Comment procder pour raliser une analyse en Bactriologie?Pr DOSSO Mireille 2009

LA MICROBIOLOGIE

Etude des microorganismes :visibles au microscope De la taille du m (10-6 m)

Gnralits: Rappel

LA MICROBIOLOGIELES DIFFERENTS MICROORGANISMES

Bactries Champignons Virus Parasites

BACTERIOLOGIE MYCOLOGIE VIROLOGIE PARASITOLOGIE

LES MICROORGANISMESEXEMPLES DE PATHOLOGIE :

Bactries :

Infections urinaires, Diarrhes Tuberculose, Diphtrie, Ttanos Mycoses, Teignes Sida, Hpatite C, Rubole Toxoplasmose, Paludisme, Tnia (ver solitaire)

Champignons : Virus : Parasites :

LES MICROORGANISMES

Les Champignons :

Champignons filamenteux (dermatophytes, moisissures) Ex : Penicillium, Aspergillus Levures Ex : Levure de bire, levure de boulanger Ex : Candida, Cryptococcus Taille : 10 m

LES MICROORGANISMES Les Virus : Taille < 0.1 m ADN ou ARN Pas denzymes : besoin dune cellule hte Reproduction par replication

Les Bactries : Taille : 1 m ADN et ARN Enzymes : biosynthses Reproduction par scissiparit

ETUDE DE LA BACTERIE

SON HABITAT

Dans lenvironnement :

Chez lhomme :

Saprophyte

Flore normale = Flore commensale

SON HABITATDANS NOTRE ENVIRONNEMENT :

Dans le sol Dans lair Dans leau Dans les aliments

SON HABITATCHEZ LHOMME EN BONNE SANT

OUI Bouche Oreilles Voies respiratoires Intestins Voies gnitales Peau ....

NON

Sang Liquide cphalocphalorachidien (LCR) Urine

Flore normale : en contact avec lextrieur

Toujours strile : cavits fermes

SA PATHOGENICITELHOMME MALADE :

La bactrie pathogne stricte :

Multiplication et dissmination dans lorganisme Rsistance au systme immunitaire Scrtion denzymes : lsions des tissus Parfois secrtions de toxines

SA PATHOGENICITELes bactries toxigniquesLa bactrie ne quitte pas le lieu de l'infection et la toxine seule provoque la maladie en diffusant dans l'organisme Ex : - Clostridium tetani (ttanos) - Corynebacterium diphteriae (diphtrie)

Intoxinations alimentaires :- Staphylococcus aureus - Clostridium botulinumBotulisme : ingestion d'aliments dans lesquels C. botulinum a labor sa toxine (non dtruite dans le tube digestif) paralysies par atteinte neuro-musculaire

SA PATHOGENICITELa bactrie pathogne par opportunisme :Quelle bactrie ? Une bactrie saprophyte ou de la flore normale dont la prsence ne provoque habituellement pas de maladie Quand ? Lors dune dficience immunitaire de l'hte Lors dune rupture de la barrire naturelle

Ex : E. coli , prsent dans la flore normale et occasionnellement mis en cause dans des infections urinaires, des septicmies...

SA PATHOGENICITE : EXEMPLESFLORE NORMALE BACTERIES PATHOGENESCAVITE ORO-PHARINGEE : ORO Streptocoque

Streptocoques, Entrocoques Neisseria Corynebactries Anarobies...

A Pneumocoque Corynebacterium diptheriae Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae

TUBE DIGESTIF :

Entrobactries Entrocoques Levures Anarobies...

Salmonella, Shigella E. coli, Yersinia, Campylobacter Vibrio cholerae Toxine : Clostridium, S. aureus

SA PATHOGENICITE : EXEMPLESFLORE NORMALEPEAU :

BACTERIES PATHOGENES

Staphylococcus epidermidis Corynebactries Propionibacterium acnes...

Staphylococcus aureus Streptococcus A Pasteurella Bacillus...

CAVITE GENITALE :

Lactobacillus Mycoplasmes Anarobies Flore dorigine cutane...

Gonocoque Streptocoque B Gardnerella vaginalis Treponema pallidum Haemophilus, Chlamydia...

SA FORME

COQUES

BACILLE

COCCO-BACILLE

SON MODE DE GROUPEMENTCOQUES

diplocoque

amas

chainettes

BACILLES

diplobacille

coccobacille

SA STRUCTUREmembrane cytoplasmique capsule (facultatif)

paroi

ribosomes

cytoplasme

flagelle (facultatif)

pili ou adhsine

ADN

SA MOBILITE1- Pas de flagelle : Bactrie immobile 2- Un flagelle : Bactrie mobile Dplacement : 3- Plusieurs flagelles : Bactrie mobile Dplacement :

SON ALIMENTATION Besoins lmentairesPour synthtiser les lments constitutifs de la bactrie C, N, O, H, sels minraux, ...

Besoins en sucrePour les dpenses nergtiques de la bactrie glucose , lactose

Besoins en facteurs de croissancePour la croissance des bactries difficiles vitamines, acides amins ...

SA RESPIRATION

Besoin doxygne

Bactrie arobie

Besoin de moins doxygne Bactrie microarophile Absence doxygne Besoin de CO2 Bactrie anarobie Bactrie capnophile

SA MULTIPLICATIONDivision toutes les 20 mn

SA MULTIPLICATIONLa vitesse de multiplication dpend de la temprature : Vitesse

Temprature 4C 37C 65C

LE LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE MEDICALE

SON ROLE

Trouver le bon traitement pour le patient

?

COMMENT ?

Isoler la bactrie responsable de l'infection Identifier cette bactrie Tester sa rsistance envers diffrents antibiotiques

LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

Prlvement Examen microscopique Culture Identification Antibiogramme

LE PRELEVEMENT

LE PRELEVEMENTPRELEVEMENT Urine MODE DE PRELEVEMENT PATHOLOGIES Infections urinaires

Selles

Infections intestinales, Intoxications alimentaires Ecouvillon Vaginite, cervicite, prostatite, urthrite, MST... Abcs, Liquide pritonal , plaie superficielle

Prlvement gnital

Suppuration

Ecouvillon ou seringue

LE PRELEVEMENTPRELEVEMENT Prlvement de gorge Expectorations MODE DE PRELEVEMENT Ecouvillon PATHOLOGIES Infections ORL, angines.. Infections pulmonaires, pneumonies ... Septicmie

Crachat ou aspiration bronchique Prise de sang

Sang

LCR

Ponction lombaire

Mningite

LCR = Liquide Cphalo-rachidien

LE PRELEVEMENT

Prlvements pluri-microbiens : pluriPrlvements : cutans

Flore normale + Agent pathogne

digestifs vaginaux, urtraux des voies respiratoires ... On observe plusieurs bactries

Prlvements mono-microbiens : monoPrlvements :

LCR, sang, urine

Agent pathogne seul

On observe une seule bactrie

LE PRELEVEMENT

Conditions de prlvementMatriel de prlvement strile. Dsinfecter autour de la zone de prlvement avant de prlever

(ex : toilette locale lors du recueil d'urine)

LE TRANSPORT DU PRELEVEMENTEnsemencer immdiatement le prlvement ou Utiliser un milieu de transport POURQUOI ?

Ce sont des organimes vivants ! il faut : 1- les garder vivants 2- viter leur multiplication QUAND ? labo loign du site de prlvement :

prlvement domicile, au lit du malade .

LE TRANSPORT DU PRELEVEMENTSi le prlvement doit attendre avant inoculation sur milieu de culture, Conditions de conservation :4C Urine, selles37 37C et/ou Milieu de transport

Prlvements gnitaux, LCR, sang, pus

?Pas de multiplication bactrienne souhaite Possibilit de germes fragiles Possibilit de germes anarobies

Le milieu de transport a lavantage dviter la dessication

LEXAMEN MICROSCOPIQUE

Procdures opratoires utiliser au Laboratoire de microscopie.

Procdures opratoires identifiables dans un Laboratoire de microscopie- Accueil et rception des chantillons - Tri et enregistrement des chantillons - Traitement des chantillons - Stockage des chantillons et conservation des frottis.

Phase pr-analytique: pr-analytique:Accueil et rception des chantillons - rception tous les jours ouvrables - noter date et heure darrive - vrifier la fiche de demande danalyse - vrifier la concordance: nom / chantillon - procder lenregistrement des chantillons

Poste de Tri des chantillons - vrifier la concordance: nom / chantillon - vrifier la quantit et la qualit - rtention ou rejet de lchantillon - si rejet: rdaction de la fiche de non conformit - remise dun exemplaire au demandeur avant son dpart

Enregistrement des chantillons

- attribuer un numro de srie chaque chantillon - procder lenregistrement:

* dabord physique * puis magntique (si possible)

- indiquer la conformit ou la non-conformit non-

Attention: Ne pas jeter systmatiquement les chantillons difficiles obtenir!!!

Phase analytique:Traitement des chantillons

- ranger les chantillons dans lordre croissant - ralisation des frottis - fixer les frottis - colorer les frottis - procder la lecture des lames - rendre les rsultats

Phase post-analytique postStockage des chantillons et conservation des lames - stockage jusquau rendu des rsultats - conservation * +4C ou temprature ambiante +4 * 80C (biopsies) 80 * les frottis positif * 1/10 frottis ngatif

LEXAMEN MICROSCOPIQUE :Premire tape

1 - L'examen direct (ou tat frais)

1 goutte entre lame et lamelle : Obj. x 40, sec.

INTERET :

Prsence et abondance des bactries Morphologie et mode de groupement Mobilit Cytologie : observation des cellules ex : Leucocytes (tmoins de linfection)

LEXAMEN MICROSCOPIQUE :2 - LE GRAMColoration la plus utilise en bactriologie Permet de faire une classification des bactries

Gram + Gram -

Violet Rose

LEXAMEN MICROSCOPIQUE :Coloration de Gram : PrincipeRepose sur la diffrence de permabilit de la paroi bactrienne

1 - Violet de Gentiane ou Crystal - Violettraversent la paroi et colorent toute la bactrie

2 - Solution d'iode ou Lugolfavorise la fixation du colorant

3 - Dcoloration l'Alcool - ActoneLes bactries dites Gram (-) se dcolorent Les bactries dites Gram (+) restent violettes

4 - La fuchsine ou la safranineColoration des bactries Gram (-) en rose

lecture objectif x 100 immersion (huile)

L EXAMEN MICROSCOPIQUE :3 - Autres Colorations Coloration au bleu de mthylne pour visualiser les bactries intra-leucocytaires ex : gonocoques Coloration de Giemsa pour les parasites sanguins et intra-cellulaires Coloration de Ziehl - Neelsen pour les Mycobactries Acridine orange Fluorescence pour les prlvements faible concentration bactrienne

LA CULTURE

LA CULTUREPour obtenir une croissance bactrienne, il faut : Rpondre aux exigences de la bactrie :

Milieu nutritif Atmosphre adapte Temprature adapte

LA CULTURE

Choisir le bon milieu de culture :

en fonction de la bactrie recherche en fonction du prlvement

?Milieu de base ?

Milieu chromogne ?

Milieu riche ?

Milieu slectif ?

LA CULTURE

Les diffrents types de milieux de culture milieu enrichi : milieu de base + sang, facteurs decroissance...

milieu de base : lments nutritifs minimum

milieu slectif : addition d'antibiotiques ou autres milieu chromogne : addition de substratschromognes qui donnent des colonies colores

Les milieux peuvent tre la fois slectifs et enrichis, ou slectifs et chromognes ...

LA CULTURE : Exemples

Urine :CPS ID 2 Glose sang

Selles :Selenite Hektoen BCP Yersinia CIN Campylosel

Prlvement gnital :

Chocolat

Sang ANC

Candida ID

Mac Conkey

LA CULTURE

Choisir la bonne temprature : Bactries : 37C Champignons : 30C

Etuve ? 30C 37C

LA CULTURE

Les differents types respiratoires1 2 3 4

LA CULTURE1 - Bactries arobies strictesNe peuvent vivre qu'en prsence d'oxygne tirent leur nergie en utilisant l'oxygne de l'air : C'est la respiration (mtabolisme oxydatif) ex : Pseudomonas, Mycobactries

2 - Aro-anarobies facultatives AroSe dveloppent avec ou sans air, mais la majorit de l'nergie produite provient de la fermentation ex : Entrobactries

LA CULTURE3 - Anarobies strictesNe se dveloppent qu'en l'absence d'air. L'oxygne leur est toxique. La totalit de l'nergie est produite par fermentation (mtabolisme fermentatif). ex : Fusobacterium, Eubacterium

4 - MicroarophilesPrfrent une pression partielle d'O2 infrieure celle de l'air. ex : Campylobacter, Mycoplasmes

5 - Bactries capnophilesCertains germes prfrent une atmosphre enrichie en CO2,elle est indispensable d'autres. ex : Neisseria gonorrhoeae

LA CULTURE Choisir la bonne atmosphre : Bactrie arobie Bactrie aro-anarobie Bactrie -arophile Bactrie anarobie Bactrie capnophilePas de gnrateur Jarre

Gnrateur microaer

Gnrateur anaer Gnrateur CO2

LA CULTURE Croissance en milieu solide :Sur boite de Ptri Une bactrie dpose la surface d'une glose nutritive, se multiplie et forme 1 amas visible l'oeil nu : la colonie = 1 million de bactries = 20 gnrations

POUR LISOLEMENT

LA CULTURE

Croissance en milieu liquide :En bouillon Une bactrie introduit dans un bouillon nutritif se multiplie, et cre un trouble visible l'oeil nu. Une culture en bouillon ne permet pas de diffrencier une pousse polymicrobienne d'une pousse monomicrobienne.POUR LENRICHISSEMENT

Ex : bouillon C ur-cervelle,Trypcase-soja ...

LA CULTURE Courbe de croissance

bactrienneQuantit de bactries

3 2

4

1 Temps 24H 48H

LA CULTURE

Courbe de croissance bactrienne

1 - Phase de latence Mtabolisme rduit : adaptation de la population bactrienne aux nouvelles conditions de culture. 2 - Phase de croissance exponentielle Multiplication bactrienne trs active. 3 - Phase de ralentissement et phase stationnaire Epuisement des lments nutritifs, accumulation de produits toxiques dans le milieu. 4 - Phase de dclin Mortalit par autolyse des bactries

LIDENTIFICATION

L IDENTIFICATION BACTERIENNE La condition : Obtenir une culture pure (si prlvement polymicrobien)

Premire tape : L'ISOLEMENTEtalement du prlvement sur une glose nutritive

1 bactrie

1 colonie

L IDENTIFICATION BACTERIENNEL'isolement1 2

3 4

L IDENTIFICATION BACTERIENNE L'isolement1 2

3 4

L IDENTIFICATION BACTERIENNE

Deuxime tape : L'IDENTIFICATION

Les bactries sont classes par : Famille Genre Espce exemple : Micrococcaceae Staphylococcus aureus exemple : Enterobacteriaceae Escherichia coli

S. aureus

E. coli

L IDENTIFICATION BACTERIENNE

Lexamen microscopique : Coques ou bacilles Mode de groupement Gram + ou Gram Observation des colonies sur botes de Ptri :Taille, couleur, aspect, odeur (!) Prsence d'une hmolyse sur milieu au sang (Streptocoques... )

L IDENTIFICATION BACTERIENNELHEMOLYSE Hmolyse E : hmolyse partielle (halo verdtre sous la colonie) Ex : Pneumocoque Hmolyse F : hmolyse totale (halo clair sous la colonie) Ex : Streptocoque groupe A, B ... Hmolyse H : pas d'hmolyse Ex : Enterococcus faecalis, faecium

L IDENTIFICATION BACTERIENNE

Tests d'orientation :recherche des enzymes "respiratoires"2 H2O2catalase

Catalase : Dgradation de leau oxygne2 H2O + O2

Oxydase :TMPDincolore oxydase

TMPD oxydrose carmin

(TMPD = N Tetra methyl - para - phnylne - diamine)

L IDENTIFICATION BACTERIENNELes rsultats des tests d'orientation : - Morphologie : Gram Catalase, oxydase permettent de dfinir la famille ou le genre, et donc de choisir les tests ou galeries d'identification Exemples : Cocci, Gram +, Catalase + Staphylocoques Cocci, Gram +, Catalase Streptocoques Bacilles, Gram -, Oxydase Entrobactries

L IDENTIFICATION BACTERIENNE Etude des caractres biochimiques :Etude du mtabolisme de la bactrie (enzymes...) Exemple :Glucose Enzyme Glucose ferment Production dacide pH

Virage de lindicateur color

TEST (+)

Pas denzyme

TEST (-)

4 - IDENTIFICATION BACTERIENNELES TESTS BIOCHIMIQUES

Mtabolisme glucidique :oxydation ou fermentation dun sucre : glucose , lactose, saccharose, arabinose...

Mtabolisme protiqueProtines : glatine, lait, sang ... protases, urase, dsaminases, dcarboxylases

Mtabolisme lipidiquelipase, lcithinase ...

L IDENTIFICATION BACTERIENNE Applications

Milieux d'identification en tubes

Galeries d'identification26 27 28 29 30 21 22 23 24 25 16 17 18 19 20 11 12 13 14 15 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5

ex :

Galeries API, VITEK

ID 32,

cartes

L IDENTIFICATION BACTERIENNE

Etude des caractres antigniquesRaction immunologique : antigne - anticorps Anticorps fixs sur des particules de latex Agglutination sur lame en prsence de lantigne correspondant (bactrie...)AGGLUTINATION latex avec anticorps bactrie

- partir de colonies isoles - ou directement partir des prlvements. Avantage : rapidit ( raction immdiate)

L IDENTIFICATION BACTERIENNE

Identification sur milieux chromognes : Permet didentifier la bactrie la couleur de sa colonie sur la boite Pour

les prlvements frquents Et pour les bactries les plus frquemment rencontres Ex : CPS ID 2 Urine (E.coli, Proteus, Strepto. D) Intrt : gain de temps et dargent

L IDENTIFICATION BACTERIENNE Identification par biologie molculaire :Permet didentifier la bactrie par un fragment spcifique de son ADN A partir des colonies Ou directement partir du prlvement

Ex : Gen Probe

Mycobactries, Gonocoque, Chlamydia...

Intrt : Spcificit, gain de temps

L ANTIBIOGRAMME

L ANTIBIOGRAMME

Gurir rapidementBUT :Trouver un traitement efficace pour le malade

L ANTIBIOGRAMMEEtudier in vitro l'activit des antibiotiques sur la bactrie isoleA raliser uniquement sur l'agent pathogne (pas sur la flore normale)

Interprter l'activit de l'antibiotique in vivo : Risques potentiels de succs ou d'chec pour le traitement

L ANTIBIOGRAMMELES ANTIBIOTIQUESagents antibactriens

1928 : Fleming dcouvre la Pnicilline

L ANTIBIOGRAMMELES ANTIBIOTIQUES Origine :- biologique : labors par des micro-organismes : champignons, bactries - chimique : produits par synthse

Action : variable selon la famille d'antibiotiques- inhibition de la synthse de la paroi bactrienne - altration de la membrane cytoplasmique - action sur la synthse d'enzymes - inhibition de la synthse des acides nucliques

L ANTIBIOGRAMME

Les rsultats sont rendus au mdecin en :

S R I

Sensible Rsistant Intermdiaire

LANTIBIOGRAMMELES RESULTATS

Bactrie sensible : S

La bactrie ne pousse pas en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un succs

Bactrie rsistante : R

La bactrie pousse en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un chec

Bactrie intermdiaire : I

Rsultat intermdiare

L ANTIBIOGRAMMERsistance bactrienne

Naturelle :

Rsistance toujours retrouve chez une mme bactrie : Cest un comportement normal et connuEx : Proteus mirabilis rsistant la Ttracycline

Acquise :

Rsistance nouvelle acquise par mutation gntique : Cest un comportement anormal Cette rsistance peut apparatre puis disparatre

A cause des rsistances acquises (donc surprises), il faut faire un antibiogramme pour chaque bactrie identifie

L ANTIBIOGRAMME

Etude de la CMI :CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE Plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la souche tudie. Mthode de dilution en milieu liquideEx : CMI = 1g/ml

Concentration dantibiotique (g/ml)

0

0,5

1

2

4

8

L ANTIBIOGRAMMELES DIFFERENTES TECHNIQUES

Diffusion en glose (disques) Galeries ATB Cartes Vitek

L ANTIBIOGRAMME

Mthode de diffusion en gloseUtilisation d'un disque de papier filtre sur lequel un antibiotique a t incorpor et sch.

inoculation de toute la surface de la glose avec la suspension bactrienne. les disques sont placs sur la surface de la bote. les antibiotiques vont alors diffuser dans la glose.

Aprs 20 heures d'incubation, une zone d'inhibition apparat autour du disque. La taille de la zone est proportionnelle la valeur de la CMI.

L ANTIBIOGRAMMEB

A

Mesure du diamtre

dinhibition pour chaque antibiotiqueC

G

Ce diamtre

H

correspond la CMI report en S, R, I en fonction des diamtres officiels donns par les comits dexperts

Ce diamtre estF E D

L ANTIBIOGRAMME

Pour tre fiable la mthode doit tre standardise STANDARDISATION :- de l'inoculum : quantit de bactries - de la glose Mueller-Hinton : composition du Muellermilieu - de l'paisseur de la glose : diffusion de l'antibiotique - de la charge dantibiotique du disque

L ANTIBIOGRAMME

Galeries ATB :On teste chaque antibiotique (A,B,C,D...) 2 concentrations diffrentes (c et C)= Pas de croissance bactrienne = Croissance bactrienne

c 0 A B C D

CTmoin de croissance

S R I S

L ANTIBIOGRAMMELes concentrations critiquesPour chaque antibiotique, les diffrents comits de l'antibiogramme fixent un intervalle critique permettant de savoir si l'antibiotique sera efficace in vivo (aux doses thrapeutiques) C : concentration critique suprieure c : concentration critique infrieure Concentrations dtermines en fonction de la pharmacocintique : - fixation sur les protines,- pntration dans certains sites, - absorption, mtabolisme et excrtion.

L ANTIBIOGRAMME Souche sensible : CMI < cL'antibiotique test est actif sur la souche bactrienne.

Souche intermdiaire : c < CMI < CNe rpondra pas un traitement doses usuelles, mais peut-tre un traitement par voie gnrale haute dose ou par voie locale. C'est l'intervalle de risque.

Souche rsistante : CMI > CLa souche rsiste aux plus fortes concentrations. L'antibiotique ne sera pas actif in vivo.

L ANTIBIOGRAMME Mthodes automatises :Etude de la croissance bactrienne dans un milieu liquide ou semi-liquide en prsence d'une ou plusieurs concentrations d'antibiotiques - ATB Expression - mini API

26 27 28 29 30

21 22 23 24 25

16 17 18 19 20

11 12 13 14 15

6 7 8 9 10

1 2

- VITEK

3 4 5

EN RESUME1- PRELEVEMENT2 - EXAMEN MICROSCOPIQUE Etat frais Gram 3 - CULTURE 4 - TESTS D'ORIENTATION Catalase Oxydase 5 - IDENTIFICATION Manuelle : Galerie API Semi-automate : ATB Expression - mini API Semi Automate complet : VITEK 6 - ANTIBIOGRAMME Diffusion en milieu glos (disques) Milieu semi-glos (galeries ATB) semi Milieu liquide (cartes VITEK)