Plateforme d’analyse génétique Sara-Edith Penney, M.Sc. Coordonnatrice de la plateforme d’analyse génétique Centre de recherche de l’Hôpital Laval Local

Plateforme d’analyse génétique

Sara-Edith Penney, M.Sc.

Coordonnatrice de la plateforme d’analyse génétiqueCentre de recherche de l’Hôpital Laval

Local Y-3160Téléphone: (418) 656-8711 poste 3761

[email protected] la supervision d’Éric Paradis

La plateforme d’analyse génétique (PAG)

• Service de type utilisateur-payeur offert en priorité aux membres du Centre de recherche de l’Hôpital Laval.

• Service d’analyse génétique accompagné d’un support technique.

Buts : Offrir un service personnalisé et adapté aux besoins de votre laboratoire.

: Fournir des outils de travail utiles au quotidien et spécifiques à vos sujets de recherche.

CEQ-8000

Plaque séquençage

Analyse de fragments (short tandem repeats)

Séquençage (méthode Sanger)

ScanArray

Étapes d’extraction

d’ARN

Synthèse et marquage de

l’ADNc

Analyse et quantification du microarray

Biomek 2000Dilutions en série

Plaques qPCR et PCR

Autres applications

Possibilités technologiques de la PAG

SpotArrayPlaque array

Purification de produits PCR

Impression de micropuces

1er service PAG : séquençage d’ADN

1) Méthode de Sanger (1977)

Incorporation de dNTP + faible proportion de ddNTP couplés à des fluorophores.

2) Électrophorèse capillaire

Électro-injection des fragments d’ADN dans les capillaires. Migration selon la taille (en nt).

Excitation des ddNTP marqués. Émission correspondant à la bonne base (A,T,C,G).

De 500 bases à 700 bases selon la séquence

*

*

*

*

*

**

**

**

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2è service PAG : microarray d’ADN (technologie «two colors»)

1. Conception et génération de la micropuce (ADN cible)

2. Préparation des sources

d’ADNc à hybrider (sonde)

3. Hybridation de la micropuce

4. Analyse des résultats

Mesure quantitative du niveau d’expression relatif de plusieurs gènes en une seule expérience.

Objectifs

• Comparer le profil d’expression de certains gènes du foie impliqués dans le diabète chez le rat

traité ou non avec du 11β-HSD1 inhibitor.

• Comparer les résultats obtenus en microarray avec ceux du qPCR pour ces gènes.

Microarray : exemple d’application réalisé à la PAG

Expression comparative de gènes impliqués dans le diabète

(Merci à Magalie Berthiaume et Yves Gélinas de l’équipe du Dr Deshaies!)

*L’inhibiteur 11-HSD1 fonctionne in vivo de façon prédominante en réductase par la conversion du cortisone en cortisol.

ContrôleRat Sprague-Dawley

pesant entre 150 et 175g ARN de foie Chow

TraitéRat Sprague-Dawley

pesant entre 150 et 175g ARN de foie

Chow + 11-HSD1 inhibitor* à 3mg/kg/jour Rat Sprague-Dawley

Gènes d’intérêt

Gènes dont l’expression est à étudier (à imprimer sur la micropuce)

1. Gck : catalyse la phosphorylation du glucose.

2. G6PDX : implication dans la pentose phosphate pathway.

3. Acadvl : métabolisme des acides gras de la mitochondrie.

4. Acadm : métabolisme des lipides.

5. Acox 1 : métabolisme des acides gras et PPAR signaling pathway.

6. MTP : assemblage des lipoprotéines riches en triglycérides. au diabète.

7. Me 1 : catalyse la conversion du L-malate en CO2 et pyruvate.

8. ACS1 : «channeling» des acides gras via la synthèse lipides ou l’oxydation.

9. L-FABP : marqueur pour les blessures au niveau renal tubulointerstitiel. au diabète.

Structure moléculaire du 11β-HSD1 en complexe avec

carbenoxolone et NADP+

Schéma expérimental : microarray

1 2

3

4

Contrôle Traité


Combinaison 2 sondes marquées, hybridation.


Excitation par 2 lasers à 550nm et 625nm.


Impression oligos 20-25mers (amorces de PCR) sur lame fonctionnalisée à l’epoxy silane.

2. Préparation des sources d’ADNc à hybrider (sonde)

Contrôle : ARN foie, diète chow, marquage

Traité : ARN foie, diète chow supplémentée 11β-HSD1 inhibitor (3 mg/kg/jour), marquage

Cy3

Cy5

Intact

18S

28S

Qualité de l’ARN des sondes

GCk

G6pdx Acox 1

Acadvl

Acadm

MTP

Me1

ACS 1

L-FABP1

GCk G6pdx

Acox 1

Acadvl

AcadmMTP

Me1

ACS 1

L-FABP1

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

GCk G6pdx Acox 1 Acadvl Acadm MTP Me1 ACS 1 L-FABP1

Gènes

Cha

ngem

ent d

'exp

ress

ion

Changement d’expression des gènes après traitement ( à l’inhibiteur de 11- HSD1) :

qPCR vs microarray

Rat traité #12 / Rat contrôle #2


Étude en Microarray :

«Spots considérés» : Cy3 et Cy5 signal to noise>2 et 2<0.05

: Changement d’expression non significatif si :

Log2 (R/G) <0.5

1,779; 1,965; 1,943; 1,750; 1,624. 1,8122 +/- 0,1422

Acox1MTP

AcadvlGck

G6pdx

ACS-1L-FABPMe1

AcadmAcox1

MTP Acadvl

Gck

G6pdx

ACS-1L-FABP

Me1

Acadm

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

Changement d'expression Microarray

Ch

ang

emen

t d

'exp

ress

ion

qP

CR

Corrélation entre les résultats du qPCR et du microarray



Particularités et avantages de l’utilisation du microarray

1) Analyse de l’expression de milliers de gènes simultanément (économie de temps et d’argent)

2) Rentabilisation des amorces ou des clones déjà existants

3) Micropuce personnalisée (analyse plus pertinente, spécialisation des micropuces pour les domaines de recherche)

4) Microarray «2-colors» (compatibilité avec plusieurs plateformes)

5) Haute qualité ARN pour les sondes

6) Importance majeure de la conception des oligos (le cas échéant)

7) Intégration de contrôles (positifs, négatifs, spiked RNA)

Possibilités du «Protein Array»

«Protein array» fontionnel

(Zhu et Snyder, 2003)

«Protein array» analytique

(Zhu et Snyder, 2003)

Impression d’une protéine purifiée à homogénéité (recoverine à 0,4mg/ml)

sur lame epoxy silane

Objectif

• Établir un système de «monitoring» simple pour l’inflammation des voies respiratoires

Exemple de «protein array» analytique

Méthodologie

• Récupérer les EBC* (exhaled breath condensate) de patients sains et asthmatique

• Les comparer au moyen d’une micropuce de protéines

J Allergy Clin Immunol volume 118, number 1 (2006)

*EBC : Méthode non invasive donc possibilités de plusieurs répétitions (Barnes et al., 2005). On y a déjà identifié plusieurs molécules inflammatoires.

Lien entre ces cytokines et PD200

(provocative dose of methacoline)

Le microarray à la PAG c’est…

Dans l’immédiat :

• Microarray d’ADN

Innovations dans la communauté scientifique

• Lipidomic array (Dr Robinson à Stanford)

• Cell array (Dr Sabatini à Boston)

Et bientôt des array dynamiques…

• «Run on» array (transcription) (UHN)

• Ribosome capture array (traduction) (UHN)

À moyen terme :

• CpG island (UHN)

•ChIP-on-chip (interaction ADN-protéine) (Agilent)

• Protein array

Domaines d’application de votre PAG

CEQ-8000

• Séquençage d’ADN* (plasmides et produits PCR)

• Analyse de fragments** (STR)

• Support technique

Voir le document pour les modalités

*Le service de séquençage est offert à un prix compétitif (voir celui de l’Université Laval)

**Le prix pour l’analyse de fragments varie selon l’analyse à faire. Il faut prévoir la synthèse d’une amorce modifiée par l’incorporation d’un fluorophore.

Biologie moléculaire

• Possibilités de support technique au niveau des manipulations qui touchent aux services de la PAG (e.g. Extraction et préparation de l’ARN)

Domaines d’application de votre PAG (suite)

SpotArray

ScanArray

• Fabrication de micropuces à ADN personnalisées (jusqu’à 20 000 gènes)

• Impression oligo court (20-30mers) ou long (50mers), produit PCR (200-400pb)

• Diverses lames fonctionnalisées (epoxy, amino, poly-L-lysine, aldéhyde)

• Impression de protéines sur lame epoxy



• Analyse et quantification du microarray

• Transmission des résultats informative



*14700 «spots»

*diamètre 100µm

*espacé de 250µm (centre-à-centre)

Merci et au plaisir de vous rencontrer pour discuter de ce que la plateforme

d’analyse génétique peut vous apportez!

Merci à Magalie Berthiaume et Yves Gélinas de l’équipe de Dr Yves Deshaies!

Pour toutes les informations au sujet de la tarification, les méthodes et autre, veuillez communiquer avec moi:

Sara-Edith Penney, responsable de la PAG du CRHLPavillon d’Youville local Y3160Téléphone: 656-8711 poste 3761 Télécopieur: 656-4942Courriel: [email protected]

Informations complémentaires

Paramètres à déterminer par l’utilisateur du service de microarray

A) Détermination du substrat (ce qui sera imprimé sur la micropuce)

1) Oligos courts (20 à 30 mers)

2) Oligos longs (50 à 70 mers)

3) ADNc (nécessite au moins une amplification PCR ainsi que son séquençage)

B) Détermination des deux sondes (ce qui sera comparé)

ARNtotal (5 à 25µg) ou ARNm (~500ng) (provenant de deux sources différentes)

AB Pour faire incorporation des amino allyl-dUTP durant la synthèse de l’ADNc puis marquage des AA-dUTP avec des CyDye NHS-ester.

Critères pour la conception des oligos

1) Longueur en nucléotides. On veut que tous les oligos ont la même longueur. Ils peuvent être courts (20-30nt) ou longs (50-70nt).

2) Aucune dimérisation et aucune formation de structure secondaire.

3) Tm uniformes entre les oligos.

4) % (G+C) entre 40 et 60% de la séquence (Li et Stormo, 2001).

5) Régions continues de A, T, C ou G, moins de 25% de la taille de l’oligo (Li et Stormo, 2001).

6) Pour oligos de 50mers un maximum de 10 «mismatch» (Kane et al., 2000).

7) Énergie libre. On veut un minimum d’énergie libre (G) d’hybridation pour le gène d’intérêt et le maximum G avec les autres gènes. Plus le G est élevé, plus l’oligo est instable (Li et Stromo, 2001).

Détails de l’appareillage de la PAG

Appareillage de la plateforme d’analyse génétique

Station de séquençage d’ADN

CEQ-8000 (Beckman-Coulter)

Spécifications techniques :

- Huit (8) capillaires

- Un système d’électrophorèse

- 2 lasers

- Une caméra CCD

- Utilisation de la méthode de Sanger (dNTP terminator) (Sanger et al., 1977)

Utilisation :

- Séquençage d’ADN (plasmides et produits PCR)

-Analyse de fragments, génotypage.

Appareillage de la plateforme d’analyse génétique (suite)

Station de fabrication de micropuces

SpotArray24 (Perkin-Elmer) Spécifications techniques :

- 24 places pour des lames fonctionnalisées à imprimer

- Un système de contrôle de l’humidité et de la température

Utilisation :

- Impression d’ADN sur des lames fonctionnalisées


Station d’analyse de micropuces

ScanArray Express (Perkin-Elmer)Spécifications techniques :

- Une protection contre la lumière

- Deux lasers (λ de 633µm et 543µm)

- Un logiciel de quantification des «spots»

Utilisation :

- Analyser de l’expression différentielle des gènes présents sur la micropuce.


Station de pipettage automatisée

Biomek 2000 (Beckman-Coulter)

Spécifications techniques :

- Plusieurs outils de pipettage (multiple et différents volumes)

- Adaptateur pour microtubes

- Unité de vacuum

- Unité de lavage

- Et bien d’autres…

Utilisation :

- Automatisation d’une partie des manipulations

- Accélérer et uniformiser les manipulations.

Détails du séquençage à électrophorèse capillaire

Séquençage d’ADN : méthode Sanger

L’ADN soumis au séquençage doit d’abord être amplifié par une polymérase qui incorpore des dNTPs en plus d’une faible proportion de ddNTPs marqués, ces derniers mettant fin aléatoirement à l’élongation. Il s’agit de la méthode de Sanger (Sanger et al., 1977). L’ADN ainsi amplifié est électro-injecté dans le système d’électrophorèse capillaire où il y aura migration des fragments d’ADN selon leur longueur, dans une matrice de gel de polyacrylamide, sous l’effet d’un très haut voltage. À l’autre extrémité du capillaire (l’anode), un laser excite les ddNTPs marqués qui émettent de la fluorescence à une longueur d’onde spécifique qui correspond à une base spécifique.

Effet EOF : electroosmosis or electroosmotic flow

Sous l’effet du champ électrique ADN de charge nette (-) migre vers l’anode dans un électrolyte, souvent polyacrylamide. Cependant l’EOF peut affecter négativement la séparation. Pour remédier à cela, l’intérieur des capillaires à été enduit d’un polymère inerte.

Détails divers sur le microarray

Analyse des microarrayHeatmap : diff. de couleur=expression relative

Box plotMA plot

Volcano plot pvalue

Analyse des microarray : légende de la diapositive précédente

Microarray : technologie Affymetrix


Photolithographie: - densité de l’ADN;- Maximum de 25nt par séquence; - 11 à 20 paires de séquences par gène.

2. Préparation des sources d’ADNc à hybrider (sonde)

Marquage des ARNc à la biotine.


1 ARN pour 1 micropuce


- Révélation avec streptavidine/phycoérythrine - Criblage à 488nm (émission à 570nm)

Photolithographie

Documents

Plateforme d’analyse génétique Sara-Edith Penney, M.Sc. Coordonnatrice de la plateforme d’analyse génétique Centre de recherche de l’Hôpital Laval Local