Place des nouvelles techniques dans le diagnostic des
infections mycobactries J. MAUGEIN CHU de Bordeaux
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LE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE Direct partir de lchantillon
Examen microscopique Lamplification gnique La culture gold standard
Lidentification Par techniques de biologie molculaire La sensibilit
aux antibiotiques
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Examen microscopique Directement sur lchantillon ou aprs
dcontamination Coloration de Ziehl Neelsen ou auramine sensibilit :
50% pour les chantillons dorigine pulmonaire, < 40% pour les
extra-pulmonaires Spcificit : ne permet pas de diffrencier les
diffrentes espces de mycobactries Avantages : rapide et peu
coteux
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AMPLIFICATION GENIQUE Dtection du complexe tuberculosis PCR
(Polymerase Chain Reaction) amplification dun fragment du gne
codant pour lARN16S Amplicor, Roche Diagnostic, manuelle ou
automatise TMA (Transcription Mediated Amplification) amplification
isotherme dune squence de lARN 16S AMTD, bioMrieux, technique
manuelle SDA (Strand Displacement Amplification) Amplification
isotherme de DNA BDProbeTec TM ET DT, Becton Dickinson,
automatise
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AMPLIFICATION GENIQUE GenoType Mycobacteria direct Complexe
tuberculosis et 4 MNT Amplification du rRNA 23S (NASBA) Complexe
tuberculosis M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum M.
kansasii M. malmoense Sensibilit MTBC : 87.5%, MNT : 67% (6
souches)
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Genotype MTB Direct v3.0 Genotype MTB Direct
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AMPLIFICATION GENIQUE Sensibilit Les rsultats des tudes sont
dpendants des chantillons tests rsultats comparables selon les
techniques pour les chantillons positifs lexamen microscopique : 96
100% rsultats diffrents selon les tudes et les techniques pour les
chantillons ngatifs lexamen microscopique : 27 75% pour les
chantillons dorigine pulmonaire diffrence majore pour les
chantillons extrapulmonaires Spcificit 98 100% selon les tudes
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AMPLIFICATION GENIQUE Comparaison des techniques
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AMPLIFICATION GENIQUE Intrt et indications Permet de faire le
diagnostic diffrentiel entre complexe tuberculosis et MNT sur les
chantillons positifs lexamen microscopique Sa place est mal dfinie
sur les chantillons ngatifs lexamen microscopique, mais permet
cependant un diagnostic plus rapide que la culture dans environ 50%
des cas condition que le test soit pratiqu au moins une fois par
semaine Lamplification gnique est plus sensible que lexamen direct,
mais moins que la culture Cest un test relativement coteux Une
amplification ngative nexclue jamais un diagnostic de
tuberculose
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TECHNOLOGIE DES PUCES A ADN Une puce ADN est une petite surface
contenant une multitude de sondes (oligonuclotides) de squences
diffrentes : sondes de captures
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LA CULTURE Les milieux liquides systmes automatiss : Bactec
460TB, mthode radiomtrique, abandonn? Bactec 960TB (MGIT), Bactec
9000MB, BacT/Alert 3D Systmes manuels : MGIT (Mycobacterial Growth
Indicateur Tube) MB Redox, Bio FM, Middlebrook (7H9) enrichi en
ADC
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MGIT
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MB Redox
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Comparaison des milieux MGIT, MB Redox, Lwenstein 494
chantillons (423 pulmonaires) Dcontamination par BBL MycoPrep Les
contaminations : MB redox : 8.7%, MGIT : 5.6%, Lowenstein 2.6%
LA CULTURE Avantages et inconvnients des milieux liquides Une
pousse plus rapide dlai moyen de 6 12 jours pour les chantillons
positifs lexamen microscopique, 14 18 pour les ngatifs. Une
sensibilit augmente Les contaminations par des bactries pousse
rapide plus frquentes ncessitent ladjonction dun cocktail
antibiotique Isolement plus frquent de MNT sans implication
pathologique De rares souches ne poussent pas en milieu liquide La
mthode de culture la plus performante associe milieux solides et
liquides
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IDENTIFICATION Identification du complexe tuberculosis Les
mthodes classiques Techniques dhybridation : trs bonne spcificit et
sensibilit Accuprobe (Gen-Probe) complexe ADN-ARN ribosomiaux,
ralise en 2 heures INNOLiPA (Innogenetics) ncessite lamplification
de lITS 16-23S, confirme le diagnostic de mycobactrie (7 8 H)
GenoType Mycobacteria (Hain Diagnostika) mme technique que INNOLiPA
Autres techniques : PRA (PCR Restriction Enzyme Analysis), squenage
de lARN 16S
IDENTIFICATION Diagnostic despce au sein du complexe
tuberculosis Technique classique Niacine test (production dacide
nicotinique) Rduction des nitrates en nitrites Rsistance au TCH
Sensibilit au pyrazinamide (M. bovis) Sensibilit la cyclosrine (M.
Bovis -M. Bovis BCG) Hybridation molculaire GenoType MTBC (Hain
Diagnostika) bas sur le polymorphisme du gne gyrB Les gnes
MIRU
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GenoType MTBC
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SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Mthodes phnotypiques Mthode des
proportions (Canetti, Rist et Grosset) ralise en milieux solides
adapte aux milieux liquides MGIT permet dobtenir des rsultats entre
5 et 12 jours, partir de la primo culture Technique de Heiffets,
dtermination de la CMI, pour les antibiotiques autres que les
antituberculeux en cas de multirsistance.
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SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Mthodes gnotypiques INNOLiPA Rif
Tb pour la rsistance la rifampicine, sensibilit de 90 97% et
spcificit proche de 100% GenoType MTBDR : sensibilit de 99% pour la
rifampicine et 88.4 pour l INH Squenage des gnes impliqus dans la
rsistance pour dautres molcules, mais du domaine des laboratoires
spcialiss.
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DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE Un test commercialis : ANDA TB Technique
ELISA utilisant lantigne A60 de M. bovis Sensibilit peu
satisfaisante, surtout dans les formes extrapulmonaires Nombreuses
recherches en cours sur les antignes, quelques rsultats
encourageants mais rien de commercialis
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TYPAGE MOLECULAIRE La RFLP (polymorphisme de longueur des
fragments de restriction) technique de rfrence, fastidieuse mais
peu onreuse Le spoligotypage (polymorphisme des rgions inter DR)
plus rapide, moins sensible Les MIRU (squences rptitives en nombre
variable) Interprtation dlicate
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CONCLUSION Les nouvelles techniques reposent essentiellement
sur la biologie molculaire mais aussi sur les techniques de culture
en milieu liquide lamplification gnique doit tre considre comme une
aide au diagnostic et ne jamais tre interprte seule Lidentification
du complexe tuberculosis se fait partir de la culture en 2 heures
par hybridation molculaire. La culture est indispensable et devrait
combiner milieux solides et liquides. Ces derniers permettent de
rduire significativement le dlai de pousse. Permettent dobtenir un
antibiogramme en 7 12 jours
