Plusieurs types de division cellulaire

Cellulessomatiques

Cellules humainesen culture

Embryon de Xenope après 4-5 divisions au stade 8-10 blastomères

(ou cellules)Première division méiotique chez un Ovocyte humain, Xenope, etoile de

mer…

Cellulesembryonnaires

Cellules germinales : ovocytes

1mm

1mm

Vésicule germinale(noyau)

1mm

Globule polaire

division

Levures

Figure 1.1

Embryon précoce de Drosophile 8 minutes

Embryon précoce de Xenope 30 minutes

Embryon précoce d’Oursin 60 minutes

Schizosaccharomyces pombe ou levure du boulanger ou « fission yeast » 60 minutes

Saccharromyces cerevisiae ou levure de bière ou « budding yeast » 90 minutes

Cellule humaine en culture 18 heures

Figure 1.2 : Durée des divisions cellulaires dans divers types de cellules.

Figure 1.3.1 : Evènements observables durant les phases du cycle cellulaire.

Cytocinèse

Télo

phas

e

An

aph

ase

Mét

aph

ase

Prophase

Prom

étap

hase

Croissance

Croissance et réplication de l’ADN

Croissance et Derniers préparatifs

en vue de la division

SG2

MG1

Phase Go

Point de restriction

Interphase Métaphase Interphase

noyau

réticulumendoplasmique

golgi

Dans les cellules HeLa environ 130 vésicules (ou fragments de golgi) d’un diamètre moyen de 60 nm se dispersent dans le cytoplasme.

Des vésicules mixtes de membranes denoyau et de reticulum de forment.

En fin d’anaphase les membranes vésiculaires mixtes de noyau et de réticulum se reforment progressivement à partir de leur organisation autour de la chromatine. Les vésicules de golgi fusionnent pour reformer l’organite.

Figure 1.3.2. : Devenir des organites au cours de la division cellulaire.

Figure 1.4 : Variations des types de cycle cellulaire et des cellules produites.

G1 S G2 M

S M

M

S

Nombre de chromosomesdivisés par deux

Nombre de chromosomesmultipliés par deux

Volume cellulairedivisé par deux

A

B

C

D

Figure 1.5 : Succession des types de cycle cellulaire.

G1 S G2 MS MM M

MéioseMitose de

l’embryon précoceMitose de

l’embryon et adulte

Figure 1.6 : Place du Cycle cellulaire dans les destins cellulaires.

Cycle de divisioncellulaire

C

A

B

D

F

E

Quiescence ouphase G0

Différenciation

Z

Z

Apoptose (ou mort cellulaire programmée)

Sénescence post-réplicative

Cellule musculaire multinucléée

Cellules polarisées en brossede l’épithelium du tube digestif

Fragmentation de le membrane plasmique Fragmentation

de l’ADN nucléaire

Dégradation lente des fonctions cellulaires suivie de nécrose cellulaire

A

B

G1, S ou G2 M M

G1 S S

+ =

+ =

Figure 1.7 : Dominance cellulaire : Expériences de Rao et Johnson, 1970.

ADN en réplication (incorporation de BrdU)

ADN Métaphasique condenséADN Interphasique: Chromatine

Figure 1.8 : La maturation méiotique chez quelques espèces et les étapes de fertilisation provoquant l’accomplissement de la méiose.

VG

Fertilisation chez :Ascaris (nématode)Spisula (bivalve)Octopus (poulpe)Urechis (ver marin)

Fertilisation chez :Chaetopteres (ver marin tubulaire)Mytilus (moule)Patella (patelle ou Bernique)Artemia (crustacé marin)Drosphila (mouche du vinaigre)Ascidia (tunicier marin ou violet)

Fertilisation chez Presque tous les vertébrés

Fertilisation chez :Arbacia (oursin)Tubularia (hydrozoaire)

Chromosomes Fuseau

1er globule polaire

2ème globule polaire

Noyau haploïde= pronucleus

Vésicule germinale=VG= noyau de l’ovocyte

Rupture de la vésicule germinale= GVBD

Prophase I= Arrêt en G2

= Ovocyte immature

GVBD= Germinal Vesicle Break Down

= Ovocyte mature

Metaphase I Metaphase II Pronucleus= Phase G1

Arrêt méiotique primaire Arrêts méiotiques secondaires

Figure 1.9 : Déclenchement hormonal de la maturation méiotique chez quelques espèces modèles.

GVBD

GVBD

GVBD

17, 20-dihydroxy4-pregnen 3-one(Nagama et Adachi, 1985)

Progestérone(Fortune et al., 1975 ;Godeau et al., 1978)

1-Methyladenine(Kanatani et al., 1969)

Poisson rouge

Rana pipiens; Xénope

Etoile de mer

Protéases (fluide digestif)(Peaucellier, 1977)

Sabellaria alveolata

GVBD

VG

VG

VG

VG

Vésicule germinale=VG= noyau de l’ovocyte

Rupture de la vésicule germinale= GVBD

Phase G2 Phase MI

Déclencheur de la maturation méiotique

GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

Figure 1.10 : Emergence du concept MPF (Maturation Promoting Factor) après transfert de cytoplasme d’ovocytes activés par l’hormone de maturation chez diverses espèces.

GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

GVBD

1-MethyladenineVG

G2 M

VG

G2

GVBD

M

VG

G2

GVBD

M

VG

G2

GVBD

M

Crapaud (Bufo sp.)(Dettlaf, 1964)

Grenouille (Rana pipiens)(Masui et Markert, 1971;Smith et Ecker, 1971)

Etoile de mer(Kishimoto et Kanatani, 1976)

MPF

MPF

MPF

Hormone induisant la maturation méiotique

Vésicule germinale=VG= noyau de l’ovocyte

Rupture de la vésicule germinale= GVBD

A

B

C

Incubation dans un milieu contenant du cycloheximide = blocage des traductions de protéines.

VG

G2

GVBD

M

Figure 1.11.1 : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971).

CVG

G2

Progestérone

VG

G2

Pas de maturation méiotique

VG

G2

VG

G2

VG

G2

Pas de maturation méiotique

A

B GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

VG

G2

GVBD

M

Figure 1.11.2 : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971).

D

E

GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

VG

G2

Traitement du cytoplasme contenant

le MPF par des enzymes (DNase

RNAse) ou dialyse.

GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

VG

G2

Traitement du cytoplasme contenant

le MPF par des Protéases ou la

chaleur.

VG

G2

Pas de maturation méiotique

GVBD100%

Progestérone 1-Methyladenine

Masui et Markert, 1971Grenouille (Rana pipiens)

VG

G2 M

VG

G2 M

GVBD69%

VG

G2 M

GVBD91%

VG

G2 M

GVBD75%

GVBD100%

Kishimoto et Kanatani, 1976Etoile de mer

VG

G2 M

VG

G2 M

GVBD100%

VG

G2 M

GVBD88%

VG

G2 M

GVBD93%

Figure 1.12 : Résumé des expériences de « transferts de cytoplasmes d’ovocytes activés » en série dans deux modèles d’étude (le pourcentage d’ovocytes receveurs qui atteignent le stade GVBD est indiqué).

A B

Figure 1.13 : Principe du test MPF de Masui et Markert Rana pipiens (1971).

G2 MI MII fertilisation 1ère Mitose 2ème mitose

VG

MPF ?

VG

G2 M

[MPF]= concentration

de MPF2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

Divisions embryonnaires

Maturation de l’ovocyte

Progestérone Fertilisation

10 20 30 40 50 60 minutes

Embryon 2 cellules

Figure 1.14.1 : Principe des tests MPF et CSF de Masui et Markert chez Rana pipiens (1971).

GVBD

M

GVBD

ProgestéroneVG

G2 M

VG

G2

TestMPF

TestCSF

fertilisation

fertilisation

MPF

CSF

contrôle

MPF

?

Figure 1.14.2 : Activité MPF et CSF mesurables au cours de la maturation méiotique par transferts de cytoplasmes dans des ovocytes ou des blastomères d’embryons précoces de. grenouille (Rana pipiens ) par Masui et Markert (1971).

Act

ivit

é M

PF

Act

ivit

é C

SF

---

---

Arrêt G2 Meïose I Meïose II 1er cycle 2ème cycle embryonaire embryonaire

G2 MI MII fertilisation

VG

Temps

Figure 1.15 : Chronogramme de l’identification du MPF.

Année Modèle méiotique Modèle somatique Modèle embryonnaire

Découverte de la transformation automatique d’un ADN exogène en ADN d’ovocyte (Dominance) après microinjection (Oursin, Amphibien).

Synchronisation du cycle cellulaire chez Tetrahylmena.

Découverte de l’hormone de maturation des amphibiens.

Découverte de l’hormone de maturation de l’Etoile de mer.

1922-1929

1964

1967

1969

1970 Dominance des phases S et M du cycle cellulaire (Cellules HeLa).

1964-1971 Découverte du MPF (Amphibiens).

1971 Découverte du CSF (Amphibiens).

Premiers mutants cdc de S. cerevisiae (Levure)1974

Premiers mutants cdc de S. pombe (levure)1975

Gene Cdc2 requis pour l’entrée en phase M de S. pombe (Levure)1976 Découverte du MPF d’Etoile de mer.

Elévation des phosphorylations de protéines au cours de l’entrée en méiose (Etoile de mer).

1976

1978-1982

1980 Nécessité d’ATP pour l’activité MPF.

Universalité du MPF en méiose.

1979-1982

1982-1986 Identification et clonage de la 1ère Cycline (Oursin).

Découverte du MPF dans cellules HeLa et chez S. cerevisiae

Les gènes cdc2 (S. pombe) et CDC28 (S. cerevisiae) sont équivalents.

1982

Oscillations parralèles du MPF et des phosporylations de protéines (Etoile de mer).

1983

Nécessité de synthèses de protéines au MPF pour pouvoir se régénérer (Xenope).1984

Découverte du MPF en mitose (Xenope).

1985-1986Les gènes CDC28 et cdc2 codent pour une protéine kinase (Levures).

Clonage du gène cdc2 humain.1987

Purification du MPF de Xenope

Purification du MPF (Xenope) .Purification de l’Histone H1 kinase (Etoile de mer).

1988

Identification de cdc2 dans le complexe MPF-H1 kinase de Xenope et d’Etoile de mer (western blot).

Le MPF = complexe stoechiométrique entre une sous-unité cycline et une sous-unité P34cdc2 (Etoile de mer).

1989

1990-1991 Homologues de cdc2 identifiés dans divers modèles et adoption d’une nouvelle nomenclature des protéines da la famille de cdc2= CDK1.

2001 Paul Nurse, Leland Hartwell et Tim Hunt partagent ensemble le prix Nobel de Médecine pour leurs découvertes respectives des régulateurs de la division cellulaire.

Figure 1.16.1 : Expérience d’identification de la première cycline dans l’embryon d’Oursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt 1983.

Fertilisation des ovocytes dans l’eau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines.

Collecte d’échantillons toutes les 10 minutes et traitement dans l’acide trichloroacetique pour fixation puis migration sur gel SDS-PAGE, séchage et autoradiogramme.

Cycline

Protéines radioactivesSDS-PAGE

Densitométrie de la cycline

Le second pic de synthèse de Cycline est moins important à cause de la dilution de la [35S]methionine rajoutée au début de l’expérience.

3

2

1

Minutes 10 30 50 70 90 110 130

Figure 1.16.2 : Expérience d’identification de la première cycline dans l’embryon d’Oursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt 1983.

Fertilisation des ovocytes dans l’eau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines.

Collecte d’échantillons toutes les 10 minutes et traitement comme pour la Figure 1.17.1.

Quantité de Cycline (- -) % d’embryons en division ( )

2

1

0

0 1 2 Heures après fertilisation

50

25

0

Figure 1.17 : Mutants cdc de Levure (Schizosaccharomyces pombe) isolés par Paul Nurse à partir de 1976 : Réseau de régulation en amont de cdc2.

CDC2 kinase

CDC2 kinase

CDC2 kinase

CDC2 kinase

Légende : Effet inhibiteur Délétion du gène

Effet activateur Surexpression du gène

Phénotype de division normal

Phénotype de division Wee

Phénotype de division cdc25

Phénotype de division de typecatastrophe mitotique= Entrée en phase M avant la fin de la phase S = Totale désynchronisation des phases S et M.

wee1 cdc25

Figure 1.18 : Clonage de l’homologue humain de cdc2 par complémentation focntionnelle, Lee et Nurse, 1987.

Banque d’ADNc humains(Labo. Hirota Okayama)

Culture de mutant cdc2ts de S. pombeÀ la température permissive= divisions

Transfection des levures cdc2ts avec l’ADN de la banque

Observation des colonies de Levures cdc2ts à T° restrictive

Repiquage des colonies de levures qui arrivent à pousser

Observation au microscoped’une colonie de Levure à T° restrictive.

Levure de grande taille ayant perdu le plasmide et incapable de se diviser = phénotype cdc2ts.

Levures de taille normale sans phénotype cdc2ts= phénotype normal.

Isolement et séquençage du plasmide de la banque d’ADNc Humain présent dans le clone de Levure.

N- -C

Cdc2 LevureN- -C

Cdc2 Humain

Identification du produit codé par l’ADNc responsable de la complémentation fonctionnelle de la mutation cdc2ts (perte de fonction) par comparaison de séquence aminoacides.

63% d’identité