PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17675/2/088114039_Full.pdfHIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME® SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK PADA PEMISAHAN KLORAMFENIKOL DAN LIDOKAIN

HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME®

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Winarti H. Wibowo

NIM: 088114039

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

2011

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Kesuksesan itu jangan dilihat dari hasil yang dicapai tetapi lihatlah

dari proses hingga mendapatkan hasil yang dicapai tersebut”

“Looking your dream, it’s like looking place far away. The

important thing is don’t ever think about giving up, STAND

UP again towards the dream you’ll meet someday”

“Orang yang pesimistik selalu menemukan kesulitan dalam

setiap kesempatan. Orang yang optimistik justru menemukan

peluang disetiap kesempatan” –Lawrence P.J.-

“Hidup itu keras, mampukan dirimu untuk bertahan di

setiap rintangan dan cobaan. Jadikan semua itu

pengalaman yang berarti dalam hidupmu”

Karyaku ini kupersembahbahkan kepada:

Keluargaku tercinta

Sahabat-sahabat setiaku

Teman-teman seperjuangan

Almamaterku


v


vi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan anugrah yang diberikan sehingga penelitian dan penyusunan skripsi

yang berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik

pada Pemisahan Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dalam Sediaan Tetes

Telinga Colme®” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai

salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

membimbing dan memberikan pengarahan, masukan dan saran selama

berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan skripsi.

3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Dra. MM. Yetty Tjandrawati, M.Si.

selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang

membangun dalam penyusunan skripsi.

4. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati,

Apt. selaku Dosen Pengajar yang telah bersedia menyediakan waktu untuk

diskusi pribadi terkait penelitian ini.


vii

5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan ilmu yang bermanfaat demi kemajuan mahasiswa dan

mahasiswi dalam berkarya dalam bidang farmasi.

6. PT. Interbat yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang

berguna bagi penelitian.

7. Seluruh staf kemananan, staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto,

Mas Otok, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu selama

penelitian di laboratorium dan menyediakan sarana untuk terselesaikannya

seluruh kegiatan akademik dengan lancar.

8. Martha Herati sebagai sahabat terdekatku yang selalu menyemangatiku

untuk belajar dan mengenal arti kehidupan.

9. Pakde, bude, mas sunu, mas damar, mas daru, mba vero yang menjadi

keluargaku selama berada di Yogyakarta dan telah memberikan semangat,

doa dan dukungan dalam penyusunan skripsi ini.

10. Efrida Lusia Sari Tambunan dan Theresia Wijayanti sebagai teman

seperjuangan skripsi dan tempat saling berbagi suka dan duka. Terima

kasih atas semangat, doa, kegigihan dan kebersamaannya selama ini.

11. Felicia, Prasilya dan Sasa sebagai teman seperjuangan skripsi satu tema

yang selalu membantu dan memberikan semangat.

12. Novi, Citra, Helena, Ayesa, Amel, Dina, Susi, Nona, Susan sebagai teman

seperjuangan di laboratorium.


viii

13. Teman kelompok bermainku: Dea, Siska, Yessi, Lia, Lala yang selalu

menyemangatiku dan memberikan saran, doa dan tempat saling berbagi

suka dan duka.

14. Semua teman-teman FST A yang telah menjadi teman terbaik selama

berada di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

15. Seluruh teman-teman Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas

pengalaman dan kebersamaan selama ini.

16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini. Terima kasih atas

dukungannya.

Penulis menyadari bahwa masih di dalam skripsi ini masih banyak

kekurangan. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat

penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca

dan dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ................................. vi

PRAKATA ............................................................................................... vii

DAFTAR ISI ............................................................................................ xi

DAFTAR TABEL .................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xix

INTISARI ................................................................................................. xxi

ABSTRACT ............................................................................................... xxii

BAB I. PENGANTAR .............................................................................. 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

1. Permasalahan .................................................................................. 3

2. Keaslian penelitian.......................................................................... 3

3. Manfaat penelitian .......................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian.................................................................................. 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ....................................................... 5

A. Kloramfenikol ...................................................................................... 5


x

B. Lidokain Hidroklorida .......................................................................... 6

C. Obat Tetes Telinga ............................................................................... 6

D. Spektrofotometer UV ........................................................................... 7

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ......................................................... 9

1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT ................................................ 9

2. Kromatografi partisi fase terbalik ..................................................... 12

3. Pemisahan puncak dalam kromatografi ............................................ 13

F. Landasan Teori ..................................................................................... 20

G. Hipotesis .............................................................................................. 21

BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................ 22

B. Variabel Penelitian ............................................................................... 22

1. Variabel bebas .................................................................................. 22

2. Variabel tergantung ......................................................................... 22

3. Variabel pengacau terkendali ........................................................... 22

C. Definisi Operasional ............................................................................. 23

D. Bahan-bahan Penelitian ........................................................................ 23

E. Alat-alat Penelitian ............................................................................... 23

F. Tata Cara Penelitian .............................................................................. 24

1. Pembuatan fase gerak ....................................................................... 24

2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

yang digunakan untuk untuk penentuan panjang gelombang

pengamatan ...................................................................................... 24


xi

3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

yang digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT .................... 25

4. Pembuatan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida......... 26

5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis.................... 26

6. Preparasi sampel ............................................................................. 26

7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

dengan metode KCKT fase terbalik .................................................. 27

G. Analisis Hasil ....................................................................................... 29

1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ..... 29

2. Waktu retensi (tR) ............................................................................. 30

3. Nilai resolusi .................................................................................... 30

4. Nilai HETP ...................................................................................... 31

5. Reprodusibilitas ............................................................................... 31

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 32

A. Pemilihan Pelarut ................................................................................. 32

B. Pembuatan Fase Gerak ......................................................................... 32

C. Pembuatan Larutan Baku ...................................................................... 34

D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan

Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis .................... 36

E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Metode

KCKT Fase Terbalik ............................................................................ 40


xii

1. Fase gerak metanol:aquabides 75:25 dengan flow rate 0,8; 1,0;

dan1,2 mL/menit .............................................................................. 46

2. Fase gerak metanol:aquabides 85:15 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan

1,2 mL/menit .................................................................................... 50

3. Fase gerak metanol:aquabides 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan

1,2 mL/menit .................................................................................... 54

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 64

A. Kesimpulan .......................................................................................... 64

B. Saran .................................................................................................... 64

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 65

LAMPIRAN ............................................................................................. 68

BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 139


xiii

DAFTAR TABEL

. ...................................................................................................... Halaman

Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT ............................ 11

Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides ......................... 24

Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol:aquabides ...... 33

Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain

hidroklorida dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida .......................................................................... 40

Tabel V. Tekanan kolom (kgf/cm2=kPa) ............................................. 44

Tabel VI. Hasil optimasi kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

berdasar parameter Asymmetry Factor (AF) dengan fase

gerak metanol:aquabides 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow

rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit ............................................. 45

Tabel VII. Hasil optimasi flow rate baku campuran kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida dengan fase gerak metanol:aquabides

95:5 ...................................................................................... 58

Tabel VIII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi baku campuran

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 60

Tabel IX. Data hasil perhitungan %CV nilai resolusi baku campuran

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 61

Tabel XII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi dan nilai resolusi

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes

telinga Colme® .................................................................... 63


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-

hidroksi-α-(hidroksimetil)-p)nitrofenetilasetamida) ............. 5

Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)-2’,6’-

aetoksilidida monohidroklorida monohidrat) ....................... 6

Gambar 3. Instrumentasi KCKT ............................................................. 9

Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik ...... 13

Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik .................................. 14

Gambar 6. Difusi Eddy .......................................................................... 15

Gambar 7. Transfer massa pada fase diam .............................................. 17

Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak ............................................. 17

Gambar 9. Pemisahan dua senyawa ........................................................ 18

Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor ............ 20

Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak ................... 20

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol ............ 37

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain hidroklorida . 37

Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13

ppm (A) dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B) .................. 37

Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5

ppm (A) dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B) ................. 38

Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26

ppm (A) dan lidokain hidroklorida 600 ppm (B) .................. 38


xv

Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18

(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals................. 41

Gambar18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C18

(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals dan

interaksi ion-dipol ............................................................... 41

Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak

metanol:aquabides ............................................................... 42

Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida dengan fase

gerak metanol:aquabides ..................................................... 42

Gambar 21. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida

(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

rate 0,8 mL/menit ............................................................... 46

Gambar 22. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida

(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

rate 1,0 mL/menit................................................................ 47

Gambar 23. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida

(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

rate 1,2 mL/menit................................................................ 48



rate 0,8 mL/menit................................................................ 50


xvi


(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow

rate 1,0 mL/menit ................................................................. 51


(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow

rate 1,2 mL/menit ................................................................. 52



rate 0,8 mL/menit ................................................................. 54


(B.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida (B.3) dengan fase gerak metanol:aquabides

95:5 dan flow rate 1,0 mL/menit ........................................... 55


(C.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida (C.3) dengan fase gerak metanol:aquabides

95:5 dan flow rate 1,2 mL/menit ........................................... 56

Gambar 30. Kromatogram kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam

sediaan tetes telinga Colme® pada replikasi 1, replikasi 2,

dan replikasi 3 dengan komposisi fase gerak dan flow rate

hasil optimasi........................................................................ 62


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat analisis kloramfenikol ......................................... 69

Lampiran 2. Sertifikat analisis lidokain hidroklorida .............................. 70

Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak

metanol:aquabides (75:25) ................................................. 71

Lampiran 4. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides

(75:25) dan contoh perhitungannya .................................... 77


metanol:aquabides (85:15) ................................................. 79



(85:15) dan contoh perhitungannya .................................... 85


metanol:aquabides (95:5) ................................................... 87



(95:5) dan contoh perhitungannya ...................................... 95

Lampiran 9. Nilai resolusi dan HETP pada fase gerak

metanol:aquabides (95:5) dan contoh perhitungannya ........ 97

Lampiran 10. Reprodusibilitas: Kromatogram baku kloramfenikol, baku

lidokain hidroklorida, baku campuran kloramfenikol dan


xviii


(95:5) flow rate 1,0 mL/menit ............................................ 100

Lampiran11. Reprodusibilitas: Kromatogram kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®

.. 127

Lampiran 12. Data hasil uji reprodusibilitas sistem dan perhitungan

%CV .................................................................................. 130


xix

INTISARI

Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida merupakan zat aktif yang

terdapat dalam sediaan tetes telinga Colme®. Dalam produk tetes telinga perlu

adanya penjaminan mutu terkait kadar senyawa aktifnya sehingga semakin

terjamin keamanan dan khasiatnya. Pada penelitian ini digunakan metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode analisis

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum dari KCKT

sehingga dapat digunakan sebagai penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sistem KCKT fase terbalik

menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol:aquabides. Optimasi

dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak metanol:aquabides

(75:25), (85:15) dan (95:5) serta mengubah-ubah flow rate yaitu 0,8; 1,0; dan 1,2

mL/menit dengan detektor ultraviolet pada λmaks 265 nm.

Kondisi optimum sistem KCKT yang didapatkan adalah fase gerak

metanol:aquabides (95:5) pada flow rate 1,0 mL/menit. Kondisi optimum ini telah

memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu peak yang simetri, tR kurang dari

10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 yaitu 3,1819, dan nilai HETP yang paling kecil yaitu

0,0128.

Kata kunci: kloramfenikol, lidokain hidroklorida, tetes telinga, optimasi metode,

KCKT fase terbalik


xx

ABSTRACT

Chloramphenicol and lidocaine hydrochloride is the active substances

contained in preparations Colme® ear drops. Ear drops needs the quality assurance

of products related to levels of the active compounds, so security is ensured and

usability. In this study using High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

reverse phase as a method of analysis of chloramphenicol and lidocaine

hydrochloride in the preparation Colme® ear drops.

This study aims to determine the optimum conditions for HPLC can be

used as a test of lidocaine hydrochloride and chloramphenicol in the preparation

Colme® ear drops. Reverse phase HPLC system using C18 column with mobile

phase methanol:aquabidest. Optimization is done by changing the composition of

mobile phase methanol:aquabidest (75:25), (85:15) and (95:5) and varying the

flow rate of 0,8; 1,0; and 1,2 mL/min with an ultraviolet detector at λmaks 265

nm.

The optimal conditions obtained by HPLC system is the mobile phase

methanol: aquabidest (95:5) at flow rate of 1,0 mL/min. Optimal conditions in

accordance with the parameters of a good separation of the peak of the symmetry,

tR less than 10 minutes, the value of resolution ≥ 1,5 is 3,1819, and the lowest

HETP is 0,0128.

Key words: chloramphenicol, lidocaine hydrochloride, ear drops, optimization

methods, reversed-phase HPLC


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Guttae auricularies atau obat tetes telinga adalah bahan obat berbentuk

cairan yang cara penggunaanya dengan meneteskan ke dalam saluran telinga,

kecuali dibuat dengan pembawa bukan air (Dirjen POM RI, 1974). Colme®

adalah

salah satu jenis obat tetes telinga yang beredar di Indonesia. Colme®

mengandung

senyawa antibiotik yaitu kloramfenikol 10% dan obat pemati rasa yaitu lidokain

hidroklorida 4% (Anonim, 2006).

Kloramfenikol memiliki kelarutan 1 bagian di dalam 400 bagian air dan 1

bagian didalam 2,5 bagian etanol, sangat larut di eter dan kloroform (Clarke,

1969). Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), tetes telinga kloramfenikol

adalah larutan steril kloramfenikol dalam pelarut yang sesuai, mengandung tidak

kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 130% C11H12Cl2N2O5 dari jumlah yang

tertera pada etiket.

Lidokain hidroklorida (Otopain) adalah obat pemati rasa yang bekerja di

dalam kulit dan selaput lendir dengan menghilangkan rasa nyeri, rasa terbakar,

dan gatal pada telinga (Tan dan Rahardja, 2010). Lidokain berbentuk bubuk

kristal putih dan memiliki sifat larut 1 bagian dalam 0,7 bagian air, 1 bagian

didalam 1,5 bagian etanol, dan 1 bagian didalam 40 bagian kloroform dan tidak

larut dalam eter (Clarke, 1969). Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida

mengandung lidokain hidroklorida tidak kurang dari 95,0


2

% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Dirjen POM

RI, 1995).

Dalam rangka menjamin kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme®,

dibutuhkan suatu metode yang sensitif dan selektif sehingga khasiat dan

keamanannya benar-benar dapat dipertanggungjawabkan. Oleh karena itu, metode

yang dipilih sebagai metode analisis dalam pemisahan kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme® adalah metode KCKT fase

terbalik. Metode KCKT ini sering digunakan sebagai metode analisis kuantitatif

atau penetapan kadar suatu senyawa tertentu di dalam suatu matriks yang

kompleks atau terdapat banyak komponen lain di dalam matriks sampel (Khopkar,

1990). Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet.

Kloramfenikol di dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar

ultraviolet yaitu pada 272 nm ( ) dan lidokain hidroklorida di dalam

metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet pada 263 nm (

) dan 271 nm ( ) (Dibbern, Muller and Wirbitzki, 2002).

Penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk

sediaan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pernah

dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990). Fase diam yang digunakan adalah

kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm i.d; ukuran partikel 5µm) dan fase

gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Hal yang membedakan penelitian ini dengan

penelitian Sadana dan Ghogare adalah senyawa yang akan dipisahkan, yaitu

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Selain itu kolom yang akan digunakan


3

pada penelitian ini adalah Kromasil sedangkan Sadana dan Ghogare adalah kolom

µBondapak. Adanya perbedaan tersebut maka diperlukan adanya suatu penelitian

optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut untuk mendapatkan kondisi optimal.

Optimasi metode KCKT bertujuan untuk mengetahui kondisi yang

optimum pada metode KCKT sehingga dapat digunakan sebagai metode

penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada obat

tetes telinga Colme®. Kondisi yang optimum yang diharapkan adalah bentuk peak

yang simetri, waktu retensi (tR) < 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak

terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil (Synder, Kirkland, and Glajh, 1997).

Optimasi yang dilakukan adalah dengan mengubah komposisi fase gerak dan

kecepatan alir atau flow rate sehingga parameter-parameter yang telah disebutkan

tersebut dapat terpenuhi.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang, permasalahan yang diperoleh adalah

bagaimanakah komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum yang dapat

menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (tR) < 10 menit,

nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil

untuk penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada

obat tetes telinga Colme®

dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik?

2. Keaslian penelitian

Penelitian terkait pernah dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990),

yaitu penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk sediaan

dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase


4

diam yang digunakan adalah kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm i.d;

ukuran partikel 5µm) dan fase gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Akan tetapi,

penelitian berupa optimasi campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik belum pernah

dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Menjadi sumbangan karya ilmiah tentang

metode penelitian dalam melakukan optimasi alat KCKT untuk penetapan kadar

campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan topikal.

b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode awal untuk

validasi dan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang

nantinya dapat memberikan informasi bagi masyarakat mengenai penjaminan

mutu pada obat tetes telinga yang mengandung kedua obat tersebut.

B. Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan di atas, maka penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum

yang dapat menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (tR)

< 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang

semakin kecil untuk validasi dan penetapan kadar campuran kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida pada obat tetes telinga Colme® dengan menggunakan

metode KCKT fase terbalik.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kloramfenikol

Kloramfenikol adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan cara

menghambat sintesis protein mikroba. Penghambatan yang terjadi yaitu pada

enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator dalam pembentukan

ikatan peptida ketika sintesis protein. Kloramfenikol bersifat bakteriostatik, dan

dapat bersifat baktersid pada konsentrasi yang tinggi (Setiabudy dan Kurnadi,

1995).

Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-

p)nitrofenetilasetamida) (Hutt and O’Grady, 1996)

Kloramfenikol memiliki berat molekul (BM) 323,13 g/mol.

Kloramfenikol mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 103,0%

C11H12Cl2N2O5. Namun, untuk tetes telinga kloramfenikol mengandung tidak

kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% C11H12Cl2N2O5 dari jumlah yang

tertera pada etiket. Kloramfenikol memiliki hablur halus, berbentuk jarum atau

lempeng memanjang, berwarna putih kelabu atau putih kekuningan, dan sifatnya

stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam, serta sukar larut dalam air,

mudah larut dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat (Dirjen POM

RI, 1995). Kloramfenikol di dalam metanol memiliki λmaks pada 272 nm


6

( ) (Dibbern et al., 2002). Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5 dan

7,5 (Dirjen POM RI, 1995), dan pKa 5,5 (Clarke, 1969).

B. Lidokain Hidroklorida

Lidokain memiliki daya kerja yang cepat dan merupakan obat anestesi

lokal yang paling sering digunakan karena lebih stabil dalam pemanasan dan

jarang menimbulkan reaksi hipersensitivitas (Sutedjo, 2008).

Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)-2’,6’-aetoksilidida

monohidroklorida monohidrat) (British Pharmacopeia Comission, 2009)

Lidokain hidroklorida memiliki berat molekul (BM) 270,80 g/mol,

berbentuk serbuk hablur putih, tidak berbau dan rasa sedikit pahit dan sifatnya

mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi tidak larut dalam

eter. Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida mengandung lidokain hidroklorida

tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada

etiket (Dirjen POM RI, 1995). Lidokain di dalam metanol memiliki λmaks pada

263 nm ( ) dan 271 nm ( ) (Dibbern et al., 2002).

Lidokain hidroklorida memiliki pH antara 5,0 dan 7,0 (Dirjen POM RI, 1995),

dan pKa 7,9 (25°) (Clarke, 1969).

C. Obat Tetes Telinga

Tetesan (guttae) adalah sediaan cair yang mengandung bahan obat atau

sediaan obat atau bahan obat dan sediaan obat terlarut, teremulsi, atau tersuspensi,


7

ditakar berdasar jumlah tetesan, digunakan untuk diminum dan diisikan ke dalam

wadah bertakaran ganda. Untuk tetesan tertentu yang digunakan di telinga,

dinamakan tetes telinga (otoguttae) (Voigt, 1994).

Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, obat tetes telinga (guttae

auriculares) adalah obat tetes yang digunakan dengan cara meneteskan ke dalam

telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan menggunakan pembawa bukan air.

Pembawa pada obat tetes telinga harus mempunyai kekentalan yang cocok hingga

obat mudah menempel. Pada umumnya digunakan gliseril dan propilenglikol,

selain itu dapat juga menggunakan etanol, heksilenglikol, dan minyak lemak

nabati (Dirjen POM RI, 1995).

D. Spektrofotometer UV

Teknik spektroskopik merupakan salah satu teknik analisis fisiko-kimia

yang mengamati interaksi atom atau molekul dengan suatu radiasi

elektromagnetik (REM) (Mulja dan Suharman, 1995). Metode analisis

spektrofotometri ultraviolet didasarkan pada substitusi pada daerah panjang

gelombang sekitar 190-380 nm (Khopkar, 1990).

Absorbansi cahaya ultraviolet mengakibatkan transisi elektronik, yaitu

promosi elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital

keadaan tereksitasi yang lebih tinggi. Panjang gelombang ultraviolet bergantung

pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan banyak

energi untuk promosi elektron akan menyerap pada panjang gelombang yang

lebih pendek dan sebaliknya (Fessenden dan Fessenden, 1997).


8

Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ σ*, n

σ*, n π*, dan π π* (Mulja dan Suharman, 1995). Pada transisi σ σ*,

elektron pada suatu orbital σ tereksitasi ke orbital σ*, dengan mengabsorbsi

radiasi. Anti-ikat Transisi n σ* terjadi dalam senyawa-senyawa jenuh dengan

elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi yang lebih kecil

dan terjadi dalam daerah 150-250 nm dengan є = 100-3000. Transisi n π* dan

π π*mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi yang diperlukan untuk

transisi menghasilkan absorbsi maksimum dalam daerah 200-700 nm. Dengan

adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi tidak jenuh. Transisi n π*

memiliki є = 10-100 L/cm/mol sedangkan transisi π π* memiliki є = 1000-

10.000 L/cm/mol (Khopkar, 1990).

Kromofor merupakan suatu gugus fungsional tidak jenuh yang

menyediakan orbital π yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog,

1985). Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada

kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum,

cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor (Sastrohamidjojo,

2001).

Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum panjang gelombang

tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan

atau diabsorbsi. Sehingga, spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi

yang ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang

gelombang (Khopkar, 1990).


9

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT

Kromatografi cair kinerja tinggi atau yang dikenal dengan HPLC (High

Performance Liquid Chromatography) mulai dikembangkan akhir tahun 1960 dan

awal tahun 1970 (Rohman, 2009). Penggunaan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) tidak terbatas untuk sampel yang bersifat volatil atau

stabilitasnya yang mudah dipengaruhi oleh suhu. HPLC dapat memisahkan

makromolekul, spesies ion, produk alami yang bersifat labil, polimer, dan lain-

lain (Willard, Merrit, Dean, and Settle, 1988).

Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal atau fase

terbalik. Fase normal apabila fase diamnya lebih polar dibandingkan dengan fase

geraknya dan fase terbalik apabila fase diamnya lebih non polar daripada fase

geraknya. Dengan adanya kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan

menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik (Gritter, 1991).

Gambar 3. Instrumentasi KCKT(Christian, 2004)


10

Bagian yang harus diperhatikan pada kromatografi partisi fase terbalik

adalah kolom, fase gerak, dan detektor.

a. Kolom. Oktadesil silika (ODS atau C18) adalah fase diam yang paling

umum digunakan pada KCKT fase terbalik karena mampu memisahkan senyawa

dengan kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Rohman, 2009).

Panjang kolom KCKT biasanya sekitar 5-25 cm, dengan tekanan yang

sangat tinggi yaitu sampai 6000 psi (Gritter, 1991). Standar diameter kolom

HPLC sekitar 4-5 mm. Diameter partikel berada pada kisaran 4 sampai 7 µm

untuk kolom pada umumnya (Dean, 1995).

b. Fase gerak. Selain susunan kimiawi dari fase gerak, ada empat hal

pada fase gerak yang harus diperhatikan yakni harus murni secara kimia, harus

bebas partikel yang dapat menyumbat kolom, harus bebas gas yang terlarut, dan

jika dilakukan pencampuran, maka saat pencampuran harus dicampur dengan

benar (Gritter, 1991).

Komposisi fase gerak yang digunakan dapat mempengaruhi variasi

retensi analit untuk pemisahan yang optimal. Sehingga fase gerak disesuaikan

komposisinya agar diperoleh kepolaran relatif yang mirip dengan sampel untuk

memperoleh pemisahan yang optimal (Willard et al., 1998).


11

Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT (Synder et al., 1997)

Dalam pemilihan fase gerak yang sesuai, parameter yang dilihat

berdasarkan kepolaran campuran pelarut yang semakin linier dengan pelarut

murni. Tingkat kepolaran suatu pelarut menunjukkan kemampuan pelarut dalam

mengelusi suatu senyawa. Besarnya polaritas dapat dihitung dengan cara seperti

dibawah ini:

P’camp: Ф1 P’1 + Ф2 P’2 + ........ + Фn P’n (1)

Keterangan:

P’= indeks polaritas

Ф = fraksi volume pelarut (Gritter, 1991).

Semakin besar nilai indeks polaritas campuran maka fase gerak yang digunakan

semakin polar (Synder et al., 1997).

c. Detektor. Secara umum suatu detektor harus memiliki karakteristik

tertentu yaitu memiliki respon cepat terhadap solut, reprodusibel, memiliki

sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasian, signal yang dihasilkan berbanding

lurus dengan konsentrasi solut, tidak dipengaruhi suhu dan kecepatan alir fase

gerak (Rohman, 2009).

Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu:


12

1) Bulk property detectors

Detektor ini merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase

gerak dan solut. Detektor ini cenderung relatif tidak sensitif dan menghendaki

suhu yang terkendali. Contohnya yaitu detektor indeks bias.

2) Solute Property detectors

Detektor ini hanya dapat mengukur sifat fisik solut dan 1000 kali lebih sensitif

serta mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi.

Contohnya yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan (UV-Vis), dan

detektor elektrokimia (Munson, 1991).

2. Kromatografi partisi fase terbalik

Konsep dasar kromatografi partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi

cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat

(Gritter, Bobbit, and Schwarting, 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak

saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing

senyawa. Jika solut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut

tidak saling campur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, maka solut akan

tersebar di antara kedua fase menurut persamaan:

(2)

K = koefisien distribusi

Cs = konsentrasi solut dalam fase diam

Cm = konsentrasi solut dalam fase gerak (Johnson dan Stevenson, 1978).

Mekanisme pemisahan pada kromatografi partisi fase terbalik dapat digambarkan

sebagai berikut:


13

Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik (Munson,

1991)

3. Pemisahan puncak dalam kromatografi

Parameter pemisahan dengan sistem KCKT sebagai ukuran kemampuan

kolom untuk memisahkan senyawa dari suatu campuran. Batasan yang digunakan

adalah efisiensi kolom, waktu retensi (tR), dan faktor resolusi (Munson, 1991).

a. Efisiensi Kolom. Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang

paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N) (Rohman, 2009).

Ada dua teori mengenai pemisahan puncak dalam kromatografi,yaitu lempeng

teoritik dan teori laju.

Pada teori Lempeng (Plate theory) dijelaskan bahwa ukuran efisiensi

kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep

lempeng teoritis (Rohman, 2009). Jumlah lempeng (N) dihitung dengan

persamaan (Willard et al., 1988):

(3)


14

Nilai w adalah lebar alas, w1/2 adalah lebar alas puncak pada setengah

tinggi puncak, dan tR adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo, 2001). Persamaan

dibawah ini menggambarkan hubungan anatra panjang kolom (L) dengan efisiensi

kolom (H):

(4)

Jumlah lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik

yang nilainya sebanding dengan semakin panjang kolom (L) dan semakin

kecilnya nilai H. H adalah tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP (High

Equivalent Theoritical Plate), merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk

menghasilkan suatu lempeng teoritis. Kolom yang baik seharusnya memiliki

jumlah plat teoritis (N) yang tinggi dan nilai H yang rendah. Ukuran partikel

merupakan suatu hal yang berpengaruh pada nilai H, dimana semakin kecil

ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis (Rohman, 2009).

Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik

(Willard et al., 1988)

Pada teori laju dapat diketahui adanya pengaruh variabel-variabel lain

yang menyebabkan pelebaran peak, sedangkan teori lempeng hanya

menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif. Ketika migrasi, solut mengalami

N

LHETPH


15

transfer pada fase diam dan fase gerak berkali-kali, solut bergerak bersama fase

gerak sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur yang mengakibatkan laju

rata-rata solut relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi. Laju rata-rata

solut relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga mengakibatkan pelebaran

peak solut (Noegrohati, 1994).

Berdasarkan teori laju yang ada, efisiensi kolom dinyatakan dengan

persamaan Van Deemter yang dinyatakan sebagai berikut:

(5)

(6)

Keterangan:

λ = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan

dp = diameter rata-rata partikel penyangga

D = kedifusian linarut dalam fase gerak

k’ = Faktor kapasitas

µ = kecepatan alir

γ = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom (Willard et al., 1988).

Berdasarkan persamaan Van Deemter di atas, hal-hal yang mempengaruhi

efisiensi kolom yaitu Difusi Eddy, Difusi Longitudinal, dan Transfer Massa

(Willard et al., 1988).

Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan kolom

yang kurang baik.

Gambar 6. Difusi Eddy (Noegrohati, 1994)


16

Nomor 1 menunjukkan analit yang keluar lebih dahulu karena melewati kolom

dengan partikel berukuran besar dan kurang kompak. Nomor 2 menunjukkan

analit keluar lebih lambat dari nomor 1 karena ukuran partikel yang lebih kecil

dan lebih kompak daripada nomor 1. Nomor 3, analit keluar paling akhir, hal ini

terjadi karena melewati bagian kolom dengan ukuran partikel halus dan kompak

(Noegrohati, 1994).

Menurut Willard (1988), difusi Eddy dinyatakan sebagai A (2λdp) yang

menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang lintasan di sekitar

partikel yang ter-packing. Lintasan alir yang tidak sama pasti ditemukan dalam

setiap kolom ter-packing. Suatu molekul solut dapat melewati kolom dekat

dinding kolom di mana kerapatan kolom rendah dengan cepat mencapai akhir

kolom, khususnya pada kolom berdiameter kecil. Sedangkan suatu molekul solut

yang melewati bagian tengah kolom menjadi lebih lambat untuk mencapai akhir

kolom. Dengan demikian, laju tiap molekul melalui kolom berbeda-beda. Difusi

Eddy dapat diminimalkan dengan memperkecil diameter rata-rata partikel dalam

kolom hingga sekecil mungkin dan seseragam mungkin.

Difusi longitudinal dilambangkan dengan nilai B (2γD/µ) yang

menggambarkan pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh difusi

longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan pada kecepatan fase

gerak yang rendah/lambat. Pada kecepatan difusi solut yang tinggi dalam fase

gerak menyebabkan molekul solut terdispersi secara aksial dan lambat bermigrasi

melalui kolom (Willard et al., 1988).


17

Transfer massa dinyatakan dengan nilai Cstasionary dan Cmobile.

Cstasionery yang menunjukkan solut yang tertahan karena adanya fase diam.

Suatu molekul bergerak lambat pada fase diam, sementara molekul lainnya

bergerak melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal tersebut,

dapat dibuat fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental) (Willard et al.,

1988).

Gambar 7. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)

Sedangkan Cmobile menggambarkan adanya peristiwa dimana solut dalam fase

diam bertemu dengan fase gerak yang masih baru.

Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)

b. Waktu retensi (tR) dan faktor resolusi. Waktu tambat atau waktu retensi

merupakan selang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi hingga

keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu tambat atau

retensi ini dinyatakan sebagai tR. Apabila harga D (koefisien distribusi) kecil,


18

maka analit akan lebih banyak di dalam fase gerak atau (Cm > Cs) yang berarti

analit akan lebih lama tinggal di dalam fase gerak dan memiliki waktu retensi

lebih cepat (Mulja dan Suharman, 1995).

Kolom yang lebih efisien akan memiliki resolusi yang baik. Tingkat

pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi

direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Hasil pemisahan yang baik

ditunjukkan dengan puncak-puncak yang terpisah secara sempurna atau tidak ada

tumpang tindih (overlapping) (Rohman, 2009).

Faktor resolusi atau daya pisah (Rs) dapat diukur secara kuantitatif

dengan persamaan (Willard et al., 1988):

(7)

Nilai tR2 dan tR1 adalah waktu tambat atau waktu retensi komponen, diukur pada

titik puncak maksimum puncak dan ∆t adalah selisih antara tR2 dan tR1. Nilai w2

dan w1 adalah lebar alas puncak (Johnson dan Stevenson, 1978).

Gambar 9. Pemisahan dua senyawa (Willard et al., 1988)


19

Pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama dikenal

dengan base resolution dengan harga Rs ≥1,5. Dalam praktiknya, pemisahan

dengan nilai Rs = 1,0 (kedua puncak berhimpit 2%) dianggap memadai (Pescok,

Shields, and Cains, 1976).

Pada analisis dengan metode KCKT, kondisi percobaan yang dapat

menghasilkan puncak simetris lebih disukai, hal ini dikarenakan puncak asimetris

menghasilkan pengukuran bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi yang

tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat resolusi dan puncak

minor pada ekor puncak tidak dapat terdeteksi, serta waktu retensi tidak

reprodusibel (Synder et al., 1997). Peak yang tidak simetris sering dijumpai bila

konsentrasi sampel dalam fase gerak terlalu besar. Apabila kapasitas kolom lebih

besar pada konsentrasi yang lebih rendah, bagian eluen dengan konsentrasi yang

lebih rendah akan bergerak lebih lambat dari pada bagian dengan konsentrasi solut

lebih tinggi, sehingga peak yang terjadi tidak simetris dengan bidang bagian

depan naik dengan tajam sedangkan bidang di bagian belakang turun dengan

landai (tailing). Keadaan sebaliknya dikenal sebagai leading atau fronting.

Penyebab tailing antara lain karena ketidaksesuaian antara analit dengan kolom,

pengemasan kolom yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi di luar kolom

seperti pada injektor (Noegrohati, 1994).

Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah peak

asymmetry factor (As), yang diukur 10% tinggi puncak. Peak yang simetri

memiliki nilai As =1,0. Sedangkan puncak lain dengan nilai As pada rentang 0,95-

1,1 masih dikatakan baik. Parameter lain yaitu peak tailing factor (Tf), yang


20

diukur pada 5% tinggi puncak (Synder et al., 1997). Sedangkan menurut Willard

(1988), nilai asymmetry factor (AF) pada peak yang simetri dengan rentang 0,95-

1,15.

Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor (Synder et al.,

1997)

Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat terjadinya

tailing dan leading terdapat pada gambar dibawah ini:

Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak (Kuwana, 1980)

F. Landasan teori

Kloramfenikol merupakan senyawa antimikroba yang memiliki sifat

stabil dalam larutan netral, larutan agak asam, sukar larut dalam air, mudah larut

dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat. Kloramfenikol di dalam


21

metanol memiliki λmaks pada 272 nm ( ). Senyawa ini memiliki pH

antara 4,5 dan 7,5, dan pKa 5,5.

Lidokain hidroklorida merupakan obat anestesi yang memiliki sifat

mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi tidak larut dalam

eter. Lidokain di dalam metanol memiliki λmaks pada 263 nm ( ) dan

271 nm ( ). Senyawa ini memiliki pH antara 5,0 dan 7,0, dan pKa 7,9

(25°).

Sediaan tetes telinga Colme® merupakan sedian tetes telinga yang

mengandung kloramfenikol 10% dan lidokain hidroklorida 4%. Untuk menjamin

kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme® maka dibutuhkan metode yang

sensitif dan selektif. Metode yang memiliki sensitifitas dan selektivitas yang

tinggi adalah metode KCKT. Optimasi dengan KCKT fase terbalik dilakukan

untuk memperoleh keadaan optimum pada pemisahan campuran kloramfenikol

dan lidokain hidroklorida. Parameter pemisahan dengan metode KCKT yang

menunjukkan kondisi optimum yaitu bentuk peak simetri, tR kurang dari 10 menit,

nilai resolusi ≥ 1,5 dan nilai HETP yang semakin kecil.

G. Hipotesis

Metode KCKT fase terbalik dengan komposisi fase gerak dan flow rate

yang optimum dapat menghasilkan kromatogram dengan bentuk peak yang

simetri, tR < 10 menit, resolusi pemisahan ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai

HETP yang semakin kecil sehingga dapat digunakan untuk validasi dan penetapan

kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada sediaan tetes telinga Colme®.


22

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan jenis rancangan penelitian

eksperimental analitik karena ada perlakuan pada subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol:aquabides dan flow rate

yang digunakan.

2. Variabel tergantung

Pemisahan peak dari tiap komponen yaitu kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida yang dilihat dari bentuk peak, waktu retensi (tR), nilai resolusi dan

HETP tiap-tiap senyawa.

3. Variabel pengacau terkendali

a. Kemurnian pelarut. Oleh karena itu, digunakan pelarut yang memiliki

kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.

b. Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Oleh karena itu, digunakan

baku dengan kemurnian tinggi yang disertai dengan Certificate of Analysis

(CoA).


23

C. Definisi Operasional

1. Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang dianalisis merupakan senyawa

aktif dalam sediaan tetes telinga Colme® dengan perbandingan 5:2.

2. Lidokain HCl yang digunakan adalah lidokain hidroklorida monohidrat.

3. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT

menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol p.a:aquabides.

4. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate.

5. Parameter optimum dengan metode KCKT adalah bentuk peak, waktu retensi,

nilai resolusi dan HETP.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kloramfenikol

(Chemo Lugano Branch, No. batch 8000225001, kemurnian 99,1%) dan baku

lidokain hidroklorida (Megafine Pharma, No. batch ALH/449/10, kemurnian

99,20%) (PT. Interbat), metanol p.a (E.Merck), aqua bidestilata (PT.

Ikapharmindo Putramas), tetes telinga Colme® (PT. Interbat) dengan volume 8 ml

yang mengandung 10% kloramfenikol dan 4% lidokain hidroklorida.

E. Alat-alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat KCKT fase

terbalik dengan sistem gradien dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C,

kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250

x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System


24

RD01- D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000

625730), UV/Vis Spectrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA dengan

detektor silicon photo diode, timbangan analitik Ohaus Carat Series PAJ 1003

(max 60/120g, min 0,001g, d = 0,01/0,1 mg), millipore, alat ultrasonikasi Refsch.,

Tipe: T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ.:35 kHz), kertas

saring Whatman 0,45 μm, alat vacuum, dan seperangkat alat gelas.

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol

dan aquabides dengan komposisi tabel II.

Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides

No. Komposisi Fase gerak

Metanol Aquabides

1. 75 25

2. 85 15

3. 95 5

Masing-masing pelarut disaring dengan penyaring Whatman yang dibantu

dengan pompa vakum dan didegassing selama 15 menit menggunakan

ultrasonicator. Untuk mendapatkan komposisi fase gerak di atas, pencampuran

fase gerak dilakukan di dalam sistem KCKT.

2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang

digunakan untuk penentuan panjang gelombang pengamatan

a. Pembuatan larutan baku kloramfenikol. Sebanyak kurang lebih 10,0

mg kloramfenikol ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol hingga 10,0


25

mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 13; 19,5;

dan 26 ppm dengan mengencerkan 0,13; 0,195; dan 0,26 mL larutan stok tersebut

dalam metanol hingga 10,0 mL.

b. Pembuatan larutan baku lidokain hidroklorida. Sebanyak kurang lebih

10,0 mg lidokain hidroklorida ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol

hingga 10 mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu

300; 450; dan 600 ppm dengan mengencerkan 3; 4,5; dan 6 mL larutan stok

tersebut dalam metanol hingga 10,0 mL.

3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang

digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT

a. Larutan stok kloramfenikol. Lebih kurang 10,0 mg kloramfenikol baku

ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 10,0 mL.

b. Larutan intermediet kloramfenikol. Larutan stok kloramfenikol 1000

ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 1 mL kemudian diencerkan dengan

metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas, sehingga didapatkan

konsentrasi sebesar 100 ppm. Saring dengan milipore dan didegassing selama 15

menit.

c. Larutan stok lidokain hidroklorida. Lebih kurang 20,0 mg lidokain

hidroklorida baku ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga

10,0 mL.

d. Larutan intermediet lidokain hidroklorida. Larutan stok lidokain

hidroklorida 2000 ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 5 mL kemudian

diencerkan dengan metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas, sehingga


26

didapatkan konsentrasi sebesar 1000 ppm. Saring dengan milipore dan

didegassing selama 15 menit.

4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida

Campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yaitu dengan

konsentrasi masing-masing 100 ppm dan 1000 ppm dibuat dengan mencampur 1

mL stok kloramfenikol dengan 5 ml stok lidokain hidroklorida dalam labu ukur 10

mL, lalu tambahkan dengan metanol hingga tanda. Campuran kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida tersebut disaring dengan milipore dan didegassing selama

15 menit.

5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis

Masing-masing seri konsentrasi baku kloramfenikol 13; 19,5; 26 ppm dan

lidokain hidroklorida 300; 450; 600 ppm diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Dari spektra serapan

dapat diketahui panjang gelombang yang dihasilkan pada masing-masing

konsentrasi. Panjang gelombang yang akan digunakan pada sistem KCKT

ditentukan yaitu panjang gelombang yang menghasilkan serapan optimum pada

ketiga konsentrasi tersebut.

6. Preparasi Sampel

Sediaan tetes telinga Colme®

(kloramfenikol 10% dan lidokain

hidroklorida 4 %) digojog homogen, kemudian dipipet seksama sebanyak 0,1 mL

dan diencerkan dengan metanol sampai 10 mL sehingga didapatkan konsentrasi


27

kloramfenikol 1000 ppm dan lidokain hidroklorida 400 ppm. Larutan tersebut

kemudian dipipet seksama sebanyak 1 mL sehingga didapatkan konsentrasi

kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 40 ppm. Larutan ini kemudian

ditambahkan 2,4 mL larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm dan diencerkan

dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL hingga batas tanda, sehingga

didapatkan konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000

ppm. Larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm disiapkan dengan menimbang

seksama lebih kurang 2,0 mg lidokain hidroklorida yang diencerkan dengan

metanol dalam labu takar 5,0 mL hingga batas tanda. Larutan sampel dengan

konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000 ppm disaring

dengan milipore dan didegassing selama 15 menit.

7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan

metode KCKT fase terbalik

a. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi

kloramfenikol. Larutan baku kloramfenikol dengan konsentrasi 100 ppm

diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada

panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak

metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow rate

0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate

tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya kurang dari 10

menit.

b. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi lidokain

hidroklorida. Larutan baku lidokain hidroklorida dengan konsentrasi 1000 ppm


28

diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada

panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak

metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow rate

0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate

tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya kurang dari 10

menit.

c. Pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan

fase gerak hasil optimasi. Baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

dengan konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm diinjeksikan

sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT menggunakan perbandingan fase gerak

dan flow rate hasil optimasi. Pemisahan dilakukan pada panjang gelombang

pengamatan kemudian mengamati kromatogram yang terjadi. Setelah mendapat

kromatogram dilanjutkan dengan menghitung nilai resolusi dan HETP dari hasil

pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.

d. Reprodusibilitas baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida. Baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan

konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm direplikasi sebanyak 3

kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 12; 16; dan 20 µL ke dalam sistem KCKT

menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Setelah

mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV resolusi dan waktu

retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.

e. Reprodusibilitas campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sampel yang telah dipreparasi dengan


29

konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000 ppm

direplikasi sebanyak 3 kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam

sistem KCKT menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi.

Setelah mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV resolusi

dan waktu retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida

F. Analisis Hasil

Hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate tertentu menghasilkan

data kromatogram. Data kromatogram yang didapatkan yaitu kromatogram baku

dan sampel diamati, sehingga dapat diketahui sistem KCKT fase terbalik yang

memberikan pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida paling baik yaitu

dengan mengamati bentuk peak, waktu yang dibutuhkan untuk elusi, menghitung

nilai resolusi dan HETP. Pemisahan yang baik adalah pemisahan dengan bentuk

peak yang simetri (tidak tailing atau fronting), waktu retensi (tR) kurang dari 10

menit, memiliki nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat dan nilai HETP yang

semakin kecil.

1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

Bentuk peak yang diharapkan adalah simetri. Sebagai parameternya yaitu

Asymmetry Factor (AF) yang diukur 0,1 dari tinggi peak. Perhitungan AF melalui

persamaan: AF = b/a. Apabila AF = 1 maka peak dikatakan simetri dan pada nilai

AF = 0,95-1,15, peak masih dikatakan baik.


30


2. Waktu retensi (tR)

Pengamatan waktu dilakukan untuk melihat waktu yang dibutuhkan

untuk pemisahan senyawa. Apabila kurang dari 10 menit, maka pemisahan

dikatakan efisien.

3. Nilai resolusi

Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan

rumus sebagai berikut:

Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs ≥ 1,5.


(8)


31

4. Nilai HETP

Nilai HETP dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

(9)

dimana “N” merupakan bilangan lempeng teoritik dengan persamaan sebagai

berikut:

Nilai HETP semakin kecil menandakan efisiensi kolom semakin baik dan

pemisahan juga semakin baik.


5. Reprodusibilitas

Reprodusibilitas resolusi dan waktu retensi diketahui dengan menghitung

nilai %CV dari nilai resolusi dan waktu retensi hasil pemisahan kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida pada baku campuran dan sediaan tetes telinga Colme®.

Perhitungan %CV dengan persamaan sebagai berikut:

Reprodusibilitas yang baik apabila harga CV kurang dari 2% (Mulja dan Hanwar,

2003).

N

LHETPH

(10)

(11)


32

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pemilihan Pelarut

Pemilihan pelarut menjadi sangat penting karena hanya pelarut yang

sesuailah yang dapat melarutkan analit yang akan dianalisis. Syarat utama dari

pelarut yang akan dipilih adalah pelarut yang dapat melarutkan analit.

Berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV, kelarutan kloramfenikol adalah 1:2,5

dalam etanol dan kelarutan lidokain hidroklorida adalah 1:1,5 dalam etanol.

Namun dalam penelitian ini bukan menggunakan etanol, melainkan metanol.

Metanol dipilih karena memiliki viskositas yang lebih rendah daripada etanol

yaitu 0,54 cP, sehingga penggunaan metanol dapat mengurangi tekanan pada

kolom. Metanol yang digunakan merupakan metanol pro analysis karena

memiliki kemurnian yang tinggi sehingga hasil pengukuran lebih akurat. Syarat

pelarut yang baik untuk digunakan pada KCKT adalah murni, inert, dapat

melarutkan analit dan dapat bercampur dengan fase gerak.

B. Pembuatan Fase Gerak

Metode KCKT yang digunakan adalah KCKT fase terbalik dengan fase

diam oktadesilsilan (C18) yang bersifat non polar dan fase gerak yang bersifat

lebih polar yaitu campuran metanol dan aquabides. Sistem yang digunakan adalah

sistem gradien yaitu pencampuran komposisi fase gerak berada di dalam alat

KCKT untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang diinginkan dengan


33

mengubah-ubah komposisi fase gerak. Metanol dipilih karena memiliki solubilitas

yang baik untuk garam, hal ini sangat menguntungkan karena pada penelitian ini

menggunakan analit dalam bentuk garam yaitu lidokain hidroklorida. Metanol

juga merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada sistem

KCKT fase terbalik. Selain itu digunakan aquabides untuk mendapatkan indeks

polaritas yang sesuai sehingga dengan komposisi yang tepat pada campuran

metanol dan aquabides akan dihasilkan profil kromatogram yang diinginkan dan

memenuhi syarat. Menurut Kellner et al. (1998), pada metode KCKT fase terbalik

sering kali digunakan solven seperti metanol, asetonitril yang dimodifikasi dengan

air (aquabides). Pemilihan komposisi fase gerak ini juga mengacu pada Sadana

dan Ghogare (1990) yang pernah memisahkan kloramfenikol dan benzokain

dengan campuran metanol dan aquabides dengan perbandingan 35:65.

Komposisi fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah

metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25 ; 85:15; dan 95:5. Menurut Synder

et al. (1997), dengan meningkatnya jumlah metanol pada KCKT fase terbalik

maka analit akan terelusi lebih mudah, sehingga perbandingan kompisisi fase

gerak ini dipilih dengan meningkatkan jumlah metanol secara bertahap. Fase

gerak yang telah dibuat terlebih dahulu disaring dengan penyaring Whatman

untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya fase gerak

diawaudarakan dengan menggunakan ultrasonicator untuk menghilangkan

gelembung udara yang dapat mengganggu pengukuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida.


34

Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol:aquabides

No Komposisi Fase Gerak

Indeks Polaritas Metanol Aquabides

1 75 25 6,375

2 85 15 5,865

3 95 5 5,355

Semakin kecil nilai indeks polaritas berarti semakin non polar fase gerak

tersebut sehingga urutan kepolaran dari yang polar ke non polar adalah 75:25,

85:15, dan 95:5. Menurut Mulja dan Suharman (1995), dalam sistem KCKT fase

terbalik, kemampuan elusi akan semakin meningkat dengan menurunkan indeks

polaritas fase gerak. Komposisi fase gerak tersebut diubah-ubah agar hasil

pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memenuhi parameter yang

diinginkan yaitu peak yang runcing dan simetri, memenuhi nilai resolusi, dan

HETP yang semakin kecil.

C. Pembuatan Larutan Baku

Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida didapatkan dari PT.

Interbat dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) sehingga terjamin

kemurniannya. Larutan baku ini dibuat dengan menggunakan pelarut metanol pro

analysis dengan kemurnian 99,85%. Tujuan pembuatan larutan baku yaitu sebagai

pembanding atau reference standard yang dapat digunakan untuk memastikan di

dalam sampel benar-benar terdapat analit yang dimaksud.

Dalam optimasi ini dibuat dua larutan baku masing-masing untuk

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan tiga volume injeksi yang berbeda.

Volume injeksi tersebut dibuat rendah, sedang, dan tinggi yaitu 12; 16; dan 20µL


35

dengan mengambil dari konsentrasi stok kloramfenikol 100 ppm dan stok lidokain

hidroklorida 1000 ppm. Selain itu dibuat pula baku campuran untuk

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang juga dibuat dalam tiga volume

injeksi yang berbeda dengan konsentrasi masing-masing 100:1000 ppm.

Pada optimasi ini digunakan perbandingan kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida 1:10, perbandingan ini dipilih karena kedua senyawa tersebut dapat

dilihat pada respon yang sama yaitu 500mV. Kandungan kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida yang tertera pada sediaan tetes telinga Colme® masing-

masing adalah 10% dan 4% sehingga perbandingannya adalah 10:4 atau 5:2.

Namun, pada penelitian ini tidak digunakan perbandingan tersebut karena lidokain

hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet

( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan kloramfenikol dalam metanol memiliki

spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( ) yang jauh lebih besar yaitu 297

(Dibbern et al., 2002), sehingga dengan perbandingan 5:2 kloramfenikol memiliki

respon yang sangat besar sedangkan lidokain memiliki respon yang sangat kecil

dan keduanya terpaut jauh maka keduanya sulit dilihat pada respon yang sama.

Alasan tersebut yang mendasari digunakan perbandingan 1:10 karena dengan

perbandingan tersebut kedua senyawa tersebut dapat dilihat di respon yang sama.

Volume injeksi 16 µL sebagai volume tengah yang akan digunakan pada

pengamatan kromatogram dengan komposisi fase gerak 75:25; 85:15; dan 95:5

dan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit. Sedangkan volume injeksi 12; 16; dan

20 µL akan digunakan pada uji reprodusibilitas baku campuran kloramfenikol dan

lidokain hidroklorida dengan komposisi fase gerak yang telah optimum.


36

D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan

Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis

Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan mengukur

panjang gelombang masing-masing senyawa terlebih dahulu. Penentuan panjang

gelombang ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet-

visibel. Secara teoritis kloramfenikol dan lidokain hidroklorida berada pada

rentang 200-400 nm, oleh karena itu dilakukan pengamatan panjang gelombang

pada daerah tersebut. Penentuan panjang gelombang pengamatan ini dilakukan

dengan mengukur absorbansi kedua senyawa dengan konsentrasi rendah, sedang

dan tinggi yaitu 13; 19,5; dan 26 ppm untuk kloramfenikol dan 300; 450; dan 600

ppm untuk lidokain hidroklorida. Penggunaan tiga seri konsentrasi ini bertujuan

untuk meyakinkan bahwa panjang gelombang pengamatan yang didapatkan

benar-benar berasal dari kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Selain itu, untuk

memastikan bahwa panjang gelombang pengamatan dan bentuk pola spektra yang

didapatkan sama.

Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus kromofor dan

auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang

ultraviolet. Gugus kromofor bertanggung jawab dalam penyerapan cahaya

ultraviolet dan gugus auksokrom adalah gugus yang melekat pada kromofor yang

berperan dalam pergeseran panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.


37

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain hidroklorida

Kurva serapan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dapat dilihat pada

gambar dibawah ini:

Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13 ppm (A)

dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B)

A

B

. H2O


38

Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5 ppm (A)


Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26 ppm (A)


Dari hasil spektra menunjukkan bahwa pada konsentrasi rendah, sedang

dan tinggi, panjang gelombang maksimum kloramfenikol adalah 270 nm dan

lidokain hidroklorida adalah 265 nm dan dihasilkan bentuk pola spektra yang

sama. Menurut Dibbern et al. (2002) panjang gelombang maksimal kloramfenikol

dalam metanol adalah 272 nm. Pergeseran panjang gelombang yang diijinkan

A

A

B

B


39

adalah 2 nm (Dirjen POM RI, 1995). Oleh karena itu panjang gelombang

kloramfenikol ini dapat diterima karena bergeser 2 nm dari panjang gelombang

teoritis. Berdasarkan Dibbern et al. (2002) panjang gelombang maksimal lidokain

hidroklorida dalam metanol adalah 263 nm, sehingga panjang gelombang ini juga

dapat diterima karena bergeser 2 nm dari panjang gelombang teoritis.

Berdasarkan pengamatan panjang gelombang maksimum yang ada dapat

diketahui panjang gelombang overlapping kedua senyawa. Titik potong panjang

gelombang kedua senyawa yang didapat adalah 267 nm.

Lidokain hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada

sinar ultraviolet ( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan kloramfenikol dalam

metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( ) yang jauh lebih

besar yaitu 297 (Dibbern et al., 2002). Sehingga, nilai lidokain hidroklorida

yang kecil ini yang membuat lidokain hidroklorida lebih sukar terdeteksi daripada

kloramfenikol. Pada maks lidokain hidroklorida, serapan kloramfenikol masih

cukup tinggi, sedangkan serapan lidokain hidroklorida menjadi rendah pada

maks kloramfenikol. Hal ini yang mendasari pemilihan panjang gelombang

pengamatan yang digunakan dalam pemisahan kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida adalah 265 nm yang merupakan panjang gelombang lidokain

hidroklorida, hal ini bertujuan agar kedua senyawa tersebut dapat memberikan

serapan optimum.


40

E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Metode

KCKT Fase Terbalik

Optimasi dengan metode KCKT fase terbalik dilakukan dengan

mengubah-ubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk didapatkan pemisahan

yang baik antara kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Komposisi fase gerak

yang digunakan yaitu 75:25; 85;15; dan 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2

mL/menit.

Berikut merupakan waktu retensi yang diperoleh dari kloramfenikol,

lidokain hidroklorida, dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain

hidroklorida pada masing-masing komposisi fase gerak dan flow rate yang

berbeda.

Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain hidroklorida dan baku

campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida

Komposisi fase gerak Analit

Waktu Retensi (tR)

(menit)

Metanol Aquabides

0,8

(mL/min)

1,0

(mL/min)

1,2

(mL/min)

75 25

Kloramfenikol 3,703 2,919 2,475

Lidokain

Hidroklorida 8,409 6,868 5,653

85 15


Lidokain


95 5


Lidokain


Baku Campuran

(Kloramfenikol)

-

2,532 2,141

Baku Campuran

(Lidokain

Hidroklorida)

3,306 2,805

Dari masing-masing komposisi fase gerak tersebut menunjukkan bahwa

dengan semakin meningkatnya metanol maka waktu retensi menjadi semakin


41

pendek atau singkat dan semakin meningkatnya flow rate pada masing-masing

komposisi fase gerak juga menunjukkan waktu retensi yang semakin pendek.

Struktur kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus polar

dan non polar yang dapat berinteraksi dengan fase diam (oktadesilsilan) dan fase

gerak (campuran metanol dan aquabides). Gugus non polar akan berinteraksi

dengan fase diam melalui ikatan Van Der Waals sedangkan gugus polar akan

berinteraksi dengan fase gerak melalui interaksi hidrogen. Berikut interaksi

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase gerak dan fase diam:

Si

CH3

H3C

O

H3C

Interaksi Van Der Waals

Oktadesilsilan (C18)

N

H OH

H

H2C O H

NH

C

O

CHCl2O

o

Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18 (oktadesilsilan) melalui

interaksi Van Der Waals

Si

CH3

H3C

O

H3C

CH3

HN

CH3

C

O

H2C NH

C2H5

C2H5

Cl

Interaksi Van Der Waals

Oktadesilsilan (C18)

Interaksi ion-dipol

Gambar 18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C18 (oktadesilsilan)

melalui interaksi Van Der Waals dan interaksi ion-dipol


42

Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak

metanol:aquabides

CH3

N

CH3

C

O

H2C NH

C2H5

C2H5H

O

H

H

H

OCH3H

O

H OCH3

H

Cl

Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida dengan fase gerak

metanol:aquabides

Gambar di atas menunjukkan bahwa interaksi kloramfenikol dengan fase

diam lebih sedikit dibandingkan interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam

oktadesilsilan. Oleh karena itu, kekuatan ikatan kloramfenikol pada fase diam

lebih lemah sehingga waktu retensinya lebih pendek atau lebih cepat

dibandingkan lidokain hidroklorida. Dengan adanya fase gerak yaitu campuran

metanol dan aquabides akan berfungsi untuk membawa analit untuk keluar dari


43

kolom. Semakin banyak jumlah interaksi hidrogen antara solut dengan fase gerak

maka solut akan lebih mudah dibawa oleh fase gerak melewati kolom (terelusi)

sehingga waktu retensinya akan semakin singkat dan sebaliknya.

Pada komposisi metanol:aquabides 75:25 menunjukkan waktu retensi

yang paling lama baik untuk kloramfenikol maupun lidokain hidroklorida. Hal ini

dikarenakan jumlah metanol yang ada pada komposisi fase gerak tersebut lebih

sedikit sehingga kemampuan untuk membawa analit lebih rendah dibandingkan

komposisi metanol:aquabides 85:15 dan 95:5. Oleh karena itu, interaksi

kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase diam lebih kuat sehingga

akan lebih tertahan pada fase diam maka waktu retensi menjadi lebih lama.

Berbeda halnya pada komposisi metanol:aquabides 85:15 yang memiliki jumlah

metanol yang lebih banyak sehingga waktu

Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17675/2/088114039_Full.pdfHIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME® SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat