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Faculté des Sciences et Techniques de Rouen
Site de Mont Saint Aignan
Master Biologie Santé Spécialité Imagerie Pour La Biologie
Année universitaire 2009‐2010
Fabien LEGRAND
Mise en place d’un protocole de visite de maintenance annuelle
Montpellier RIO Imaging
Plate‐forme Régionale d’Imagerie
Institut de Génétique Humaine
Directeur technique de la plate‐forme : Dr. Pierre Travo
Directeur scientifique de la plate‐forme : Edouard Bertrand
Maître de stage : Dr. Julien Cau
Faculté des Sciences et Techniques de Rouen
Site de Mont Saint Aignan
Master Biologie Santé Spécialité Imagerie Pour La Biologie
Année universitaire 2009‐2010
Fabien LEGRAND
Mise en place d’un protocole de visite de maintenance annuelle
Montpellier RIO Imaging
Plate‐forme Régionale d’Imagerie
Institut de Génétique Humaine
Directeur technique de la plate‐forme : Dr. Pierre Travo
Directeur scientifique de la plate‐forme : Edouard Bertrand
Maître de stage : Dr. Julien Cau
Remerciements
Je remercie Julien de m’avoir accueilli au sein du plateau d’imagerie de l’IGH, de son
soutien, de sa disponibilité, son savoir ainsi que tous les précieux conseils et qu’il a pu me
donner au cours de son stage. Je le remercie aussi pour sa gentillesse et sa bonne humeur.
Sa perspicacité, son dynamisme et sa rigueur ont été indispensables pour que ce travail
puisse aboutir.
Je souhaite remercier également Nicole pour ses conseils, sa gentillesse et sa bonne
humeur continuelle.
Bien évidemment je n’oublie pas non plus les membres des autres plateaux
techniques qui m’ont aussi conseillé et appris énormément.
Enfin je souhaite bonne chance à Luc pour son entré au sein du Master Imagerie pour
la Biologie en septembre et lui souhaite une bonne continuation.
Sommaire
Abréviations…………………………………………………………………………………………………………………….......0
I. Introduction………………………………………………………………………………………………………………1
La plate‐forme MRI…………………………………………………………………………………………………..2
1. Structuration de la plate‐forme…………………….……………………………………………….3
2. Les Plateaux Techniques………………………………………………………………………………..4
3. Le Plateau MRI IGH Optique……………………………………….…………………………………5
4. Objectifs de l’étude…………………………………………………………………………………….…7
II. Développements techniques…………………………………………………………………………………….8
III. Résultats…………………………………………………………………………………………………………………11
1. Inspection visuelle des optiques………………………………………………………………….12
2. Homogénéité de champ………………………………………………………………………………12
3. Comparaison des détecteurs (microscope confocal)…………………….……………..13
4. Comparaison des dichroïques d’excitation (microscope confocal)....…………..14
5. Aberrations chromatiques – coalignement………………………………………………….14
6. Résolution latérale et axiale : Point Spread Function……………………………………15
7. Mesures de puissance (microscope confocal)………………………………………………16
8. Caractéristiques du CCD (microscope champ plein)…………………………………….16
IV. Discussion………………………………………………………………………………………………………………18
V. Conclusion………………………………………………………………………………………………………………27
Abréviations
AOTF: Acousto‐Optic Tunable Filter
CCD: Charge‐Coupled Device (capteur photographique)
CRBM : Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire
DBS : Département Biologie Santé
FWHM: Full Width at Half Maximum (largeur à mi‐hauteur du maximum du pic)
MRI : Montpellier RIO Imaging
IBiSA : Infrastructure en Biologie Santé et Agronomie
IGH : Institut de Génétique Humaine
IGMM : Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
INM : Institut des Neurosciences de Montpellier
IRB : Institut de Recherche en Biothérapie
IRCM : Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier
IURC : Institut Universitaire de Recherche Clinique
PHIV : Physiologie, Histologie et Imagerie Végétale
PSF : Point Spread Function
RIO : Réunion Inter‐Organisme
ROI : Région d’Observation d’Intérêt
RTMFM : Réseau Technologique de Microscopie photonique de Fluorescence Multidimensionnelle
Résumé
Mon stage de Master 2 "Imagerie pour la Biologie" s’est déroulé au sein de la plate‐
forme Montpellier RIO Imaging (MRI) et plus particulièrement sur le plateau technique MRI –
IGH (département Optique). MRI est une plate‐forme IBiSA, certifiée ISO 9001v2008 (LRQA)
dont la mission est de faciliter l’utilisation des méthodes et techniques d’imagerie pour
l’étude du vivant. Elle est constituée de différents départements qui regroupent différents
plateaux techniques, tous situés sur la ville de Montpellier.
L’objectif principal de ce stage a été de rédiger un protocole de visite de maintenance
annuelle et de le soumettre aux responsables techniques des différents plateaux du
département Optique. Ce protocole de visite de maintenance annuelle est venu en
complément d’un protocole de visite de maintenance mensuelle que chaque responsable
appliquait à son plateau technique. Le but a été d’uniformiser les visites de maintenance en
rédigeant un protocole unique que chaque responsable a utilisé pour faire sa visite de
maintenance annuelle. Deux versions ont été rédigées, une pour la microscopie confocale et
une autre pour la microscopie "champ plein" (widefield). L’objectif final a été de comparer
les différents systèmes présents sur la plate‐forme
D’autres objectifs secondaires m’ont été attribués au cours de cette période de stage
tels que la formation et l’assistance des utilisateurs désirant être formés sur tel ou tel
système, la rédaction de fiches descriptives d’allumage/extinction ainsi que la rédaction d’un
livret d’utilisation de certains systèmes et l’entretien et la maintenance des différents
systèmes présents sur le plateau technique.
Introduction
1
Figure 1 : Organigramme 2009 de la Plate‐forme MRI
La plate‐forme MRI (figure 1)
MRI est une plate‐forme IBiSA, certifiée ISO 9001:2008 dont la mission est de faciliter
l’utilisation des méthodes et techniques d’imagerie pour l’étude du vivant.
Elle est ouverte au secteur privé et au secteur public sans aucune condition thématique,
institutionnelle ou géographique. De la même manière, l'accès aux moyens de MRI n'est pas
conditionné par l'établissement d'une collaboration, sous quelque forme que ce soit.
Créée en 2003 pour assurer des services d’imagerie cellulaire par microscopie optique, MRI a
connu une diversification importante. Le soutien qu’elle offre aujourd’hui consiste d’une
part en la mise à disposition de 59 stations de travail. Ces postes sont entretenus par des
ingénieurs dédiés qui en assurent la maintenance et l’évolution, via une veille technologique
permanente. D’autre part, ces ingénieurs ont également la charge de la formation des
utilisateurs et éventuellement de leur assistance. Par ailleurs, les ingénieurs responsables
des différents plateaux techniques font également bénéficier les utilisateurs de leurs
expertise, conseils et mènent, pour le compte de ceux‐ci différentes études de faisabilité.
Une chargée de mission non affectée à un plateau (Figure 2, MRI‐UNION) prend en charge
les utilisateurs qui le souhaitent, de la définition de leurs besoins à l’analyse de leurs
résultats, en passant par le design expérimental et à la réalisation de leurs expériences.
Enfin, MRI mène des activités de Recherche et Développement en microscopie (avec la
création en 2011 d’une structure de R&D commune avec le Centre De Biochimie Structurale,
présentée en Figure 2), en analyse d’image, en outils de gestion à destination des utilisateurs
et solutions d’administration des plates‐formes.
Le personnel de la plate‐forme est réparti sur les différents plateaux techniques d’une part,
pour en assurer le fonctionnement quotidien. Ces ingénieurs de plateaux sont aidés dans
leur charge par des personnels non affectés aux plateaux, regroupés sous le terme MRI‐
UNION. La plate‐forme est dirigée par un responsable scientifique, anciennement le Dr. J‐M.
Blanchard et actuellement le Dr. E. Bertrand, reconnu au niveau national et international en
microscopie optique. Les activités « plateaux techniques » (en saumon dans la figure 1) et
« MRI‐UNION » sont sous la responsabilité actuelle du Dr. Pierre Travo. Le comité de pilotage
de MRI, composé des responsables des unités de recherche dont dépendent les utilisateurs,
2
Figure 2 : Départements et plateaux techniques
s’assure du bon fonctionnement de MRI, nomme les responsables scientifiques, « plateaux
techniques » et « MRI‐UNION » et prend les décisions clés.
1. Structuration de la plate‐forme :
Les moyens de la plate‐forme sont actuellement répartis sur 12 plateaux techniques
organisés en trois domaines méthodologiques : microscopie optique, cytométrie en flux et
tomographie à rayon X. Ces grands domaines regroupent le végétal et l’animal, l’agronomie
et la santé humaine. La répartition des plateaux techniques suit étroitement l’organisation
géographique des Laboratoires d'Appui de MRI et de leurs IFRs.
Un ensemble de services transversaux permet par ailleurs d’assurer le bon fonctionnement
des plateaux techniques et la gestion de la plate‐forme. Ainsi, sous le terme MRI‐UNION
(nommé ainsi car cette structure est le trait d’union entre les plateaux techniques), sont
regroupées les activités qui ne sont pas spécifiques d’un domaine méthodologique ou d’un
plateau technique.
Deux types d’activités sont à distinguer. D’une part des cellules d’administration et de
support direct au plateau :
• MRI‐Qualité est en charge du processus qualité mis en place depuis 2008. MRI est la
première plate‐forme d’imagerie cellulaire distribuée et certifiée ISO 9001 (version
2008). Le système qualité mis en place structure l’offre de services de MRI et permet
de s’assurer de son adéquation avec les attentes des utilisateurs. Il constitue un
puissant outil de management de la plate‐forme. Il bénéficie en particulier des
activités de la cellule MRI‐MCD (mesures, contrôles et Développement) qui met en
place les outils de métrologie et de suivi de la métrologie de MRI.
• MRI‐NET assure la gestion du parc informatique (stations de travail) et
l’administration systèmes et réseaux de MRI (environs 10 serveurs informatiques).
• La cellule de gestion, commune avec d’autres plates‐formes de l’IFR122, assure
l’administration (recettes et dépenses) de la plate‐forme. Elle bénéficie pour cela
3
d’un système original de tarification « au forfait par anticipation » directement inspiré de
la tarification instaurée par l'industrie téléphonique. MRI a par ailleurs développé des
moyens matériels et logiciels autorisant le contrôle au quart d'heure près et par
personne de l'utilisation de chacune de ses stations de travail où qu'elles se situent dans
Montpellier.
En plus de ces cellules assurant le bon fonctionnement de la plate‐forme, MRI a d’autre part
mis en place différentes structures destinées aux utilisateurs :
• MRI‐Formation regroupe, coordonne et organise les opérations de formations et
notamment celles menées en partenariats avec les Services de Formation des
Etablissements et Organismes publics et privés (environ 10 formations académiques
de 2 à 3 jours par an)
• MRI‐R&D conçoit, teste et met à disposition des outils originaux d’analyse d’image et
d’automatisation d’analyse d’image, de métrologie ou encore de gestion de base de
données images/mesures.
• De plus, deux services coordonnent les relations de la plate‐forme avec d’une part les
utilisateurs privés (MRI‐Industrie) et d’autre part le grand public et l’enseignement
supérieur (via sa cellule de médiation scientifique et la valorisation culturelle, MRI‐
MSVC). MRI‐Industrie entre en contact avec les entreprises, fait connaître les services
de la plate‐forme et cadre la prestation de service avec celles‐ci (contrat de
partenariat, accord de secret, etc.). La cellule MSVC organise différentes actions (TP
en ligne avec des lycéens, fête de la science, journées portes ouvertes des
universités).
• Enfin, une chargée de relation, présentée plus haut, assiste les responsables de
plateaux pour la métrologie d’une part et les études de faisabilité avec les utilisateurs
d’autre part.
2. Les Plateaux Techniques
Les plateaux techniques sont au nombre de 12 et sont répartis sur plusieurs sites,
tous situés sur Montpellier :
4
En Microscopie optique :
Plateau MRI CRBM Optique
Plateau MRI DBS‐UM2 Optique
Plateau MRI IGH Optique
Plateau MRI INM Optique
Plateau MRI LA Gaillarde Optique
Plateau MRI PHIV Optique
En Cytométrie :
Plateau MRI DBS‐UM2 Cytométrie
Plateau MRI IGH Cytométrie
Plateau MRI IGMM Cytométrie
Plateau MRI IRB Cytométrie
Plateau MRI IRCM Cytométrie
En Microtomographie RX :
Plateau MRI ISEM‐UM2
Chaque plateau est animé par un responsable de plateau, assisté sur certains sites par
d’autres personnes. Le personnel affecté au plateau assure l’accueil des utilisateurs publics.
En effet, chaque personne souhaitant utiliser une station de travail de façon autonome sur la
plate‐forme doit impérativement avoir été informé et accepter les règles formalisant la
prestation offerte par MRI. Le personnel évalue ensuite les besoins de l’utilisateur, procède
avec lui si nécessaire à des études de faisabilité et le forme ensuite le cas échéant à
l’utilisation autonome des stations de travail. Il continue ensuite à l’assister et le conseiller
dans l’acquisition des données et l’analyse de ses résultats.
3. Le Plateau MRI IGH Optique
Ce plateau, situé sur le Campus Arnaud de Villeneuve/IFR3, a été inauguré dans ses
nouveaux locaux de l’Institut de Génétique Humaine, le 5 mai 2009.
Le campus CNRS Arnaud de Villeneuve est un acteur majeur en Biosanté sur Montpellier et
regroupe l’Institut de Génétique Humaine (IGH), l’Institut de Génomique Fonctionnelle (IGF)
et le Centre de Biochimie Structural (CBS).
5
La structure qui l’héberge, l’IGH, est une unité propre de recherche du CNRS qui regroupe
principalement des équipes « dynamique du génome et de la chromatine », « génétique du
développement », « contrôle épigénétique » et « pathologies moléculaires et cellulaires ».
L’unité contiguë, l’IGF, est une unité mixte CNRS/INSERM/UM1, dont les thématiques sont
l’endocrinologie moléculaire, la neurobiologie, neurophysiologie et neuropharmacologie
ainsi que l’oncologie. Les principaux utilisateurs (environ 200) du plateau proviennent de ces
deux unités.
Le plateau MRI IGH Optique comprend 17 stations de travail sous la gestion de MRI. Les frais
de maintenance et de fonctionnement sont assurés par MRI sauf pour 3 stations dont les
frais sont assurés par l’IGH. Ces 3 stations sont en accès libre rapide et limité à 1h pour la
visualisation des échantillons avant de réserver une session d'acquisition.
Les 17 stations de travail présentes sur le plateau sont (annexe 1, 2 et 3) :
• Leica DM 6000‐1
• Leica DM 6000‐2
• Leica DMRXA Piezo
• Leica Macroconfocal LSI/PSE
• Leica SP2 Confocal
• Zeiss Axioimager Z1 Apotome
• Zeiss Axiovert 200M
• Zeiss LSM 510 META Confocal
• Zeiss LSM 780 Confocal
• Zeiss M2BIO Stéréomicroscope
• 4 stations d’analyse (IMARIS, Volocity, Image J, Metamorph, Huygens)
• Leica DMRA 2 (station en accès libre)
• Leica MZ2FL Stéréomicroscope (station en accès libre)
• Zeiss Axiovert40 (station en accès libre)
6
4. Objectifs de l’étude
L’objectif principal de mon stage a été de rédiger un protocole de visite de
maintenance annuelle sur l’ensemble des microscopes de la plate‐forme MRI (microscopes
confocaux et microscopes champ plein) et de mettre en œuvre ce protocole sur les stations
de travail du plateau MRI IGH Optique.
Les objectifs secondaires étaient d’une part de parfaire ma connaissance du fonctionnement
des microscopes acquise au cours de mon Master et d’autre part de découvrir et
appréhender tous les aspects liés au fonctionnement d’un plateau technique
d’imagerie/Microscopie Optique. Ces aspects seront discutés en fin de ce rapport.
7
Développements techniques
8
Le parc de microscopes optiques de la plate‐forme est entretenu, sur une base
formalisée dans le cadre de la certification ISO 9001, de façon mensuelle et bisannuelle. Les
visites mensuelles correspondent à un entretien des optiques, une vérification des réglages
simples (Koehler, homogénéité de champ) et le cas échéant une mesure des puissances
lumineuses délivrées par les appareils. Ces différents points ont été formalisés dans un
document qualité. Les visites annuelles prévues dans le cadre de la démarche qualité
reprennent logiquement un ensemble plus complet de mesures par rapport aux visites
mensuelles. Elles sont effectuées d’une part par un prestataire externe (en général le
fournisseur de microscope) et d’autre part, en interne, par un personnel MRI. L’intérêt de
cette dualité est d’avoir un regard extérieur sur la machine et de connaître les limites et les
défauts de son système.
Les points principaux des visites de maintenance annuelle internes étaient listés dans
un document qualité à mon arrivée. Il était nécessaire d’une part d’établir un protocole
détaillé de visite de maintenance adapté aux deux types de machines (microscopes
confocaux et microscopes champ plein) et d’autre part d’insérer ce protocole et les résultats
obtenus dans le cadre de notre démarche qualité et définir des valeurs charnières
déclenchant des mesures correctives éventuelles.
L’établissement des protocoles de maintenance annuelle confocaux/champ plein
s’est fait initialement sur la base des travaux du Réseau Technologique RTmfm (microscopie
de fluorescence multidimensionnelle). La première étape a été de rédiger une version
initiale de ce protocole avec un autre plateau similaire dans ses équipements (MRI‐CRBM,
localisé sur l’autre campus CNRS de Montpellier). J’ai ensuite soumis cette version, lors
d’une présentation orale, aux 6 plateaux techniques de microscopie de MRI. Au cours de
cette réunion, les commentaires et les remarques des différents responsables de plateaux
ont été pris en compte afin d’éditer une nouvelle version du protocole. Enfin, cette dernière
version a subi quelques changements au fil des discussions avec les différents fournisseurs
de la plate‐forme (Zeiss, Leica) afin de la rendre plus cohérente avec les mesures effectuées
lors des visites annuelles externes. Avoir l’adhésion de tous était important afin d’obtenir
une implication égale du personnel et de pouvoir obtenir des éléments de comparaison au
sein même du parc matériel de notre plate‐forme et détecter d’éventuels défauts de
fonctionnement qui auraient pu paraître « normaux ».
9
Enfin, une version a été remise à chaque responsable de plateaux du département afin qu’ils
puissent débuter la visite de maintenance annuelle sur leur plateau. Je leur ai également
remis une proposition de valeurs charnières de mesures, établie avec mon responsable de
stage. A chaque valeur charnière proposée était associée une mesure corrective potentielle.
Nous discuterons en septembre, une fois toutes les visites effectuées, de la pertinence de
ces valeurs et les modifieront en adéquations avec l’ensemble de nos résultats. Par ailleurs,
le matériel nécessaire pour l’utilisation de ce protocole a été fourni aux différents plateaux
techniques. Ce matériel comprend des lames FluoRef en plastique dans lequel le fabricant à
inséré dans la masse un fluorochrome et des préparations de lames Tetraspeck de taille
variable (0.2 et 4 µm et marquées en superficie ou en profondeur avec 4 fluorochromes).
Chaque plateau est équipé d’un mesureur de puissance lumineuse et d’une sonde adaptée
aux longueurs d’onde mesurées. Enfin, nous avons mis à disposition la collection de plugins
ImageJ « MetroloJ » développée par le RTmfm et F. Cordelières /C. Matthews et la macro
CCD.txt. J’ai aidé certains responsables de plateaux dans l’installation et l’utilisation de ces
outils.
J’ai ensuite collecté, dans la mesure du possible, les résultats obtenus afin de valider
les protocoles, comparer les différents systèmes entre eux et revoir les valeurs charnières
proposées. Mon travail permettra dans un second temps de suivre l’évolution de ces
systèmes au cours du temps et servira de base de départ pour le stockage en ligne des
mesures effectuée et la gestion centralisée des actions correctives. En effet, dans un futur
proche, une solution en ligne appelée « OPTIMU » (et développée par DELTA MU), qui est un
logiciel de gestion de parc d’instruments de mesure, d’assistance à l’étalonnage et de calculs
d’incertitudes, nous permettra d’entrer les valeurs mesurées lors des visites. Une alerte
automatique et une indication des mesures correctives à suivre seront indiquées
automatiquement. Cet outil de centralisation, automatisé, permettra une meilleure gestion
du parc matériel, en cohérence avec le souci d’offrir une prestation de la meilleure qualité.
Par ailleurs, dans le cadre du processus métier/matériel, il permettra au pilote de ce
processus une connaissance globale du parc.
10
Résultats
11
Figure 3: Field illumination report generator
Figure 4: Résultats fournis en document pdf
Vous trouverez en annexe libre, les 2 protocoles (microscopie champ plein et microscopie
confocal) qui ont été fournis aux responsables des plateaux techniques afin qu’ils mettent en
place leurs visites de maintenance annuelle, ainsi qu’un exemple de fiche annuelle de
résultat que j’ai obtenu. Le protocole fixe les paramètres communs aux différentes machines
du plateau. Comme indiqué dans le protocole, la fiche fixe les paramètres spécifiques de
chaque machine (type d’objectifs, de filtres, etc.).
1) Inspection visuelle des optiques
Les performances d’un objectif ou d’un filtre sont étroitement liées à sa propreté. Nous
avons uniformisé l’inspection et le nettoyage des optiques sur les différents plateaux. Pour
ce faire, un kit de nettoyage a été fourni à chaque responsable. Il comprend des écouvillons
BASAN®, du papier Whatman® (Schleicher & Schuell) et du nettoyant optique Zeiss. Ce kit
permet le nettoyage des objectifs, du condenseur mais aussi des cubes de filtre. Un simple
nettoyage à l’œil nu ne permet pas de détecter d’éventuels défauts et n’est pas un gage de
nettoyage efficace. Il est important d’observer et de nettoyer les composants optiques sous
une loupe binoculaire afin d’éliminer toutes traces d’huile ou de poussières et de vérifier
l’état de ces composants. Les défauts non nettoyables sont consignés dans la base de
donnée en ligne « GLPI/périphériques » (environ 1200 pièces), avec la date de l’observation
du défaut dans le champ commentaire.
2) Homogénéité de champ
La fiabilité des mesures d’intensité de fluorescence nécessite que l’excitation des
fluorochromes soit la plus homogène possible dans le champ de vision/acquisition. Le
matériel requis pour vérifier la bonne homogénéité de champ est une lame
FluoRef/catégorie de fluorochromes (bleus, verts, orange/rouge et rouge profond). La
vérification de l’homogénéité sur l’ensemble du champ est à effectuer pour tous les objectifs
et pour les quatre raies (microscopie confocale) ou cubes (microscopie champ plein)
correspondant aux lames. Plusieurs points doivent être pris en considération avant de
commencer : pour les microscopes confocaux, il faut aligner les pinholes (si possible) avec
une lame miroir et essayer de garder le même miroir dichroïque primaire/secondaire afin
d’avoir le moins de variation possible dans le trajet optique, pour les microscopes champ
plein, il est nécessaire de procéder à un alignement de la lampe (boîtiers sources non fibrées
12
Figure 5 : CV report generator
Figure 6 : Résultats fournis en document pdf
centrables manuellement).
Les paramètres d’acquisition doivent être réglés comme décrit dans le protocole afin d’avoir
une reproductibilité maximale sur une même machine et entre des équipements différents
de différents plateaux.
L’analyse des images se fait à l’aide du logiciel Image J et du plug‐in MetroloJ – Generate
field illumination report. Celui‐ci ouvre une fenêtre (figure 3) dans laquelle il faut entrer
différents paramètres d’acquisition puis le plug‐in se lance : il trace quatre profils d’intensité
(horizontale et verticale à mi‐image et deux diagonales) en prenant le centre de l’image
comme origine du repère, puis il détermine le centre d’intensité de l‘image et calcule sa
distance au centre réelle de l’image. Il détermine ensuite les intensités de huit points
d’intérêt (intersections des quatre ROIs avec les bords de l’image) et les normalise par
rapport au maximum d’intensité de l’image. Enfin, il génère une image des régions d’iso‐
intensitées normalisées par rapport au maximum d’intensité de l’image. Le résultat est
fourni dans un document pdf (figure 4). Les points de mesure de ce rapport consignés dans
la fiche de visite sont d’une part le centre d’intensité (« center of intensity ») et d’autre part
les intensités relatives par rapport à l’intensité maximale (« intensity relative to max »)
(valeurs encadrées sur la figure 4). Ces points nous permettent de déterminer des valeurs de
centrage ainsi que l’homogénéité sur la totalité du champ d’observation.
3) Comparaison des détecteurs (microscope confocal)
Cette comparaison est effectuée afin d’avoir une idée de la sensibilité des différents
détecteurs présents sur les systèmes ainsi qu’une caractérisation du bruit de chaque
détecteur dans le but de pouvoir conseiller aux utilisateurs le meilleur trajet optique ou du
moins, le détecteur le plus approprié.
La comparaison des détecteurs se fait à l’aide des lames FluoRef et avec un seul objectif
(10x). Avant toute acquisition, il faut aligner les pinholes (avec une lame miroir). Le chemin
optique doit être le moins variant possible pour par la suite pouvoir comparer les détecteurs
entre eux.
L’analyse des images se fait sous Image J et le plug‐in MetroloJ – Generate CV report. Ceci
ouvre une fenêtre (figure 5) dans laquelle il faut entrer certains paramètres d’acquisitions
puis l’analyse se lance : il faut dessiner une ROI sur l’image analysée, le plugin calcule ensuite
13
Figure 7: Co‐alignement report generator
Figure 8 : Résultats du co‐alignement report fournis en document pdf
la distribution des intensités et détermine la moyenne et l’écart type (standard deviation)
des intensités, puis elle calcule le Coefficient de Variation (CV= écart type/moyenne) (figure
6). Les points consignés dans la fiche sont l’intensité moyenne (« average ») et le coefficient
de variation (« CV ») (valeurs encadrées sur la figure 6). La CV donne une idée du bruit
associé au détecteur. Pour les différents détecteurs, l’intensité relative est calculée
(moyenne/moyenne la plus basse des détecteurs).
4) Comparaison des dichroïques d’excitation (microscope confocal)
L’intérêt de cette comparaison est de suivre la transmission/réflexion des miroirs
dichroïques primaires et secondaires, pour suivre leur performance et proposer le trajet
optique optimal aux utilisateurs.
La comparaison des dichroïques d’excitation se fait à l’aide des lames FluoRef et avec un seul
objectif (10x). Comme précédemment, il faut aligner les pinholes avant chaque acquisition.
Le chemin optique doit être le moins variant possible afin que l’on puisse comparer, lors de
l’analyse, les dichroïques entre eux (par raie d’excitation).
L’analyse des images se fait sous Image J en mesurant l’intensité moyenne (il suffit de
sélectionner toute l’image puis de mesurer l’intensité moyenne (« mean intensity »).
5) Aberrations chromatiques – Co alignement
De légers décalages dans l’assemblage des cubes de fluorescence des microscopes champ
plein, un défaut de réglage pour un microscope confocal (collimateurs UV/VIS par exemple)
ou encore un défaut de la correction des aberrations chromatiques latérales et
longitudinales, peuvent induire un décalage spatial entre les différentes couleurs de
fluorescence observées. Afin de s’assurer de la parfaite colocalisation d’un signal quatre
couleurs, des images d’objets fluorescents doivent être analysées.
Le matériel requis pour cette partie est l’utilisation de lames de billes Tetraspeck de 4µm.
Les éventuelles aberrations chromatiques sont observées sur les objectifs 40x, 63x et 100x.
Des séries z (ou z‐stack) de billes marquées Tetraspeck sont acquises en suivant les règles de
densité d’échantillonnage de Shannon & Nyquist. Par ailleurs, afin de pallier à d’éventuels
défauts de repositionnement de la platine/surplatine/piezo, les quatre couleurs
(correspondant à DAPI/GFP ou FITC/Cy3/Cy5) sont acquises séquentiellement plan par plan.
14
Figure 9: PSF report generator
Figure 10: Résultats du PSF report fournis en document pdf
L’analyse des séries en z se fait sous Image J avec le plug‐in MetroloJ – Generate co‐
alignement report. Ce plug‐in ouvre une fenêtre intitulée Co‐alignement report generator
dans laquelle certains paramètres d’acquisition sont à entrer (les longueurs d’onde
d’émission, l’ouverture numérique de l’objectif ainsi que la taille du pinhole) (figure 7). Sur
chacune des images de billes, le rapport génère deux projections d’intensité maximum XY et
XZ, il segmente l’histogramme de l’image par la méthode des moyennes mobiles, il isole le
domaine d’intensité correspondant à la bille (seuil) puis ajuste les pixels seuillés sur une
ellipse et détermine le centre de l’ellipse sur les deux projections. Enfin il calcule toutes les
distances centre à centre et les distances de référence. Les résultats s’affichent dans un
document pdf (figure 8). Les valeurs analysées sont celles affichées dans le tableau
« Distances table (calibrated) » (tableau encadré sur la figure 8). La valeur entre parenthèses
correspond à la valeur théorique limite calculée pour laquelle il y a encore coalignement en
tenant compte du « volume de résolution » (calculé avec les paramètres d’acquisition entrés
dans la fenêtre « Co‐alignement report generator », figure 7). La valeur située au dessus de
la valeur entre parenthèses est la valeur mesurée. Il y’a co‐alignement si la valeur réelle est
inférieure à la valeur théorique. La valeur 1 est entrée dans la fiche de maintenance. A
défaut, le co‐alignement n’est pas correct et la valeur 0 est reportée.
6) Résolution spatiale : Point Spread Function
La qualité des images obtenues dépend des performances en termes de résolution latérale
(XY) et axiale (Z) d’un objectif. Afin d’évaluer la résolution d’un objectif, des images de billes
fluorescentes Tetraspeck de 0.2µm de diamètre (inférieur où égal à la limite de résolution
des optiques testées) sont prises. Des séries Z, avec les objectifs 40x, 63x et 100x sont prises
en suivant les règles de densité d’échantillonnage de Shannon & Nyquist.
L’analyse des séries en z se fait sous Image J avec le plug‐in MetroloJ – Generate PSF report.
Ce plug‐in ouvre une fenêtre intitulée « PSF report generator » (figure 9) dans laquelle
certains paramètres d’acquisition sont à entrer. Sur l’image de la PSF, le « report » génère
deux projections d’intensité maximum XY et XZ, il détermine les coordonnées du maximum
d’intensités et les profils d’intensités passant par le centre, suivant les trois axes. Il ajuste
ensuite chacun des trois profils dans une gaussienne et il calcule enfin les FWHM (largeur à
mi hauteur) et les résolutions théoriques. La FWHM est considérée comme une évaluation
15
Figure 11 : FieldMate Coherent et sa sonde OP2‐VIS
Figure 12 : « macro » sous Image J pour la caractérisation du CCD
relativement proche de la distance limite de résolution (critère de Rayleigh et
Wilson/Sheppard pour le confocal). Les résultats sont ensuite générés dans un document pdf
(figure 10). Lorsque le fit de courbe est relativement proche de la réalité mesurée (R² est
supérieur ou égal à 0.95), les valeurs reportées sur la fiche sont les FWHM X, Y et Z
encadrées sur la figure 10. Nous avons ajouté à la fiche un champ pour l’écart type à la
moyenne de ces mesures. Enfin, le rapport entre valeur mesurée et valeur théorique est
calculé.
7) Mesures de puissance (microscope confocal)
La puissance lumineuse délivrée en sortie d’objectif (un 10x) est mesurée avec un mesureur
de puissance Field Mate de Coherent calibré et sa sonde adéquate OP2‐VIS (pour les LASERs
visibles, figure 11). La mesure de puissance est effectuée en sortie d’objectif (10x). Les
mesures relevées sont en µW. Les paramètres doivent être réglés comme décrit dans le
protocole pour que l’on ait une reproductibilité dans les résultats sur les différents plateaux.
Ces mesures sont à comparer avec les mesures de puissance faites lors des visites
mensuelles et sont à suivre au cours du temps. La linéarité de l’AOTF est un paramètre
important à vérifier pour extrapoler les puissances à d’autres réglages d’AOTF.
8) Caractéristiques du CCD (microscope champ plein)
Les CCD utilisés sur les microscopes sont des détecteurs relativement peu bruités.
Cependant, la répartition du bruit, son importance est à vérifier pixel par pixel afin de
s’assurer d’une répartition homogène du bruit sur le capteur.
10 images d’un temps d’exposition de 30 secondes chacune (de façon à négliger le bruit de
photon) sont prises avec le shutter de fluorescence fermé afin de dénombrer les pixels
chauds, les pixels froids et les pixels morts. Dans ces conditions, la valeur d’intensité d’un
pixel résulte du bruit électronique, issu du courant d’obscurité et du processus de lecture,
auquel un offset est soustrait. Un pixel chaud est défini comme un pixel dont l’intensité est
supérieure de deux fois à la valeur moyenne d’intensité des pixels du CCD. Un pixel froid est
moins bruité et a une valeur inférieure à la moitié de l’intensité moyenne des pixels du CCD.
Un pixel mort apparaît comme un point dont l’intensité ne varie plus.
L’analyse des images est faite ensuite sous Image J à l’aide d’une macro « ccd.txt » (figure
12) qui à partir d’un stack de 10 images, calcule la moyenne du nombre de pixels chauds,
16
froids et morts.
En conclusion, l’ensemble des mesures obtenues dans les différentes parties citées
précédemment est retranscrit dans des fiches de visite de maintenance annuelle spécifiques
de chaque système (annexe 4). Ces résultats seront, dans un futur proche, collectés dans le
logiciel de maintenance OPTIMU.
17
Discussion
18
Figure 13 : kit de nettoyage pour l’inspection des optiques
Le protocole de visite de maintenance annuelle présenté est le premier protocole de
visite de maintenance annuelle formalisé de la plate‐forme MRI. Certains points sont encore
à discuter voire même à modifier au cours du temps.
La mise en place de ce protocole n’a pas été aussi simple qu’escompté et beaucoup de
changements sont intervenus au cours de son établissement. Les modifications ont été
suggérées soit par différents responsables des plateaux techniques de MRI soit après
discussion avec les techniciens des sociétés Zeiss et Leica. Par ailleurs, certains collègues ont
mis en avant le manque de temps pour pouvoir effectuer entièrement ce protocole sur tous
leurs systèmes. En moyenne, l’acquisition des images selon le protocole dure une
matinée/journée pour un microscope champ plein/confocal. L’analyse des images récoltées
prend une journée environ.
Homogénéisation de l’inspection des optiques
L’inspection des optiques est réalisée tous les mois sous une loupe binoculaire afin de
déceler toutes rayures, chocs ou traces éventuelles. Cependant, nous nous sommes aperçus
que sur certains systèmes (qui étaient utilisés régulièrement), le nettoyage des optiques tous
les mois n’est pas suffisant. Il faudrait donc mettre en place un système de vérification des
optiques à une fréquence adaptée au taux d’utilisation de l’appareil concerné. De plus, cette
inspection a du être uniformisée sur les plateaux car il y avait une hétérogénéité dans la
façon de nettoyer le matériel optique. C’est pour cela qu’un kit de nettoyage (comprenant
des écouvillons BASAN®, du papier Whatman®, un ventilateur « Rocket air » Giottos® et du
nettoyant optique) (figure 13) a été fourni à chaque responsable de plateaux et l’acquisition
de loupes binoculaires dédiées est prévue pour les plateaux n’en disposant pas.
Biais dans les mesures impliquant les lames FluoRef (dites « Chroma »)
Au cours de mon stage, j’ai pu constater un ensemble de biais potentiels induits soit
par le matériel utilisé soit par les équipements.
Ainsi, pour la mesure d’homogénéité de champ, il faut logiquement éviter d’acquérir une
image présentant une tache ou une poussière. Cela fausse le résultat final. Or il est difficile
d’avoir un champ correct avec des objectifs de faible grossissement (par exemple un objectif
10x). De plus, pour des objectifs d’ouverture variable, il est important de travailler avec une
19
ouverture fixée, par exemple sur la plus petite valeur. Ainsi, le défaut est « tamponné » dans
une épaisseur (profondeur de champ) augmentée. Enfin, le plug‐in utilisé prend les valeurs
d’intensité des pixels des quatre coins de l’image. En présence de bruit important (par
exemple sur un microscope confocal en utilisant la lame FluoRef rouge et une raie
d’excitation 633nm), la valeur peut être faussée. Pour cela, il serait intéressant d’adapter ce
plug‐in de façon à moyenner localement la mesure de l’intensité sur par exemple un carré de
20x20 pixels. Une étude de différentes tailles de la zone pourrait être réalisée de façon à
déterminer les dimensions optimales pour éviter ce biais. Nous avons également identifié
quelques bugs que nous n’avons pas pu rectifier dans le plug‐in utilisé. Ainsi, une des valeurs
du « report » (Bottom Left Corner) est identique (pour chaque « report ») à la valeur Top
Right Corner (en confocal). Tandis que sur certains « report », la valeur Bottom Right Corner
est égale à 0 sans raison apparente (en widefield). Nous avons du compiler nos résultats en
faisant abstraction de ces valeurs erronées.
Enfin, conformément aux indications des fabricants, nous avons utilisé le cas échéant des
lamelles standards (0.17+/‐ 0.005 mm) afin de s’approcher au plus près des conditions
d’observation des utilisateurs. Si l’intérêt de la lamelle est évident pour les objectifs à
immersion 0.17, est‐il nécessaire de garder cette lamelle pour les objectifs à air ? Il s’est
avéré qu’il n’y avait aucune différence dans les résultats entre ces deux techniques mais par
mesures de reproductibilité des résultats entre plateaux, nous avons gardé les lamelles pour
les observations.
Biais et variabilité dans les mesures impliquant les billes Tetraspeck
J’ai également constaté une forte variabilité dans les valeurs observées pour les études de
co‐alignement et de résolution spatiale.
Un premier biais évident était le bon réglage de l’iris de certains objectifs d’ouverture
numérique variable.
Un second biais était la saturation de certains plans des séries Z. Ainsi, dans toutes les
mesures effectuées, il est essentiel qu’aucune des images des billes ne soit saturée, dans
tous les plans des séries. Or cela n’est pas toujours évident de s’assurer de cette non
saturation pour tous les plans et pour les quatre longueurs d’ondes visualisées. Un pré‐check
des billes avant leur analyse est donc nécessaire.
20
Un troisième biais peut être induit par un défaut de centrage de la bille dans l’axe. Il faut
aussi avoir un stack proportionné à la taille de la bille observée, c'est‐à‐dire qu’il faut définir
un point haut et un point bas (pour la série en z) selon la taille de la bille et que ces deux
points ne soient pas disproportionnellement éloignés ou rapprochés par rapport aux billes
observées.
Plusieurs séries de test nous ont ensuite permis de mesurer une importante variabilité. La
résolution et le co‐alignement sur plusieurs billes ont été mesurés afin d’essayer de
caractériser cette variabilité. Il s’est avéré que pour chacun de ces deux tests, il faut mesurer
un minimum de trois billes pour les aberrations chromatiques et un minimum de cinq billes
pour la résolution axiale et latérale. Ainsi une moyenne peut être effectuée pour s’approcher
aux plus près des caractéristiques du système.
Un quatrième biais possible était la position des billes par rapport à la lamelle. Lorsque j’ai
préparé ces billes à partir des solutions mères, j’ai placé les suspensions de billes sur la lame,
puis ensuite déposé le milieu de montage et la lamelle. Afin d’éviter toute aberration en
profondeur (par exemple des aberrations sphériques dues à un milieu de montage
inadéquat ou une lamelle d’une épaisseur inadaptée) nous avons utilisé des lamelles Zeiss et
un milieu de montage Prolong Gold (Molecular Probes). L’indice de réfraction du Prolong
Gold après 48h est de 1.51 (mesuré avec un réfractomètre). Les lamelles Zeiss en
borosilicate Marienfeld de 170+/‐5 µm d’épaisseur sont les lamelles les moins variables du
marché, la catégorie #1.5 acceptant classiquement une incertitude d’épaisseur de 20 µm.
Constatant, à partir des premières mesures faites, des résolutions axiales mauvaises (sur un
Zeiss Axioimager Z1, 40x PL APO 1.3 oil), nous avons suspecté des aberrations sphériques
apportées par le fait que les billes étaient en profondeur, déposées sur la lame plutôt que la
lamelle. Des montages équivalents d’échantillons biologiques (des spreads de chromosomes
de cellules méiotiques de souris sur des lames) présentaient également des aberrations
sphériques claires, avec une asymétrie axiale des figures de diffraction. En utilisant la
réflexion de la lamelle pour repérer sa position, nous avons mesuré en mode XZ sur un
confocal SP2, une profondeur moyenne des billes de 15µm. Nous avons ensuite préparé de
nouvelles lames de billes en déposant les suspensions sur la lamelle cette fois. Dans ce cas,
les billes sont fixées par la polylysine directement sous la lamelle. Nous avons constaté que
21
les valeurs de résolution spatiale et de co‐alignement ne sont pas différentes des lames
précédentes.
Enfin, un cinquième biais, associé à la position latérale de la bille, a été analysé. Nous avons
dans un premier temps vérifié que les systèmes sont invariants au décalage latéral (lateral
shift invariant) et que les résolutions observées ne sont pas altérées avec la position de la
bille dans le champ du CCD. Ainsi, sur un Leica DM6000, 63x PL APO 0.7‐1.4 oil, nous n’avons
pas décelé de différence statistiquement significative entre 9 positions réparties sur le CCD
(3 lignes, 3 colonnes). En conclusion, pour un microscope champ plein, quelle que soit la
position de la bille, la résolution et le co‐alignement ne sont pas affectés. La situation pour
un microscope confocal est légèrement différente. Tout d’abord, de part la faible vitesse
d’acquisition et une densité d’échantillonnage plus importante (pixels de 50nm pour un 63x
1.4 sur un confocal, là où des pixels de 100nm sont suffisants sur un champ plein), il n’est
pas réaliste de prendre un champ d’acquisition contenant plusieurs billes. En effet, les billes,
pour être analysables ne doivent pas être trop près les unes des autres et prendre un champ
contenant 2 billes et de grands espaces vides est plus long que de prendre 2 séries pour
chacune des billes. Après discussion avec les techniciens des fournisseurs de microscopes
confocaux, il s’avère qu’il est préférable de centrer dans le champ la bille à acquérir plutôt
que de définir une zone d’intérêt non centrée. Ainsi, les billes étant toujours au centre, la
variabilité observée n’est pas due à des positions dans le champ différentes.
Regard sur le mode de calcul du plug‐in MetroloJ
Deux questions relatives aux choix effectués par le RTmfm restent en suspens.
D’une part, pour les microscopes champ plein, les valeurs de résolution latérale et
axiale, appréhendée en utilisant la FWHM, sont sur l’ensemble du parc MRI (20 microscopes
champ plein) relativement proches des valeurs théoriques (la moyenne des rapports
réel/théorique est de 1.2). En revanche, elles sont en moyenne plus fortes pour la résolution
spatiale (la moyenne des rapports étant de 1.9). Nous avons utilisé la longueur d’onde
d’émission comme valeur de « wavelength » des différents plugins MetroloJ. Certaines
formules utilisent la longueur d’onde d’excitation (la PSF d’excitation étant modifiée par
rapport à un champ plein). La différence observée ne serait qu’accentuée en utilisant cette
valeur. En revanche, nos résultats soit remettent en cause l’adéquation de la mesure de
22
FWHM avec la formule utilisée (critère de Wilson/Sheppard) pour l’évaluation de la
résolution en confocal, soit soulignent des réglages sub‐optimaux des appareils. Au cours de
mon stage, nous avons reçu le premier Zeiss LSM780 en France. Ce microscope neuf, installé
par un technicien de l’usine, a passé avec succès les tests d’installation. Ces tests sont opérés
via une macro et un objectif de calibration spécifique. A notre surprise, il n’a pas passé tous
les tests de résolution spatiale, et certains objectifs présentaient des valeurs de résolution
en deçà de la valeur charnière. Cet incident renforce notre première hypothèse.
D’autre part, le coalignement pour un objectif est évalué comme suit. Le décalage
réel entre deux couleurs est mesuré dans l’espace (cf. partie Résultats – Aberrations
chromatiques co‐alignement). Ces valeurs sont comparées avec une valeur théorique de
décalage. Cette valeur théorique de décalage est calculée à partir des valeurs de résolutions
théoriques entrées dans le programme du logiciel. Or cette valeur théorique se fonde sur
des performances en termes de résolution théorique et non réelle. Ainsi, il est possible
qu’un objectif ne soit pas validé pour le coalignement, non pas du fait d’une aberration
chromatique avérée mais de part une faible résolution pratique qui fausserait cette mesure.
Une alternative serait de rentrer les valeurs de résolution observées. Dans tous les cas, il est
probable qu’un objectif pour lequel la résolution spatiale est fortement dégradée soit
envoyé en réparation, quel que soit le statut de son co‐alignement.
Les dernières discussions, quant à la résolution de ce biais, tournaient autour d’une valeur
correctrice entre la valeur réelle et la valeur théorique. En effet, il a été remarqué qu’il serait
judicieux d’avoir une valeur limite de rapport entre la valeur réelle et la valeur théorique afin
de prendre en compte la valeur calculée par le logiciel (valeur théorique) mais aussi de
prendre en compte une certaine correction de cette valeur. Ainsi on aurait un co‐alignement
lorsque la valeur réelle serait X fois supérieure à la valeur théorique (cette valeur n’a pas
encore été clairement définie à l’heure actuelle).
Choix arbitraires pour les paramètres d’acquisition
Les acquisitions d’image avec un microscope confocal se font à la limite de la saturation,
avec une valeur de gain arbitrairement fixée à 600 (pour un maximum de 1250). La
puissance LASER est adaptée de façon à atteindre la limite de saturation du détecteur. Ce
protocole ne semble pas avoir d’incidence pour ce qui est des mesures de co‐alignement et
de résolution axiale. Cependant, pour la comparaison des détecteurs et des miroirs
23
dichroïques, est‐ce la bonne méthode ? Les utilisateurs préfèrent faire varier le gain (dans
une certaine limite) lorsque leur signal est faible plutôt que de faire varier la puissance du
LASER. De plus, pour les appareils présents sur le plateau, une valeur de 600 est basse (Zeiss
LSM510 Meta, Leica SP2 et SPE). Seuls les valeurs de gain utilisées sur le Zeiss LSM780 sont
proches (de part sa sensibilité). Devons‐nous revoir notre méthode et essayer de se coller au
plus près de la façon de faire des utilisateurs de la plate‐forme afin d’avoir des résultats
conformes à la méthodologie des utilisateurs ? Dans bien des cas, et au moins sur tous les
appareils du plateau, la valeur de gain correspond à la différence de potentiel (voltage)
appliquée au détecteur. La comparaison de détecteurs de technologie différente avec une
valeur de gain identique n’est donc pas forcément pertinente. Par exemple, sur un LSM780,
le gain minimal du détecteur GaAsP est de 500 et une valeur de gain de 600 et une puissance
LASER fixe donne une valeur moyenne inférieure pour ce détecteur particulièrement
sensible par rapport au Ch1 et Ch2, qui sont des PMT multi alkali classiques. Il est donc
évident que fixer une valeur arbitraire à un gain ne permet de comparer que des PMT de
technologie identique. Une alternative serait donc de mesurer à puissance constante
l’efficacité du détecteur en augmentant la valeur du gain. Cela ne résoudrait pas forcément
le problème de comparaison des gammes de gain de détecteurs de technologie différente et
par ailleurs induirait des valeurs de bruit non comparables l’une à l’autre entre des
détecteurs de même fabrication. Des lames présentant des concentrations de fluorochromes
croissante pourraient permettre d’établir entre les détecteurs des comparaisons plus fiables.
Proposition de valeurs charnières.
Une première proposition de valeurs charnières a été présentée lors de la première réunion
avec les différents responsables de plateaux (et suite à la mise en place des visites sur notre
plateau). En effet, il est nécessaire de mettre en place des valeurs charnières, de proposer
des valeurs de mesures correctives afin que l’on puisse avoir une homogénéisation sur tous
les plateaux et que l’on puisse envoyer en réparation des composants qui seraient au dessus
de ces valeurs limites.
Une réunion prochaine (en septembre) permettra de redéfinir ces valeurs charnières qui
avaient été proposés lors de la première réunion. En effet, tous les plateaux n’ont pas
encore fournis leurs résultats de maintenance et donc la compilation des résultats n’a pu se
24
faire. Cependant il se dégage quelques valeurs charnières d’après les premiers retours des
différents plateaux. En discutant avec M. Evrard (société Zeiss), nous lui avons indiqué que
nous avions proposé comme valeur charnière, un rapport de 2 entre la valeur réelle et la
valeur théorique pour la résolution latérale, axiale et spatiale. Celui‐ci nous a répondu qu’il
ne pouvait rien entreprendre pour corriger cette valeur, qu’il ne pouvait rien y faire.
Homogénéisation de la mesure de puissance
Le protocole de mesures de puissance était totalement hétérogène sur les différents
plateaux techniques. En effet, chaque responsable de plateaux avait son protocole personnel
et il n’y avait aucune correspondance entre ces protocoles. Il a donc fallu rédiger une
méthode de mesures de la puissance qui convienne à tous les responsables de plateaux mais
qui s’approche aussi de la façon de faire des techniciens du SAV afin que l’on puisse
comparer nos valeurs aux leurs, dans une certaine mesure. Après discussion avec les
responsables de plateaux et après discussion avec les techniciens du SAV de la société Zeiss,
nous avons conclu à une uniformisation du protocole sur tous les plateaux techniques. Ainsi
toutes les mesures de puissance sont faites en sotie d’objectif (10x), à 100% de puissance
pour l’AOTF et à 25% de puissance pour le potentiomètre Argon.
Cependant plusieurs questions peuvent être soulevées : doit‐on garder le même dichroïque
pour chacune des raies ? Y‐a‐t‐il une linéarité au niveau de l’AOTF et au niveau du
potentiomètre Argon ? Peut‐on comparer des objectifs ayant deux ouvertures numériques
différentes (10x 0.3 et 10x 0.45)? Ont‐ils la même transmittance ? Peut‐on comparer les
systèmes entre eux ?
Certaines de ces questions ont trouvé une réponse : Des tests de linéarité de l’AOTF ont été
réalisés au sein de la plate‐forme sur e Zeiss LSM 510 Meta et ils ont montré qu’il y’avait une
linéarité de l’AOTF et du potentiomètre Argon pour chaque raie (résultats non fournis dans
ce rapport). Cependant la majorité des ces questions restent en suspens.
Vous trouverez en annexe libre, la première proposition de mesures correctives qui avait été
présentée et proposée aux différents responsables de plateaux avant qu’ils ne mettent en
place leurs visites de maintenance annuelle. Cette proposition avait pour but de définir dans
un premier temps des valeurs charnières. Ces valeurs vont sans doute être redéfinies lors de
la prochaine réunion concernant les maintenances avec la compilation de tous les résultats
25
des différents plateaux. Ainsi il y aura une homogénéisation des valeurs charnières sur les
différents plateaux ce qui permettra par la suite d’envoyer en réparation les différents
systèmes, les différents composants étant en dehors de ces valeurs charnières.
26
Conclusion
27
La mise en place de ce protocole de visite de maintenance annuelle n’a pas été de
tout repos, il a fallu faire plusieurs modifications avant d’arriver à ce protocole final
(protocole qui changera certainement au cours du temps avec des réponses à certaine
questions soulevées dans la discussion). En effet, certains responsables de plateaux ont mis
en avant la lourdeur d’un tel protocole, de l’acquisition aux analyses, et ont même proposé à
un moment que soit recruté un ingénieur dédié aux visites de maintenance sur chacun des
plateaux. Or la visite de maintenance permet d’avoir un regard sur les différents systèmes,
permet d’avoir une meilleure connaissance de leur fonctionnement (par exemple sur le Leica
SPE, cela a permis de montrer que l’on avait une modulation non linéaire pour la raie 405nm
alors que les autres raies ont une modulation linéaire, ou encore que l’objectif 63x de
l’Axiovert 200M à une faible transmission).
Cela a permis aussi de montrer quelques surprises que l’on aurait peut être pas soupçonné
tel le problème de la résolution spatiale du DAPI pour tous les objectifs et systèmes Zeiss (les
techniciens du SAV de Zeiss dit que cela a toujours été le cas) ou bien d’autres encore.
D’un point de vue personnel, ce stage m’a permis de me familiariser avec les différents
systèmes présents sur le plateau mais il m’a permis aussi de voir ce qu’était le travail d’un
responsable de plateaux, de la réception d’un nouveau système à la veille de ce système, en
passant par la formation des utilisateurs, par l’encadrement de leurs travaux (quand il le
souhaite). Toutes ces tâches m’ont été confiées au cours du temps en complément de la
mise en place d’un protocole de visite de maintenance. Ainsi, j’ai pu me parfaire dans la
formation des utilisateurs, j’ai pu aussi discuter avec eux des différents problèmes qu’il
rencontre avec leurs échantillons lors de leurs observations et leur soumettre mon point de
vue ainsi qu’une façon de procéder dans leurs observations. J’ai aussi appliqué le protocole
de visite de maintenance annuelle sur toutes les machines ainsi que le protocole de visite de
maintenance mensuelle qui était déjà élaboré et mis en place à mon arrivée.
28
Annexe
Leica Macroconfocal LSI • Laser :
Laser Box Supply Unit • Cube de filtres :
Filtre DAPI Macrofluo Filtre FITC LP Macrofluo Filtre Rhodamine LP Macrofluo Filtre DAPI DM5500 Filtre FITC LP DM5500 Filtre Rhodamine LP DM5500
• Objectifs : Leica 1x Plan APO 0.1 (Macrofluo) Leica 5x Plan APO 0.5 LWD (Macrofluo) Leica 10x ACS APO 0.3 CS Leica 40x ACS APO 1.15oil CS Leica 63x ACS APO 1.30oil CS
Leica SP2 Confocal • Laser :
LASER 405nm LASER BOX SP2 (Ar, HeNe543, HeNe633)
• Cube de filters: Filtre DAPI DMIRB Filtre Rhodamine LP DMIRB Filtre FITC LP DMIRB
• Objectifs: Leica 10x HC PL APO 0.4 CS Leica 20x HCX PL APO 0.7 CS Leica 40x HCX PL APO 1.25oil PH3 CS Leica 63x HCX PL APO 1.4‐0.6oil
Zeiss LSM 510 Meta Confocal • Laser :
Laser Ar2 LASOS 4 lignes 30mW Laser HeNe2 543/632.8nm LASOS 1mW
• Cube de filtres : Filtre Hoechst Axioplan2 Filtre FITC LP Axioplan2 Filtre Rhodamine LP Axioplan2 Filtre Cy5 Axioplan2
• Objectifs : Zeiss 10x Plan APO 0.45 Zeiss 20x Plan APO 0.8 Zeiss 25x Plan NEOFLUAR 0.8 Imm Korr Zeiss 40x PL APO 1.3oil DIC (UV) VIS IR Zeiss 63x PL APO 1.4oil
Zeiss LSM 780 Confocal • Laser :
Laser Argon LASOS 3 lignes 25mW Laser DPSS 561‐10 15mW Laser HeNe633 5mW Diode 405‐30 30mW
• Cube de filtres : Filtre GFP Filtre DAPI Filtre DsRed
• Objectifs : Zeiss 10x EC PLN 0.3 DIC Zeiss 20x PL APO 0.8 DICII Zeiss 40x PL APO 1.3oil DICII Zeiss 63x PL APO 1.4oil DICII
Annexe 1 : Les microscopes confocaux
Leica DM6000‐2 • Caméra :
Coolsnap HQ1 3 • Cube de filtres :
Filtre Hoechst DM6000 Filtre FITC DM6000 Filtre Cy3 DM6000 Filtre Cy5 DM6000 Filtre YFP DM6000 Filtre CFP DM6000
• Objectifs : Leica 20x HC PL APO 0.7 Leica 40x HCX PL APO 1.25‐0.75oil Leica 63x HCX PL APO 1.4‐0.6oil Leica 100x HCX PL APO 1.4‐0.7oil
Leica DMRXA Pièzo • Caméra :
Micromax YHS 1300 7 • Cube de filtres :
Filtre Rhodamine LP DMRXA Filtre FITC DMRXA Filtre Hoechst DMRXA Filtre GFP DMRXA Filtre Cy7 DMRXA Filtre Texas Red DMRXA FIltre Cy5 DMRXA Filtre Cy3 DMRXA
• Objectifs : Leica 40x HCX PLAPO 1.25‐0.75 oil
Leica 100x HCX PLAPO 1.4‐0.7oil
Leica DM6000‐1 • Caméra :
Coolsnap HQ1 4 • Cube de filtres :
Filtre Hoechst DM6000 Filtre FITC DM6000 Filtre Rhodamine DM6000 Filtre Cy3/Cy5 DM6000 FiltreCFP/YFP DM6000
• Objectifs : Leica 5x HC PL Fluotar 0.15 Leica 20x HCX PL Fluotar 0.5 Leica 40x HCX PL Fluotar 0.75 Leica 40x HCX PL APO 1.25‐0.75oil Leica 63x HCX PL APO 1.4‐0.6oil Leica 100x HCX PL APO 1.4‐0.7oil
Zeiss Axioimager Apotome • Caméra :
Axiocam MRm 4 • Cube de filtres :
Filtre CY5.5 Zeiss Axioimager Filtre Texas Red Axioimager Filtre Rhodamine HE Axioimager Filtre GFP HE Axioimager Filtre Hoechst Axioimager
• Objectifs : Zeiss5X Achrostigmat 0.12 Zeiss10X PLAN APO 0.45 Zeiss16X PL NEOFLUAR 0.5ImmPH2 Zeiss25X PL NEOFLUAR 0.8Imm Korr Zeiss40X PL APO 1.3oil DIC(UV)VIS‐IR Zeiss63X PL APO 1.4oil Zeiss100X PL APO 1.4 oil
Zeiss M2BIO Stéréomicroscope • Caméra :
Cool Snap fx • Cube de filtres :
Filtre Rhodamine M2BIO Filtre GFP M2BIO Filtre DAPI M2BIO Cube de filtre vide M2BIO
• Objectifs : Zeiss 1.6x Kramer 10x HR 0.45 20x M PL APO 0.42
Zeiss Axiovert 200M • Caméra :
Coolsnap HQ1 6 • Cube de filtres :
Filte Hoechst Axiovert200M Filtre FITC Axiovert 200M Filtre Cy3 Zeiss Axiovert 200M
• Objectifs : Zeiss10x A‐PL 0.25 PH1 Zeiss20x LD PL NEOFLUAR 0.4 PH2 Korr
Zeiss40x LD A‐PL 0.5 PH2 PLASDIC Zeiss40x LD PL NEOFLUAR 0.6 PH2 Korr
Zeiss63x PL APO 1.4 PH3 oil
Annexe 2 : Les microscopes champ plein
4 stations d’analyse Logiciels :
• Axiovision LE • Adobe Photoshop extended CS5 • Huygens pro + script • ImageJ • LCS Lite • LSM Image Browser • Metamorph • Microsoft Office • MRI Cell Image Analyzer • Volocity • Imaris
Leica MZ2FL Stéréomicroscope
Zeiss Axiovert 40
Leica DMRA 2
Annexe 3 : Les stations en libre service et les stations d’analyse
