Les Mycobactéries : classification, méthodes d’identification

classiques et pathogenèse

Pr Mireille Dosso

Un brin d’Histoire 400 av. J-C : Hippocrate : Phtisie = tuberculose pulmonaire.

1865 :  Jean Antoine Villemin démontre l'infection.1882 :  Robert Koch isole "son" bacille BK.1897 :  C. Flügge : origine de l'infection : gouttelettes produites lors de la toux.

mise au point du BCG en 1921 par Calmette et Guérin tuberculose joue un rôle central dans La Dame aux Camélias (1848) d'

Alexandre Dumas fils et dans l'opéra de Giuseppe Verdi, La Traviata (1853).

Tuberculeux célèbres :John Keats ( 1795 - 1821), Robert Stevenson ( 1850 - 1894), George Orwell (1903 - 1950), Franz Kafka (1883 - 1924) et Thomas Mann (1875 à 1955) qui a décrit l'univers des sanatoriums dans La montagne magique (1924).

séquençage complet du génome de M. tuberculosis en 1998.

Classification

Le principal point commun à toutes ces espèces appartenant au genre Mycobacterium, placé dans l'ordre des Actinomycétales,

est une propriété tinctoriale pathognomonique mise en évidence par la coloration de Ziehl-Neelsen: l’acido-alcoolo-résistance.

Plus de 100 espèces de mycobactéries 3 seulement sont pathogènes / homme

– Mycobacterium tuberculosis : la tuberculose – Mycobacterium leprae : la lèpre – Mycobacterium ulcerans : l ’ulcère de Buruli

• AUTRES => SAPROPHYTES • occasionnellement opportunistes ,si immunodépression locale

ou systémique L ’histoire naturelle des infections par mycobactéries est

différente s’il s’agit de mycobactéries pathogènes ou opportunistes

famille des Mycobacteriaceae • ordre des Actinomycetales • genre Mycobacterium

Diversité du genre Mycobacterium après comparaison des séquences du gène rpoB

Mycobactéries • Tuberculose• Lèpre• « Atypiques »

Le complexe tuberculosis qui se subdivise lui-même en plusieurs espèces, dont on peut mentionner:

• Mycobacterium tuberculosis = Bacille de Koch = BK: mycobactérie humaine, agent de la tuberculose. L'infection humaine est surtout respiratoire.

• Mycobacterium bovis: mycobactérie animale (bovidés), occasionnellement agent de la tuberculose chez l'homme. L'infection humaine est surtout intestinale (lait).

• Mycobacterium africanum: mycobactérie humaine, agent de la tuberculose isolé en Afrique tropicale.

Mycobacterium leprae: mycobactérie humaine, agent de la lèpre. M leprae murium

Mycobactéries atypiques: sont généralement ubiquitaires (eaux, sols, plantes, poussières, etc.).

- MOTT = Mycobacteria Other Than Tuberculosis - MAMT = Mycobactéries Autres que les Mycobactéries de la TB - MNT = Mycobactéries Non Tuberculeuses

Mycobactéries tuberculeuses

Complex Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis B.C.G. (bacille de Calmette

et Guérin) Mycobacterium microti

Classification des Mycobactéries Atypiques

Pathogènes stricts M. ulcerans: ulcère de Buruli M. marinum: granulomes M. haemophilum: lésions cutanées disséminées M. paratuberculosis: entérite hypertrophiante des ruminants

Pathogènes opportunistes Infections pulmonaires Adénites Infections osseuses, cutanées ou disséminées

• Espèces saprophytes ou commensales• Jamais ou rarement responsables d’infection

Classification selon le type d’infection

- Infections pulmonaires M avium et intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. malmoense;

- Infections ganglionnaires : M. avium - intracellulare, M. scorofulaceum, M. kansasii;

- Infections cutanées : M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae.

- Pus et épanchement : M. avium-intracellulare, M. chelonae, M. kansasii, M. xenopi, M.

abcessus; - Infections systémiques :

M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. haemophilum, M. xenopi, M. gevanense.

Classification de Runyon

Première classification encore utilisée aujourd’hui comme orientation dans l’identification

Caractères phénotypiques: vitesse de croissance sur des milieux de culture température optimale pigmentation

Groupes I, II et III espèces pathogènes strictes ou opportunistesGroupe I: mycobactéries photochromogènes à croissance lenteGroupe II: mycobactéries scotochromogènes à croissance lente

Groupe III: espèces non chromogènes à croissance lente Groupe IV: pathogènes rares ou saprophytes

Groupe IV: espèces pigmentées ou non à croissance rapide

Taxonomie

Mycobactéries photochromogènes (GROUPE I) M. kansasii , M. marinum , M. simiae , M.asiaticum

Mycobactéries scotochromogènes (GROUPE II) M. gordonae,M. szulgai, M. scrofulaceum , M. flavescens

Mycobactéries non chromogènes (GROUPE III) Complexe aviaire : M. avium , M. intracellulaire ,M. xenopiComplexe terrae : M. non chromogenicum, M triviale, M. gastri, M.

malmoenseAutres espèces : M. ulcerans,, M. shimoidei ,M. paratuberculosis, M.

farcinogene ,M.lepraemurium

Mycobactéries à croissance rapide (GROUPE IV)

Non pigmentées : M. fortuitum, M. chelonei, M. chitae, M. senegalense,M. fallax

Pigmentées : M. Vaccae,M. vaccae-aurum,M. engloaecki

Thermophiles : M. phlei

Thermorésistibles : M. smeggmatis

Méthodes d’identification classiques

Caractères morphologiques Colorations

Ziehl-Neelsen à l’Auramine ou de Dugommier

• Morphologie• 2 à 5 µm de long sur 0,5 µm de large • forme rectiligne ou plus ou moins incurvée • extrémités arrondies, non sporulées et non

capsulés,• isolés ou en amas globulaires.

Caractères morphologiques

Les mycobactéries retiennent les colorants malgré l'action combinée d'acides dilués et d'alcool.

Cette caractéristique,appelée alcoolo-acido résistance, est due à la richesse de leur paroi en lipides.

Elle est mise à profit pour la coloration différentielle de Ziehl-Neelsen.

Au ziehl la morphologie des bacilles peut être très évocatrice , mais aucun aspect n'est rigoureusement spécifique et peut varier en fonction du milieu de culture utilisé longs et

fins, longs et courts, formes coccoïdes, courts, colorés de façon homogène ou non, fins granuleux avec présence d'amas serrés (cordes ou moustaches), longs, épais avec un aspect "zébré" et présence d'amas serrés ou non.

BAARZiehl Neelsen

Auramine

M. avium (coccoïdes) BK (cordes ou moustaches)

Espèce à croissance rapide M. Kansasii (épais et zèbré)

Caractères culturaux

1- Milieux solides 2- Milieux liquides

Caractères culturaux: Milieux

Milieux empiriques : à l’œuf Le milieu de Löwenstein-Jensen, milieu à l'oeuf, est le milieu

de référence recommandé par l'UICTMR (Union Internationale Contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires).

Enrichi de pyruvate, il permet une meilleure croissance des mycobactèries dysgoniques (M. bovis).

Lowenstein Coletsos

Milieux synthétiques : Middlebrook

Les milieux de Middlebrook 7HIO - 7HIl sont des milieux gélosés, plus souvent utilisés pour l'étude des antibiotiques que pour l'isolement primaire.

Les milieux liquides 7H9 - 7HI2 - 7HI3 de Middelbrook, le milieu

de Dubos, le milieu de Kirchner, sont des milieux d'enrichissement.

MGIT

* Les colonies sont non pigmentées, M. avium présente souvent des colonies de deux types : . lisses

transparentes et opaques rugueuses, constituées de cocco-bacilles acido-alcoolo-résistants.

* Les colonies sont photochromogènes, grosses, eugéniques, rugueuses, formées de gros bacilles à

coloration en échelle : penser à M. kansasii. * Les colonies sont pigmentées à l'obscurité.

Elles sont grosses, lisses, constituées de bacilles de taille moyenne, ce tableau évoque M. gordonae.

Au contraire, les colonies sont petites, à croissance lente, favorisées par le pyruvate, constituées de bacilles longs et chevelus : penser à M. xenopi.

Critères d’orientation

1. Délai de croissance (apparition des colonies)2. Aspect des colonies:

taille ou morphologie, caractère rugueux ou lisse

Coloration des colonies

- Tous ces caractères constituent les éléments d’orientation importants

Test de photo induction

M. kansasii

Colonies eugoniques : M tuberculosis

M. africanum a des colonies rugueuses mais platesM. bovis montre de petites colonies non pigmentées et lisses qui ne grossissent pas.

M. gordonae M. fortuitum

Lépre : M leprae

Elle est due à M. leprae (bacille découvert par Hansen en 1873), bactérie dont la culture reste impossible actuellement sur milieux inertes.

Caractères biochimiques

Tests biochimiques

NIACINE - M.tuberculosis accumule de l'acide nicotinique extracellulaire pendant sa

croissance in vitro. NITRATE-REDUCTASE CATALASE UREASE BÊTA-GALACTOSIDASE ARYLSULFATASE / HYDROLYSE DU TWEEN 80 :estérase qui hydrolyse Tween 80 et libèrent

l'acide oléique. BÊTA-GLUCOSIDASE UTILISATION DES SUCRES OU FERMENTATION SUCREES

L’identification des mycobactéries obtenues en culture pure sur milieu solide repose classiquement sur l’étude des caractères culturaux (temps de croissance, morphologie et pigmentation des colonies) et

biochimiques.

Trois épreuves biochimiques simplesTrois épreuves biochimiques simples permettent de faire la distinction entre bacilles du complexe tuberculosis et mycobactéries non tuberculeuses : la recherche de l’activité catalasique après

chauffage pendant 20 min à 68 °C, le niacine-test et l’étude de la sensibilité à l’acide para-

aminosalicylique (ou PAS).

M. tuberculosis aérobie strict donne en 21 à 28 jours, sur milieu de Löwenstein-Jensen, de grosses colonies en «

chou-fleur », de teinte crème-beige, à surface sèche etrugueuse.

elle a une activité catalasique thermolabile (après chauffage pendant 20 min à 68 °C) et une activité nitrate réductase. naturellement résistante TCH (hydrazide de l’acide thiophène carboxylique) naturellement sensible à l’acide paraaminosalicylique PAS

En cas de résistance à haut niveau à l’isoniazide, l’activité catalasique est réduite voire même absente.

Dans tous les cas, M. tuberculosis accumule l’acide nicotinique, ou niacine, qui peut être révélé par l’épreuve de Konno ou niacine-test

M. bovis micro-aérophile donne sur milieu de Löwenstein-Jensen de petites colonies non

pigmentées, lisses et brillantes qui ne dépassent pas la taille d’une tête d’épingle, sauf si le milieu de culture est enrichi de pyruvate de sodium

sensible au TCH, ne possède pas de nitrate réductase et n’accumule pas suffisamment de niacine pour donner un niacine test

positif. M. africanum donne des colonies dysgoniques, plates avec un

bourgeon central, rugueuses et de teinte mate, qui se développent plus rapidement et en plus grande quantité en présence de pyruvate de sodium.

  PIGMENT CULTURE

NIAC CATALASE NIT TCH

  Photo Scoto R Eugonique 36°c 42°c  22°c 70°c    

Complex Tuberculosis

tuberculosis (-) (-) (-) (+) (+) - (+) + - + +

bovis (-) (-) (-) (-) (+) - - + - - -

africanum (-) (-) (-) (-) (+) - V + - V V

BCG (-) (-) (-) (+) (+) - - + - - -

Groupe I kansasii (+) (-) (-) (+) (+) - - ++ + + +

Photo marinum (+) (-) (+) (-) faible - V ++ faible - +

Groupe II gordonae (+) (+) (-) (+) (+) - - ++ + - +

Scotoxenopi (+) (+) (-) (+) (+) + - ++ + - +

scrofulaceum (+) (+) (-) (+) (+) - - ++ + - +

Groupe III avium (-) (-) (-) (+) (+) V - ++ + - +

Non chromo ulcerans (-) (-) (-) (+) (-) - - ++ + - +

Groupe IV fortuitum (-) (-) (+) (+) (+) + - ++ + + +

Rapide smegmatis (-) (-) (+) (+) (+) + - ++ - + +

On remplace maintenant, lorsque l’on en a les moyens, les épreuves biochimiques par l’hybridation avec des sondes génomiques complémentaires de séquences d’ARN ribosomique, spécifiques de certaines mycobactéries,notamment de celles du complexe tuberculosis

La mesure de la fluorescence s'effectue grâce à un chimioluminomètre.

Des tests biochimiques doivent être effectués secondairement pour préciser l’espèce bactérienne en cause au sein du complexe tuberculosis.

Méthode des proportions en milieu liquide

Sensibilité aux antituberculeux

CI : testés 4 antituberculeux: isoniazide (INH), streptomycine, ethambutol, rifampicine

Pathogenèse

Le BK ne produit pas de toxine et doit son pouvoir pathogène

à sa capacité de persister et de se multiplier dans les macrophages. Mycobactéries de l’environnement (M avium, M kansasii…)

Colonisation Si déficit local Maladie Si déficit systémique Maladie disséminée

Transmission et évolutionde la tuberculose humaine

Entrée dans les macrophages Lorsque le BK est inhalé, il vient se loger dans une alvéole pulmonaire où

il est phagocyté par les macrophages. Le BK a la propriété de résister vivant très longtemps dans les

macrophages. Certains restent sur place, d'autres sont véhiculés par voie lymphatique

jusqu'aux relais ganglionnaires voisins. Le BK peut se fixer sur des récepteurs d’un certain nombre de cellules

phagocytaires. La bactérie est alors internalisée par phagocytose dans une vésicule. Elle

empêche la fusion du phagosome au lysosome (phagolysosome) en empêchant l’acidification de la vésicule.

Elle diminue aussi le « burst oxidatif » dans le macrophage activé Elle réduit aussi la production par le macrophage de cytokine

Il empêche (interfère) l’activation des macrophages Le Lipoarabinomannan des parois cellulaires supprime la prolifération des

cellules T ; bloque l’activation des gènes de l’interféron Stimulation d’une réponse inflammatoire destructive pour les tissus

La lyse des bactéries libère des constituants antigéniques qui suscitent une réaction immunitaire induisant un état d'hypersensibilité à l'origine de la transformation caséeuse

Antigène 85 Acides mycoliques Le dipeptide muramyl

La production de TNF- stimulée par les composants de la paroi cellulaire

Formation des tuberculesLa réponse mediée par les cellules T associées aux phagocytes amène à la

formation de tubercules et s’appelle la réponse granulomateuse.

« granule » enveloppe de fibrine qui peut calcifier contient des bactéries

vivantes qui en se multipliant peuvent éclater le tubercule réactivation de la TB.

. La réaction locale aboutit en un peu plus d’un mois à une lésion histologique caractéristique:

•le granulome ou tubercule qui est constitué de cellules épithélioïdes et de cellules géantes multinucléées entourées d’une couronne lymphocytaire et centrées par une zone de nécrose caséeuse. •Tout peut s’arrêter à ce stade par un enkystement et une calcification des lésions suivis d’ne auto-stérilisation spontanée du chancre d’inoculation. C’est la situation la plus fréquente

Dans la phase de latence. Les bactéries ne causent pas d’infection active M. tuberculosis se

localise dans les tubercules ou dans les nodules lymphatiques, peut-être dans d’autres organes.

Les bactéries peuvent avoir un état latent comme les spores

Après la formation des tubercules :

la caséification qui correspond à une nécrose solide des tissus où les bactéries se sont développées.

Lorsque le caséum se ramollit, la caverne se constitue dans le poumon et s'entoure d'une coque fibreuse la rendant difficilement accessible aux drogues antibacillaires.

Une dissémination hématogène est éventuellement responsable de localisations extra-pulmonaires.

Pathogénie de la tuberculose bovine

Complexe primaire: chancre d’inoculation et adenopathieVoie d'infection (aérogène, bucco-pharyngée, intestinale, ombilicale

Pathogénie de l’ulcére de Buruli (Meyers, 1995)

  Pénétration de M. ulcerans dans la peau,

§    Production de petites quantités de toxines,

§    Nécrose des tissus sous-cutanés,

§    Remaniement et infarcissement des tissus,

§    Diminution des nutriments pour M. ulcerans et action immunologique à médiation cellulaire,

§    Positivité des tests cutanés,

§    Destruction et constitution de granulomes,

§    Cicatrisation de l’ulcération.

Physiopathologie (1)

M. ulcerans : germe thermodépendant,(30°C et 33°C) T° = derme profond et l’hypoderme.

Mycolactone (macrolide dérivé d’un polykétide )

Mycolactone (George et al. )

Les polykétides (pas immunogénes) = métabolites secondaires produits par un certain nombre de bactéries du sol appartenant à l’ordre des actinomycètes

PM de743 daltons ID mycolactone purifiée chez le cobaye => histopathologie = UB Homme

(Nécrose, peu PN, Microhémorragies) Variants :

Pas production mycolactone, Pas virulent pour cobaye

semble agir à la fois comme un immunosuppresseur + cytostatique Gêne de synthèse de la toxine MU : Plasmide

Physiopathologie (2)

• Nécrose sous-cutanée : due à une exotoxine sécrétée par le germe, responsable de thrombose vasculaire et de l’infarcissement tissulaire. Ce qui expliquerait la chute importante des tissus adipeux sous-cutanés que l’on

observe particulièrement dans les points déclives des membres.• Décollement des bords de l’ulcère s’explique par la nécrose du tissu

adipeux hypodermique et la thrombose capillaire. • Cloisonnement de M. ulcerans dans la zone nécrosée expliquerait

l’inaccessibilité du germe par les traitements par voie générale.• Facteurs déterminant l’extension de la lésion ?• Accumulation (et/ou l’induction) de la toxine

lyse du macrophage hôte et pour paralyser les fonctions cellulaires des lymphocytes et des macrophages qui s'infiltrent

immunosuppression locale : retarde la réponse immunitaire systémique

Conclusion Acido alcoolo résistance Vitesse de croissance Diversité des espèces Augmentation des espèces opportunistes Emergence de certaines espèces Difficultés d’identification des M atypiques Nécessité d’utilisation outils moléculaires pour l’identification, la

tracabilité, étude épidémiologie moléculaire Problèmes dans les PED:

Formation, Disponibilité des nouveaux outils d’identification et de diagnostic