet et al., 1985 ; Odee et al., 2002). L’absence des rhizobia compatibles
avec la plante hôte introduite est cependant un phénomène courant, la présence d’une
faible quantité de rhizobia compatibles est suffisante pour la nodulation.
L’inoculation des légumineuses avec seulement 50 cellules par gramme de sol augmente
significativement l’azote fixé (Turk et al., 1993).
Plusieurs expériences réalisées sur les Acacia ont montré que les nodules formés sur les
racines ne sont pas tous capable de fixer l’azote atmosphérique (Lawrie, 1983 ;
Barnet et al., 1985 ; Odee et al.,2002).
Les bactéries appartenant au genre Agrobacterium sont reliées de prés au rhizobia mais ces
derniers induisent la formation de tumeurs ou pseudonodules sur les racines. Les
Agrobacteria sont des organismes présentent dans la rhizosphère.
Les souches appartenant au genre Agrobacterium ont toujours été identifiées à partir des
nodules de racines de légumineuses du genre Acacia (khbaya et al., 1998 ; Nick, 1998 ; de
lajudie et al., 1999, Odee et al., 2002).
Cependant quand ces espèces sont réinoculées au laboratoire, elles n’induisent pas la
formation de nodules (Nick, 1998 ; Odee et al., 2002), seulement après une inoculation
II Etude bibliographique
Page 20
intense, quelque souches forment un petit nombre de nodules ineffectifs sur différentes
espèces d’Acacia (de Lajudie et al., 1999), de ce fait Agrobacterium représente un groupe
de bactéries formant des nodules non fixateurs d’azote.
5. Inoculation des légumineuses :
On a évoqué auparavant que la fixation d’azote par les légumineuses présente un intérêt
environnemental considérable, puisqu’elle apparaît comme un moyen très économique de
maintenir ou d’accroître le stock d’azote du sol. Cet effet favorable ne peut être obtenu
qu’en présence d’une souche de Rhizobium hautement efficiente (capable de fixer une
grande quantité d’azote atmosphérique). Si une telle souche n’existe pas ou que sa
concentration demeure faible dans un sol donné, il est nécessaire de l’introduire. Cette
opération qui est de pratique courante est connue sous le nom d’inoculation: " Inoculum :
ce terme désigne l’ensemble des entités biologiques appartenant à un même groupe
taxonomique (l’espèce), présentes dans le volume de sol considéré, potentiellement aptes à
provoquer une infection sur un hôte donné" (Dommergues et al., 1999).
5.1. Quand est-il nécessaire d’inoculer ?
Il existe des sols où la densité de la population rhizobienne est très faible, d’autre où les
espèces spécifiques sont absentes, ce qui constitue une menace pour l’établissement du
processus de la fixation biologique d’azote (Thrall et al., 2001).
L’inoculation de la légumineuse est le meilleur moyen pour assurer la présence de la
souche rhizobienne appropriée au bon moment et en nombre suffisant afin d’assurer une
infection rapide et effective.
Avant de procéder à l’inoculation, il est nécessaire de vérifier les points suivants :
5.1.1. Le rendement de la légumineuse introduite : l’apparence ou l’état physique de la
légumineuse reflètent la présence ou l’absence des souches effectives, si la légumineuse est
robuste, verte et ses racines sont nodulées, une population rhizobienne efficiente est
présente dans le sol. Cependant, si la plante est jaune, non vigoureuse mais dont les racines
sont bien nodulées, on suppose que soit les souches sont infectives et non efficientes ou
bien la croissance de la plante est affectée par des facteurs environnementaux adverses tels
que le pH.
Si la légumineuse est non vigoureuse et ses racines sont non nodulés, on suppose que les
souches spécifiques à la plante sont absentes ou que leurs nombre est insuffisant.
II Etude bibliographique
Page 21
Dans les deux cas, où la plante présente une faible croissance une inoculation est
nécessaire, cette dernière doit contribuer au bon développement de la plante (Cleyet –
Marel, 1988).
5.1.2. Le facteur limitant est l’azote : il faut prouver que la croissance de la légumineuse
est affectée par la faible concentration d’azote dans le sol et non pas par des facteurs
écologiques tel que la température, ou par les propriétés du sol, ou autre carences, telle que
la carence en phosphore.
5.1.3. L’absence de souches spécifiques à la légumineuse introduite se traduit par
l’absence de nodules, ou bien le non efficience des souches présentes dans le sol :
La présence de rhizobiums dans le sol peut être facilement détectée par une simple
observation des nodules sur les racines de la légumineuse plantée dans ce site. Cependant,
leur position et leur taille indiquent leur nombre et leur efficience.
La présence d’un nombre important de nodules de grande taille, condensés au sommet de
la racine principale prouve l’abondance des souches, tandis que les petits nodules dispersés
situés dans les racines secondaires ou finales est signe d’une mauvaise nodulation. La
nodulation est souvent retardée ou absente à cause de l’absence ou de la faible
concentration de la population rhizobienne spécifique à la plante hôte, d’où la nécessité
d’inoculer cette dernière (Beunard, 2006 : communication personnel).
5.2. Sélection des souches rhizobiennes appropriées :
L’inoculation des graines d’une légumineuse dans des conditions écologiques données
nécessite la sélection préalable d’une ou plusieurs souches (dans le cas d’inoculation
multiple) présentant les qualités nécessaires à l’établissement d’une symbiose à haut
pouvoir fixateur d’azote.
Le travail de sélection consiste donc à exploiter la variabilité des espèces et à choisir la
souche la plus intéressante parmi une collection aussi large que possible. Le problème le
plus délicat est de définir selon quels critères on décidera qu’une souche est supérieure aux
autres.
Les critères de choix de Rhizobium performants sont les suivants (Brockwell et
Bottomley, 1995) :
5.2.1. Infectivité, c’est à dire aptitude particulière à pénétrer dans les tissus racinaires et à
y induire la nodulation. Pour éviter l’échec dû à la non-réceptivité de la plante hôte
considérée vis-à-vis de la souche de Rhizobium utilisée, on a préconisé l’utilisation de
souches à large spectre qui peuvent infecter un grand nombre de variétés d’une même
espèce de légumineuses ou même un ensemble d’espèces. Il faut cependant souligner que
II Etude bibliographique
Page 22
les souches à large spectre peuvent s’avérer moins efficientes que les souches plus
spécifiques et il est en fait plus rentable de choisir les souches à haut potentiel fixateur
(Burdon et al., 1999 ; Thrall et al., 2000).
5.2.2 Efficience (effectivité), ou aptitude à fixer l’azote atmosphérique. Ce critère est
primordial et doit aller de pair avec une réceptivité parfaite de l’espèce de légumineuse
considérée vis-à-vis de la souche de Rhizobium.
5.2.3. Compétitivité ou aptitude à la compétition, c’est à dire aptitude à supplanter des
souches autochtones. Les souches sont d’abord sélectionnées pour leur aptitude à remplir
la fonction qui leur est assignée (formation de nodules puis fixation d’azote). Cependant,
pour qu’un organisme dont le comportement est satisfaisant dans les conditions du
laboratoire puisse être retenu, il est nécessaire qu’il demeure efficace dans le milieu
complexe ou il sera employé. Soumis à une intense concurrence, il devra donc se montrer
compétitif.
Une souche hautement antagoniste en boite de Pétri ou dans la terre stérilisée peut être
complètement inhibée par la microbiostase dans un environnement naturel ou même
rapidement détruit par des parasites ou des prédateurs. Il faut donc que les souches
sélectionnées possèdent une forte aptitude à la vie saprophytique.
5.2.4. Résistance à l’action létale de divers facteurs physiques (température élevée,
dessiccation, salinité), chimiques (pH, substances toxiques) ou biologiques (bactéries,
champignons)
5.2.5. Persistance des souches dans le sol : La réponse à l’inoculation qui est très
marquée lors du premier établissement d’une légumineuse, tend à s’atténuer au cours des
cultures successives en raison de la multiplication spontanée dans le sol de souches natives
à faible pouvoir fixateur qui concurrencent les souches introduites. Il apparaît nécessaire
dans ces conditions, de chercher à sélectionner des souches non seulement compétitives et
efficientes mais aussi caractérisées par leur aptitude à persister dans le sol (Bergersen,
1970).
5.2.6. Adaptation au niveau de fertilité des sols : Il est toujours souhaitable de tenir
compte lors de la sélection des souches, du niveau de fertilité des sols ou elles seront
utilisées.
En effet, il a été démontré que certaines souches sont plus aptes que d’autres à la fixation
en présence de fortes doses d’azote combiné ou dans des sols carencés en potassium
(Dommergues et Mangenot, 1970).
II Etude bibliographique
Page 23
5.2.7. Stabilité des caractères génétiques : L’idéal serait de comparer tous les isolats dans
leurs conditions réelles d’emploi, ce qui est généralement impossible pour des raisons de
place, de temps, et de main d’œuvre. Il est donc nécessaire de recourir à des tests
miniaturisés (des inoculations sur des plantules en tubes).
Quelles que soient les méthodes qui permettent de les obtenir, les souches qui ont montré
leur efficacité au laboratoire doivent encore être éprouvées dans des conditions qui tout en
étant proche de la réalité, permettent une bonne reproductibilité des résultats. Cette
nouvelle série d’essais, réalisés en serre ou dans des enceintes climatisées a pour but
principal d’étudier les capacités d’adaptation à l’environnement, de faire un choix ultime
parmi le matériel sélectionné et de préciser ses conditions d’emploi.
Il faut enfin, dans une dernière étape, réaliser de multiples essais en plein champ pour
vérifier que l’agent biologique choisi répond bien aux critères cités ci-dessus.
5.3. Le choix de la plante hôte :
Il est important de ne pas perdre de vue que si grandes que soient ses potentialités, un
microorganisme symbiotique ne remplira pleinement son rôle que si le fonctionnement de
la plante à laquelle il est associé n’est pas perturbé par des contraintes environnementales.
Ainsi il est sans intérêt d’essayer d’introduire dans un sol une souche de Rhizobium
sélectionnée si la légumineuse hôte est par ailleurs soumise à un stress hydrique ou autre
facteur défavorable à sa croissance.
Dans le cadre de réaménagement de sablière et fixation des dunes littorales, l’espèce
ligneuse choisie doit présenter certaines qualités particulières ; elle doit fixer activement
N2, c’est à dire à haut potentiel fixateur, car les sols dunaires sont très pauvres en azote;
elle doit avoir des exigences limitées en nutriments; elle doit tolérer les embruns et parfois
la salinité du sol; elle doit enfin être résistante au vent et à la sécheresse et si possible être
capable de capter l’eau des condensations occultes.
Le nombre d’espèces présentant ces caractéristiques est limité. Un acteur majeur est
l’ Acacia saligna grâce à la profondeur de son système racinaire, à sa croissance rapide et à
son adaptation au milieu dunaire (Hatimi et al., 2001).
5.4. La qualité d’un inoculum:
Pour qu’un inoculum utilisé sur champs donne de bon résultats, il doit être de bonne
qualité c’est à dire il doit respecter certaines conditions entre autre la taille de ce dernier et
la méthode d’utilisation.
Le stade physiologique de la culture bactérienne n’a aucune influence sur la nodulation et
la croissance des plants (Diouf et al., 2003).
II Etude bibliographique
Page 24
La présence dans un sol de souches compétitives indigènes de Rhizobium peut
compromettre l’inoculation d’une légumineuse par une souche plus performante mais
moins compétitive. Des essais au champ ont permis d’établir que pour obtenir une réponse
positive à un apport d’inoculation, il faut qu’au moins deux tiers du total des nodosités
soient colonisés par la souche introduite et pour qu’une souche étrangère de Rhizobium
colonise plus de la moitié des nodosités, il faut un apport bactérien mille fois plus élevé
que la densité de l’inoculum naturel (Thies et al., 1991). Dans de telles situations, il est
donc nécessaire d’utiliser un inoculum très concentré et de le placer de telle sorte qu’il
arrive au contact des racines avant ses concurrents. Cette condition peut être réalisée soit
par un enrobage des semences (inoculation direct), grâce auquel l’infection a lieu dés la
germination, soit par un inoculum liquide (inoculation indirect) pendant le séjour en
pépinière s’il s’agit de sujets à transplanter (Galiana et al., 1990).
La taille de l’inoculum joue un rôle important sur la nodulation et la croissance des plants,
une inoculation avec des cultures bactériennes contenant 109 à 1010 bactérie/ml sont les
conditions optimales pour avoir une nodulation et une croissance maximale des plants
(Diouf et al., 2003).
5.5. Origine des échecs de l’inoculation :
l’inoculation des plantes avec des Rhizobium sélectionnés ne donne pas toujours l’effet
positif escompté sur les légumineuses fixatrices d’azote sur lesquelles elle a été appliquée
(Brunck et al., 1991).
Une mauvaise connaissance du devenir des inoculums au champ est l’une des causes des
échecs observés. En effet, la réponse à l’inoculation peut dépendre :
De la qualité de l’inoculum :
- Un inoculum de mauvaise qualité : une densité insuffisante des microorganismes vivants,
des souches non compétitives ou bien non infectives ni effectives.
- Contact de l’inoculum avec les engrais ou pesticides toxiques.
Des propriétés du sol :
Milieu-sol défavorable : pH élevé ou faible, humidité insuffisante, température anormale,
excès d’azote combinés, carence en certains éléments (P, Ca, Mo, Co, B) mais aussi des
propriétés physiques défectueuses.
Des caractéristiques symbiotiques de la plante ; Plante hôte non réceptrice, ou l’échec peut
être dû à l’ensemble des composantes du système sol-plante-microorganismes (Brunck et
al., 1991).
III Matériel et méthodes
Page 25
1. Matériel :
1.1. Les isolats bactériens:
Les isolats ayant fait l’objet de notre étude proviennent des nodosités d’Acacia saligna
prélevées in situ pendant la saison pluvieuse (Novembre) dans la région littorale de Bomo
plage (wilaya d’Oran).
1.2. Matériel végétal :
Les graines d’Acacia saligna récoltées dans la région où cette espèce présente une bonne
croissance (Figure 11) ont été triées puis les sujets sains sont choisis.
1.3. Sol :
Des échantillons de sol (100g) sont prélevés dans quatre endroits différents du site dégradé à
20 cm de profondeur puis sont mélangés en un seul lot. Des analyses physico-chimiques sont
effectuées sur cet homogénat des quatre échantillons de sol (400g).
Figure 11 : Foret d’Acacia saligna dans la région de Mostaganem Photo prise lors d’une sortie de l’équipe de Rhizobiologie à Mostaganem
Source : Direction des forets de Mostaganem
III Matériel et méthodes
Page 26
2. Méthodes :
2.1. Analyses physico-chimiques du sol : (Annexe 1)
2.1.1. Analyses physiques :
a- Analyse granulométrique : (Rouiller et al., 1994)
L’analyse granulométrique du sol ou encore appelée analyse mécanique, ou analyse physique
consiste à classer les éléments du sol d’après leur grosseur et à déterminer le pourcentage de
chaque fraction (sable, limon, argile).
L’analyse granulométrique a pour but de définir la texture d’un sol, c’est à dire le pourcentage
de ces divers constituants, et par là d’expliquer les propriétés physiques de ce sol : son
comportement vis à vis de l’eau, de l’air et des racines et d’évaluer sa stabilité structurale
c'est-à-dire la solidité de l’état de la structure du sol et sa résistance aux agents de
dégradation.
On utilise pour cette analyse de la terre fine obtenue par tamisage au tamis à mailles 2mm, on
élimine la matière organique par un oxydant énergique (H2O2), la durée d’exposition dépend
de la teneur en matière organique (24h à 48h). Les particules minérales sont ensuite dispersées
à l’aide d’un dispersant alcalin (hexametaphosphate de sodium).
Les particules grossières de diametre superieur à 50 mm sont séparées par tamisage, les
particules moyennes et fines sont obtenues par la mesure de la vitesse de sédimentation.
D’après le triangle des textures, on définit la texture de notre sol (Annexe n°2).
b- L’humidité : (Soltner, 1974)
L’échantillon de sol est pesé une première fois (P1), puis le sol est séché à l’étuve à une
température de 160°C pendant 24h, par la suite il est pesé une deuxième fois (P2).
L’humidité est calculée comme suite:
P1 : le poids du sol humide.
P2 : le poids du sol séché.
c- Mesure du pH : (Callot-Dupuis, 1980)
Au 20g de terre fine (séchée à l’air) y sont ajoutés 50ml d’eau distillée (pour mesurer le
pHeau). Le contenu est agité pendant quelques minutes, puis laissé à reposer 2h. Le pH est
ensuite mesuré à l’aide d’un pH-mètre après une brève agitation.
H% = (P1-P2) x 100 / P2
III Matériel et méthodes
Page 27
2.1.2. Analyses chimiques :
Sur l’homogénat des quatre échantillons prélevés (à 20 cm de profondeur), on a effectué la
mesure de la salinité, le dosage du calcaire total et actif, et enfin le dosage de carbone et de la
matière organique dans le sol.
a- Mesure de la conductivité électrique : (Aubert, 1978)
Le principe consiste à déterminer la conductivité électrique (C. E.) de l’eau pour déterminer la
salinité de l’extrait du sol. Elle est effectuée en mélangeant 1/5 du sol avec 4/5 d’eau distillée.
Après une agitation de quelque minute la solution est chauffée à une température T (25°C),
une première lecture est réalisée à cette température (CT), puis chauffer à une température T’
(35°C) une deuxième lecture est réalisé avec le conductivimètre (CT’ ).
Le coefficient de température ß est calculé comme suite :
Le conductivimètre est réglé à la valeur ß et la mesure de la C.E. est effectuée ; cette
dernière s’exprime en milli Siemens (mS).
On évaluera le degré de la salinité du sol en se référant aux normes internationales
(Annexe n°3).
b-Dosage du calcaire total : (Callot-Dupuis, 1980)
Le calcaire n’est pas un constituant toujours présent dans le sol. Par contre pratiquement tous
les sols contiennent du calcium si peu soit-il, cet élément se trouvant en particulier fixé sur
l’argile sous forme d’ion calcique ou en solution sous forme de sels solubles de calcium.
Le calcaire ou carbonate de calcium, CaCO3, est un sel insoluble. Mais l’eau chargée de gaz
carbonique peut le dissoudre lentement le transformant en un sel soluble, le bicarbonate de
calcium. C’est ainsi que peu à peu le calcaire disparaît d’un sol donné. Mais la solution du sol,
et l’argile gardent très longtemps du calcium provenant de la dissolution du calcaire.
On utilise la propriété du carbonate de calcium qui se décompose sous l’action d’un acide
(HCl) en eau et gaz carbonique, ce dernier est recueilli dans un tube gradué en ml.
p : poids du CaCO3 pure utilisé pour l’étalonnage.
V: volume du gaz carbonique dégagé par l’échantillon du sol.
P : poids de l’échantillon du sol.
v : volume de gaz carbonique dégagé par le CaCO3.
ß = (CT’ –CT) x 100 / (T’ –T) x CT
CaCO3% = (p x V) x100 / (P x v)
III Matériel et méthodes
Page 28
c- Dosage du calcaire actif : (Drouineau, 1942)
Dans le sol, une partie plus ou moins importante de calcaire total se trouve à l’état de fines
particules actives pour les végétaux, cette fraction est facilement solubilisée par les eaux
riches en gaz carbonique.
Pour le dosage du calcaire actif, on utilise la propriété du calcium se combinant aux oxalates
d’ammonium pour donner de l’oxalate de calcium insoluble.
L’excès de solution d’oxalate d’ammonium et ensuite dosé par une solution de permanganate
de potassium en milieu sulfurique.
La teneur en calcaire actif exprimée en % est obtenue à partir de la formule suivante:
N-n: correspond à la quantité d’oxalate de calcium précipité, donc à la quantité d’oxalate
d’ammonium qui a réagi avec le calcaire actif.
N: nombre de ml KMnO4 utilisés pour titrer la solution d’oxalate d’ammonium.
n: nombre de ml KMnO4 utilisés pour titrer l’extrait du sol
d- Carbone total et matière organique : (Méthode Anne, 1945)
La teneur en matière organique totale du sol s’obtient généralement en dosant la teneur en
carbone. On estime que le rapport matière organique / carbone est à peu prés constant et égal
à MO/C =1.72.
Le carbone de la matière organique est oxydé par un mélange de bichromate de potassium et
d’acide sulfurique (H2SO4). On admet que l’oxygène consommé est proportionnel au carbone
que l’on veut doser.
L’excès de bichromate inutilisé dans la réaction est dosé par le sel de mohr.
2.2. Collection et isolement des souches bactériennes :
2.2.1. Collection :
Les souches bactériennes utilisées pour cette étude sont isolées à partir des nodules d’Acacia
saligna qui proviennent de la région littorale de Bomo plage, cette région présente les
caractéristiques (climat, sol) proche de la région étudiée. Les nodosités d’Acacia saligna sont
collectées "in situ". Les racines sont déterrées puis transportées rapidement au laboratoire.
2 KMnO4 + 5(NH4)2C2O4 + 8H2SO4 2Mn SO4 + K2 SO4 + 5(NH4)2SO4 + 10CO2 + 8H2O
Calcaire actif % = (N-n) x 1.25
III Matériel et méthodes
Page 29
2.2.2. Isolement des bactéries :
Les racines d’Acacia saligna sont rincées à l’eau distillée pour éliminer le sable.
Chaque nodule est détaché de la racine à l’aide d’un scalpel, les nodules sont rincés dans de
l’eau distillée puis dans du surfactant non-ionic "Tween 80" (100 ml/l) pour éliminer toute
trace de sable.
Les nodules sont stérilisés en surface par immersion dans du chlorure mercurique Hg Cl2 à
0,25 % pendant 4 secondes.
Chaque nodule est rincé dans de l’eau distillée stérile 10 à 15 fois, puis écrasé dans des boites
contenant YEM solide (Annexe n°4 : composition milieu YEM).
2.3. Purification et conservation :
2.3.1. Observation macroscopique :
Les boites de Pétri sont incubées à 28°C entre 3 à 10 jours. Les colonies isolées sont
ensemencées sur milieu YEM solide, et incubées à 28°C pendant 2 à 3 jours, une observation
macroscopique permet de déterminer la couleur, la taille, la forme, le contour des colonies,
ainsi que la pureté des souches.
Les colonies du Rhizobium sur milieu YEM solide sont de couleur blanchâtres ou beiges,
circulaires, convexes, semi translucides, élevées et mucilagineuses (Dommergues et
Mangenot, 1970).
2.3.2. Observation microscopique :
Suite à une coloration de Gram (Annexe n°5), l’observation microscopique permet de
déterminer le Gram, la morphologie et la pureté des souches. Les Rhizobium sont des
bactéries Gram négatif en forme de coccobacilles ou de bâtonnet de 0.6 à 0.8 µm de large, et
1 à 4 µm de long (Dommergues et Mangenot, 1970).
2.3.3. Test de nodulation :
Le test de nodulation est un critère important dans la caractérisation des Rhizobium, les isolats
extraits des nodosités d’Acacia saligna ne peuvent être identifiés comme rhizobia qu’après
avoir prouver leur capacité à former des nodosités sur leur plante hôte en conditions
bactériologiques contrôlées (Graham et al., 1991).
Désinfection et scarification des graines :
Les graines d’Acacia saligna sont désinfectées à l’hypochlorite de sodium (12°) pendant 15
min, puis rincées 6 à 10 fois à l’eau distillée stérile afin d’éliminer les traces du désinfectant.
Elles sont ensuite scarifiées à l’aide d’une aiguille chauffée à blanc puis mises à germer
III Matériel et méthodes
Page 30
aseptiquement sur de l’eau gélosée (0.8%) (Annexe n°6) (Tillard et Drevon, 1988) ; les boites
ainsi préparées sont mises à l’obscurité, à température ambiante.
Culture et inoculation des plantules "in vitro" :
Après germination des graines, l’ensemble des plantules obtenues dont la longueur des
radicelles ne dépasse pas 2 cm (Figure 12), sont transférées dans des tubes à essai (Longueur
18 cm, diamètre 2 cm, et une capacité de 35 ml) contenant une solution nutritive décrite par
Broughton et Dilworth (1971) (Annexe n°7). Après leur inoculation par 2 ml de la suspension
bactérienne de la souche à identifier d’une concentration de 15 x 108 cellules/ml (cette
concentration est obtenue en comparant la turbidité du milieu ensemencé avec celle de
Mac Farland n°05 (Annexe n°8), les plantules sont transférées dans une chambre de culture
(de type Sanyo Electrobiomedical. Co. LTd. Prints. Japon) à une température de 25 °C ± 1,
une photopériodicité de 16 heures et une intensité lumineuse de 2000 luxes. Les racines
doivent être maintenues à l’obscurité dans une boite en carton trouée permettant l’introduction
de la moitié inférieure des tubes.
Une agitation quotidienne est réalisée pour faciliter le contact des bactéries avec les racines
des plantules. Il est nécessaire d’avoir des plantules non inoculées, qui serviront de témoins.
Un test de nodulation sur support sable stérile est aussi réalisé, des pots sont remplis par 100g
de sable stérilisé, les graines germées sont placées et inoculées avec 2ml d’une suspension
bactérienne d’une concentration de 15 x 108 cellules/ml de chaque souche testée. Les pots
sont ensuite placés dans une chambre de culture, les plantules sont arrosées chaque deux jour
avec une solution dépourvue d’azote (Annexe n°7). Des pots témoin non inoculés sont aussi
préparés.
Figure 12 : Les graines d’A. saligna après trois jours de germination à l’obscurité et à température ambiante
III Matériel et méthodes
Page 31
2.3.4. Conservation des souches :
Les colonies pures dont les cellules sont des bacilles courts Gram négatif, sont repiquées
stérilement sur milieu YEM incliné et incubées à 28°C pendant 48 à 72 h. Les tubes sont
ensuite conservés à 4°C pour une durée de 3 mois. Pour une conservation de longue durée
dépassant les 6 mois, les souches sont conservées à –20°C dans du YEM liquide ensemencé
par ces souches et additionné de glycérol à un ratio de 1 : 1.
2.4. Effet des différents facteurs environnementaux sur les isolats :
Des facteurs environnementaux peuvent avoir un effet limitant sur l’établissement de la
symbiose entre la légumineuse et les souches introduites. Parmi ces facteurs la température et
la salinité ainsi que le pH sont les principales contraintes qui prévalent dans les régions à
climat méditerranéen semi aride (Caravaca et al., 2002) d’où l’intérêt d’utiliser des souches
résistantes.
2.4.1. Effet de la température :
Afin de déterminer l’effet de la température sur la croissance des isolats, les boites sont
ensemencées par étalement de 50 µl de la suspension bactérienne d’une concentration de
15 x 108 cellules/ml et incubées à différentes températures : 4°C, 7°C, 10°C, 28°C, 35°C,
40°C et 45°C.
2.4.2. Effet du pH :
Le milieu YEM préparé est ajusté à différent pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12. Les boites
sont ensemencées avec les différents isolats de la même façon que pour le test de la
température et sont incubées à 28°C.
2.4.3. Effet de la salinité :
Ce test permet de sélectionner les souches microbiennes les plus résistantes à la salinité.
L’évaluation de la tolérance au sel est effectuée par culture des souches sur du milieu YEM
gélosé renfermant des teneurs croissante en NaCl à raison de: 1%, 2%, 3%, 4%, 5% et 7%.
Trois répétitions sont réalisées pour chaque traitement et la croissance des souches est évaluée
par l’apparition de colonies dans les boites de Pétri.
2.5. Séquençage partiel du gène 16S :
L’étude de l’opéron ribosomique codant pour les ARNr 16S constitue un outil de choix pour
la classification des bactéries grâce à sa présence chez toutes les bactéries, sa fonction
constante et la présence de zones très conservées ainsi que des parties à séquence variable
(Woese, 1987 ; Schleifer et Ludwig, 1989 ; Stackebrandt et Goebel, 1994).
III Matériel et méthodes
Page 32
Un séquençage partiel du gène 16S des souches isolées est réalisé au Laboratoire des
Symbioses Tropical et Méditerranéen à Montpellier.
Presque la totalité du 16S ADN ribosomal est amplifié en utilisant les amorces universelles du
16S ADNr eubactérien FGPS6 et FGPS1509 (Normand, 1992).
Le volume du mélange réactionnel est de 25µl contenant : 2µl de l’ADN, 13.85 µl de d’eau
Milli-Q stérile, 5µlTampon X5 (Invitrogen, USA), 2 µl DNTPs (2.5 mM), 1 µl de chaque
amorce (20µM) et 0.15 µl de Taq polymerase. Un control négatif est utilisé : remplacement
du 2µl d’ADN par de l’eau.
La réaction de séquence est réalisée grâce au thermocycleur (Perkin Elmer 2400) en utilisant
le programme suivant : une dénaturation initiale à 96°C pendant 2 minutes, puis 36 cycles
avec les étapes suivantes : dénaturation (30 secondes à 94°C), hybridation (30 secondes à
56°C), élongation (2 minutes à 72°C) puis une étape finale d’élongation (7 minutes à 72°C).
7- Séquençage partiel de l’ADNr 16S : Le produit PCR du 16S sont soumis à une
électrophorèse sur gel d’agarose à 0.7%, les bandes sont découpées et purifiées en utilisant un
kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen, Courtaboeuf, France) et séquencées en utilisant
deux amorces FGPS6 et FGPS1509.
Les séquences du 16S ADNr sont corrigées, alignées et analysées avec le logiciel Chromas
pro 1.23 et alignées en utilisant le logiciel Clustal X.
2.6. Sélection de souches performantes :
2.6.1. Inoculation des plantes en conditions contrôlées:
L’amélioration de la symbiose Rhizobium-Acacia passe obligatoirement par la recherche des
souches qui permettent une bonne nodulation et par conséquence une meilleure croissance de
la plante dans des conditions optimisées pour passer ensuite aux conditions naturelles.
Une inoculation en pots est réalisée afin d’évaluer l’effet d’un apport d’inoculum de chaque
souche sur la croissance d’A. saligna, les essais ont été conduits en serre réglée aux conditions
climatiques méditerranéennes.
Le sol prélevé à partir du site destiné à être revégétaliser est autoclavé 3 fois à intervalle de
24 h entre chaque stérilisation. Des graines germées sont planté dans des pots contenant 200g
du sol stérilisé, chaque pot est inoculé par 5 ml d’une suspension liquide de la souche à la
phase exponentielle à une concentration de 15 x 108 cellules/ml (Mac Farland n°05) (Diouf et
al., 2003 ; Galiana et al., 1994 ). Des pots témoin non inoculé sont préparés, les plantes sont
arrosées un jour sur deux avec la solution nutritive dépourvu d’azote (Annexe n°7).
III Matériel et méthodes
Page 33
Une deuxième inoculation est effectué une semaine après la levée pour assurer l’établissement
de la symbiose (Benbrahim et al., 1998).
2.6.2. Estimation de la croissance :
Après quatre mois de culture sous serre les plantes sont déterrées, le poids sec de la partie
aérienne (PSA) et celui de la partie racinaire (PSR) des plantes nodulées sont mesurés; le
poids sec est obtenu par un séchage des racines et les parties aériennes (tiges et feuilles) à
70°C pendant 48h. Cette méthode permet de comparer l’efficience des souches inoculées sur
des plantes poussant sur un milieu sans azote (Domenach et Wery, 1989).
2.6.3. Analyse statistique :
Toutes les valeurs du test d’inoculation représentent la moyenne de cinq répétitions. Les
résultats ont fait l’objet d’une analyse de variance à un seul facteur (effet souche). Elle
s’applique lorsqu’on veut comparer les moyennes obtenues pour une variable donnée chez
différentes populations, l’analyse de variance permet de distinguer comment se répartit la
variation totale observée et de voir plus précisément si la variation observée entre les
différentes populations (ou niveaux) du facteur contrôlé testé a un poids nettement plus
important que les variations observées au sein des populations (à l’intérieur des niveaux) due
à l’erreur résiduelle (Galiana, 2007 : communication personnelle).
Le seuil de la probabilité utilisé pour déterminer la signifiance est P < 0.05, quand le logiciel
STATISTICA indique un effet significatif, les moyennes sont comparées avec le test de
Newman & Keuls.
La sélection des souches destinées à être utilisées comme inoculum en pépinière est basée sur
deux critères :
- Souches qui permettent une bonne nodulation (nodules actifs) et par conséquence une
meilleur croissance de la plante hôte en condition contrôlés (souches efficientes).
- Souches résistantes aux conditions édaphiques extrêmes de pH, température et salinité afin
d’assurer la survie de cette dernière et le fonctionnement de la symbiose dans les conditions
naturelles.
2.7. Evaluation de la symbiose Rhizobium-Acacia saligna in situ :
2.7.1. Inoculation des plants en pépinière (Mai 2007) :
Les plants d’Acacia saligna sont produits dans une pépinière dans des conditions routinières,
c'est-à-dire que le sol de la pépinière n’a pas été traité avant d’être inoculés avec les souches
sélectionnés, l’inoculation s’est faite par la méthode indirecte (un inoculum liquide au
III Matériel et méthodes
Page 34
moment du semi) car ce dernier à été immédiatement utilisé et non pas conservé, puis les
plants ont été transférés sur champs après 6 mois d’entreposage en pépinière.
Les graines sont scarifiées à l’eau bouillante puis sont laissées à refroidir dans l’eau pendant
une nuit. Chaque graine est plantée dans un sachet en plastique (17 cm x 9.5 cm). Au semis,
les plants sont inoculés avec 5 ml d’une culture pure de rhizobium incubée pendant une
semaine et contenant 15 x 108 bactéries/ml (Diouf et al., 2003), une semaine après la levée,
les plantules ont reçu une deuxième inoculation de la même façon que la précédente.
Nous avons choisi de tester l’infectivité et l’efficience au champ de trois souches
sélectionnées en serre, 200 plants sont inoculés avec chaque souche sélectionnée et 200 plants
témoins non inoculés sont aussi préparés.
Après quatre mois de croissance en pépinière le pourcentage de survie des plants ainsi que
leurs hauteurs moyennes sont calculés.
2.7.2. Transfert des plants sur champs:
Après six mois de croissance en pépinière (en Octobre 2007), les plants sont transférés sur le
site destiné à être revégétalisé (Figure 13).
La parcelle de plantation est entourés par des roseaux pour protéger les plants contre l’érosion
éolienne et les troupeaux d’ovins, le sol est retourné pour extraire les cailloux, ensuite les
plants sont mis en terre suivant le dispositif ci-dessous et sont irrigués selon les besoins des
plants (Figure 13 et 14).
Figure 13 : Le site de la sablière avant le réaménagement.
Photo prise en Octobre 2007
III Matériel et méthodes
Page 35
Après quatre mois de croissance des plants sur site, la hauteur moyenne de ces derniers est
estimée et leur état physiologique est relevé afin de comparer les plants inoculés aux plants
témoins non inoculés et aux plants d’Eucalyptus non fixateurs.
1, 2, 3 : Plants inoculés en pépinière avec les souches ASB13, ASB7, ASB5 respectivement. 1’, 2’, 3’ : Plants réinoculés sur champs avec les mêmes souches. Témoin : Plants non inoculés. m : mètre.
24m
3 m
Figure 14 : Protocole d’inoculation suivi in situ sur le site de la sablière.
A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E 3 m
N
A : Acacia saligna E : Eucalyptus urophylla
Témoin
1 1’
2
3
2’
3’
Témoin
12m
60m
15m
IV Etat des lieux
Page 36
1. Etat des lieux - Caractéristiques du site étudié :
1.1. Localisation du site :
Le site destiné à être revégétalisé est situé à environ 7km au nord de Sidi Lakhdar à 50
km vers l’est de Mostaganem (Figure 15), la sablière s’étend sur une superficie de 76
hectares, dont 43 hectares sont en état de reboisement, 8 hectares sont au cours
d’exploitation et 25 hectares sont encore à l’état natif.
1.2. Le climat :
D’après la pluviométrie (qui ne dépasse pas 600 mm) (ONM : Organisation Nationale
de Météo, 2007) et les températures des saisons sèches et humides enregistrées ces cinq
dernières années (Tableau n°2), la région est caractérisée par un climat méditerranéen
sec.
Aschmann (1973) a défini les régions à climat méditerranéen dans le monde comme des
zones dans lesquelles au moins 65% de la précipitation tombe en hiver, la précipitation
annuelle oscille entre 275 et 900 mm et la température moyenne en hiver est inferieure à
15°c.
Dans les régions méditerranéennes, indépendamment de la quantité de la précipitation
moyenne annuelle, il existe toujours une période d’aridité ou de sécheresse estivale
(Rivas-Martinez, 1981 ; Godard et Tabeaud, 2004), et elles sont caractérisées par des
hivers humides et tempérés et des étés chauds et secs.
Figure 15: Localisation de la sablière destinée à être revégétalisée.
Sablière de l’ouest
IV Etat des lieux
Page 37
Tableau n°2 : Les températures et la pluviométrie enregistrées les cinq dernières années dans la région de Mostaganem.
Par l’ONM (Organisation Nationale de la Météo)
1.3. L’historique végétal :
Avant l’exploitation du sable le site présentait une végétation autochtone qui était
constituée essentiellement par des Retama raetam, une espèce ligneuse pionnière des
sols dunaires sablonneux (Figure 16).
Année
Température (°C)
Pluviométrie (mm)
2002 Mois le plus chaud : 27°C Mois le plus froid : 10.5°C
614 mm
2003 Mois le plus chaud : 26.5°C Mois le plus froid : 11.8°C
255 mm
2004 Mois le plus chaud : 27.1°C Mois le plus froid : 11.4°C
220 mm
2005 Mois le plus chaud : 27.8°C Mois le plus froid : 10.5°C
393 mm
2006 Mois le plus chaud : 24.7°C Mois le plus froid : 10.8°C
310 mm
Figure 16 : La légumineuse Retama raetam la plus dominante dans le site de la sablière avant l’exploitation du sable.
Source : La foresterie de Mostaganem
V Résultats et discussion
Page 38
1. Analyses physico-chimiques du sol :
D’après les analyses physico-chimiques du sol, ce dernier à une texture sablonneuse
(Tableau n°03), ce qui fait de lui un sol bien aéré, facile à travailler, mais pauvre en réserve
d’eau (humidité = 2.87%), il est alcalin grâce à la présence d’une concentration élevée en
calcaire (51.22%) ; non salé (CE = 0.06 mS) d’après Les normes internationaux. Il a été noté
une faible activité microbienne exprimée en faible concentration en matière organique, de
plus ce sol est pauvre en éléments nutritifs ce qui est une des caractéristiques des sols
sablonneux.
Tableau n°03 : Le résultat de l’analyse de l’homogénat de quatre échantillons de sol prélevés du site dégradé à 20cm de profondeur, réalisé à l’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) de Sidi Bel Abbes au
mois de Mai 2007.
En étudiant les deux paramètres (climat et sol), on constate que la région reçois des
précipitations très faibles, le sol est pauvre en éléments nutritifs, le pH est alcalin. Ces
conditions défavorables constituent non seulement une contrainte à la végétation, mais
également entravent le développement de la flore microbienne du sol indispensable pour la
croissance et la nutrition des plantes (Hatimi et al., 2001) d’où l’intérêt de sélectionner des
souches performantes.
L’humidité Conductivité électrique
pH Calcaire total
Calcaire actif
Matière organique
Carbone total
Granulométrie
2.87 % 0.06 mS 9.45 51.22 % 0.25 % 0.18 % 0.092 %
Sable grossier : 2.66%
Sable moyen : 58.83% Sable fin : 36.2%
Limon grossier : 1%
Limon fin : 3.46% Argile : 0 %
V Résultats et discussion
Page 39
2. Vérification de la pureté des isolats :
2.1. Caractéristiques morphologiques et microscopiques des isolats:
18 souches sont isolées des nodules d’A. saligna (Tableau n°4), Les colonies obtenues après
purification des différents isolats sur milieu YEM présentent les mêmes caractéristiques
macroscopiques (Figure 17), elles apparaissent homogènes le long des stries, elles sont
circulaires de 2 à 3 mm de diamètre, de couleur blanchâtre, compactes pour la plupart,
opaques, de surface lisse et visqueuse à contour régulier et marquées par une très forte
viscosité qui augmente avec le temps d’incubation surtout chez les isolats ASB3, ASB6,
ASB8, ASB9, ASB12, ASB13 (Figure 18). Cette viscosité est due à une production massive
d’exopolysaccharide (Zahran, 1994). Ces caractéristiques morphologiques obtenues sont
semblables à ceux des rhizobiums décrits par de Lajudie et al., 2004.
L’observation microscopique des isolats après coloration de Gram montre qu’ils présentent
une forme coccobacillaire pour les isolats ASB1, ASB3, ASB6, ASB8, ASB9, ASB10,
ASB11, ASB16, ASB17, à bacilles pour les isolats ASB2, ASB4, ASB5, ASB7, ASB12,
ASB13, ASB14, ASB15, ASB18, de couleur rose (Gram-), ce qui confirme la pureté de nos
isolats.
Figure 17: Aspect macroscopique de la souche ASB11 sur milieu YEM après 72h d’incubation à 28°C
V Résultats et discussion
Page 40
2.2. Test de nodulation :
La formation de nodules sur les racines de la plante hôte après 48 jours d’incubation confirme
l’appartenance des souches isolées au groupe des BNL (Bactéries Nodulant les
Légumineuses) (Figure 19) (Tableau n°04).
Figure 18: Aspect visqueux de la souche ASB3 après une semaine d’incubation sur milieu YEM à 28°C
ASB1 ASB2
Figure 19 : Formation des nodules sur des racines des plantes d’Acacia saligna inoculées sur sable stérile après 48 jours de croissance dans la chambre de culture
V Résultats et discussion
Page 41
3. Effet des différents facteurs sur la croissance des isolats :
Certains auteurs (Zahran, 1999 ; Priefer et al., 2001 ; Brigido et al., 2007 ; Chimining’wa et
Vessey, 2006) ont montré que les facteurs environnementaux tels que la température, la
salinité et le pH sont des facteurs limitant de la croissance et de l’activité des deux partenaires
de la symbiose.
Afin d’assurer l’établissement de la symbiose dans les conditions naturelles, il est nécessaire
de sélectionner des souches résistantes aux différents facteurs environnementaux
(température, pH et salinité).
3.1. Effet de la température :
Ce test a été effectué dans l’objectif de déterminer la croissance des isolats à différentes
températures, et de ce fait sélectionner ceux qui présentent une croissance à des températures
extrêmes.
Les résultats obtenus montrent que toutes les souches présentent une meilleure croissance à
28 °C, qui représente la température de croissance optimale des rhizobiums (Dommergues et
Mangenot, 1970 ; Dommergues et al., 1999).
Aucune croissance n’est signalée à 4 °C pour toutes les souches, c’est une température de
conservation.
A 7 °C seules les deux souches ASB2 et ASB4 présentent une bonne croissance, tandis que
les souches ASB9, ASB16 et ASB18 présentent une croissance moyenne.
A 10 °C la croissance est observée chez toutes les souches.
A 35 °C, ASB2 et ASB4 sont les seules souches qui ne présentent aucune croissance, tandis
que les autres souches présentent une bonne croissance à cette température, avec un degré
moins important pour les deux souches ASB14 et ASB18.
A 40°C la souche ASB11 présente une bonne croissance, tandis qu’elle est légèrement
affectée pour les souches ASB1, ASB3, ASB5, ASB6, ASB7, ASB8, ASB9, ASB10, ASB11,
ASB12, ASB13, ASB15, ASB16, ASB17 est totalement inhibée pour les souches ASB2,
ASB4, ASB14 et ASB18.
La capacité des souches de rhizobium à croître à 40 °C a été déjà démontrée par Zarhari et al.,
en 2000 pour des souches isolées à partir de 4 espèces d’Acacia : A. seyal, A. tortilis,
A. senegal et A. saligna.
A 45 °C la croissance n’est observée que chez trois isolats ASB9, ASB11, ASB16.
La majorité des souches présentent une résistance à une température supérieure ou égale à
40°C, ce résultat peut être expliqué par le fait que ces souches ont été isolées d’une région
V Résultats et discussion
Page 42
présentant des périodes d’aridité. En effet, Cacciari et al., (2003) ont conclu que la
température de croissance des rhizobiums varie en fonction de l’espèce et de la région
d’isolement. Et pour ce qui est de la croissance des rhizobiums à des températures élevées
plusieurs travaux ont rapporté que certaines souches isolées des légumineuses ligneuses au
Kenya, en Inde et au Pakistan peuvent croître à des températures variant entre 44 °C et 50 °C
(Zahran, 1999). Des résultats similaires ont été aussi signalés par Cacciari et al., (2003) qui
ont montré que certaines souches de rhizobium isolées d’Acacia tortilis subsp. raddiana
provenant du Sénégal peuvent croître à 45 °C.
On remarque que certaines souches préfèrent des températures basses et sont sensibles aux
températures élevés tel que les deux souches ASB2 et ASB4, d’autres au contraire sont
sensibles aux températures basses et préfèrent des températures élevés, un troisième groupe de
souches peuvent croitre aux températures extrêmes, elles présentent donc un intérêt pour la
sélection.
3.2. Effet du pH :
Ce test permet de déterminer le pH optimal de croissance des différents isolats, ainsi que les
pH extrêmes auxquels ils peuvent croître.
On remarque que les deux souches ASB5 et ASB12 présentent une bonne croissance dans
l’intervalle de pH de 3 à 12 (Figure 20 et 21).
La souche ASB7 présente une bonne croissance dans l’intervalle de pH de 3 à 11.
La souche ASB1 présente une bonne croissance allant de pH 4 jusqu’au pH 11.
Les autres souches présentent une bonne croissance dans un intervalle de pH 5 à 11 sauf pour
la souche ASB18 qui est de pH 6 à 11.
Singleton (1999), Young et al., (2001) ont montré que le pH optimal de croissance des
rhizobiums est compris entre 6 et 7, alors que celui de nos isolats se situ dans l’intervalle de
5 à 11 pour la plupart des souches (Tableau n°04). Selon Beunard en 2007 (communication
personnelle) la croissance des souches à cette gamme de pH au laboratoire ne signifie pas
forcément que ces souches peuvent croître à des pH aussi basique (pH 11) et acide (pH 5)
dans la nature.
Nos résultats sont en corrélation avec d’autres travaux, en effet, Zahari et al., (2000) ont
rapporté que certaines souches isolées d’Acacia saligna et Acacia tortilis supportent des pH
bas de l’ordre de 4, Watkin et al., (2003) ont aussi rapporté qu’une souche de Rhizobium
leguminosarum biovar trifolii peut croître à un pH de 3,5.
Tandis que Kulkarni et al., en 2000 ont montré que des souches de Rhizobium peuvent croître
jusqu’à des pH de12.
V Résultats et discussion
Page 43
Figure 20 : Aspect de la souche ASB5 à pH 3 après 48 h d’incubation à 28°C
Figure 21 : Aspect de la souche ASB5 à pH 12 après 48 h d’incubation à 28°C
V Résultats et discussion
Page 44
3.3. Effet de la salinité :
La salinité réduit la survie et la distribution des rhizobia dans le sol et la rhizosphère (Tate,
1995 ; Jenkins et al., 1989), elle affect également le processus de nodulation ainsi que la
fixation symbiotique de l’azote (El-Sheikh et Wood, 1995), Néanmoins, cet effet diffère selon
que les souches de rhizobia présentes dans le sol sont sensibles ou tolérantes au sel (Kumar et
al., 1999).
Dans le but de sélectionner les souches les plus tolérantes à la salinité destinées à la
production d’inoculum, et pour déterminer le seuil de tolérance de nos isolats vis-à-vis du
NaCl, nous les avons cultivés sur milieu YEM avec différentes concentrations de NaCl.
D’après les résultats obtenus on remarque que les souches ASB7, ASB10 et ASB18 sont les
moins tolérantes au sel, en effet une faible croissance est observée à une concentration de 2 %
(350 mM) de NaCl.
Par contre, les isolats ASB9, ASB11, ASB14, ASB15 et ASB16 peuvent croître à une
concentration de 3% (400 mM) de NaCl et les souches ASB1, ASB2, ASB3, ASB4, ASB5,
ASB6, ASB8, ASB12, ASB13, ASB17 peuvent croitre jusqu’à une concentration de 5% de
NaCl (Figure 22, 23 et 24, 25).
Malgré la provenance des différents isolats de la même plante hôte, leur réaction vis-à-vis du
sel diffère. Cette variabilité s’observe non seulement entre deux espèces différentes de
rhizobium mais aussi entre deux souches d’une même espèce isolées à partir d’une même
plante hôte (Bekki, 1983). Serraj et al., (2004) ont montré que la sensibilité des souches de
rhizobiums à la salinité varie d’une souche à l’autre.
La vitesse de croissance des rhizobia intervient dans la tolérance à la salinité, El-Sheikh et
Wood (1995) ont observé que des souches de rhizobia isolées du pois chiche et à croissance
rapide sur milieu de culture, étaient plus tolérantes à la salinité que celles à croissance lente.
Ce qui peut expliquer la tolérance de nos souches à de forte concentration de sel.
La plupart de nos isolats sont plus tolérantes au sel comparés à certaines souches de
Sinorhizobium americanus isolées à partir d’Acacia spp qui ne présentent aucune croissance à
300 mM de NaCl (Toledo et al., 2003).
Quoique cette tolérance reste faible comparant à des souches de rhizobium isolées d’Acacia
saligna et Acacia karoo qui peuvent tolérer une concentration allant jusqu’à 8% de NaCl
(Mohamed et al., 2000).
V Résultats et discussion
Page 45
Figure 24: La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM incubé pendant 48h
à 28°C
Figure 23: La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM salé à 2% (350Mmol)
incubé pendant 48h à 28°C
Figure 22: La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM incubé pendant
48h à 28°C
Figure 25: La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM salé à 3.5% (500Mmol)
incubé pendant 48h à 28°C
V Résultats et discussion
Page 46
4. Séquençage partiel du gène 16S :
Les résultats du séquençage partiel du gène 16S de nos souches révèlent une certaine diversité
malgré le nombre limité des souches identifiées, certaines légumineuses dites à large spectre
d’hôte acceptent plusieurs espèces de rhizobia, c’est le cas des Acacia (Lewin et al., 1987, de
Lajudie et al., 1994 ; de Lajudie et al., 1998 ; Nick et al., 1999). On note qu’Acacia saligna
nodule avec quatre genres différents de BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) :
Rhizobium, Sinorhizobium, Devosia et Phyllobacterium. Cependant toutes les souches
identifiées sont des souches à croissance rapide, la nodulation des Acacia avec des souches à
croissance rapide a été rapporté par plusieurs auteurs (Lal et Khanna, 1993 ; Ndoye et al.,
1995).
On peut rapporter cependant qu’une souche identifiée comme appartenant au groupe des
BNL : ASB1 est nod-, ceci peut être du à la perte du plasmide où siège les gènes de
nodulation (Martinez-Romero, 1994). En effet selon Rosenberg et al., 1981 ; Appelbaum et
al., en 1985, les gènes nod de la plupart des Rhizobium à croissance rapide sont localisés sur
un grand plasmide appelé pSym.
Autre phénomène intéressant noté pour les souches ASB4 et ASB11 appartenant au genre
Azospirillum et Devosia respectivement qui sont nod+, on ne peut valider ces résultats
qu’après un séquençage des souches isolées à partir des nodules formés.
V Résultats et discussion
Page 47
Tableau n°04: Les résultats du test de nodulation, effet des différents facteurs édaphiques et le séquençage partiel du gène 16S des souches isolées
T°C : Température, NI : Non identifiée, Nod- : Absence de nodules, Nod+ : Présence de nodules.
Facteurs édaphiques Souches Test de
nodulation T°C pH Sel %
Identification
moléculaire
ASB1
Nod-
10 - 40
4 - 11
5
Rhizobium sp.
ASB2
Nod-
07 - 30
5 - 11
5
NI
ASB3
Nod+
10 - 40
5 - 11
5
Rhizobium sp.
ASB4
Nod+
07 - 30
5 - 11
5
Azospirillum lipoferum
ASB5
Nod+
10 - 40
3 - 12
5
Sinorhizobium sp.
ASB6
Nod-
10 - 40
5 - 11
5
NI
ASB7
Nod+
10 - 40
3 - 11
2
NI
ASB8
Nod-
10 - 40
5 - 11
5
Azospirillum sp.
ASB9
Nod+
07 - 45
5 - 11
3
Rhizobium sp.
ASB10
Nod-
10 - 40
5 - 11
2
NI
ASB11
Nod+
10 - 45
5 - 11
3
Devosia naptuniae
ASB12
Nod+
10 - 40
3 - 12
5
NI
ASB13
Nod+
10 - 40
5 - 10
5
Rhizobium sp.
ASB14
Nod-
10 - 35
5 - 11
3
NI
ASB15
Nod-
10 - 40
5 - 11
3
Phyllobacterium sp.
ASB16
Nod-
07 - 45
5 - 11
3
NI
ASB17
Nod-
10 - 40
5 - 11
5
NI
ASB18
Nod-
07 - 35
6 - 11
2
NI
V Résultats et discussion
Page 48
5. Inoculation des plantes en serre:
Après 4 mois de culture en pots sous serre une première observation est faite sur la croissance
des plantes inoculées avec les différentes souches comparées à celle des plantes témoins non
inoculées.
La croissance des plantes inoculées avec les souches ASB1, ASB2, ASB6, ASB8, ASB10,
ASB14, ASB15, ASB16, ASB17 et ASB18 est la même à celle des témoins (Figure 26), par
contre celle des plantes inoculées avec les souches ASB3, ASB4, ASB5, ASB7, ASB9,
ASB11, ASB12 et ASB13 est nettement améliorée par rapport aux témoins non inoculés
(Figure 27, 28 et 29).
Ensuite toutes les plantes sont déterrées pour vérifier la présence de nodules sur leurs racines ;
seule les plantes inoculées avec les souches ASB3, ASB4, ASB5, ASB7, ASB9, ASB11,
ASB12 et ASB13 présentent des nodules sur leurs racines, ce qui explique leur croissance qui
dépasse celle des plantes témoins.
Après avoir dessécher les parties racinaires et les parties aériennes des plantes nodulées et des
plantes témoins et les avoir pesées, on a analysé les résultats par le logiciel Statistica, une
analyse de variance à un facteur (effet souche sur le PSA et PSR des plantes) qui a révélé un
coefficient de corrélation P= 0.0001 (P<0.05) ce qui veut dire que l’effet souche est
significatif, confirme les observations visuelles faite sur la croissance des plantes, le
classement de moyenne de Newman & Keuls montre que les souches ASB3, ASB7 et ASB13
augmentent de manière significative le poids sec de la partie aérienne et celui de la partie
racinaire des plantes d’Acacia saligna (Annexe n°8).
V Résultats et discussion
Page 49
ASB7
Témoin
Figure 27 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB7 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé
Figure 26: Effet de l’inoculation avec la souche ASB17 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé
Témoin ASB17
V Résultats et discussion
Page 50
Témoin
ASB13
Figure 28 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB13 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé
Témoin ASB5
Figure 29: Effet de l’inoculation avec la souche ASB5 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé
V Résultats et discussion
Page 51
L’effet de l’inoculation sur la croissance des plantes hôtes varie en fonction des souches
bactériennes. Les résultats obtenus (Figure 30) montrent que dans la majorité des cas,
l’inoculation a amélioré favorablement le développement des parties aériennes et des parties
racinaires des jeunes plantes d’A. saligna. Avec la souche ASB5 la biomasse sèche de la
partie aérienne des plantes d’A. saligna atteint 0.1066 g par plante, soit une augmentation
d’environ 80% par rapport aux témoins.
L’effet positif des rhizobiums à été rapporté par plusieurs auteurs (Lal et Khanna, 1993 ;
Ndoye et al., 1995)
On a sélectionné trois souches ASB5 (Sinorhizobium sp.), ASB7 (n’a pas encore été
identifiée), ASB13 (Rhizobium sp.) qui présentent une bonne résistance "in vitro" aux pH
(allant de pH 5 jusqu’au pH10), à la température (40°C) et à la salinité (allant de 2% jusqu’à
5%) du milieu de culture. Ces souches une fois associées à la plante hôte, ont montré une
infectivité et une efficience importante, ce qui a permis l’amélioration de la nutrition azotée
des jeunes plantes d’A. saligna et par conséquent l’amélioration de leur croissance dans les
conditions contrôlées.
V Résultats et discussion
Page 52
6. Inoculation en pépinière :
Les résultats obtenu en pépinière montrent qu’il est important que la souche sélectionnée en
conditions contrôlées en serre et qui présentait de bonnes caractéristiques symbiotiques puisse
conserver ces propriétés une fois introduite dans le sol de la pépinière en plus de son pouvoir
compétitive vis-à-vis des souches indigènes.
On remarque qu’après quatre mois de croissance en pépinière, le pourcentage de survie des
plants inoculés avec la souche ASB7 est de 60% proche à celui du témoin qui est de 50%,
par contre celui des plants inoculés avec la souche ASB5 (Sinorhizobium sp.) est de 80% et
celui des plants inoculés avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.) est de 95%, en effet,
l`inoculation avec les deux souches ASB5 et ASB13 a diminué le taux de mortalité des plants
de 20 - 15% respectivement comparé à la souche ASB7 (non identifiée) (Figure 31).
Cependant, il n`a pas été noté une grande différence concernant la croissance en hauteur des
plants inoculés avec la souche ASB5 (12cm) et ceux inoculés avec la souche ASB7 qui est de
17cm comparé aux plants témoins non inoculés qui est de 13cm, tandis que la hauteur
moyenne des plants inoculés avec la souche ASB13 est nettement plus élevé 29 cm par
rapport aux témoins (Figure 32, Tableau n°5), il est clair que le paramètre de survie est plus
sensible à l’inoculation que le paramètre de hauteur moyenne.
L’état physiologique des plants est différent, les plants inoculés avec les deux souches ASB5
et ASB13 présentent des feuilles larges de couleur vert foncé contrairement à celles des plants
témoins et les plants inoculés avec la souche ASB7, elles sont moins large et de couleur
jaunâtre (Figure 33).
L’efficience des deux souches ASB5 et ASB13 en serre est confirmée en pépinière,
l’inoculation a amélioré significativement la croissance en hauteur et la nutrition azotée des
plants exprimé en un taux de survie élevé et un bon état physiologique des plants.
Néanmoins l’effet de l’inoculation avec la souche ASB5 a diminué en pépinière par rapport à
son effet en serre.
Le succès de l’inoculation avec ces deux souches s’explique par la bonne qualité de
l’inoculum, contrairement à l’inoculation avec la souche ASB7, l’échec est dû probablement
au phénomène de compétitivité ; des souches de rhizobiums natifs au sol utilisé en pépinière
qui doivent être peu efficientes ont colonisé le système racinaire des plants.
Nos résultats sont semblables à ceux obtenu par Galiana en 1990, qui a inoculé une espèce
d’Acacia australienne Acacia mangium avec la souche de Bradyrhizobium Aust 13c, cette
V Résultats et discussion
Page 53
souche avait un effet positif sur la croissance de l’espèce d’Acacia en pépinière mais qui
diminue avec le temps à cause du phénomène de compétitivité.
Tableau n°05 : Le pourcentage de survie et la hauteur moyenne des plants inoculés comparés aux plants
témoins non inoculés en pépinière
% de survie Hauteur
moyenne
Témoin 50% 13cm
ASB5 (Sinorhizobium sp.) 80% 12.5cm
ASB7 (non identifiée) 60% 17cm
ASB13 (Rhizobium sp.) 95% 29cm
Témoin Sinorhizobium sp. ASB7 Rhizobium sp.
Témoin ASB13
Figure 31: Effet de l’inoculation avec les différentes souches sur la croissance des plants d’A. saligna pendant 4mois en pépinière.
Figure 32 : La hauteur du plant témoin comparé à celui inoculé avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.)
6 cm
20 cm
V Résultats et discussion
Page 54
Figure 33: Le taux de survie des plants inoculés avec les trois souches comparés aux plants témoin en pépinière.
Tém
oin
AS
B7
AS
B13
(Rh
izob
ium
sp.)
AS
B5
(Sin
orh
izo
biu
m sp
.)
V Résultats et discussion
Page 55
7. Transfert des plants sur champs :
Les plants ont été transférés sur site dégradé de la sablière selon le dispositif décrit auparavant
(Figure 14) (Figure 34), après 4 mois de croissance, une observation a été faite sur la survie
et la croissance des plants. Les plants inoculés avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.)
présentent un taux de survie élevé et une croissance en hauteur améliorée par rapport aux
autres plants (Figure 35), ce résultat reste à confirmer après 6 mois de croissance des plants
sur la sablière avec une étude statistique.
Figure 34 : La plantation d’Acacia saligna suivant le protocole décrit auparavant
Photo prise en Novembre 2007
Figure 35 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.) sur A. saligna après 4 mois de croissance sur site de la sablière
Photo prise en Janvier 2008
VI Conclusion & perspectives
Page 56
Conclusion & perspectives
Dans le but de revégétaliser la Sablière de l’Ouest dans la région de Mostaganem et de lutter
contre l’érosion éolienne très fréquente dans la région, un couple Acacia - Rhizobium
performant est proposé, parmi les 18 souches spécifiques à Acacia saligna qui ont été isolées,
seuls deux candidats ont été retenus.
Cette étude a montré que Acacia saligna, plante fixatrice des dunes littorales est nodulée
préférentiellement par des souches à croissance rapide, les souches identifiées appartiennent
aux différents genres ce qui nous a permis d’enrichir la collection du laboratoire. Ces
dernières présentent une bonne résistance in vitro à la température jusqu’à 45°C, aux pH
allant de 4 à 11 et à la salinité jusqu’à 5%.
Parmi ces souches, trois sont sélectionnées pour des essais en pépinière et sur champs : ASB5
(Sinorhizobium sp.), ASB13 (Rhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée). Elles présentent en
effet une bonne efficience (formation de nodules et fixation d’azote) en conditions contrôlées
qui se traduit par une amélioration de la nodulation et de la croissance des plants, en plus de
leur résistance aux conditions extrêmes.
Par ailleurs, après quatre mois de croissance en pépinière, deux souches ont amélioré la
nodulation et la croissance des plants : Rhizobium sp. et Sinorhizobium sp.
A noté que l’effet positif de la souche Rhizobium sp. persiste même après transfert des plants
sur site dégradé de la sablière.
Nous pouvons donc conclure que le couple A. saligna- ASB13 (Rhizobium sp.) peut être
proposé au département forestier pour un programme de revégétalisation ou de fixation des
dunes côtières ; en plus de sa résistance aux conditions extrêmes et de son efficience, cette
souche a prouvé sa compétitivité face aux souches indigènes.
L’introduction d’Acacia saligna inoculés par les souches sélectionnées à été un réel succès et
offre de véritables potentialités pour de futures plantations à plus grande échelle destinée à la
revégétalisation des sablières et à la fixation des dunes littorales.
Ce travail sera complété par une analyse statistique des résultats sur champs puis un
réisolement des souches à partir des nodules des plants inoculés afin de tester la pérennité des
souches introduites et leur compétitivité vis-à-vis des souches autochtones.
Références bibliographiques
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Références bibliographiques
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Annexes
ANNEXES
Annexe 1 : Analyses physicochimiques du sol
a. Analyse granulométrique :
La granulométrie a été déterminée par la méthode internationale à la pipette de
Robinson.
- Dans un bécher de 600 ml, mettre 15g de terre fine séchée et tamisée.
- Ajouter 50 ml de l’eau oxygénée (H2O2) à 20 volumes.
- Recouvrir le bécher afin d’éviter les projections pendant la période de
l’effervescence.
- Mettre le bécher sur un bain de sable dont la température ne dépasse pas 85°C
Si une ébullition trop forte se manifestait, l’eau oxygénée se décompose très
rapidement.
Si la terre est humifère l’effervescence peut produire une mousse abondante risquant
de déborder, ce phénomène peut être évité en ajoutant quelques gouttes d’alcool
éthylique.
A la fin défervescence, faucher pendant 2 h pour éliminer l’H2O2 en excès et terminer
par 10 min d’ébullition (on peut accélérer l’élimination de l’excès d’eau oxygénée en
ajoutant quelques gouttes d’ammoniaque).
- S’assurer que toute l’eau oxygénée a disparu en versant quelques gouttes du
liquide chaud 60°C dans une solution de permanganate de potassium, en
présence d’eau oxygénée le permanganate de potassium se décolore.
- Laisser refroidir puis transvaser à l’aide d’un jet de pissette dans un flacon de
sédimentation à large ouverture et jaugé de 750 ml.
- 15 ml d’hexaméthaphosphate de sodium 50 g/l. Cette solution alcaline a pour
rôle de disperser les particules qui ont tendance à s’agglomérer.
- Compléter avec de l’eau déminéralisée jusqu’au trait de jauge 750 ml.
- Agiter le flacon durant une heure sur un agitateur magnétique.
- Porter le flacon à proximité de la pipette de Robinson qui doit être placée dans
une pièce à température constante.
Annexes Pour le mélange des argiles, des limons fins et des limons grossiers :
- Maintenir la température à 20°C, agiter immédiatement par retournement
répété de manière à mettre en suspension toute la terre.
- Laisser décompter pendant 20 secondes.
- Prélever au bout de 46 secondes, à 10cm de profondeur 10ml de liquide.
- Porter la capsule dans une étuve à dessiccation à température 105°C.
- Après évaporation totale, peser la capsule et son contenu sec.
- Par différence avec le poids de la capsule vide, déterminer le poids P1 de
sédiment.
(Argile + limons fins + limons grossiers + hexaméthaphosphate de sodium) contenu
dans 10 ml de suspension.
Pour le mélange des argiles et des limons fins :
- Après agitation et retournement du liquide, laisser déposer durant 4 min.
- Effectuer le prélèvement de 10 ml à une profondeur de 10 cm après la
sédimentation.
- Transvaser le prélèvement dans une capsule en verre pyrex.
- Faire évaporer puis peser la capsule.
- Par différence avec le poids de la capsule vide, déterminer le poids P2 du
sédiment (Argile + limon fin + hexaméthaphosphate de sodium) contenu dans
10 ml de suspension.
Pour l’argile :
- Agiter et laisser sédimenter 8h.
- Effectuer le prélèvement de 10 ml.
- Peser comme précédemment P3 (Argile + hexaméthaphosphate de sodium)
dans 10 ml de suspension.
- Verser 15 ml d’ hexaméthaphosphate de sodium dans un flacon gaugé de
750 ml.
- Agiter puis faire un prélèvement à la pipette Robinson comme précédemment.
- Transvaser le prélèvement dans une capsule en verre pyrex.
- Faire évaporer puis peser la capsule et son contenu sec.
- Déterminer comme précédemment le poids correspondant à la surcharge en
hexaméthaphosphate de sodium contenu dans 10 ml de suspension.
- D’après les pesées P1, P2, P3, calculer les taux des Argiles, limons fins et
limons grossiers.
Annexes
- Tamiser et peser les sables fins et sables grossiers, pour les sables grossiers
utiliser un tamis de 200 µm et pour les sables fins un tamis de 50µm.
b. Dosage du calcaire total :
Déposer 1g de sol séché à l’air, dans un flacon puis remplir l’appendice latérale du
flacon avec 5 ml de HCl 0.5N, après avoir lier le flacon au calcimètre de Bernard
amener au zéro les niveaux de l’eau dans la colonne et dans l’ampoule, verser
l’acide sur l’échantillon, ensuite à l’aide de l’ampoule, rétablir le niveau et lire le
volume de CO2 dégagé (en cm3), une foie le dégagement du CO2 terminé, baisser
l’ampoule du calcimètre jusqu’à ce que le niveau de cette dernière soit dans un
même plan horizontal que celui dans la colonne, enfin déposer 1g de CaCO3 pur
pour l’étalonnage de l’appareil tel qu’il provoque un dégagement gazeux.
c. Dosage du calcaire actif :
Peser 10g de sol séché à l’air, les introduire dans un flacon de 500ml et y ajouter
250 ml de la solution d’oxalate d’ammonium (NH4)2C2O4 à 0.2N, agiter durant
2h, ensuite filtrer la solution en rejetant les premier ml du filtrat.
Prélever 10ml du filtrat qui sera versé dans un bécher de 100ml, ajouter à ce
dernier 10ml de H2SO4au 1/10, ensuite porter le contenu du bécher à une
température de 60°C, puis placer le bécher sur un agitateur magnétique surmonter
d’une burette graduée contenant le permanganate de potassium KMnO4 en
solution décimale, le titrage par le permanganate se fait jusqu’à l’obtention d’une
couleur rose persistante, soit n le nombre de ml de KMnO4 versé.
Titrer de la même façon 10ml de la solution d’oxalate d’ammonium utilisée, soit
N le nombre de KMnO4 versé pour le témoin.
d. Dosage du carbone total et de la matière organique :
- Utiliser un sol finement broyé et passé au tamis (0.2 mm).
- Peser 0.25g de sol, introduire la prise dans un ballon pyrex avec réfrigérant
ascendant, ajouter 10 ml de solution de bichromate à 8% et 15 ml d’acide
sulfurique H2SO4 pure.
- Porter 5 min à l’ébullition douce.
- Laisser refroidir puis transvaser dans une fiole jaugée de 200 ml, laver trois
fois à l’eau distillée, verser dans un bécher de 250ml.
- Diluer à 200ml.
- Ajouter 1.5g de fluorure de sodium (FNa) en poudre par ml d’acide sulfurique
H2SO4 plus 3 à 4 gouttes de diphénylamine puis titrer l’excès de bichromate
Annexes
avec une solution de Mohr à 0.2N (la couleur passe du bleu foncé au
bleu-vert).
Les calculs :
1g de bichromate 0.2N oxyde 0.615mg de carbone (C)
Effectuer un témoin avec du sable stérile calciné, soit
n : la quantité de sel de Mohr versé
n´ : la quantité de sel de Mohr correspondant à l’échantillon.
C% = ( n-n´) x 0.615 x 100/ 1000
Pour obtenir le taux de la matière organique, multiplier C% par 1.72.
Annexe 2 : Le triangle de texture
Permet de classer les sols d’après leur composition granulométrique
Annexes
Annexe 3 : Les normes de salinité du sol ISS, htpp//www.iges-stb.org/pdf/dico_donesol2.pdf
1S/m = 104 µS/cm = 10 mS/cm = 103mS/m
(Normalisations françaises, afnor, 1986)
Annexe 4 : Milieu de culture YMA (Yeast Mannitol Agar) (Vincent, 1970).
Utilisé pour la culture courante des souches de BNL, sa composition en gramme par
litre est la suivante :
Extrait de levure …………………………………..1g Agar-Agar ………………………………………...15g Mannitol …………………………………………..10g KCl 1g FeCl3 0.02g Solution minérale de Bergersen 10 M…………..100ml : CaCl2,2H2O 0.53g Bergersen (1961) Na2HPO4,12H2O 4.5g MgSO4,7H2O 1g H2O distillée 1000ml H2O distillée……………………………………….qsp 1000ml pH (6.9 –7)
Salinité (ECe : mS/CM) Salinité du sol Réponse des plantes
0 à 2 Non salé Pas d’impact sur la
croissance des plantes
2 à 4 Légèrement salé La croissance des plantes
sensibles peut être réduite
4 à 8 Moyennement salé La croissance de plusieurs
plantes est réduite
8 à 16 salé Bonne croissance des
plantes tolérantes au sel
>16 Très salé Bonne croissance des
plantes très tolérantes au sel
Annexes
Annexe 5 : Coloration de Gram
La coloration de Gram différencie les bactéries en deux groupes, celles qui retiennent
la première coloration (bactéries Gram- positives) et celle qui perdent la première
coloration et qui prennent la couleur de la contre- coloration (Gram- négatives).
Au cours de la coloration Gram, on utilise 4 réactifs : un colorant pour la première
coloration, l’iodure de potassium, un décolorant, et un contre-colorant.
La paroi des bactéries Gram positifs se distingue de celle des Gram-négatifs par la
présence de l’acide muramique.
Les étapes du protocole sont les suivant :
Les cellules sont fixées à la flamme. Ensuite le violet de Genciane est ajouté (20 sec).
Les bactéries se colorent alors en violet. Le colorant et par la suite fixé à l’aide du
Lugol (Iodure de potassium KI). La préparation est abondamment rincée à l’eau du
robinet afin d’éliminer l’excès de colorant. La préparation est décolorée (l’éthanol à
95° pendant 5 sec) et rincée de nouveau abondamment à l’eau de robinet. Puis, une
recoloration avec de la Fuschine acide est réalisée (30 sec). De nouveau, la
préparation est rincée à l’eau et séchée à une température ambiante. L’observation
microscopique permet de voir si les cellules sont colorées en violet (Gram-positives)
ou bien en rose (Gram-négative).
Annexe 6 : Eau gélosée (0.8%)
Agar-agar…………....0.8 g
Eau distillée………....100 ml
Autoclavé pendant 20 min à 120°C.
Annexes
Annexe 7 : Solution nutritive pour la nodulation in vitro des Acacia. (Broughton &Dilworth, 1971)
Solutions stock
Formule chimique
Concentration
g/l
Volume de la solution stock/volume finale
ml/l 1 CaCl2 2H2O 294 0.5 ml 2 KH2PO4 196 0.5 ml 3 MgSO4 7H2O
K2SO4 MnSO4 H2O
126 87
0.338
0.5 ml
4 H3BO3 ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O CoSO4 7H2O
Na Mo O2 2H2O
0.247 0.288 0.100 0.056 0.048
0.5 ml
5 Na Fe_EDTA 0.734 0.5 ml Annexe 8 : Mc Farland n° 5 (15 x 108 UFC/ml) (NCCLS, 2000)
BaCl2 (1.175%)…………… 0.5 ml
H2SO4…………………….. 9.5 ml
Composition des standards de turbidité de McFarland
Standard de turbidité numéro
Dihydrate de chlorure de baryum (1,175 %), en ml
Acide sulfurique (1 %), en ml
Densité approximative correspondante de
bactéries/ml 0,5 0,5 99,5 1.108 1 0,1 9,9 3.108 2 0,2 9,8 6.108 3 0,3 9,7 9.108 4 0,4 9,6 12.108 5 0,5 9,5 15.108 6 0,6 9,4 18.108 7 0,7 9,3 21.108 8 0,8 9,2 24.108 9 0,9 9,1 27.108 10 1 9,0 30.108
Annexes
Annexe 9 : Analyse statistique avec le logiciel Statistica de l’effet
souche sur la croissance (Poids Sec des Parties Aériennes et Poids Sec
des Parties Racinaires) des plantes en serre
Type III Sums of Squares
Source
df
Sum of
Squares
Mean
Square
F-Value
P-Value
Souche 8 ,002 2,105E-4 8,560 ,0001
Residual 36 ,001 2,459E-5
Dependent: PSPR (g)
Means Table
Effect: Souche
Dependent: PSPR (g)
Count Mean Std. Dev. Std. Error ASB10
5 ,004 ,004 ,002
ASB11
5 ,013 ,006 ,003
ASB12
5 ,010 ,006 ,003
ASB13
5 ,006 ,006 ,003
ASB3
5 ,016 ,009 ,004
ASB4
5 ,002 ,001 ,001
ASB7 5 ,021 ,005 ,002
ASB9 5 ,010
,010 ,001
Témoin 5 ,004
,002 ,001
Annexes
Student-Newman-Keuls
Effect: Souche
Dependent: PSPR (g)
Significance level: ,05
Type III Sums of Squares
Source
df
Sum of
Squares
Mean
Square
F-Value
P-Value
Souche 8 ,045 ,006 18,397 ,0001
Residual 36 ,011 3,049E-4
Dependent: PSPA (g)
Means Table
Effect: Souche
Dependent: PSPA (g)
Count Mean Count Mean
ASB4 5 ,002
ASB10 5 ,004
Témoin 5 ,004
ASB13 5 ,006
ASB9 5 ,010
ASB12 5 ,010
ASB11 5 ,013
ASB3 5 ,016
ASB7 5 ,021
Count Mean Std. Dev. Std. Error ASB10
5 ,013 ,003 ,001
ASB11
5 ,093 ,015 ,006
ASB12
5 ,057 ,017 ,008
ASB13
5 ,036 ,021 ,009
ASB3
5 ,039 ,026 ,012
ASB4
5 ,013 ,010 ,005
ASB7
5 ,107 ,008 ,004
ASB9
5 ,048 ,027 ,012
Témoin
5 ,020 ,015 ,007
Annexes Student-Newman-Keuls
Effect: Souche
Dependent: PSPA (g)
Significance level: ,05
Count Mean Count Mean
ASB10 5 ,013
ASB4 5 ,013
Témoin 5 ,020
ASB13 5 ,036
ASB3 5 ,039
ASB9 5 ,048
ASB12 5 ,057
ASB11 5 ,093
ASB7 5 ,107
RÉSUMÉ
Dans le but de sélectionner un couple symbiotique Rhizobium- Acacia saligna performant
pour la revégétalisation de la Sabliere de l’Ouest situé dans la région de Mostaganem et la
fixation des dunes littorales, 18 isolats ont été obtenus à partir des nodules racinaires
d’Acacia saligna. Ces isolats présentent une morphologie comparable à celle des rhizobia
connus, et une bonne résistance à la température jusqu’à 45°C , à la salinité jusqu’à 5% et au
pH allant de pH 4 à pH 11, sur ceux 3 souches sont sélectionnées ASB13 (Rhizobium sp.),
ASB5 (Sinorhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée) pour être utilisé comme inoculum sur la
base de leur efficience en condition contrôlées (capacité à former des nodules et à fixer de
l’azote atmosphérique) et de leur résistance aux conditions extrêmes. Ces inocula
performants en condition de laboratoire sont inoculés à de jeunes plants en pépinière. Après
4 mois il a été noté l’effet positive des deux souches l’une appartient au genre
Rhizobium sp. et l’autre au genre Sinorhizobium sp. sur la croissance des plants d’Acacia
saligna, puis ces derniers sont transférés sur la sablière et sont divisés en deux lot, le
premier réinoculé contrairement au second. Les souches sont jugées sur leur persistance
sur le terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes. La souche
qui appartient eu genre Rhizobium sp. a montré une efficacité très élevée pour la croissance
et la nutrition azotée des jeunes plants d’Acacia saligna après 4 mois de transplantation sur
site dégradé de la sablière.
Mots clés :
Revégétalisation, Sablière, Dunes littorales, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation.