LA GAZETTE DU LABORATOIREn°32 - juin 2009 P 10PAGES PRATIQUES

Détection des mycotoxines dans les noixRETSCH - Tél : +49 2129 5561-0 - Fax : +49 2129 8702 - e-mail: mk@retsch.com - Web : www.retsch.com

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires dits naturels puisqu’elles sont synthétisées par les moisissures. Leur effet peut être toxique pour l’homme et l’animal. Tout comme les microorganismes produisant des antibiotiques, les variétés de moisissures produisant des mycotoxines sont présentes dans le monde entier. Parmi les mycotoxines, les aflatoxines sont les plus toxiques. Les aliments qui présentent un risque accrû de sécrétion d’aflatoxine du fait de leur contamination fongique sont outre les fruits secs et les épices aussi tous les types de noix (cacahuètes, noisettes, pistaches, par exemple) et les céréales (blé, maïs, par exemple).

Les mycotoxines sont souvent produites seulement dans certaines conditions favorables de température et d’humidité et avec un grand apport en nutriments, les aliments étant ici tout indiqués. Cette occurrence de mycotoxines est presque toujours due à de mauvaises conditions de stockage ou à un stockage de trop longue durée. Le problème est souvent qu’il ne se forme pas seulement une substance mais toute une famille de composés chimiquement apparentés. Les mycotoxines sont particulièrement thermostables et en général, elles ne sont donc pas détruites au cours de la transformation des produits alimentaires.

Pré-broyage et broyage fin

Afin d’extraire suffisamment bien les mycotoxines de la matière à analyser, l’échantillon doit d’abord être broyé

et homogénéisé. Comme les valeurs limites pour la charge en mycotoxines varient entre 0,025 et 15 μg/kg et qu’une attaque fongique est en principe de type local ou ponctuel, un échantillon prélevé au hasard doit être suffisamment grand pour pouvoir prouver une contamination. Pour ce faire, on commence par pré-broyer une quantité représentative d’env. 1 à 2 kg par tonne de noix avec le broyeur à couteaux SM 100 jusqu’à l’obtention de particules d’une taille d’env. 1 à 3 mm. Ce broyeur est notamment utilisé pour le broyage rapide et soigneux de matières sèches jusqu’à une granulométrie finale de 0,25 mm. Une division représentative de l’échantillon est ensuite effectuée avec le diviseur d’échantillons rotatif PT 100 qui se distingue par une précision de division extrêmement grande. La fraction d’échantillon obtenue est ensuite soumise à un broyage fin, le broyeur ultra-centrifuge ZM 200 étant ici la solution idéale. Ce broyeur à rotor performant se distingue par son maniement simple et sûr et du fait de la vaste gamme d’accessoires, par son utilisation polyvalente. C’est ainsi que les tamis d’écartement spécialement conçus pour le broyage d’échantillons cassants thermosensibles se prêtent par exemple particulièrement bien à la préparation des noisettes. Comme les mycotoxines sont très liposolubles, le broyage doit être effectué avec le plus grand soin possible afin d’éviter le rejet de matières grasses de la matière échantillon.Une granulométrie d’env. 300 μm suffit pour la prochaine étape qui consiste à extraire les mycotoxines de la matière échantillon.

Extraction

Pour l’extraction, 25 g de l’échantillon homogénéisé sont ajoutés à 200 ml d’un mélange eau/acétonitrile (16+84 v/v) puis agités pendant 60 minutes et filtrés. On extrait 100 ml du filtrat avec 100 ml d’éther de pétrole ; la phase éther de pétrole est rejetée. Un aliquot est mélangé à un complexe de charbon actif / Al2O3 / célite (7:5:3 - w/w/w) et brassé pendant 10 minutes, puis centrifugé, le liquide surnageant est évaporé et le résidu est mélangé à de l’eau. La solution est déposée sur une colonne d’immunoaffinité, purifiée avec de l’eau et éluée avec du méthanol. L’éluat est ensuite séparé par HPLC.

La chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography ou HPLC en anglais) est une méthode d’analyse qui se distingue par une série d’avantages comme la haute sélectivité, la reproductibilité et les très basses

limites de détection.Pour la préparation des échantillons, on dispose avec les colonnes d’immunoaffinité (IA) disponibles sur le marché de colonnes d’extraction en phase solide (SPE) spéciales avec lesquelles les aflatoxines sont isolées par des anticorps de liaison sélective et éluées de la matrice avec des solvants organiques. Les extraits d’échantillon obtenus sont finalement séparés par le biais d’une phase HPLC RP18 et les mycotoxines sont détectées par fluorescence après une dérivatisation post-colonne la plupart du temps effectuée avec une solution de brome ou d’iode. Il n’est pas rare que la mainlevée de la saisie de cargaisons dépende de la possibilité de déterminer la teneur en aflatoxines des noix au plus vite et avec exactitude. La méthode décrite ci-dessus donne en peu de temps des résultats représentatifs et garantit ainsi une sécurité optimale non seulement

pour le fournisseur mais aussi pour le consommateur.

Noisettes avant le broyage

Le résultat du pré-broyage

Les principales moisissures produisant des mycotoxines

Broyeur à couteauxSM 100

Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

La trousse artus® HBV RG (CE-IVD) associée au système Rotor-Gene® Q permet une quantification exacte du virus de l’hépatite B par PCR temps réel.Contact : QIAGEN S.A - Email : export-fr@qiagen.com - Web : www.qiagen.comLa trousse artus HBV est marquée CE-IVD pour la détermination de la charge virale du virus de l’hépatite B (VHB) à partir de plasma EDTA. Elle contient l’ensemble des réactifs et enzymes nécessaires à l’amplification et la détection en PCR temps réel

d’une région génomique conservée et spécifique de l’ADN du VHB. L’amplification simultanée d’un contrôle interne (CI) permet de vérifier la qualité des extractions, l’efficacité des réactions PCR et l’absence d’inhibiteurs. Les standards de quantification sont

fournis de manière à déterminer avec exactitude et précision les charges virales du VHB. Les acides nucléiques doivent être préalablement extraits ; soit avec les kits de la gamme QIAamp®, manuellement ou de façon automatisée sur l’extracteur QIAcube®, soit encore,

sur le système BioRobot EZ1 Advanced (QIAGEN) grâce à la technologique des billes magnétiques.

La trousse est optimisée pour la plateforme Rotor-Gene Q (QIAGEN) et dispose de deux autres formats

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pour un usage sur les thermocycleurs ABI PRISM (Applied Biosystems) et LightCycler® (Roche). La quantification de l’ADN viral est fiable dans un large domaine de dosage compris entre 2 UI/ml et 4 x 109 IU/ml (Figure #1). Le test HBV de QIAGEN montre par ailleurs une concordance quantitative et qualitative avec les autres trousses commerciales. Cette exactitude est essentielle dans la mesure de l’efficacité thérapeutique. Le Rotor-Gene Q fonctionne selon un concept innovant faisant appel à un rotor et un système d’air pulsé pour les échanges thermiques. Cette technologie résout de nombreuses limitations rencontrées par les thermocycleurs à effet peltier, malgré l’utilisation par ces derniers de matériaux composites.

Grâce à son carrousel en continuelle rotation, les échantillons sont maintenus au fond des tubes supprimant tous risques d’apparition de bulles ou de condensation, tout en favorisant la réaction enzymatique. Combinée avec un système d’air pulsé optimisé, la technologie du Rotor-Gene Q confère une qualité d’analyse jamais atteinte que ce soit avec une utilisation de trousses commerciales ou avec des techniques d’amplification dites « ouvertes ». La trousse artus HBV est un outil très sensible et spécifique pour la quantification virale du VHB. Le contrôle interne, un schéma de pipetage simplifié, des standards de quantification inclus, le marquage CE-IVD sont autant d’éléments en faveur de son utilisation en Diagnostic in-vitro.

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Nanotechnologie & traitement des eaux.Le déséquilibre entre les ressources hydriques et la demande en eau douce devient de plus en plus important et affecte certaines régions dans le monde beaucoup plus que d’autres. A cet égard, les pays de la rive sud méditerranéenne sont considérés parmi les régions les plus touchées par le manque en ressources hydriques. Dans ces pays, ce déséquilibre est en aggravation continue, suite au développement enregistré dans les domaines agricole, industriel, social etc. ainsi que par la tendance de réchauffement annoncé par les spécialistes, qui devrait rendre cette situation plus critique dans les décennies à venir.

Le manque en eaux fait de la recherche de ressources non conventionnelles, et de la préservation des ressources disponibles par réutilisation de l’eau, une question vitale pour assurer un développement durable. Si les pays industrialisés s’intéressent plus aux ressources d’énergie, les pays en voie de développement souffrent d’une triple menace :

- déficit en accès à l’eau potable et manque de structures sanitaires ;- menace d’épidémies par certaines maladies associées à la pénurie et à la contamination des eaux ;- manque d’énergie ;

Ces trois menaces sont étroitement liées et l’humanité entière est appelée à trouver des solutions adéquates et, surtout, accessibles. A cet égard, les nanotechnologies sont appelées à jouer un rôle décisif, à court comme à long terme, et à apporter une contribution importante dans la résolution de ces questions vitales.

Les nanotechnologies regroupent l’étude, la fabrication, la manipulation de structures, de dispositifs et de systèmes à l’échelle de 1 - 100 nanomètres. Une échelle où les propriétés physicochimiques seront souvent très différentes de celles connues à l’échelle métrique. Chaque nanoparticule ou nanomatériau est

doué de caractéristiques techniques spécifiques et doit être considéré comme une entité particulière, avec un comportement physicochimique spécifique, qui est à évaluer. Les nanotechnologies pourraient donc, dans un futur proche, occuper une place décisive dans l’économie mondiale.

En effet, les propriétés de matériaux comme le carbone, l’oxyde de titane ou le fer changent d’une manière impressionnante lorsque la taille se réduit au dessous de 100 nm. Au dessous de ce seuil, le rapport de la surface spécifique sur la masse ainsi que le nombre d’atomes occupant la surface par rapport au nombre total devient tellement grand qu’il modifie de façon inattendue la réactivité chimique, la conductibilité thermique, électrique,… de ces matériaux.

Les nanotechnologies sont à la croisée de plusieurs disciplines scientifiques : l’électronique, la mécanique, la chimie, le génie chimique, l’optique, et la biologie où l’on manipule des objets d’une taille de l’ordre du nanomètre.

Il est vital aujourd’hui que soit établie une stratégie forte pour stimuler la disponibilité de l’eau propre, une stratégie basée sur les grands potentiels des nanotechnologies, avec quatre objectifs principaux et prioritaires :

- détecter des contaminants et faciliter leur dosage,- rendre leur séparation par voies physicochimiques (filtration membranaire, adsorption,…etc.) plus facile et plus efficace,- réduire la consommation de l’eau à l’échelle industrielle et agricole- dépolluer des eaux contaminées par des voies accessibles, en utilisant l’énergie solaire et sans engendrer des pollutions supplémentaires.

Le traitement physicochimique des eaux utilise depuis la fin des années 70 les nanotechnologies, par le biais des sels de fer ou d’aluminium qui sont ajoutés pour décontaminer les eaux ou

les traiter avec une bonne efficacité et un coût limité. Il y a eu ainsi, au cours des années 80, des développements de sels d’aluminium préhydrolysés, c’est-à-dire que l’on formait déjà par des assemblages moléculaires, comme l’Al13 par exemple, qui est une nanoparticule en solution ou ce que l’on appelle polycation.L’insertion de ces polycations dans certains types d’argiles possédant une structure expansible permet d’avoir des particules d’une taille correspondant à l’échelle nanométrique, dotées d’une activité catalytique plus élevée et rendant plus facile la séparation de l’eau purifiée de catalyseurs.Ces argiles pontées par les oxydes métalliques peuvent ajouter les propriétés physicochimiques de l’argile (capacité d’adsorption, facilité de floculation,…etc.) à l’activité catalytique ou photocatalytique des nanoparticules de Fe2O3, TiO2, Zr etc. intercalées entre les feuillets d’argile.

La pollution des eaux par des composés organiques non biodégradables, en particulier les chlorophénols, les colorants, les pesticides,…etc, constitue l’une des principales difficultés pour leur traitement. Les méthodes physico-chimiques et biologiques sont considérées comme peu efficaces pour combattre ce type de polluants.

Une alternative intéressante a suscité beaucoup de recherches : il s’agit des procédés d’oxydation avancés comme la photocatalyse, le procédé Fenton, et leur synergie avec d’autres techniques radiatives comme les ultrasons et les microondes. Ces procédés sont basés sur la formation de radicaux HO° caractérisés par leur potentiel oxydatif très fort.

Par ailleurs, ces techniques d’oxydation ne nécessitent pas l’ajout de produits chimiques et, en conséquence, leur mise en œuvre est simple. De plus, elles peuvent utiliser une énergie propre et renouvelable : l’irradiation solaire. Plus la taille des particules de ces oxydes métalliques est réduite, plus leur efficacité est élevée.

L’évaluation de l’activité catalytique ou photocatalytique des solides ainsi préparés, dans la dégradation des divers polluants organiques considérés comme modèles de polluants bio-récalcitrants (chlorophénols, l’acide dichloroacétique, les colorants synthétiques, les pesticides,…etc.), permet de conclure que ces procédés APOs sont efficaces dans l’élimination de la majeure partie de ces polluants organiques.

Ces procédés peuvent contribuer fortement à la purification des eaux usées industrielles et urbaines, pour répondre aux normes en vigueur pour la réutilisation des eaux et, par conséquent, assurer la préservation des ressources hydriques.

A ceux qui s’interrogent sur le rôle possible et utile des nanotechnologies, on peut sans nul doute répondre que les nanotechnologies offrent des perspectives intéressantes, que ce soit pour la filtration et la réutilisation des eaux usées (élimination des bactéries, virus, matières organiques, métaux lourds) ou pour le dessalement.

Contact :

Pr Hussein KHALAF

Université Saad Dahlab de Blida Faculté des Sciences de l’IngénieurLaboratoire de Génie ChimiqueRoute de Soumaa, BP 270.09000-Blida, Algérie.

Tél : (+213)(0)25.43.36.31 (+213)(0)25.43.66.86 (+213)(0)25.43.36.26Mobile : (+213)(0)6.62.55.40.64Fax : (+213)(0)25.43.36.31Mail : khalafh@hotmail.com/ lgc.usdb@mail.univ-blida.dz Web: http://www.univ-blida.dz/lgc

Détermination du domaine de linéarité de la trousse HBV sur le système Rotor-Gene Q