Prof. F. BourgaudDir. Laboratoire Agronomie et Environnement (UMR INRA – Univ. de Lorraine)VP Recherche Plant Advanced Technologies PATfrederic.bourgaud@plantadvanced.com

Plantes médicamentsPlantes à traire

Métabolisme secondaire des végétaux

Métabolisme primaire = métabolisme de base

Métabolisme secondaire = métabolisme de l’adaptation

Réponse/tolérance aux stress biotiques ou abiotiques

Polyphénols

- Flavonoïdes

- Stilbènes

Terpènes

- Composés à HE

- Caroténoïdes

Alcaloïdes

- Indoliques

- Tropaniques

Les plantes comme sources de médicaments

3

Vinblastine

Taxol

Camptothécine

Catharanthus roseus

Taxus baccata

Camptotheca acuminata

Quelle ressource végétale pour répondre aux besoins en ingrédients actifs végétaux ?

� Des plantes facilement disponibles

� Biodiversité végétale concentrée dans les zones équatoriales

� Comment rationaliser l’approvisionnement ?

� Technologie des bioréacteurs de cellules végétales

Des succès (Taxol® BMS-Phyton)mais d’une portée limitée

Réacteurs (Protalix)

4

� Une matière végétale fortement titrée en principes actifs

� La teneur en M2 résulte d’une interaction complexe G x E

� Cultures/récoltes conventionnelles

Ruta graveolens0%

25%

50%

75%

100%

root stem leaf fruit

fura

no

co

um

ari

ns %

Compartment

psoralen xanthotoxin isopimpinellin bergapten

O O O

OCH3

OCH3

O O O

OCH3

O O OO O O

OCH3

Milesi et al., Plant Sci. 161 (2001) 189-199

Spécifique aux racines

Plantes de 6 mois :

3.8 mg (+/- 1.7 mg) de furanocoumarines

Exsudé par les racines en 24h

Gontier et al., Plant Sci. 163 (2002) 723-732

Plants de 3 ans :

0.20 mg (+/- 0.16 mg) de paclitaxel

Exsudé par les racines en 24h

Cultures hydroponiques

Plantes de 2 mois:

0.7 mg (+/- 0.17 mg) d’alcaloïdes tropaniques

Exsudé par les racines en 24h

Ruta graveolens Taxus baccata Datura innoxia

Après permeabilisation

4.5 mg (+/- 1.2 mg) de furanocoumarines

Exsudé par les racines en 24h

2.1 mg (+/- 1.0 mg) de paclitaxel

Exsudé par les racines en 24h

5.0 mg (+/- 1.5 mg) d’alcaloïdes tropaniques

Exsudé par les racines en 24h

Observations de laboratoire

Alcaloïdes tropaniques de Datura

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Alc

alo

ïde

s p

ar

pla

nte

(m

g/p

lan

t)

Alcaloïdes dans le milieu (mg)

Alcaloïdes dans la plante (mg)

6

Amélioration du rendementen métabolites secondaires

� Composante Génétique

7

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

A B C D E

Teneur en dérivé d’acide caféique (mg/g MS de racine)

Variétés, plante X

a a

b b

c

Variabilité intra-spécifique

Amélioration du rendementen métabolites secondaires

8

� Composante Environnement� Nutrition

Le Bot et al., J Exp Bot 2009

� Facteurs abiotiques

Suivi de l’expression de l’orf c2’h

Vialart et al., Plant J 2012

� Facteurs biotiques

Larbat et al., JBC 2007

Ajout d’éliciteurs (Pmg)

PAT plantes à traire®

Un nouveau procédé de production d’actifs naturelsà partir de végétaux

Brevet WO0133942 9

Société & objectifs

10

Objectifs:

� Développer des plateformes végétales innovantes

� Produire des molécules naturelles rares à destination des marchés

cosmétiques et pharmaceutique

� Préserver et valoriser les ressources végétales

• Récompensée : Concours du Ministère de la Recherche, tremplin Entreprise (Sénat-ESSEC), Lauréat 2006 Prix Pierre Potier « L'innovation en chimie au bénéfice de l'environnement »

• Société créée en 2005 à Nancy - France

(essaimage de l’INPL-ENSAIA/INRA)

• Cotée sur NYSE Euronext depuis juillet 2009

• Aujourd’hui composée de 25 personnes

11

SolventCuve

d’exsudation

CultureCulture ExudationExudationChoix desespècesChoix desespèces

IngrédientactifIngrédientactifStimulationStimulation

Développementdes plantesCulture

aéroponique

Tablettesmobiles

Systèmed’irrigation

Eliciteur, precurseur, optimisation des

conditions de culture

Recyclage des plantes pour un

nouveau cycle de production (3 à 8 /an)

Procédé PAT Plantes A Traire ®

12

0,125

0,25

0,75

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

récolte

traditionnelle*

récolte après

optimisation*

PAT

Rendement en polyphénols (g/m²/an)

PAT plantes à traire®: Exemples de rendements

� Dans ces conditions de rendement1000m² de production = 6000 m² en champ !

Acide gallique et dérivés

x2

x3x6

par élicitation

13

0,06

0,15

0,45

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

récolte

traditionnelle*

récolte après

optimisation*

PAT

Rendement en alcaloïdes (g/m²/an)

PAT plantes à traire®: Exemples de rendements

� Dans ces conditions de rendement1000m² de production = 7500m² en champ !Scopolamine et apparentés

x2,5

x3x7,5

Datura innoxia

par ajout de précurseurs phenylalanine et ornithine

14

0,02 0,6

3

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

récolte

traditionnelle*

récolte après

optimisation*

PAT

Rendement en dérivés d'acide caféique

(g/m²/an)

PAT plantes à traire®: Exemples de rendements

�Dans ces conditions de rendement : 1000m² de production = 15 ha en champ !

x30

x5

x150

Acide chlorogénique et dérivés

par optimisation du milieu nutritif

PATplantes à traire®Avantages

15

Procédé écologique : préservation des plantes et production durable

Accès à des composés à haute valeur ajoutée issus de plantes rares ou difficiles à cultiver (>200 espèces)

Haut rendement par la stimulation

La racine est la partie la plus riche de la plante et la moins étudiée

Accès au profil phyto-chimique unique et meilleure pureté

Echelle de production facile et rapide à adapter

Sécurité d’approvisionnement

Processus de production (4000m² de serre instrumentée en 2012) incluant le management de la qualité selon ISO9001

���� Une opportunité pour produire ou revisiter des « hits » issus de végétaux

Nouvelles approches : ingénierie métabolique

D’après Aharoni et al., 2006, Trends in Plant Sci.

Consortium européen Smartcell (FP7)

16

� Synthèse de monoterpènes chez le tabac (Projet EU SMARTCELL)

O P

O

O-

O P

O

O-

O-Geranyl diphosphate

OH

Geraniol

OH

OH

10 hydroxy-geraniol

Geraniol synthase (Veronica officinalis)

Geraniol 10 hydroxylase (Arabidopsis / Catharanthus)

P450 reductase (Arabidopsis)

Néosynthèse de monoterpènes

chez le tabac

N

N

H

H3C

H3CO

CH3

O

O

CH3

OHH

O

OCH3

N

NH

O

OCH3

CH3

OH

17

Nouvelles approches : ingénierie métabolique

Production de protéines recombinantes par des végétaux

� Procaryotes

• Bactéries

� Eucaryotes

• Levures

• Cellules animales

� Cellules de hamster (CHO)

� Cellules d’insectes (baculovirus)

• Plantes

18

Quelles plantes modèles chez PATpour la production de protéines thérapeutiques ?

19

PAT Vendredi®Un nouveau système d’expression

pour la production de protéines recombinantes végétales

Patent WO/2008/040599 20

Le modèle Drosera

Le modèle Nepenthes

Technologie PAT Friday®

21

Tests GUS

Preuve de concept PAT Friday®

22

Interferon Y humain

Drosera Protéines humaines recombinantes

Facteur intrinsèque de Castle humain

Témoin FI Plante

transforméePlante témoin

WT

Plante témoin

WT

Plantes

transformées

Témoin IFN Y

Modèle Nepenthes

Production des premières protéines recombinantes PAT Friday®

23

� Récolte aisée

� Purification & downstream process simplifiés

� Stérilité possible

� Montée en echelle facile

� Activité Protease controlée

PAT Friday®

Avantages

24

Merci de votre attentionRemerciements à tous nos collaborateurs :

Dr. Flore Biteau

Sissi Miguel

Benoit Mignard

Jean-Marc Lainé

Dr. Paul Hannewald

Estelle Muller

Cindy Michel

Jean-Paul Fèvre

Dr. Alain Hehn

Prof. E. Gontier

Alain Clément

Prof. Guckert

Audray Dugrand 25

Comparaison des systèmes d’expression hétérologue

Sécurité sanitaire Maturation des protéines

Immunogenicité Sécurité technologique (confinement)

Coût économique

E. Coli Pyrogénicité (endotoxines)

NON NON OUI €€€

Levure Pyrogenicité (endotoxines)

OUI OUI OUI €€€

CHO Risques théoriques liés aux maladies (prions, virus) , ADN oncogénique

OUI NON OUI €€€€€€

Cellules végétales en réacteur

Pas de risques théoriques

OUI OUI parfois OUI €€€

Plantes entières Pas de risques théoriques

OUI Oui parfois OUI si serresNON si plein champ

€

27

Expression de GFP

Drosera Gènes marqueurs(GFP et GUS)

Trichome

Papier filtre avec des taches fluorescentes

Preuve de concept PAT Friday®

28

Ma

rqu

eu

r d

e

po

ids

(KD

a)

Flu

id e

issu

de

N.

ra

ffle

sia

na

Flu

id f

rom

N.

ve

ntr

ico

sa

Flu

ide

issu

de

N

. a

lata

20

26

34

4786

120

20

26

34

4786

120

20

26

34

4786

120

34

SDS-Page sur des fluides de feuilles de Nepenthes pitcher

���� PURIFICATION facilitée (sterilité possible)

Ma

rqu

eu

r d

e

po

ids

(KD

a)

Etude des protéines foliaires de Népenthes

29

30

Zymogramme

pH5

Fluide

d’urne

fermée

Fluide

d’urne

ouverte

Zymogramme

pH7

Fluide

d’urne

fermée

Fluide

d’urne

ouverte

Zymogramme,

pH3

Fuilde

d’urne

fermée

Fluid

d’urne

ouverte

Nepenthacine

� Zymogramme� Gel + Gelatine + pH 3 / 5 / 7 à 37°C pendant 12H

Evaluation de l’activité protéase chez Nepenthes

31