Chapitre 58

Cellules souches embryonnaires et cellules pluripotentes induites, aspects biologiques et applications

G. Tachdjian, O. Féraud, C. Bas, A. Magniez, N. Oudrhiri et A.L. Bennaceur-Griscelli

Introduction

L es premières lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEH) ont été dérivées à partir de la masse cellulaire interne

de blastocystes humains en 1998 (1). Grâce à leurs propriétés d’autorenouvellement et de diff érencia-tion cellulaire potentielle dans tous les types de cel-lules du corps humain, ces CSEH ont révolutionné la recherche biomédicale ces dernières années. La technologie des CSEH a ouvert de nouvelles pers-pectives dans la recherche fondamentale et dans les applications thérapeutiques en médecine. Les CSEH off rent donc la possibilité de développer des modèles cellulaires humains dans diff érents domai-nes de la recherche médicale tels que les maladies humaines et la pharmacologie.Récemment, des techniques de reprogrammation cellulaire ont été décrites permettant la produc-tion de cellules pluripotentes induites (iPS) à partir de cellules somatiques (2). Comme les CSEH, ces cellules iPS peuvent se diff érencier dans tous les types cellulaires de l’organisme. Ainsi, cette tech-nologie permet d’envisager la production de cellu-les pluripotentes à partir de cellules diff érenciées de patients de façon spécifi que. Cependant, en dépit de son énorme potentiel, la technologie des cellules souches n’a pas encore conduit à de nouvel-les thérapeutiques. Dix ans après la description de la première lignée de cellules souches embryonnai-res humaines, les propriétés biologiques des CSEH sont toujours en cours d’exploration.Dans cet article, nous décrivons la biologie des cel-lules souches embryonnaires humaines et les cellu-les pluripotentes induites ainsi que les perspecti-ves d’applications de ces cellules en médecine.

Pluripotence

La pluripotence correspond au fait qu’une cellule souche a la capacité de se diff érencier dans n’importe lequel des trois feuillets embryonnaires : endoderme, mésoderme et ectoderme. Les cellules souches pluri-potentes peuvent ainsi donner naissance à tous les

types cellulaires fœtaux ou adultes. Quelques cellules de la masse cellulaire interne (MCI) du blastocyste sont pluripotentes avec le potentiel de former tou-tes les cellules somatiques et germinales dans l’orga-nisme. In vivo, cet état de pluripotence des cellules de la MCI est transitoire au cours du programme du développement embryonnaire qui dirige ces cellules vers la diff érenciation cellulaire. Cependant, ces cellu-les de la masse cellulaire interne peuvent être isolées et maintenues in vitro dans un état indiff érencié et correspondre à ce que l’on appelle les cellules souches embryonnaires (3, 4). Les cellules souches embryon-naires ont été dérivées la première fois, en 1981, à partir de cellules de la MCI chez la souris par Martin (4) et par Evans et Kaufman (3). En 1998, les cellules souches embryonnaires humaines ont été dérivées à partir d’embryons surnuméraires obtenus par fécon-dation in vitro (1). Les cellules souches embryon-naires expriment des marqueurs spécifi ques, tels que des antigènes embryonnaires spécifi ques, des activités enzymatiques (phosphatase alcaline, télo-mérase) et des gènes de pluripotence tels qu’OCT4 et NANOG qui sont rapidement réprimés au cours de la diff érenciation. Sous certaines conditions de culture cellulaire, les cellules souches embryonnaires peuvent proliférer de façon indéfi nie dans un état indiff érencié. Ces cellules souches embryonnaires gardent la capacité comme les cellules de la MCI de se diff érencier en n’importe quel type cellulaire. In vivo, ces cellules souches embryonnaires se diff érencient en tératomes qui correspondent à des tumeurs com-portant des cellules diff érenciées provenant des trois feuillets embryonnaires endoderme, mésoderme et ectoderme. Les cellules souches embryonnaires humaines représentent donc une source illimitée de cellules ou de tissus pour la thérapie cellulaire.

Cellules souches embryonnaires humaines

Dérivation des lignées CSEH

Il existe diff érentes sources de cellules souches humaines qui varient en fonction de leur potentiel de développement. Les cellules souches adultes multi-

C. Poncelet, et al., Physiologie, pathologie et thérapie de la reproduction chez l’humain© Springer-Verlag France, Paris 2011

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de leurs applications, car elles fournissent le maté-riel cellulaire initial pour toutes les étapes suivan-tes de la recherche. Pour permettre le maintien indiff érencié et l’amplifi cation des CSEH, les colo-nies cellulaires sont généralement cultivées sur des champs de fi broblastes murins. Les fi broblastes murins fournissent dans le milieu de culture des facteurs de croissance qui permettent la croissance indiff érenciée des CSEH. Contrairement aux cel-lules souches embryonnaires murines, dont l’état indiff érencié est maintenu par l’ajout de LIF dans le milieu de culture, le LIF humain ne permet pas aux CSEH de conserver leur état indiff érencié (1).La méthode la plus utilisée pour maintenir des CSEH dans un état indiff érencié est l’amplifi cation cellulaire par microdissection mécanique des cellu-les (6). Les colonies cellulaires sont découpées en petits morceaux, qui sont transférés dans de nou-velles boîtes de culture. Cette étape d’amplifi cation cellulaire est répétée tous les cinq à sept jours. Les principaux avantages de la méthode de dissection mécanique est l’absence d’utilisation d’enzymes et la possibilité de sélectionner morphologiquement les CSEH à l’état indiff érencié par rapport à des cel-lules en cours de diff érenciation dans les colonies cellulaires. La culture des CSEH peut se faire en l’absence de fi broblastes murins sur des matrices contenant des facteurs de croissance solubles (10). Des études ont montré que l’état indiff érencié des CSEH peut être maintenu en utilisant la voie de signalisation Wnt (11), la combinaison de facteurs de croissance LIF, TGF 1 (transforming growth fac-tor 1) et bFGF (basic fi broblast growth factor) (12), la combinaison de facteurs noggin et bFGF (13) ou des concentrations élevées de bFGF seul (14).L’utilisation d’enzymes pour la dissociation cellu-laire est plus simple et plus rapide que la microdis-section mécanique des cellules. Diff érentes enzymes ont été utilisées pour l’amplifi cation des CSEH telles que la collagénase IV, la trypsine ou la dispase. Des études ont suggéré que l’utilisation d’enzymes pour l’amplifi cation des CSEH pourrait induire des altéra-tions génétiques des CSEH durant la culture in vitro (15). Les mécanismes impliquant les conditions de culture cellulaire dans la survenue d’instabilités chromosomiques ne sont pas actuellement connus.Des progrès ont été réalisés pour le développement des conditions de culture et dans l’identifi cation de molécules qui maintiennent l’autorenouvellement et la pluripotence des cellules (16). Un des déve-loppements important de la culture des CSEH est l’utilisation de milieux de culture ne contenant pas de substances d’origine animale. L’absence d’élé-ments d’origine animale est un élément important pour une utilisation en thérapeutique.Concernant la cryoconservation des CSEH, plusieurs méthodes sont utilisées, telles que la vitrifi cation des cellules (17) ou la congélation lente des cellules (18).

potentes peuvent être dérivées de la moelle osseuse ou d’autres organes. Les cellules souches fœtales mul-tipotentes peuvent être obtenues à partir du sang de cordon ombilical ou de tissus fœtaux humains (5).Les CSEH pluripotentes proviennent d’embryons humains surnuméraires issus de fécondation in vitro réalisée pour la prise en charge des couples infertiles ou d’embryons atteints d’une maladie génétique détectée par le diagnostic génétique préimplantatoire.La dérivation des premières lignées de CSEH a été initialement adaptée des techniques précédem-ment développées chez la souris (1). Pour établir une lignée de CSEH à partir de la MCI d’un blas-tocyste, le blastocyste est incubé avec de la pro-nase pour digérer la zone pellucide. Le blastocyste sans la zone pellucide est traité avec un anticorps antihumain total et du complément de porc. Cette méthode, appelée immunochirurgie, permet la lyse des cellules trophoblastiques par une réaction anticorps – complément. La MCI, ainsi isolée, est placée dans une boîte de culture cellulaire sur une couche nourricière composée de cellules fi broblas-tiques murines, dont l’activité mitotique a été inac-tivée. Les cellules de la MCI qui se développent sont ensuite transférées par dissection cellulaire méca-nique dans de nouvelles boîtes de culture environ tous les sept jours. L’observation microscopique permet d’apprécier la morphologie du développe-ment des CSEH (6). Le milieu de culture utilisé pour la culture des CSEH est basée classiquement sur le milieu de Dulbecco modifi é selon Eagle et de milieu F12 (DMEM/F12 1:1) complémenté avec 20 % de substitut de sérum (Knock Out Serum Replacer, Invit-rogen) et 10 ng/mL de facteur de croissance basique des fi broblastes (bFGF), une cytokine permettant le maintien des CSEH en état d’autorenouvellement. À ce jour, la majorité des CSEH a été dérivée à par-tir de la méthode de dérivation classique (7) ou des alternatives n’utilisant pas l’immunochirurgie, telles la culture du blastocyste entier (8) ou la dis-section laser (9). Les lignées de CSEH peuvent être maintenues en culture indéfi niment en gardant le potentiel de diff érenciation dans tous les types cel-lulaires humains y compris en cellules trophoblas-tiques. La dérivation et la mise à disposition des lignées de CSEH sont encadrées par des règles éthi-ques et légales dans la plupart des pays. En France, la recherche sur l’embryon est encadrée par la loi de bioéthique, et les autorisations de dérivation de CSEH et d’utilisation des CSEH en recherche sont données par l’Agence de la biomédecine.

Culture des lignées de CSEH

Le maintien en culture et l’amplifi cation des CSEH sont des étapes cruciales dans l’étude des CSEH et

Cellules souches embryonnaires et cellules pluripotentes induites, aspects biologiques et applications 635

Les CSEH peuvent être caractérisées phénotypique-ment par leurs morphologies cellulaires et par les profi ls d’expression de leurs marqueurs (fi g. 1). Les CSEH sont de petite taille, avec un rapport nucléo-cytoplasmique important et de larges nucléoles.La morphologie des CSEH, qui ont une diff érencia-tion spontanée, présente des aspects cellulaires dif-férents avec des modifi cations des limites des colo-nies cellulaires ou de la taille des cellules. Les CSEH en cours de diff érenciation présentent ainsi des colonies cellulaires avec des bordures diff érentes.Les marqueurs cellulaires de surface spécifi ques des CSEH sont SSEA-3 (stage-specifi c embryonic antigen 3), SSEA-4, TRA-1-60 (tumor rejection antigen 1-60) et TRA-1-81 (tableau I) (fi g. 2).Ces marqueurs cellulaires disparaissent au cours de la diff érenciation cellulaire. Contrairement aux cellules souches embryonnaires murines, les CSEH n’expriment pas SSEA-1 (tableau I). Par ailleurs, les CSEH ont une activité phosphatase alcaline et une activité télomérase (1). Les CSEH expriment une combinaison de facteurs transcription spécifi que : OCT-4 (POU-domain transcription factor Octam-er-4), Nanog et Sox 2 (tableau I).

Caractérisation des CSEH

Les CSEH n’existent pas à l’état physiologique et cor-respondent donc à un artéfact de culture cellulaire in vitro. Les CSEH peuvent être maintenues indéfi -niment en culture in vitro. Les cellules peuvent être conservées dans des banques pour servir de sources cellulaires pour la génération de diff érents types cel-lulaires humains. Les cellules diff érenciées à partir des CSEH peuvent être utilisées pour des applications in vitro ou pour des applications thérapeutiques futures.

Fig. 1 – Aspect morphologique d’une colonie de cellules souches embryon-naires humaines.

Fig. 2 – Marqueurs cellulaires des cellules souches embryonnaires humaines [Tra-1-81, SSEA-4, phosphatase alcaline (AP), Tra-1-60].

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de leur état indiff érencié, induisaient de façon non négligeable une instabilité chromosomique. Des tri-somies des chromosomes 12, 17 ou X ont ainsi été mises en évidence très fréquemment (22, 23). L’hy-pothèse qui prévaut actuellement pour expliquer ce phénomène est que l’amplifi cation de certains gènes qui se trouvent sur ces chromosomes confère un avantage sélectif aux cellules souches indiff éren-ciées. Les mécanismes impliqués dans la survenue des anomalies chromosomiques dans les CSEH ne sont pas actuellement connus. L’instabilité chromo-somique des CSEH en culture pourrait être due au type de cellules de coculture ou des matrices cellu-laires utilisées, aux milieux de culture ou des techni-ques de dissociation cellulaire. Les anomalies chro-mosomiques actuellement le plus souvent observées correspondent à des trisomies, qui peuvent aff ecter la diff érenciation, la régulation du cycle cellulaire et la croissance cellulaire. La présence d’anoma-lies chromosomiques dans les CESH soulève aussi le problème de leur utilisation en thérapeutique avec d’éventuels risques de cancérogenèse associés. L’étude cytogénétique des CESH est donc indispen-sable dans le cadre des recherches sur les CSEH et de la validation des protocoles thérapeutiques.L’étude cytogénétique fait donc partie du contrôle de qualité de la culture des CSE. Les méthodes utili-sées pour l’analyse cytogénétique incluent les tech-niques de cytogénétique conventionnelle, d’hybri-dation in situ fl uorescente (FISH) et l’hybridation génomique comparative (CGH) (fi g. 3).Les techniques de cytogénétique conventionnelle permettent de classer les chromosomes en fonction de leur profi l de bandes. Le caryotype obtenu permet de mettre en évidence des anomalies chromosomi-ques de nombre ou des remaniements chromosomi-ques dont la taille est supérieure à 10 Mb. La techni-que de FISH utilise des sondes d’ADN spécifi ques de régions chromosomiques ou de chromosome entier. Cette technique permet de mettre en évidence de façon ciblée l’absence ou la présence de plusieurs copies d’une région chromosomique dans le génome. La CGH permet une analyse globale du nombre de copies de séquences d’ADN (gains ou pertes) dans le génome. Son principe est de cohybrider un ADN total témoin normal avec l’ADN total à tester, cha-cun marqué par un fl uorochrome diff érent, sur des métaphases normales. Elle permet ainsi de réaliser une analyse globale du génome sans a priori sur une région particulière du génome. Les variations de quantité d’ADN entre les deux échantillons (normal et testé) sont mesurées par les rapports des intensi-tés de fl uorescence des deux fl uorochromes le long des chromosomes. La CGH sur puces à ADN cumule les avantages des techniques de FISH et de CGH sur chromosomes, en y ajoutant une meilleure sensibi-lité pour la détection des remaniements de petite taille, une plus grande précision dans la délimitation

L’étude de la pluripotence fait partie de la caracté-risation des CSEH et de leur contrôle de qualité. La pluripotence peut être analysée in vitro par la diff érenciation spontanée et la formation de corps embryoïdes (6). Les marqueurs de diff érenciation des trois feuillets embryonnaires sont ensuite ana-lysés par immunocytochimie. La pluripotence est aussi analysée in vivo par la xénogreff e des CSEH dans des souris immunodéprimées. La xénogreff e de cellules pluripotentes va entraîner la formation de tératomes. L’étude histologique de ces térato-mes, qui sont des tumeurs comportant diff érents tissus provenant des trois feuillets embryonnaires, montre par exemple la présence de tissus tels que muscle, cartilage, os (mésoderme), intestin, trachée (endoderme) et neurones (ectoderme) (19) mar-quant ainsi la pluripotence des CSEH originelles.

Génétique des CSEH

Il a été montré que des altérations génétiques peu-vent survenir durant la culture des CSEH (20). In vivo, le taux de mutations spontanées dans une cel-lule somatique normale (contenant environ 3 x 109 nucléotides) est de l’ordre de 10–7 à 10–8 par division cellulaire (21), soit environ 100 mutations par cellule à chaque cycle cellulaire. Certaines de ces mutations procurent aux cellules mutées un avantage sélectif qui leur permet de croître plus rapidement. In vitro, lors de la culture à long terme ce type d’avantage aboutit progressivement à la substitution des cellu-les non mutées initiales par les cellules porteuses de la mutation. Dès 2004, plusieurs études ont démon-tré que les conditions de culture classiques des cel-lules ES humaines in vitro, permettant le maintien

Tableau I – Marqueurs cellulaires, cytokines et facteurs de transcription dans les cellules souches embryonnaires murines et humaines.

Cellules ES murines

Cellules ES humaines

Marqueurs

SSEA-1 + -

SSEA-3 - +

SSEA-4 - +

Tra 1-60 - +

Tra 1-81 - +

Phosphatase alcaline + +

Cytokines

LIF + -

FGF2 - +

Facteurs de transcription

Sox-2 + +

Rex-1 + +

Oct-4 + +

Nanog + +

Cellules souches embryonnaires et cellules pluripotentes induites, aspects biologiques et applications 637

une cellule somatique dans un état génétique com-parable à celui des cellules souches embryonnaires (2). En surexprimant de façon transitoire diff érentes combinaisons de 24 gènes connus pour être impli-qués dans la pluripotence des CSE murines, Taka-hashi et Yamanaka ont identifi é ces quatre facteurs de transcription dont l’expression est suffi sante pour produire des cellules semblables aux CSEH (2).Ces cellules ont été dénommées cellules pluripotentes induites (iPS). Ces cellules ont des propriétés similai-res aux cellules souches embryonnaires en termes de marqueurs d’expression, d’activité transcriptionnelle et de la possibilité de diff érenciation dans diff érents tissus des trois feuillets embryonnaires (28). La rela-tive simplicité avec laquelle les cellules iPS peuvent être obtenues fait de cette technique une approche très attractive pour étudier la reprogrammation nucléaire et l’utilisation potentielle en clinique. Par exemple, des cellules iPS ont été utilisées pour traiter la drépanocytose chez la souris (29).En 2007, la génération d’iPS a été réalisée à partir de la transfection de cellules somatiques humaines par les équipes de Shinya Yamanaka et James Th omson (30, 31). Ces cellules iPS humaines exprimaient les mar-queurs de cellules souches embryonnaires humaines et étaient capables de se diff érencier dans des cellules des trois feuillets embryonnaires. Yamanaka et al. ont utilisé les mêmes quatre facteurs de transcription que dans leur étude chez la souris (30). Th omson et al. ont utilisé une nouvelle combinaison de quatre facteurs de transcription incluant OCT4, SOX2, NANOG et LIN28 (31). Ces découvertes ont donc montré qu’un nombre peu important de facteurs est nécessaire pour générer des cellules pluripotentes à partir de cellules diff érenciées et que ces mécanismes molécu-laires sont conservés entre les espèces.La cascade transcriptionnelle liée à l’expression de ces facteurs est actuellement peu connue (32).La technologie des cellules iPS a entraîné une révo-lution dans la recherche sur les cellules souches. Ainsi, les cellules iPS ne nécessitent pas d’embryons humains pour leur production. Il est maintenant

des régions d’ADN perdues ou gagnées. En utilisant cette technologie, il a ainsi été montré que les CSEH s’associent à la survenue d’instabilités génomiques avec de nouveaux « hot spots » impliquant des gènes favorisant l’autorenouvellement et possiblement la transformation tumorale (24). Ces techniques d’ana-lyse des chromosomes dans les CSEH sont complé-mentaires. En eff et, le caryotype présente une faible résolution d’analyse des chromosomes, la FISH ne permet pas l’analyse de tous les chromosomes et la CGH est incapable de détecter une translocation équilibrée, un faible mosaïcisme ou une triploïdie.La variabilité observée dans le potentiel de diff éren-ciation des diff érentes lignées de CSEH disponibles suggère des diff érences dans le statut transcriptionnel et épigénétique. Les mécanismes épigénétiques dans les CSEH font intervenir la méthylation de l’ADN ou la modifi cation des histones. Des variations épigéné-tiques ont été observées entre les lignées de CSEH, en particulier au niveau des gènes soumis à empreinte sur le chromosome X dans les lignées CSEH fémini-nes (25). La survenue de modifi cations épigénétiques au cours de la culture des CSEH peut poser des pro-blèmes quant à leur utilisation en médecine (26). Les variations épigénétiques sont une explication aux dif-férences phénotypiques observées entre les lignées de CSEH. L’étude du chromosome X a ainsi montré des variabilités d’expression dans les CSEH (27).

Cellules pluripotentes induites (iPS)

Une des grandes avancées récentes dans le domaine de la recherche dans les cellules souches a été la découverte que l’introduction de plusieurs gènes peut induire la pluripotence dans les cellules somati-ques. Le groupe de recherche dirigé par Shinya Yama-naka de l’université de Kyoto a montré que des cel-lules somatiques murines transduites par des virus rétroviraux avec quatre facteurs de transcription Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4 peuvent reprogrammer

Fig. 3 – Étude cytogénétique des cellules souches embryonnaires humaines. A : caryotype 46, XY ; B : trisomie 12 en hybridation in situ fl uorescente ; C : gain de la région 20q11.21 par microarrays CGH.

A B C

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des cellules iPS, il existe une probabilité de réac-tivation de l’expression de ces gènes induisant de nouveau une pluripotence avec son risque tumoral. De nouvelles approches de reprogrammation utili-sant des expressions transitoires des gènes ou de petites molécules ont été récemment décrites (36) mais leur effi cacité reste encore à confi rmer.

Applications

Les CSEH ont la capacité de se diff érencier dans tous les types cellulaires de l’organisme. Les cellules diff é-renciées à partir de CSEH pourraient être ainsi uti-lisées en thérapie cellulaire. La première étape dans la diff érenciation cellulaire à partir de CSEH est la formation de corps embryoïdes (fi g. 4 et 5).Les corps embryoïdes correspondent à des struc-tures cellulaires dans lesquelles se diff érencient les trois feuillets embryonnaires endoderme, mésoderme et ectoderme (19). Les CESH peuvent

possible de créer des modèles cellulaires de mala-dies humaines à partir de cellules diff érenciées de patients (33). Cette technologie ouvre la possibilité pour le développement d’une thérapie cellulaire personnalisée. Cependant, cette approche possède des limites pour son utilisation en médecine. La reprogrammation utilisant le gène c-Myc entraîne la formation de tumeurs chez la souris (34). Il a été cependant montré que c-Myc n’était pas absolu-ment nécessaire pour la génération de cellules iPS mais avec une reprogrammation moins effi cace, lorsque cet oncogène n’était pas utilisé (35). Un autre problème concerne le fait que la transfec-tion de multiples copies des gènes peut induire des mutations aux sites d’insertion dans le génome et ainsi déréguler des gènes endogènes. La surexpres-sion de ces gènes transfectés peut aussi poser un problème s’ils continuent de s’exprimer dans les tissus diff érenciés. En eff et, une expression rési-duelle dans quelques cellules diff érenciées peut être à l’origine d’un processus tumoral. Bien que les gènes transfectés soient silencieux dans la majorité

Fig. 5 – Origine des cellules souches embryonnaires et diff érenciation cellulaire.

Fig. 4 – Corps embryoïdes après 3 jours (A) et 11 jours (B) de diff érenciation (grossissement x 10).

Cellules souches embryonnaires et cellules pluripotentes induites, aspects biologiques et applications 639

peutique. Les principaux axes de recherche sont la médecine régénératrice et la pharmacologie.

CSEH en médecine régénératrice

Une des applications potentielles les plus impor-tantes est la génération de cellules et de tissus fonctionnels pour une thérapie cellulaire dédiée à la réparation des organes. La régénération des tis-sus lésés est limitée dans le corps humain. Seule-ment quelques tissus comme par exemple le foie, le sang et les vaisseaux ont une capacité de répara-tion cellulaire. Les CSEH pourraient donc être une source cellulaire pour remplacer les tissus lésés. Le principal argument du potentiel des CSEH est leur capacité à générer un nombre important de cellules humaines diff érenciées fonctionnelles (fi g. 6).

ensuite, dans des milieux de culture appropriés, se diff érencier en cellules diff érenciées fonctionnelles de diff érents tissus, comme par exemple les cellu-les hépatiques, les neurones, les cellules hémato-poïétiques… (37-48) (tableau II).Les CSEH off rent aussi la possibilité d’étudier les mécanismes moléculaires du développement humain et des maladies humaines. La recherche sur la physiopathologie des maladies humaines est limi-tée par les modèles cellulaires utilisés. Le dévelop-pement des CSEH, et en particulier des iPS, permet d’envisager de créer des modèles cellulaires humains pour n’importe quelle pathologie humaine.La compréhension des mécanismes moléculaires de la prolifération et de la diff érenciation des CSEH s’est développée de façon importante ces dernières années. La caractérisation de ces mécanismes est un prérequis nécessaire pour une utilisation théra-

Tableau II – Diff érenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans les cellules des trois feuillets embryonnaires.

Feuillet embryonnaire Lignée cellulaire RéférencesEctoderme Kératinocytes 37

Cornée 38

Neurones dopaminergiques 39

Neurones moteurs 40

Oligodendrocytes 41

Mésoderme Ostéoblastes 42

Chondrocytes 43

Cardiomyocytes 44

Cellules hématopoïétiques 45

Cellules endothéliales 46

Endoderme Cellules pancréatiques 47

Hépatocytes 48

Fécondation

in vitro

Implantation

intra-utérine

Destruction

de l’embryonDéveloppement

embryonnaire

Recherche dans le cadre

réglementaire et éthique

Différenciation

• Cellules sanguines

• Cellules endothéliales

• Muscle

• Neurones

• Foie

• Cœur

Thérapie cellulaire

Modèles in vitro

Récupération

de cellules embryonnaires

par microchirurgie

Amplification

Fig. 6 – Production des cellules souches embryonnaires humaines et leurs applications.

640 Physiologie, pathologie et thérapie de la reproduction chez l’humain

Bien qu’un certain nombre de mécanismes cellulai-res et moléculaires de la pluripotence et de la dif-férenciation cellulaire soient inconnus, les CSEH et les iPS représentent un développement majeur de la biologie pour des applications thérapeutiques en médecine.La recherche sur les CSEH est encore une disci-pline jeune. Cependant, cette recherche a avancé de façon signifi cative depuis dix ans. Il paraît ainsi réalisable d’envisager à court terme la génération de cellules pluripotentes, de manière standardi-sée, pour des applications variées, y compris une utilisation clinique. Il est aussi important de déve-lopper en parallèle un contrôle de qualité pour les cellules pluripotentes produites.

Références

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Par ailleurs, les CSEH seraient moins susceptibles à un rejet immunitaire que les cellules adultes. Ces propriétés des CSEH permettent d’envisager une thérapie cellulaire pour des maladies diver-ses telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, le diabète ou l’infarctus du myo-carde.

CSEH en pharmacologie

Actuellement, la majorité des tests in vitro de toxicologie se fait sur des modèles cellulaires ani-maux. Les résultats obtenus dans ces expériences sont diffi cilement extrapolables entre espèces chez l’homme. Les organismes modèles diff èrent de l’homme pour de nombreux aspects, tels que par exemple la taille et la physiologie. La souris, qui est un des modèles animaux principaux utilisé, diverge d’un ancêtre commun avec l’homme il y a 75-80 millions d’années conduisant à des diff éren-ces dans l’anatomie et la physiologie importantes, même aux stades précoces du développement (49). Les lignées cellulaires humaines obtenues, à par-tir de tissus cancéreux, sont les seules alternatives actuellement. Ces lignées cellulaires peuvent pro-liférer en culture mais ont une faible capacité de diff érenciation.

Perspectives

La dérivation des premières lignées de CSEH a été obtenue, il y a une dizaine d’années et bien que ces cellules off rent un potentiel thérapeutique, un certain nombre de problèmes n’ont pas été résolus pour les utiliser en médecine. Les conditions de culture des CSEH et les protocoles de diff érencia-tion doivent être standardisés. La stabilité généti-que doit être contrôlée pour éviter, en particulier, un risque tumoral après injection des cellules chez un patient. La fonctionnalité des cellules diff é-renciées doit être évaluée in vitro et in vivo. Les neurones obtenus à partir de cellules pluripoten-tes doivent pouvoir médier les signaux chimiques et électriques. Les cellules pancréatiques doivent pouvoir secréter de l’insuline en réponse aux concentrations de la glycémie dans le sang. L’im-munocompatibilité des cellules doit aussi être étu-diée et il a été proposé une banque cellulaire pour répondre à la diversité HLA (50). Le développe-ment des cellules pluripotentes induites pourrait résoudre le problème immunologique. Cependant, la dérivation des cellules iPS utilisant des transfec-tions virales ne permet pas encore d’envisager une utilisation clinique.

Cellules souches embryonnaires et cellules pluripotentes induites, aspects biologiques et applications 641

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