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Enseignante H.DJELILI Polycopies du module Immunothérapie -Master 2 (Immunologie)-
Partie II : Outils moléculaires
Anticorps monoclonaux
32
Chapitre 1
Méthodes de production des anticorps monoclonaux
En 1975, Georges Köhler et Cesar Milstein mettent au point la technique
des hybridomes. Cette méthode révolutionnaire, qui leur valut un prix Nobel en 1984,
permet en effet de cultiver indéfiniment un clone de cellules productrices d’un seul
type d’anticorps, appelé dès lors anticorps monoclonal.
1-Définitions
Les anticorps (Acs) sont des immunoglobulines (Ig) de nature glycoprotéines
Elles sont présentes :
- sous forme soluble dans le plasma
- dans de nombreuses sécrétions
- sous forme membranaire comme élément du récepteur
de l’Ag à la surface des cellules B (BCR)
Terminologie : Immunoglobulines = anticorps = γ-globulines
Anticorps monoclonaux est une population homogène d’anticorps issus d’un
« seul et unique » clone de cellules B. Les anticorps monoclonaux sont des anticorps
ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné. Ils sont par
définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte.
Leurs avantages sont :
- Spécificité : on peut diriger l’anticorps vers un épitope donné de la protéine ;
- Affinité : on peut créer des anticorps extrêmement affines ;
- Production massive et constante de ces anticorps ;
33
1.2- Pour la structure d’un anticorps voir la figure 1 ci-après
Figure 1 : Structure schématique
d’une Ig ou d’un anticorps.
1.3-Fonctions biologiques des Ig
⬧ Dualité fonctionnelle : une fonction de reconnaissance et une fonction
effectrice, correspondant aux différents segments de l’Ac (Fig.2).
a) Fragment Fab : liaison à l’antigène
⬧ Paratope sur l’anticorps complémentaire de l’épitope de l’antigène.
⬧ Paratope se trouve dans les zones hypervariables ou CDR (Complementary
Determining Region) des domaines variables VH et VL.
b) Fragment Fc : Porteur des fonctions effectrices des anticorps :
-Activation du complément (domaine CH2) (fixation C1q)
- Liaison à des récepteurs spécifiques du Fc (cytophilie)
PN, macrophages, NK (Domaines CH2 et CH3)
- Catabolisme des immunoglobulines régulé par le domaine CH2 du Fc
- Passage transplacentaire
34
Figure 2: Différentes activités fonctionnelles associées aux fragments d’anticorps.
2- Technique des hybridomes
La chaine de production des anticorps monoclonaux se passe de la manière
suivante (Fig.3):
✓ Immunisation in vivo
✓ Culture d'un myélome parental,
✓ Fusion proprement dite,
✓ Sélection des hybrides secrétant des anticorps par le milieu sélectif
de culture et le test de criblage,
✓ Enfin, les étapes de production des anticorps monoclonaux soit in vitro,
soit in vivo:
2.1-Protocole d’immunisation in vivo (Immunisation de l'animal)
Choix des animaux
⬧ La souris reste l’animal le plus utilisé, car :
- Une homologie de génome avec celui de l’homme d’environ 95%
- Animaux de petites tailles et faciles à élever, ont une durée de vie courte et se
reproduisent facilement.
- La souche la plus utilisée, souche BALB/C, est une souris élevée en
atmosphère stérile. Son sérum contenant peu d’anticorps naturels, ces souris
permettent ainsi une bonne réponse de son système immunitaire à une stimulation
antigénique. Cette souche nous permet de travailler avec des souris syngéniques,
35
même souche, (cellules de myélome et lymphocytes B compatibles) pour l’étape
suivante, la fusion.
Pour réaliser une hybridation cellulaire il faut :
2.2-Partenaires de fusion :
Cellules B extraites d’organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions).
Une population de plasmocytes possédant l’enzyme: Hypoxanthine guanine
phosphoribosyl transférase (HGPRT) et sécrétant les Ig. Ces plasmocytes contribuent
à la capacité des hybridomes à survivre dans un milieu de culture sélectif HAT
(Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine).
Les Cellules myélomateuses (cellules MOPC de souris Balb/c déficitaire en
HGPRT). Les cellules de myélome utilisées dans les hybridomes n’ont pas l’enzyme
HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase). Elles ont perdu
la capacité de produire des immunoglobulines (mutants Ig-). Les cellules de myélome
n’apportent que leur propriété d’immortalité aux cellules résultant de la fusion.
Figure 3 : Principe de la production des anticorps monoclonaux par
la technique des hybridomes (César Milstein et Georges Köhler, 1970)
36
2.3-Méthode de fusion :
Une fois bien immunisé, l'animal est sacrifiée, la rate est prélevée stérilement
puis dilacérée. Une suspension cellulaire homogène de splénocytes est mélangée avec
les cellules de myélome dans le rapport de 1 pour 5 à 10 splénocytes. Après
centrifugation le culot de cellules est remis en suspension dans l'agent fusionnant:
- Fusion physique : Électrofusion
⬧ Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques
⬧ Technique onéreuse
⬧ Moins destructrice
- Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG)
⬧ fusion des membranes cytoplasmiques
⬧ rendement de fusion élevé
⬧ dimethysulfoxyde (DMSO) renforce la viabilité cellulaire
L’action de PEG est stoppée par addition progressive de milieu de culture
RPMI-1640. Après nouvelle centrifugation pour éliminer l'excès de PEG.
2.4-Méthode de sélection
Les cellules fusionnées sont délicatement remises en suspension dans
le milieu sélectif de culture pour la croissance des hybridomes (RPMI - 1640, 10 à
15 % de sérum de veau fœtal, additionné d'aninoptérine 10-5 M et d'hypoxanthine
10-3M).
Les cellules sont réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y
ait qu'une cellule par puits.
Sélection sur milieu sélectif HAT
- Hypoxanthine Aminopterine Thymidine (substrat de l’enzyme HGPRT)
- Facteurs de croissance : IL6, β-mercaptoethanol
- Sérum de veau foetal
- Fibroblastes
- Sous atmosphère CO2
- Seuls les hybridomes se développent
- 1 x 105 cellules/ml
37
❖ La sélection par le milieu HAT dépend du fait que les cellules de mammifères
peuvent synthétiser les nucléotides par deux voies différentes :
La voie de novo et la voie de récupération en incorporant directement les purines
et les pyrimidines dans les nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ADN et de
l’ARN. Les enzymes qui catalysent la voie de récupération incluent HGPRT
et TK. Une mutation de l’un ou l’autre de ces deux enzymes bloque la capacité de la
cellule à utiliser la voie de récupération et entraîne sa mort dans le milieu HAT.
✓ Les cellules myélomateuses sans voie de sauvetage meurent en milieu HAT.
✓ Les cellules spléniques normales meurent naturellement.
✓ Seuls les hybrides issus de la fusion des 2 types cellulaires survivent.
L’immortalité est apportée par les cellules myélomateuses et la voie de
sauvetage par les cellules spléniques.
Le taux de succès d’une fusion est plutôt faible et varie selon les protocoles utilisés
(de 5% à 50%).
2.5- Méthodes de criblage ou screening des cellules productrices d’anticorps
Les puits de culture positifs contiennent une série entière d’hybridomes
secrétant des anticorps tous différents. La lignée de cellule de l’hybridome réellement
productrice d’anticorps monoclonal doit être isolée avant sa mise en culture.
La sélection des hybridomes producteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques se fait
par des tests d’activité anticorps dans le surnageant de la culture. Les méthodes
utilisées sont la radioimmunologie (RIA), la révélation immunoenzymatique (ELISA),
l’hémagglutination, l’immunofluorescence indirecte. Ces tests sont généralement
effectués entre 9 et 11 jours après la fusion.
38
2.6-Méthode de clonage
Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes
productrices de l'anticorps désiré, les conserver et les cloner. Deux méthodes sont
utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :
Sélection d’une seule cellule et mise en culture
- Soit dans l’Agarose : les cellules se divisent et forment des foyers sur le gel
d’agarose qui ressemblent à des petites sphères. Comme le milieu est semi solide, ces
petites boules peuvent être prélevées à l’aide d’une pipette et placées dans une plaque
de puits de culture après dilution.
- Soit par dilution limite où le clonage est réalisé directement dans une plaque de
microtitration. Cette méthode est la plus utilisée en labo car elle est peu onéreuse.
Cependant, cette méthode est longue, fastidieuse et laborieuse.
-Soit par cytométrie de flux
Seule la technologie de cytométrie de flux permet de sélectionner, parmi
des millions de cellules et à une vitesse de 200 cellules/secondes les hybridomes qui
sécrètent un anticorps spécifique de l’antigène choisi.
3- Production de masse des anticorps monoclonaux
Le but à atteindre ensuite est de faire proliférer l’hybridome sélectionné dans
les meilleures conditions afin de produire suffisamment d’anticorps. La production à
grande échelle d’anticorps monoclonaux repose sur la culture des hybridomes soit
in vivo, soit in vitro.
3.1-Production in vivo : procédé de l’ascite
Le procédé de l’ascite consiste à :
- Injection par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée tout d’abord de pristane
(huile minérale) chez une souris ou un rat, provoquant ainsi une irritation de la cavité
abdominale mais pas encore d’ascite ;
Sur milieu gélosé
Une colonie= une cellule initiale Par dilution limité
Une ou zéro cellules par puits
39
- Injection des hybridomes (106 à 107cellules) dans la cavité péritoine des
souris ;
- Développement d'une dans toute la région péritonéale sous forme d’ascite;
- Multiplication de cellules et production de quantités importantes d’anticorps
monoclonaux.
- Une fois l’ascite a atteint un certain volume, le liquide d’ascite est récupère par
ponction de l’abdomen avec une aiguille,
Une seule souris produira 10 à 20 ml de liquide d’ascite contenant environ
10 mg/ml d’anticorps monoclonaux.
Les inconvénients :
- Petite taille de la souris ;
- Présence dans le liquide de l’ascite de nombreuses enzymes protéolytiques
et d’un mélange de protéines dont certaines sont des immunoglobulines ;
- Le problème éthique a été également soulevé au sujet d’injection des cellules
cancéreuses aux souris.
La production in vivo devient de plus en plus une technique obsolète.
3.2-Production in vitro : procédé par culture cellulaire
Pour diverses applications, il est nécessaire de produire des quantités plus
importantes d’anticorps. Pour l’imagerie in vivo, on doit disposer de quelques
centaines de microgramme d’anticorps par patient. Pour la thérapie in vivo, plusieurs
centaines de milligramme sont requises par patient.
La production in vitro est basée sur la culture des hybridomes dans des milieux
de culture définis.
La culture de cellules peut être effectuée dans (Fig.4):
- des flacons d’un contenu de 0,5 à 1 litre (flacons pour cultures en rotation) ;
- des flacons pour cultures selon Spinner d’un contenu de 1 à 10 litres,
- des réacteurs capillaires (principe de la dialyse) ou dans des fermenteurs de
capacités diverses (10 à 1000 litres) de type batch ou fed batch.
- Actuellement ces bioréacteurs sont perfectionnés selon le procédé Celli-Gen
Plus (New Brunswick Scientific Co, Inc, Edison, New Jersey, Etats-Unis).ces
bioréacteurs comprennent un agitateur à haut débit qui permet de faire circuler le
fluide nutritif et l’oxygène à travers un lit de supports fibreux sur lesquels les cellules
sont fixées en grand nombre.
40
4- Purification et conservation des anticorps monoclonaux
- La purification peut se faire de différentes manières : la chromatographie par
filtration sur gel, chromatographie par échange d’ions ou par précipitation au
sulfate d’ammonium.
- La durée de conservation des anticorps varie de quelques semaines à plusieurs
années en fonction de la nature de l’anticorps et des conditions de stockage
(Tab.1).
Figure 4 : les différents systèmes de culture cellulaire utilisés in vitro
pour la production des AcsM
Flacon Spinner
avec barreau aimanté
Flacon de culture cellulaire
Culture cellulaire dans le bioréacteur
de type Celli-Gen Plus
41
Tableau 1 : Conditions de stockage des anticorps
Encadré 1 : quelques définitions
• Affinité : force de liaison antigène-anticorps.
• Avidité : force avec laquelle un anticorps multivalent se fixe à un antigène plurivalent
(synergie des affinités de chaque Fab pour son épitope).
• Epitope : déterminant antigénique.
• Paratope : site de liaison à l’antigène, présent sur l’anticorps.
• Anticorps monoclonaux : anticorps ayant le même paratope et dirigés contre un seul
épitope. Ils sont produits par un même clone de plasmocytes.
• Anticorps polyclonaux : anticorps reconnaissant de multiples épitopes d’un même
antigène (Ac monospécifique) ou de plusieurs antigènes (Ac polyspécifiques).
Milieux
aqueux, 4oC
25-50%
glycérol ou
éthylène glycol, -20
oC
Congélation à -20/-80oC
ou dans l’azote liquide
Lyophilisé
Durée de vie 1mois 1 an Plusieurs années Plusieurs
années
Concentration
de l’anticorps
1-5 mg/ml 1-5 mg/ml 1-5 mg/ml 1-5 mg/ml
Protéines pour
dilution
BSA BSA BSA Non
Conditions
stériles ou
antibactériennes
Oui généralement Non Non
Antioxydants Généralement;
2-ME, DTT
Généralement;
2-ME, DTT
Non Non
Conjugué
fluorescent
Protéger
de la lumière
Protéger
de la lumière
Protéger de la lumière Protéger
de la lumière
Valeur de pH 7.2-7.6 7.2-7.6 Aucune Aucune
Chélateur
métallique
EDTA EDTA Non Non
Utilisations
multiples
d’un aliquot
Oui Oui Non; les cycles de
congélation/décongélation entrainent la dégradation
des anticorps
Non-
applicable
42
Chapitre 2
Caractérisation des anticorps monoclonaux
à visée thérapeutique
1-Evolutions technologiques des AcsM
Les AcsM ont subi plusieurs modifications technologiques dont l’intérêt est
d’améliorer leur efficacité thérapeutique:
✓ Augmenter la demi-vie1
✓ Moduler les propriétés effectrices selon la situation pathologique
✓ Sélectionner ou bien de renforcer la puissance d’anticorps
✓ Améliorer l’accès intracellulaire
1.1-Technologie d’humanisation des AcsM
Les étapes de la technologique d’humanisation des AcsM est montrée dans figure 1.
-AcsM de la 1ère génération (AcsM murins) = AcsM 100% murins
Pour limiter les réactions immunitaires HAMA (Human Anti-Mouse
Antibodies) les anticorps murins peuvent être utilisés sous forme de fragment Fab
ou Fab′2.
-AcsM de la 2ème génération (AcsM recombinants)
(i) AcsM chimériques composés des parties constantes humaines et des parties
variables murines.
(ii) AcsM humanisés constitués de 90% de séquences humaines, dans lesquelles
seules les régions hypervariables sont d’origine murine.
-AcsM de la 3ème génération (AcsM entièrement humains) : Les anticorps
humains sont constitués exclusivement de séquences d’origine humaine. Ces
anticorps sont dits invisibles ou "transparents" pour le système immunitaire des
patients. Plusieurs méthodologies ont été mises au point pour générer les AcsM
totalement humains dont l’Approche de souris transgéniques2 "xenomouse"(1994) est
l’approche la plus utilisée.
1 Utilisation des AcsM pour diagnostic nécessite plutôt de réduire leur demi-vie
2 Un animal est dit transgénique lorsqu'il possède, outre ses propres séquences d'ADN, des gènes
supplémentaires ou modifiés, dits transgènes, qui ont été ajoutés à son patrimoine héréditaire. Ainsi,
des gènes de souris peuvent être remplacés par des gènes humains codant des immunoglobulines
humaines.
43
Figure 1 : Les différentes générations d’anticorps thérapeutiques.
Tableau : Nomenclature internationale des AcsM
mab: monoclonal antibody
Approche de souris transgéniques3 "xenomouse"(1994) La " xenomouse " est une
souris transgénique qui exprime la grande majorité des gènes codant les
immunoglobulines humaines. Chez ces souris, la machinerie servant à la production
d’immunoglobulines (Ig) de souris est inactivée et humanisée avec la presque totalité
des locus correspondant aux gènes codant les Ig humaines afin de permettre chez cette
3 Un animal est dit transgénique lorsqu'il possède, outre ses propres séquences d'ADN, des gènes
supplémentaires ou modifiés, dits transgènes, qui ont été ajoutés à son patrimoine héréditaire. Ainsi,
des gènes de souris peuvent être remplacés par des gènes humains codant des immunoglobulines
humaines.
Immunogénicité
durée d’action & efficacité
100% Souris
75 % Homme25% Souris
90% Homme10% Souris
100% Homme
44
souris la production d’une large diversité d’anticorps humains de forte affinité.
L’obtention
de ces souris nécessite trois grandes étapes.
– La première consiste à inactiver les gènes codants pour les chaînes légères
et lourdes de l’anticorps considéré. Cette manipulation a été réalisée dans des cellules
souches embryonnaires (cellules ES pour embryonic stem).
– La seconde étape consiste à transférer chez la souris les locus correspondant
aux gènes des anticorps humains. Le clonage de ces locus a été facilité par
l’utilisation des chromosomes artificiels de levure (Yeast artificial chromosome,
YAC).
L’étape finale consiste à réimplanter les cellules ES dans l'utérus de souris
femelles. Les descendants de ces souris exprimant les chaînes lourdes et légères des
anticorps humains. Après immunisation de ces souris avec l’antigène, on peut obtenir
des anticorps humains en suivant la technique classique des hybridomes décrite
par Köhler et Milstein.
1.2- Technologie de l’ingénierie génétique et moléculaire
L’ingénierie génétique moléculaire des AcsM a permet d’améliorer leurs
propriétés pharmacologiques dans le but d’accroître leur efficacité et leur sécurité
d’utilisation.
L’ingénierie génétique et moléculaire des AcsM est basée principalement sur
les approches de mutagénèse aléatoire ou dirigé et les banques combinatoires
obtenues par la technique du phage display.
Cette ingénierie se réalise de façon rationnelle en fonction de la pathologie à traiter et
de la stratégie thérapeutique envisagée.
Optimisation des propriétés préexistantes. Ces caractéristiques pharma-
cologiques peuvent être modulées à façon en jouant sur l’architecture moléculaire des
anticorps: mutation des CDRs, changements d’isotype, ingénierie et glyco-ingénierie
du fragment Fc, ingénierie de la région charnière, format de l’anticorps (taille,
multivalence, multispécificité, conjugaison à d’autres molécules ou particules).
1.2.1- Anticorps monoclonaux optimisés
a. Optimiser les propriétés du fragment variable (Fab)
-Propriétés de liaison à l’antigène : l’amélioration in vitro de l’affinité et de
la spécificité des AcsM est réalisée soit par l’introduction des mutations localisés ou
aléatoires dans les régions variables.
45
b. Optimiser les propriétés du fragment constant (Fc)
-Optimisation des fonctions effectrices : Les fonctions effectrices
des anticorps thérapeutiques sont portées par le fragment Fc. En fonction de la
pathologie à traiter, ces fonctions effectrices peuvent être requises car elles
contribuent à l’efficacité thérapeutique (cancer), ou bien au contraire indésirables car
elles sont responsables d’effets secondaires chez les patients.
L’optimisation du "profil effecteur" doit être guidée par la nature
de l’antigène ciblé, la stratégie thérapeutique envisagée et le contexte clinique
de la pathologie.
-Optimisation des propriétés pharmacocinétiques et de biodistribution : La
demi-vie et la biodistribution des anticorps sont deux paramètres étroitement liés qui
dépendent à la fois de l’anticorps (fragment, anticorps entier, murin, humanisé,...)
et de l’antigène cible (densité, internalisation,...).
En fonction de la situation pathologique: l'augmentation de la demi-vie
est souhaitable pour améliorer l’efficacité et optimiser la distribution et la rétention
dans les tissus ciblés. En revanche, dans d’autres cas, il est préférable de restreindre la
demi-vie pour limiter les effets secondaires ou accroître la résolution lors d’une
utilisation des anticorps en imagerie.
Un moyen efficace pour moduler la pharmacocinétique des anticorps
thérapeutiques est de moduler l’interaction entre le fragment Fc et le récepteur FcRn
(neonatal Fc receptor) 4.
-Optimisation des propriétés biophysiques : les dégradations physico-chimiques
classiquement retrouvées pour les anticorps, incluent la dénaturation, l’agrégation,
l’hydrolyse, la désamidation ou désamination et l’oxydation, peuvent avoir l’impact
sur l’efficacité et la sécurité du produit. Afin de limiter l’apparition de tels
phénomènes, il est possible d’intervenir à deux niveaux : soit directement au stade de
la production des AcsM soit au niveau du développement galénique.
1.3-Technologie de l’ingénierie chimique et biochimique
L’ingénierie chimique et biochimique ont permis de combiner des anticorps
avec des composés chimiques par le biais d’un agent de liaison (linker). Cette
technologie permet de synthétiser des AcsM dotés de nouvelles fonctionnalités
des AcsM immuno-conjugués ou Acs tueurs (Fig.2).
4 FcRn est le récepteur responsable du recyclage des IgG qui leur assure une demi-vie
d’environ 20 jours chez l’homme.
46
Le principe de cette approche consiste en l’utilisation des anticorps
monoclonaux comme des vecteurs permettant une délivrance ciblée de ces molécules
directement sur leurs sites d’action.
L’AcsM joue le rôle de porteur pour guider l’agent vers la cible spécificité
du ciblage
Figure 2 : Anticorps monoclonaux conjugués
1.4- De nouveaux formats pour les anticorps
Pour un usage thérapeutique et/ ou diagnostic, l’utilisation de fragments
d’anticorps de taille réduite et d’affinité élevée est recherchée afin de faciliter l’accès
au domaine intracellulaire de la cible.
1.4.1- Obtention par voie enzymatique
-Les fragments (Fab’)2 et Fab
Les formats Fab (55 kDa) et F(ab’)2 (110kDa), produits par voie enzymatique
(Fig.3), ont été les premiers fragments d’anticorps utilisés pour le diagnostic in vivo
des tumeurs. Néanmoins, l’inconvénient de ce format est sa monovalence (un seul
paratope) ce qui diminue son affinité totale (avidité) et donc réduit sa fixation dans
les tumeurs. Par ailleurs, l’avancée de la biologie moléculaire a permis l’ingénierie de
fragments d’anticorps de tailles et valences variables.
immunoenzyme immunocytokine immunotoxine immunoradionucléique
Particules magnétique
chargées d’AcsMimmunoliposome
47
Figure 3 : Clivage protéolytique de la molécule d'Ac.
1.4.2 - Obtention par ingénierie moléculaire
a. Single chain variable Fragment (scFv)
Le scFv est la plus petite unité capable de lier l’Ag (single-chain variable
fragment). Ce fragment est constitué que des régions variables lourdes et légères
reliées par un lien peptidique de 12 à 25 acides aminés. Ce fragment, de 25 et 30
kDa, représente un sixième de la taille d’un anticorps entier (Fig.4). Le scFv conserve
la même spécificité et affinité que l’anticorps monoclonal dont il est issu, mais reste
un fragment monovalent.
Figure 4: Conception du fragment scFc
Une séquence codant pour un polypeptide
flexible de 15 à 20 acides aminés
(dénommé Linker)
Une séquence codant pour un polypeptide
flexible de 15 à 20 acides aminés
(dénommé Linker)
48
A partir du format scFv, deux stratégies ont été développées pour produire
des fragments d’anticorps :
b. des chimères scFv-région constante: scFv-CH3 et scFv-Fc (Fig.5)
c. des multimères ou multi-valents de scFv: diabody, triabody, tetrabody
(Fig.6).
Figure 5 : Représentation schématique des différents formats d’anticorps
Figure 6: Représentation schématique des multimères de scFv
49
d. Fragments multispécifiques
L’utilisation des anticorps multispécifiques bloquent simultanément plusieurs
voies pathologiques avec une seule molécule. Les AcsM multispécifique sont
de même intérêt potentiel que l’utilisation des anticorps polyclonaux ou oligoclonaux
dirigés contre un même ou différents antigènes pathologiques.
Acs bispécifiques : Ces anticorps recombinant bispécifiques peuvent se lier à deux
cibles différentes. Les anticorps bispécifiques possèdent deux paratopes différents sur
une même molécule d’anticorps et ainsi une double spécificité (Fig.7).
Figure 7: Format d'AcM bispécifique
✓ Anticorps bispécifiques ciblant d’une part un antigène tumoral, et d’autre part
le récepteur CD3 des lymphocytes T. La propriété la plus impressionnante de ces Acs
bispécifiques est leur capacité à activer fortement les lymphocytes T cytotoxiques
en l’absence de facteurs de co-stimulation. Ces anticorps sont appelés triomabs
car ils sont trifonctionnels. Ils peuvent cibler efficacement les cellules tumorales,
induire leur destruction en activant les LT et également recruter des cellules
de l’immunité innée (macrophages, cellules NK, cellules dendritiques) via le Fc
(Fig.8).
✓ Anticorps bispécifiques possédant un bras agoniste du récepteur FcγRIIIa
(CD16) et un autre bras liant un antigène tumoral, pourraient être des agents
thérapeutiques efficaces pour traiter les cancers. Ces Anticorps bispécifiques sont
capables de mobiliser les cellules NK pour déclencher le processus d’ADCC.
Ac naturel possède deux régions
variables de même spécificité.Ac bispécifique possède une partie variable
de spécificité A et une autre de spécificité B.
Ac naturel possède deux régions
variables de même spécificité.Ac bispécifique possède une partie variable
de spécificité A et une autre de spécificité B.
50
Figure 8: Schéma illustrant l'action d'un AcM bispécifique
Tumeur maligne de péritoine
Administré par voie intra-
péritoniale
Tumeur maligne de péritoine
Administré par voie intra-
péritoniale
51
Chapitre 3
Utilisation thérapeutique des anticorps monoclonaux
1-Cibles des anticorps thérapeutiques
Deux tiers des molécules ciblées par les anticorps thérapeutiques sur le marché
sont des protéines de surface (récepteurs, molécules d’adhésion, protéines
d’enveloppe virale) alors que le un tiers restant correspondent à des molécules
solubles (cytokines, facteurs de croissance) (Fig.1). La plupart des AcsM
thérapeutiques actuellement sur le marché sont des IgG.
Figure 1 : Cibles des anticorps thérapeutiques approuvés et en cours de phase III
2-Anticorps non conjugués ou anticorps nus : Anticorps protecteurs
2.1-Modes d’action : à la différence des petites molécules chimiques, les anticorps
thérapeutiques présentent des modes d’actions très variés et souvent multiples (Fig.2).
2.1.1-Effets neutralisants (assuré par le fragment Fab)
Le mode d’action le plus commun correspond tout simplement :
(i) Effet de blocage : fixation de l’anticorps sur sa cible en l’empêchant
d’exprimer son activité biologique et l’interaction avec d’autres partenaires
Virus
Bactéries
Enzymes
Canaux ioniques
Transporteurs
Ligands: peptides, hormones, cytokines,Facteurs de croissance
52
(récepteurs, enzymes et transporteurs). Ce mode d’action implique beaucoup plus des
antigènes solubles (ligands, toxines)
(ii) Effet antagoniste : action directe de l’anticorps sur les récepteurs en
empêchant l’accès du ligand pour son récepteur et ainsi inhiber l’activation des voies
de signalisation responsable de la pathologie. C’est le cas des récepteurs à tyrosine
kinase. Ces récepteurs sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que
la prolifération cellulaire ou la différenciation. Les anticorps anti-EGFR ou anti-IGF-
1R comme le cétuximab et le dalotuzumab qui, en empêchant la fixation des facteurs
de croissance sur leurs récepteurs, permettant d’inhiber la croissance de diverses
tumeurs.
Figure 2 : Principaux mécanismes d’action des anticorps monoclonaux
2.1.2-Effets biorégulateurs (assuré par le fragment Fab)
Ces effets se résument par une action agoniste des Acs via :
✓ L’internalisation de récepteurs
✓ L’empêchement du processus homo ou hétéro-dimérisation
✓ L’induire des voies d’apoptose des cellules cibles
✓ La modulation de l’activité des récepteurs : ces anticorps thérapeutiques
engendrent des effets comparables du ligand naturel. C’est le cas des AcsM anti-
récepteur CD3 (muromomab) utilisé pour la transplantation et en phase III et pour
le diabète de type 1 (otélixizumab et téplizumab). En se fixant sur le CD3, ces Acs
permettent d’induire le relargage de calcium intracellulaire et la production des
Effets neutralisants
53
cytokines à action tolérogène favorisant l’expansion de LT CD8+ régulateurs plutôt
que les Tc.
La plupart des anticorps anti-récepteurs présentent à la fois des propriétés
agonistes et antagonistes. C’est en fait la combinaison de ces différentes activités qui
permet d’expliquer le mode d’action des anticorps, à la fois responsable des effets
thérapeutiques, mais aussi des effets toxiques.
2.1.3- Effets immunotransmis
Les anticorps peuvent, via leur fragment Fc, interagir avec le système
immunitaire de l’hôte et déclencher l’élimination de l’antigène cible par différents
mécanismes de cytotoxiques :
(i) Cytotoxicité Cellulaire Dépendante d’Anticorps (CCDA) : l’anticorps via son
Fc se lie sur le récepteur FcγRs situé généralement sur les cellules immunitaires
cytotoxiques, le cas des cellules NK.
(ii) Cytotoxicité dépendante du Complément (CDC) : La CDC met en jeu
l’interaction de la 1ère fraction du complément C1q et le fragment Fc de l’Ac. La
liaison du C1q sur le Fc déclenche l’activation de la cascade du complément, ce qui
aboutit à la formation du complexe d’attaque membranaire et la lyse de la cible.
(iii) Cytotoxicité Cellulaire Dépendante du Complément (CCDC) : le complément
peut également potentialiser la CCDA via l’interaction de la protéine iC3b avec son
récepteur CR3 (CD11b/ CD18) exprimé par les phagocytes et les cellules NK.
(iv) Cytotoxicité Cellulaire Dépendante d’opsinisation (CCDA) : les cibles
tapissées par des anticorps peuvent également être internalisées puis détruites par de
cellules phagocytaires.
La destruction de la cible défaillante par ces modes peut être particulièrement
efficace dans le cas d’une agression tumorale ou infectieuse mais peut être délétère
dans d’autres situations pathologiques.
54
2.2-Applications des Acs protecteurs dans le traitement de certaines affections
2.2.1- Maladies virales
Les virus sont des cibles d’intérêt pour les anticorps monoclonaux dans
la mesure où de nombreux virus n’ont pas de traitement spécifique. Utilisés en tant
qu’anticorps neutralisants, ils sont capables d’empêcher la liaison et l’entrée
des pathogènes dans les cellules hôtes.
Virus Respiratoire Syncytial (VRS) : Ce virus entraîne des troubles graves des voies
respiratoires inférieures chez les jeunes enfants. Il est neutralisé par un anticorps
monoclonal de type IgA qui exerce une action neutralisante uniquement mais
également par deux IgG1 humanisés liant spécifiquement la protéine de fusion.
✓ AcM palivizumab commercialisé sous le nom de Synagis®. Le seul anticorps
monoclonal autorisé à ce jour.
AcM humanisé, IgG1
Cible : Site antigénique A de la glycoprotéine F du virus respiratoire syncytial (VRS)
Mode d’administration : IM dans la cuisse
Laboratoire : Abbott/ MedImmune
Indication : prévention des infections respiratoires graves, dues au virus respiratoire
syncytial (VRS)
Posologies : 15 mg/kg une fois par mois pendant les périodes à risques d’infections à
VRS
Mécanisme d’action : Il y a deux principales protéines immunogènes à la
surface du virus respiratoire syncytial: la glycoprotéine F (fusion) et G (facteur
d'attachement à l’épithélium bronchique). La protéine F est hautement conservée et
nécessaire pour infecter les cellules alors que la protéine G est variable. Le virus
s’adsorbe à la surface des cellules, via la protéine G et la protéine F (fusion entre
membranes du virus et de la cellule hôte). Le palivizumab bloque l’entrée du virus en
liant la protéine F du VRS, ce qui empêche la fusion des membranes et la formation
de syncitia (qui permet au virus de passer de cellules en cellules).
55
⬧ Virus immunodéficient humain (VIH): l’infection par le virus du sida
a toujours été un domaine de grand intérêt pour l’application thérapeutique des
anticorps monoclonaux d’autant plus que le développement de vaccins est lent et
incertain. Le VIH connaît des résistances aux traitements, notamment aux thérapies
antivirales combinées.
Il existe 4 anticorps monoclonaux en phase I et II. La principale voie explorée est
l’inhibition de l’entrée du VIH dans les cellules au niveau des récepteurs CCR5 ou
CD4 ou de la glycoprotéine virale gp 120.
Un antirétroviral anti-ccr5 pro 140 est en phase d’étude clinique. Il cible le
principal co-récepteur pour l’entrée du VIH dans les cellules, le récepteur de
chimiokines CCR5. AcM, le Maraviroc®, une molécule antagoniste du CCR5.
L’efficacité de ces anticorps pourrait être améliorée en augmentant l’affinité de la
partie Fc pour certains de leurs récepteurs situés à la surface des cellules
présentatrices d’antigènes. D’autre part, les variants protéiques constituent un obstacle
à l’élaboration d’anticorps adaptés. La solution réside sûrement dans la combinaison
du ciblage de certaines protéines des cellules hôtes par des anticorps monoclonaux
avec les thérapies existantes, tout en restant attentif à d’éventuels effets secondaires
⬧ Cytomégalovirus : le CMV est un virus de grande taille pouvant persister dans
l’organisme à l’état latent. Il est très répandu au niveau mondial et affecte par
exemple 60% des adultes aux Etats-Unis. LeSevirumab, MSL 109, est actuellement
en phase clinique pour son traitement chez les personnes infectées par le VIH et les
nouveau-nés. Il s’agit d’un anticorps monoclonal humain.
⬧ Virus de l’hépatite B et C : les hépatites sont des inflammations du foie
causées le plus souvent par des virus. Les hépatites B et C représentent deux des cinq
virus entraînant une infection ciblée et une inflammation du foie. Il existe
actuellement deux anticorps monoclonaux en développement, ciblant ces virus.
Le bavitumab et le MDX-1106 visent à améliorer le contrôle des infections hépatiques
chroniques tout particulièrement dans le cas de co-infection avec le VIH.
⬧ Les virus de la grippe : la menace d’une pandémie grippale fait du virus
de la grippe un candidat de choix pour le développement d’anticorps monoclonaux.
La principale difficulté réside dans le fait que les variations antigéniques entre
les différentes souches sont très importantes. Cependant un anticorps étant capable
de cibler des souches H5N1 comme H1N1 a été mis en évidence et un anticorps
56
spécifique du variant H5 de la protéine hémagglutinine de la souche H5N1 est en
développement
⬧ Des anticorps monoclonaux sont également en développement contre d’autres
virus comme la rage, le West Nile Virus, les virus Hendra et Nipah ou le SRAS
corona virus. La principale difficulté rencontrée est, là encore, l’existence de
nombreuses variations antigéniques des virus pathogènes.
2.2.2 -Traitements des maladies auto-immunes Maladie caractérisée par une agression de l'organisme par son propre système
immunitaire. L’auto-immunité est la rupture des mécanismes de tolérance qui conduit
à l’action pathogène du système immunitaire vis-à-vis de constituants naturels
de l’organisme et à l’apparition d’une maladie dite auto-immune.
Classification des maladies auto-immunes
On distingue :
Les lymphocytes B jouent un rôle central dans la pathogénie des maladies auto-
immunes. Ceci laisse penser que des traitements spécifiquement dirigés contre les
lymphocytes B doivent être efficace au cours des maladies auto-immunes.
Le rituximab est un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la molécule
CD20 exprimée à la surface de certains lymphocytes B au cours de leur
différentiation.
Mode d’action du Rituximab : Les fonctions mêmes de la cible (CD20) du rituximab
étant partiellement connues, les modes d’actions de cet anticorps sont également mal
élucidés. Le rituximab pourrait induire la déplétion lymphocytaire B par plusieurs
mécanismes pouvant être associés:
(i) une cytotoxicité médiée par le complément.
Maladies autoimmunes spécifiques d’organes Maladies auto-immunes systémiques ou non
spécifiques d’organes
Diabete de type 1;
Thyroidite auto-immune ;
Hepatopathies auto-immunes ;
Myasthenie ;
Maladies bulleuses auto-immunes ;
Vitiligo ;
Uveite auto-immune ;
Retinite auto-immune ;
Cytopenies auto-immunes.
Lupus systemique ;
Syndrome de Gougerot-Sjogren ;
Polyarthrite rhumatoide ;
Sclerodermie ;
Polymyosite et dermatopolymyosite ;
Connectivite mixte ;
Vascularite primitive ;
Polychondrite atrophiante.
57
(ii) une cytotoxicité cellulaire avec un rôle prépondérant du récepteur
à la portion Fc des Ig (FcγR) des cellules effectrices (monocytes, macrophages,
cellules NK).
(iii) un arrêt du cycle cellulaire et une apoptose des cellules B. La fixation
du rituximab sur sa cible (et probablement son cross-linking) induit un changement de
conformation de la molécule CD20 par le biais d’une phosphorylation.
Il s’ensuit une augmentation du flux calcique vers le secteur intracellulaire et
donc une augmentation de la concentration intracellulaire du calcium avec comme
conséquence le blocage du cycle cellulaire en phase S.
Les antigènes responsables de ces maladies sont mal définis comme l’est la
hiérarchie de leur implication. En revanche, notre connaissance détaillée des
mécanismes intermédiaires d’entretien de l’inflammation et de la destruction tissulaire
a permis d’identifier des cibles puis des molécules thérapeutiques, et notamment des
anticorps monoclonaux.
2.2.3-Maladies neurodégénératives
Maladie neurodégénérative : maladie progressive qui affecte le cerveau ou plus
globalement le système nerveux, entraînant la mort des cellules nerveuses. Les plus
fréquentes sont la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. L'aducanumab, un
anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine bêta-amyloïde (Peptide β amyloïde
est une protéine néfaste pour le SN agrégats empêche et abaisse l’efficacité de
la transmission synaptique cholinergique) a permis de ralentir le déclin des fonctions
mentales chez des patients souffrant d'une forme précoce d'Alzheime.
2.2.4-Maladies allergiques
Les maladies allergiques sont caractérisées particulièrement par l’élévation du
taux d’IgE. Actuellement un AcsM, omalizumab ((XOLAIR®) anti-IgE, est
disponible sur le marché comme traitement des asthmes allergiques sévères.
AcM humanisé, IgG1k
Cible : immunoglobuline E (IgE)
Mode d'administration : SC, utilisé à partir de 6 ans
Laboratoires : Genentech Inc / Novartis Pharmaceuticals Corp/ Tanox Inc
Indication : asthme allergique persistant
Prix indicatif 2013: 441,85€ pour 1 seringue de 1 ml soit 150 mg
Usage : prescription initiale hospitalière annuelle
Posologie : selon poids corporel et taux initial d’IgE (UI/ml). Par exemple, pour un
adulte de 70 kg et un taux initial de 50 UI/ml, 75 mg doivent être injectées par dose.
58
▪ Mécanisme d’action : L’omalizumab est un anticorps qui se fixe à l’IgE. Il
empêche ainsi le processus de déclenchement de l’asthme en bloquant la fixation de
l’IgE sur le récepteur de forte affinité FcεRI présent sur les mastocytes, les basophiles
et les éosinophiles.
Traitement des asthmes sévères hyperéosinophilique :
Les AcsM, le mépolizumab et le reslizumab, anti-IL-5 administrés par voie
intraveineuse, ont montré une suppression des éosinophiles circulant et de
l’expectoration, mais sans amélioration clinique ou fonctionnelle significative.
Une approche alternative par l’AcM, benralizumab, pour antagoniser l’IL-5 est
de bloquer le récepteur de l’IL-5 et d’induire l’apoptose des éosinophiles et des
basophiles.
2.3-Thérapie combinée
Cette thérapie consiste à la combinaison de la radiothérapie ou chimiothérapie
avec l’immunothérapie passive à base des AcsM. Face au manque d’efficacité des
approches thérapeutiques décrites précédemment, de nouvelles stratégies ont été
envisagées pour optimiser les fonctions effectrices du fragment Fc et également
pour doter les anticorps de nouvelles fonctions plus adaptées à la destruction de la
cible. Ces nouvelles fonctions consistent à coupler aux Acs des molécules ou de
particules leur permettant d’exercer leur fonction selon d’autres modes. Ces anticorps
couples sont appelés les immunoconjugués.
59
3-Les anticorps tueurs (AcsM couplés ou conjugués)
L’efficacité thérapeutique repose sur les effets cytotoxiques puissants de
médicaments chimiques ou de radio-isotopes qu’il aurait été trop dangereux
d’administrer sans ciblage, avec des effets indésirables hors des tissus cibles.
3.1-Les immunodrogues et immunotoxines
(i) Toxines ou drogues utilisés : extraits de plantes (ricine et l’abrine), les toxines
des bactéries comme la toxine diphtérique et antibiotiques etc.
(a) Un traitement faisant appel à une immunotoxine diphtérique:
Structure des toxines diphtérique : Protéines possédant habituellement
un domaine de fixation non spécifique aux cellules et un domaine capable d’inhiber
la synthèse protéique.
Synthèse de toxine chimérique : remplacement du domaine de fixation non
spécifique de la toxine par un anticorps, la toxine peut être dirigée spécifiquement
vers des cellules tumorales.
Mode d’action : Après liaison à la surface de la cellule, le complexe anticorps-
toxine est internalisé dans des vésicules et les compartiments de l’appareil de Golgi
où la présence d’un pH faible facilite la protéolyse de la toxine. La sous-unité
toxique est transportée vers le cytosol de la cellule. Dans le cytosol, le domaine
catalytique de la toxine peut modifier le facteur d’élongation 2 ou inactiver l’ARN
ribosomial 28S, et de cette manière, inhiber la synthèse protéique indispensable
à la survie de la cellule défaillante.
✓ Un Ac monoclonal anti-CD3 couplé à la toxine diphtérique a été testé
récemment avec succès dans le lymphome cutané à cellules T.
(b) Un traitement faisant appel à la calicheamicin
La calicheamicin est, antibiotique cytotoxique très puissant, un membre
hydrophile de la famille des antibiotiques qui clive les séquences spécifiques
des doubles hélices de l’ADN.
✓ Un Ac monoclonal humanisé [Le gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)]
ciblant spécifiquement l’antigène CD33 qui se retrouve à la surface de la plupart
des cellules leucémiques blastiques. Cet Ac est conjugué à la calicheamicin.
Le mode d’action : Le complexe gemtuzumab ozogamicin-calicheamicin
se lie à l’antigène de surface CD33 des cellules leucémiques myéloïdes. Le complexe
pénètre dans la cellule et la calicheamicin est ensuite libérée dans les lysosomes
60
des cellules myéloïdes. Elle se lie à l’ADN, ce qui entraîne une cassure de l’ADN,
suivie d’une apoptose cellulaire.
3.2-Anticorps conjugués à des enzymes
Cette approche séquentielle, qui consiste à réaliser un préciblage de la tumeur
avec l’anticorps conjugué puis à injecter une pro-drogue, est nommée ADEPT pour
Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy. L’enzyme couplé à l’Ac transforme in
situ la pro-drogue en un composé cytotoxique au voisinage de cellules tumorales.
Cette technique permet de diminuer la toxicité générale de la drogue tout en
assurant une efficacité locale maximale. Dans certains cas, la prodrogue peut être
activée spécifiquement par des peptidases endogènes. Enzymes couplés avec les
AcsM : Amidases, kinases, phosphatases, glycosidases, carboxypeptidases, glucuro-
nidase et β-lactamase.
3.3- Immunocytokines
L’utilisation de cytokines (IL-2, IL-12, GM-CSF), en combinaison avec un
traitement à base d’anticorps, s’est révélée efficace pour améliorer le traitement de
certains cancers. Néanmoins, l’injection systémique de cytokines provoque des effets
secondaires importants. Par conséquent, des anticorps couplés à des cytokines ont été
générés et ont montré des effets anti-tumoraux significatifs et une réduction des effets
secondaires.
3.4-Anticorps conjugués à des radio-isotopes : radio-immunothérapie
Les Ac radio-marqués permettent de réaliser une irradiation ciblée sur le site
tumoral en épargnant au maximum les tissus sains.
❖ Les radio-isotopes utilisés
✓ Les émetteurs β peuvent traverser jusqu’à quelques centimètres de tissus.
Cytotoxique sur un rayon de plusieurs cellules. Les beta-émetteurs 131I, 90Y et 177Lu
sont les plus prometteurs et les plus pratiques pour destruction des tumeurs
volumineuses.
✓ Les émetteurs α ont une demi-vie courte et émettent de l’énergie sur une très
faible distance. Les alpha-émetteurs 213Bi, 225Ac et 211At sont les plus utilisés pour la
destruction tumeurs de petit volume sans affecter les cellules saines
immédiatement adjacentes aux cellules tumorales. La radio-immunothérapie a surtout
été utilisée dans le traitement des lymphomes parce que ces tumeurs sont
généralement fortement radio-sensibles. Pour limiter l’exposition aux radiations, des
61
Acs monoclonaux murins ont été choisis car leur haute immunogénicité favorise une
clairance rapide du produit.
3.5-Anticorps conjugués à un médicament (Les immunoliposomes)
Cette technologie, appelée immunoliposomes, consiste à encapsuler des
molécules ou des nucléotides à action thérapeutique dans les liposomes et, grâce aux
Ac monoclonaux, peuvent être téléguidés directement sur les cellules cibles. Bien que
cette approche soit encore à un stade de développement, des progrès significatifs ont
été réalisés ces dernières années.
Mode d’action : les immunoliposomes offrent l’avantage d’augmenter
l’interaction locale avec la cellule cible, soit sous la forme d’une fusion avec la
membrane cellulaire, soit grâce à une internalisation par endocytose, ce qui aboutit à
un plus haut taux de rétention de l’agent pharmacologique.
Les immunoliposomes ont été utilisés avec succès in vivo pour délivrer,
de façon ciblée dans la tumeur, des gènes suppresseurs de la tumeur, grâce à des
fragments d’Ac monoclonaux contre le récepteur humain de la transferrine. Cette
approche a été appliquée à des tumeurs cérébrales ou à des cancers du sein.
Cette technique peut également être utilisée dans un but d’imagerie à visée dia-
gnostique. Dans ce cas, les immunoliposomes sont utilisés pour acheminer de façon
ciblée des agents de contraste utilisés en résonance magnétique nucléaire ou des
radioéléments utilisés en médecine nucléaire.
3.6- Anticorps greffés à la surface de nanoparticules
Enfin, l’essor parallèle des nanotechnologies et de l’ingénierie moléculaire des
anticorps a permis l’émergence de nanoparticules fonctionnalisées avec des anticorps
ou des fragments d’anticorps. Ces nanoparticules peuvent renfermer des molécules
actives (comme les immunoliposomes cités plus haut) ou simplement se composer
d’atomes métalliques.
Grâce aux anticorps greffés à leur surface, les nanoparticules peuvent être
injectées et redirigées efficacement vers les tissus cibles, en particulier les tumeurs.
Une fois localisées au sein des tumeurs, les nanoparticules métalliques peuvent servir
à réaliser de l’imagerie (Imagerie par résonance magnétique IRM, une technique qui
peut permettre de détecter précocement les cancers) mais aussi de la thérapie
hyperthermique (par oscillation magnétique ou rayonnement infrarouge).
62
4-Anticorps vaccins
Un idiotype est une partie d’un anticorps qui sert à reconnaître l’antigène
spécifique contre lequel
l’anticorps devra lutter.
Vaccination idiotypique
Les vaccins anti-idiotypes déclenchent une réaction du système immunitaire
presque de la même façon que le font les vaccins antigéniques (Fig.4). Ils incitent le
corps à produire des anticorps contre des cellules cancéreuses. Les anticorps agissent
comme les antigènes situés à la surface des cellules cancéreuses. Lorsqu'on injecte le
vaccin, celui-ci incite le système immunitaire à reconnaître les antigènes des cellules
cancéreuses. Les lymphocytes B produisent alors des anticorps contre les antigènes
des cellules cancéreuses
Figure4 : Principe de base de la vaccination anti-idiotypique
Mécanisme d’action
Le vaccin BiovaxID® est fabriqué selon un processus connu sous le nom de
« rescue fusion hybridization ». Indiqué dans Lymphome non-hodgkinien.
La « rescue fusion hybridization » est un procédé dans lequel les cellules tumorales
individuelles obtenues par biopsie sont fusionnées avec une cellule sécrétant des
anticorps pour former un hétérohybridome (Fig.5). Cette cellule sécrète alors
63
l'idiotype unique d'immunoglobuline ou l'antigène caractéristique de la tumeur
individuelle, qui est purifié pour une utilisation comme vaccin.
Figure 5 : Stratégie de production des anticorps anti-idiotype
L'idiotype de la tumeur du patient est ensuite lié de manière covalente avec
une protéine appelée hémocyanine de patelle (KLH : keyhole limpet hemocyanin).
Cette protéine, qui est totalement étrangère à la biologie humaine déclenche une
réponse immunitaire générale. En effet, l’hemocyanine de patelle est un pigment
transporteur d’oxygène très immunogène, d’un mollusque appelé Megathura
Cranulata.
Le complexe idiotype-KLH est injecté par voie sous cutanée avec un adjuvant
immunologique, le facteur de stimulation GM-CSF.
5- Effets secondaires
Il existe toujours des limitations importantes qui freinent l’utilisation massive
des AcsM en clinique ; principalement le coût excessif des traitements, le manque
d’efficacité (surtout en oncologie) et dans des cas plus rares, la survenue d’effets
indésirables graves : infections opportunistes, syndrome cytokinique, pathologies
auto-immunes, toxicité d’organe et immunogénicité.
64
Chapitre 5
Propriétés pharmacocinétiques des AcsM
Introduction
Pourquoi étudier la pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques ?
Anticorps sont caractérisés par une forte variabilité pharmacocinétique
• Il existe une relation concentration-effet: efficacité quand les concentrations
•Donc, la variabilité pharmacocinétique influence, au moins en partie, la variabilité
de l’effet.
•Connaissance de la pharmacocinétique: adaptation des posologies en vue
d’optimiser l’efficacité.
Le but de chapitre est de faire le point sur les propriétés pharmacocinétiques
des anticorps monoclonaux utilisés actuellement en thérapeutique.
1-Administration (Absorption)
Les anticorps monoclonaux sont administrés par voie intraveineuse ou par voie
intramusculaire. La voie sous-cutanée, la voie intrapéritonéale et la voie
intralymphatique ont été utilisées lors d'essais thérapeutiques.
✓ Absorption lente (Cmax atteinte en 2 – 10 jours)
✓ Mécanisme mal connu (probablement drainage lymphatique, FcRn)
✓ Fraction absorbée : ~ 60%
2-Distribution
➢ Distribution aux tissus : mécanismes actifs (FcRn)
➢ Distribution aux cibles : Fixation aux cibles antigéniques : grande affinité et
spécificité
• Cibles circulantes (Infliximab anti-TNF, bevacizumab anti-VEGF)
• Cibles cellulaires (Rituximab anti-CD20 exprimé sur les lymphocytes B)
• Tumeurs : Pénétration de l’anticorps au sein de la tumeur (Trastuzumab anti-
HER2)
La phase de distribution apparaît déterminante pour les anticorps à visée
tissulaire c'est-à-dire les anticorps utilisés en oncologie. Globalement, les anticorps
65
monoclonaux diffusent mal et de manière hétérogène dans les tumeurs. La distribution
dépend de:
✓ La physiologie tumorale : La distribution tumorale est liée à deux
paramètres :
la vascularisation de la tumeur (perméabilité, débit sanguin) et la différence de
pression observée entre le capillaire tumoral et le liquide interstitiel. Ainsi la
distribution tumorale des AcsM est limitée probablement à la mauvaise
vascularisation tumorale (distance importante entre le capillaire sanguin et certaines
zones tumorales) comparée au tissu sain.
✓ l'affinité pour l'antigène membranaire cible et l'intensité de l'expression
antigénique. Le principal facteur limitant la diffusion tumorale des anticorps apparaît
être la captation spécifique de l'anticorps en périphérie tumorale. L'augmentation de la
dose améliore partiellement (de manière non proportionnelle) la distribution
tumorale.
✓ La masse moléculaire de l’AcM peut également constituer un facteur limitant.
Les fragments Fab (poids moléculaire 50 000 D) ou scFv (poids moléculaire 27 000
D) présentent une diffusion plus rapide et plus homogène que l'anticorps entier dans
un modèle murin porteur de xénogreffes. Néanmoins, l'utilisation des fragments Fab
est limitée par leur demi-vie d'élimination courte (inférieure à 12 heures) et par
l'absence du fragment Fc impliqué dans l'activité cytotoxique.
Les approches destinées à optimiser la diffusion tumorale ont souligné les
difficultés à optimiser la liaison à l'antigène, l'activité cytotoxique, la diffusion
tissulaire et les paramètres d'élimination.
Le passage des AcsM à travers la barrière hématoencéphalique est très faible.
Les concentrations évaluées simultanément dans le sérum et le liquide céphalo-
rachidien, chez une patiente, montrent un très faible passage de l'anticorps
monoclonal (212 ng/mL dans le liquide céphalo-rachidien versus 70326 ng/mL dans
le sérum).
3-Elimination
Très peu de données sont disponibles sur les voies d'élimination des anticorps
monoclonaux. Par analogie aux IgG endogènes, les anticorps monoclonaux semblent
être catabolisés dans les cellules du lit vasculaire (cellules endothéliales).
Recyclage des IgG : Les IgG endogènes sont les protéines plasmatiques qui
présentent la demi-vie d'élimination la plus longue, environ trois semaines. Cette
66
longue demi-vie est liée à un récepteur saturable appelé FcRn situé dans les cellules
endothéliales, les cellules intestinales et rénales. Le récepteur FcRn possède deux
propriétés : le passage transcellulaire et le recyclage cellulaire. Après fixation au
récepteur, les anticorps sont internalisés dans la cellule endothéliale et ainsi protégés
de la dégradation lysosomale jusqu’à leur recyclage à la surface de la cellule, qui
permet leur relargage dans la circulation sanguine (Fig. 1).
Catabolisme endogène :
✓ Endocytose par cellules endothéliales vasculaires puis lyse intra-lysosomiale
dont les mécanismes de captation sont mal connus. Les IgG non liées aux récepteurs
FcRn dans les vésicules de pinocytose (les IgG en excès) sont transférées vers des
lysosomes pour être dégradées.
✓ Elimination liées aux cibles antigéniques : dégradation après fixation sur leur
antigène cible («Target mediated disposition»).
– En cas d'antigène circulant : inactivation de l’anticorps et phagocytose des
complexes immuns
– En cas d'antigène membranaire : internalisation, cytolyse et/ou phagocytose.
Figure1: Protection des IgG de la dégradation.
67
4- Pharmacocinétiques des AcsM
La cinétique des anticorps monoclonaux suit une décroissance des
concentrations en fonction du temps de type mono- ou biexponentielle. Les
paramètres cinétiques des anticorps monoclonaux sont marqués par une importante
variabilité intra- et interindividuelle (c'est-à-dire > 30 %).
4.1-Cinétique monoexponentielle
Une quantité est dite sujette à une décroissance monoexponentielle si elle
diminue à un taux proportionnel à sa valeur. Mathématiquement, cela peut être
exprimé par l'équation différentielle linéaire
suivante:
L’équation (1) C(t)= C0.e-Ke t
C0 = la concentration mesurée à l’instant zéro
C(t) = la concentration au temps t
Ke = la constante apparente d’élimination
Figure 1: Représentation
graphique
d'une cinétique
monoexponentielle
La constante d’élimination dépend de la clairance et du volume de distribution :
L’équation (1) peut être facilement transformée sous une forme logarithmique :
ln C(t) = ln Co – Ket
Ce modèle se définit par sa constante apparente d’élimination et par sa demi-vie
d’élimination qui correspond au temps nécessaire pour qu’une concentration passe de
C à une valeur C/2. On peut écrire une équation qui définit la demi-vie d’élimination :
68
La demi-vie plasmatique correspond au temps qu’il faut pour que la concentration
plasmatique d’un médicament décroisse de moitié. Elle peut également se détermine
graphiquement (Fig.2).
Figure 2: Détermination graphique
de la demi-vie plasmatique
La demi-vie plasmatique est égale à la demi-vie d’élimination si le modèle
de distribution ne comprend qu’un compartiment ; dans ce cas, la cinétique
d’élimination est de type monoexponentielle.
A noter que demi-vie plasmatique et demi-vie pharmacologique sont deux
paramètres différents : la demi-vie pharmacologique est l’intervalle de temps
nécessaire pour que l’effet pharmacologique diminue de moitié.
4.2- Cinétique biexponentielle
69
Les cinétiques mono-exponentielles correspondant à une distribution mono
compartimentale sont rares. En général, la distribution se fait dans plusieurs
compartiments. Le modèle le plus courant est le modèle à deux compartiments dans
lesquels le médicament s’équilibre. En représentation semi-logarithmique et après
administration i.v., la cinétique est bi-exponentielle, correspondant à deux phases.
Figure 3: Représentation graphique d'une cinétique biexponentielle
La première phase (α) correspond à la phase de distribution, la deuxième (β) à la
phase d’élimination. L’équation de ce modèle est : C = A e-αt + B e-βt
Pour chaque phase, il est possible de déterminer une t½ :
t½ α = la demi-vie de distribution
t½ β = la demi-vie d’élimination
En fait, dans l’organisme, le médicament peut se distribuer dans de nombreux
compartiments, en particulier un compartiment profond de stockage d’où le
médicament n’est relargué que très lentement. Ces situations font l’objet de
modélisations mathématiques complexes.
70
Références
Kaplon , H et Carnoy, C. Guide des anticorps monoclonaux et protéines de fusion à usage
thérapeutique, université de Lille 2,2015
Schindele, A. Les Anticorps Monoclonaux, de la Production à l’utilisation en Oncologie.
Thèse de doctorat en Sciences pharmaceutiques, UNIVERSITE HENRI POINCARE –
NANCY 1, 2009.
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