Processus photophysiques dans la molCcule de colchicine

H. ROIGT ET R. M. LEBLANC Universite' du Que'bec ir Trois-Rivieres, Groupe de Biophysiqsre, De'pc~rtetnent cle Chimie-Biologie,

C.P. 500, Trois-Rivikres, QuPbec R e ~ u le 6 mars 1973

Un diagramme de Jablonski est propose pour la molCcule de colchicine. A cette fin des resultats primor- diaux ont CtB tires de l'ttude de I'absorption u.v.-visible, de la luminescence a 77 "K et de la photolyse. Ainsi le rendement de phosphorescence a kt6 trouvC &gal a 0.86 et un resultat important concerne la mise en evidence de 1'Ctablissement de pont hydrogene entre la colchicine et le solvant.

The photophysics of colchicine has been studied by absorption and luminescence spectroscopy. The quantum yield of phosphorescence has been found to be 0.86. The quantum yield measurements of col- chicine photodegradation in different solvents are reported. The polarity and hydrogen bond character of the solvents are observed to play an important role in these measurements. The Jablonski diagram is pro- posed for the colchicine molecule.

Can. J . Chern., 51, 2821 (1973)

Introduction Une des principales caracttristiques de la

colchicine rtside dans son pouvoir antimito- tique sptcifique (1, 2). Un excellent rtsumC des proprittts apparait dans l'article de Wallace et Ertel (3). Bien que posstdant au point de vue mtdical des effets secondaires nocifs et imprt-

I visibles, la colchicine est encore ttudite et 1 utiliste frtquemment surtout dans les labora-

toires de gtnttique cellulaire. Or, un travail recent dtmontre que l'on peut

I inverser l'action biologique de la Colcemide (N-mtthyl N-dtsacttyl colchicine) par irradia-

I tion du produit 366 nm. Ce comportement est expliqut par la photodtgradation de la subs- tance (4). Pourtant, d'autres auteurs (5) ob- servent des effets difftrents selon la region spectrale d'irradiation utiliste.

On s'aper~oit donc qu'une explication dtfini- tive ne pourra &tre formulte que lorsqu'une ttude quantitative approfondie sur la photoin- activation de la colchicine aura t t t entreprise. Si l'on en juge par les travaux anttrieurs (6-14) les rtsultats concernant la photodtgradation quantique ne sont pas nombreux. Notre ttude tente de combler cette lacune en examinant les

thanol (99.9% pur), le n-propanol (certified normal), l'isopropanol (certified A.C.S.), le 11-butanol (reagent A.C.S.), I'isobutanol (certified), le tertiobutanol (certified), le 1,4-dioxane (certified, 99% pur), le benzene (spectra- nalyzed), le formamide (certified), le N,N-dimethylfor- mamide (certified A.C.S.), I'acCtonitrile (certified A.C.S.) sont tous des produits Fisher et ont ete employks sans autre purification. I1 en est de mCme du melange ditthyl ether, isopentane, ethanol, 5 :5 :2, (EPA mixed solvent, American Instrument Co. Inc.) et de I'Cthanol a 95% (C.I.P., Gatineau, Quebec). L'eau est distillke dans un systeme Barnsted.

Les standards de luminescence appartiennent a un ensemble de photosensibilisateurs (Organic Laboratory Chemicals, J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, New Jersey, kit 4040).

L'oxalate de potassium et le chlorure ferrique (Fisher, reagent grade) ont servi a la preparation de I'actinometre K3Fe(CZ04)3.3Hz0, lequel est recristallil trois fois dans l'eau distillie tiede, a l'abri de la lumi6re.

Les cristaux verts obtenus sont seches B l'air et r t- cupkres dans un flacon teinte. Une solution sulfurique 0.006 M de ferrioxalate de potassium est ensuite pr6parCe selon la technique elaborCe par Hatchard et Parker (16).

L'acCtate de sodium (reagent. Anachemia Chemicals Ltd.) et la 1,lO-phknanthroline (certified A.C.S., Fisher) sont aussi utilisis tels quels dans la preparation des solutions necessaires a I'obtention du complexe de couleur rouge avec les ions Fez+.

Les criteres de puretC de la colchicine utilisee, ainsi que la description des caractkristiques du spectrophotometre Unicam SP 1800 et du spectrofluorimetre Perkin-Elmer

processus photochimiques primaires et en tta- MPF 2A, ont dkja e t t mentiomes dans une publication

blissant un bilan tnergttique compte tenu d'un anterieure (15). Cependant pour la determination des rendements quantiques de phosphorescence, le photo-

rtsultat prtliminaire lit a la phosphorescence de multiplicateur HTV R106 a kte remplace par le HTV la colchicine (15). R136. Les spectres d'8mission furent corrigCs a l'aide de

la riponse spectrale relative du photomultiplicateur au moyen d'une calculatrice electronique Hewlett-Packard Partie experimentale 9820 A qui intigrait automatiquement les aires sous les

Les solvants tels le titrachlorure de carbone (spec- courbes dans une unite commune. Les Cchantillons con- tranalyzed), le chloroforme (spectranalyzed, 0.75% tenus dans des tubes en quartz ne prksentaient aucune C,H,OH), le dichloromethane (spectranalyzed), le me- trace d'eau qui aurait eu pour effet de fendiller le verre

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TABLEAU 1. Coefficients d'absorption de la colchine dans differents solvants

Solvant h,,,(log 4 (i 1 nm)

Eau Methanol Ethanol 95% n-Propanol 2-Propanol 11-Butanol r-Butanol Tetrachlorure de carbone Chloroforme Dichloromethane Benzene 1,4-Dioxane Formamide N,N-Dimethyl formamide Acetonitrile

(EPA solide) a 77 OK. Les tubes eux mCmes Btaient main- tenus en place par une garniture interieure en Teflon, systeme qui avait pour effet d'obtenir des resultats repro- ductibles. Chacun des resultats est la moyenne d'une sCrie de cinq ou six essais effectues dans des conditions expCrimentales differentes.

Le systeme d'irradiation comporte les parties suivantes: line lampe ail mercure General Electric AH4, 125 W, "pression moyenne"; un rkflecteur cylindrique; une len- tille convergente; un filtre de chaleur Chance No. HAI; un filtre optique 366 nm Chance No. 0.X.I.; un dia- phragme a iris ainsi qu'un bloc d'irradiation.

Le bloc d'irradiation comporte trois cellules de quartz, cylindriques, de 1 cm de trajet optique et de 2.75 cc de volume, calees dans des rainures a cet effet. Au milieu du bloc et placee perpendiculairement, avec un angle de 45" par rapport au faisceau incident, se trouve une lamelle de quartz de 1.5 mm dlCpaisseur que repartit la lumiere incidente en deux faisceaux perpendiculaires, dans le rapport: 7% rCflCchie a angle droit et 93% traversant sdns aucune deviation. Ce rapport est independant de l'inten- site incidente.

La cellule laterale contient toujours de I'actinometre et la densite optique mesuree a 5100 A sert au calcul de l'intensite lumineuse Cmise par la lampe (eliminant ainsi les erreurs dues a une fluctuation possible de I'intensitC durant l'irradiation).

La cellule arriere contient Cgalement de I'actinometre et sert au calcul de la quantitC de photons qui n'a pas Cte absorbee par la solution de colchicine: o n peut ainsi corriger la valeur du rendement quantique de photo- degradation obtenue.

Enfin la cellule frontale contient la solution dont on veut etudier la photolyse.

Les solutions de colchicine ayant servies a I'irradiation n'ont pas etC dCgazCes a I'inverse de celles qui ont BtC utiliskes pour la determination des rendements de phos- phorescence. En effet quelques experiences ont montrC que le rendement quantique de degradation de la colchi- cine derneurait dans les limites de l'erreur exptrimentale quand on passait d'une solution non dCgazCe a une solu- tion degazee (pression inferieure a Torr).

RCsultats et discussion

Absorption Certains rCsultats concernant l'absorption des

molCcules apprtenant 2 la m&me famille que la colchicine ont dCja fait l'objet d'une importante Ctude de la part de Santavjl et coll. (17).

D'autres travaux portant sur les tropolones en particulier, prouvent la spCcificitt des bandes d'absorption dont l'une commune A tous ces composCs et situCe vers 350 nm (arrangement du cycle tropolone) (1 8-20).

Quant A nous, nous nous sommes penchts plut6t sur l'effet de solvant, en restreignant notre champ d'investigation A la molCcule de colchicine uniquement. I1 va sans dire que les rCsultats concernant les coefficknts d'absorption molCculaire sont absolument nCcessaires pour le calcul des rendements quantiques de photoiso- mCrisation de la colchicine.

Le tableau 1 concerne directement l'absorption en fonction du solvant, les coefficients d'absorp- tion Ctant calculCs par la mCthode des moindres carrCs. L'intervalle de concentrations se situe entre 10-3-1~-6 M, sauf le tetrachlorure de carbone (10-5-10-6 M).

On note en premier lieu qLe la valeur de ces coefficients E est relativement ClevCe (E 2 12000) ce qui implique des transitions nx* pour toutes ces bandes. Ceci est vCrifiC ell outre par le dCplace- ment bathochrome des maxima lorsque la pola- ritC du solvant augmente.

On s'aper~oit aussi que le nombre des bandes d'absorption varie selon le solvant utilist, mais celle entre 340 et 355 nm demeure toujours.

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Un rCsultat important concerne I'absorption de la colchicine dans le formamide d'une part et dans son dCrivC N,N-dimCthylC d'autre part. Le maximum se dCplace de 350-344 nm quand on passe du premier au second. Ce dCplacement relativement important ne peut etre expliquC uniquement par la variation du moment dipolaire du solvant. En effet, ici intervient un effet de liaison hydrogene c'est-a-dire que l'augmenta- tion en intensitt du ou des ponts hydrogenes entre la colchicine et le solvant conduit au meme phtnomkne qu'une augmentation dans la pola- ritC de ce dernier. Le doublet Clectronique libre sur I'azote du formamide est beaucoup plus dis- ponible que dans le cas du N,N-dimkthylfor- mamide a cause d'un empechement stCrique provoqut par les groupements mCthyle dans ce dernier cas. 11 en dCcoule donc une plus grande capacitC A Ctablir des liaisons hydrogene dans le cas du forlnamide et le diplacement de h,,, observe est tout a fait normal. Un tel effet a kt6 comment6 pour d'autres moltcules (21).

Luminescence Aucune fluorescence n'a Ctt dCcelCe, cependant

une importante phosphorescence apparait entre 380 et 600 nm, caractCrisCe par un spectre peu structuri avec un maximum d'intensiti 5 423 nm et une bande 0-0 6 402 nm dans 1'e.p.a. La nature de cette luminescence a dCjk fait l'objet d'un travail publiC rtcemment (15).

Le choix des standards pour la mesure du rendement relatif de phosphorescence de la col- chicine a CtC conditionnC par 1'Cnergie de son Ctat triplet, ET, = 71.5 kcal mol- '. A cette fin nous avons choisi la benzophCnone (22), I'acCto- phtnone (23) et le biphCnyle (24). Le rendement de phosphorescence +,(Colt.) a CtC dttermint a I'aide de la relation proposCe par Parker et Rees (25):

Colc. et S, indices se rapportant respectivement a la colchicine et au standard; H, hauteur maxi- mum du spectre d'Cmission pour une meme longueur d'onde d'excitation; A , aire sous le spectre, corrigCe, d'apres la rCponse du photo- multiplicateur.

Dans le cas des deux premiers standards la corrClation est excellente et indique une valeur moyenne $,(Colt.) = 0.86 (15 essais B diffC- rentes longueurs d'onde d'excitation), tandis

qu'avec le biphCnyle on obtiei~t une valeur de 0.18.

Cependant dans ce dernier cas, Parker et Hatchard (24) signalent que la valeur trouvCe pour le biphCnyle n'est qu'approximative. Quant a nous, nous considCrons qu'elle doit etre erronCe compte tenu des rCsultats obtenus avec les autres standards. Quoiqu'il en soit le calcul des rende- ments de photodCgradation de la colchicine confirmera cette assertion.

Photolyse En utilisant le dispositif d'irradiation dCcrit

dans la partie expirimentale, on mesure par spectrophotornCtrie la dCcroissance de densite optique de la bande d'absorption nn* vers 350 nm, absorption due au cycle tropolone qui sera le siege d'un photorearrangement. Cette bande est idtale pour une telle mesure puisqu'elle dis- parait presque completement dans le spectre des lumicolchicines P et y dont le coefficient d'absorp- tion ?i 350 nm, calculC A partir du graphique de Grewe et Wulf (12), est Cgal 8: E = 1650 1 mol-' cm-', soit une valeur tquivalente au dixikme de celle de la colchicine.

La figure 1 montre I'aspect spectral que revet cette photodtgradation dans l'eau. Des spectres semblables ont dkja CtC publies mais ils con- cernaient la photoisomtrisation de la lumicol- chicine a (26) et celle de la N-mCthyl, N-dCsacCtyl colchicine (1 3).

Apres un certain temps d'irradiation, il ap- parait deux nouvelles bandes dont les maxima se situent respectivement a 223 et 2 266 nm, absorp- tions caracttristiques des lumicolchicines P et y. On note Cgalement la presence de quatre points isobestiques soit B 21 1, 228, 257 et 301 nin. La bande situCe a 350 nm diminue beaucoup d'in- tensitt tout en se dCplaqant vers les courtes lon- gueurs d'onde (d:minution de la conjugaison dans le cycle), tandis que les maxima B 199 et a 246 nm deviennent des minima.

To~ijours sur la fig. 1, il est important de re- marquer que la photodCgradation de la colchicine n'est pas linCaire en fonction du temps, d70a l'obligation de recourir a une intensit6 d'irradia- tion plus faible et aussi des intervalles d'irra- diation plus courts. On a donc utilisC une inten- sit6 incidente corrigee, voisine de 1014 quanta s-' cm-2 et dans ce cas on a note une dCcrois- sance uniforme de la densitt optique en fonction du temps, ce, durant 5 mi11 a peu pres, et pour deux series de solvants, soient les chloromCthanes

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FIG. I. Photodegradation de la colchicine en solution aqueuse. 4.9 x M ; pH = 5.8; Iabr = 2 x loL5 quanta s s L ~ m - ~ ; temps d'irradiation 0: 0 min, 1 : 10 min, 2: 20 min, 3: 30 min, 4: 40 min, 5: 50 min, 6: 120 min, 7 : 240 min.

d'une part (fig. 2a), et les alcools d'autre part (fig. 2b). Le temps au bout duquel la linCaritC disparalt, dCpend du solvant: plus celui-ci est polaire, plus le temps est long. C'est la pente de ces droites qui sert h calculer le rendement quan- tique de photoisomCrisation de la colchicine, selon 1'Cquation:

Q(Co1c.) : rendement quantique de photoisomCri- sation de la colchicine; A(d.o.),,, ",: diminution de densit6 optique du maximum vers 350 nm; No: 6.023 x loz0 molCcules ~ m - ~ ; V: volume de la solution de colchicine irradiCe en cm3; t: temps d'irradiation en s; E,,,: coefficient d'ab- sorption molCculaire vers 350 nm en 1 mol-I cm- ' ; I,,, : intensit6 absorbCe par la colchicine en quanta s-I cmP2.

Efet de solvant En plus des deux series de solvants citCs prCcC-

demment, ont CtC utilisCs le benzene (faible

probabilitb de rCaction d'abstraction d'hydro- gene), le formamide et son dCrivC N,N-dimCthylC pour une comparaison possible quant A 1'Cta- blissement de liaisons hydrogene. Les rCsultats apparaissent dans le tableau 2.

Dans l'une ou l'autre des sCries de solvants CtudiCs, on remarque une diminution du rende- mint quantique de photodCgradation en fonction du moment dipolaire du solvant.

Cet effet est expliquC par la formation d'un complexe de solvatation solutC - solvant, d'au- tant plus stable que le moment dipolaire est ClevC.

Le cas du formamide et de son dCrivC N,N-di- mCthylC, offre un aspect interessant de l'inter- vention des ponts hydrogene et de leur impor- tance dans les processus photophysiques. En effet, en passant du formamide B son dCrivC, on assiste h une augmentation du simple au double du rendement de photodCgradation et l'explica- tion de ce phCnomene ne peut rCsider uniquement dans la diffkrence de moment dipolaire entre les deux molCcules de solvant. Cette variation est

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FIG. 2. Decroissance du maximum d'absorption vers 350 nm en fonction du temps d'irradiation: (a) cas des chloromethanes; (b) cas des alcools.

TABLEAU 2. Rendements quantiques de photodegredation de la colchine dans diffirents solvants

I ~ ~ ~ x 1014 ~ C O I C . ) p x 1019 Solvant Concentration (M) (quanta s-' cm-') ( 2 loOA (u.e.s. c.g.s.)

C H ~ C ~ ~ HzO* MeOH PrOH i-PrOH CsHs HCONH,

HCON /Me

'Me

'En ce qui a trait i la N-m6thyl,N-d6sac~tyI colchicine, Aronson et InouC (4) avaient trouve comme rendement quanticlue de degradation: in = 3 x 10-3 dans I'cau; CD 1, 36 :; 10-3 dans le 11-butanol. Ces resultats sont t r is voisins des nbtres.

essentiellement due au fait que dans le forma- mide, le doublet tlectronique libre sur I'atome d'azote est beaucoup plus disponible donc du meme coup, beaucoup plus apte B triger un ou plusieurs ponts hydrogkne avec la moltcule de colchicine. Le complexe colchicine-formamide serait donc beaucoup plus stable B cause de ces liaisons hydrogkne et inhiberait la photoisomtri- sation de la colchicine.

L'Ctablissement de ponts hydrogine entre la colchicine et le solvant pourrait trks bien expli- quer l'action antimitotique de la substance.

Par contre, le cas du benzkne est marginal: si l'on s'en tient B la valeur du moment dipolaire des moltcules de solvant, le benzine devrait donner B peu pris le meme rtsultat que le tttra- chlorure de carbone. Or il n'en est rien et il se pourrait bien que dans ce cas on assiste B un

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FIG. 3. Diagramme de Jablonski. (->) processus radiatif; (-+) processus non radiatif.

transfert de charge qui diminuerait du m&me coup la photodCgradation de la colchicine.

Autces effets Des essais prkliminaires sur quelques solu-

tions portent a croire qu'un effet de concentra- tion existe, surtout dans l'isopropanol. En effet le rendement quantique de photodCgradation augmente proportionnellement avec la concen- tration. Or quand on sait que l'isopropanol est le solvant le plus apte a donner lieu a une rCaction secondaire d'abstraction d'hydrogkne en prC- sence d'une fonction cCtone (21), on con~oi t donc qu'un tel effet soit tout B fait normal avec la colchicine qui posskde aussi un groupement cCtone sur le cycle tropolone.

Des Ctudes en ce sens sont actuelleinent en cours avec parallklement des essais sur l'effet d'intensiti, de la longueur d'onde d'irradiation, et aussi de pH (27).

Diagranzme cle Jablonski Les processus photophysiques les plus impor-

tants que subit la colchicine, peuvent se rCsumer dans les Ctapes suivantes :

(C~lc . )~ , + solvant -> (~omplexe)~,

(c~mplexe)*~~ -r (C~lc . )~ , + solvant

(cornple~e)*~~ -> (C~lc . )*~ , + solvant

Le complexe solvant-colchicine absorbe un photon, ce qui le conduit a un Ctat excitC S,,. Suite a cette absorption, le processus de con- version interne du complexe libkre la inolCcule de colchicine qui demeure a 1'Ctat excitC '(n.rr*). A partir de S,, aucune dbsactivation radiative n'est observCe. Par contre la constante de conversion interne k,, correspondant a une dksactivation thermique S, -, So est calculCe thkoriquement (28) k, = logs- ' .

Toujours a partir de S,, on assiste a un croise- lnent inter-systkme S, -, T, dont la constante de vitesse calculCe thkoriquement est Cgale a k, , 3 10" s-I.

A partir de cet Ctat triplet 3(nn"), il y a alors Cmission de phosphorescence (77 OK) avec k , = 5 103 s - ~ (15).

Au sujet du processus photochimique qui con- duit A I'isomCrisation de la molCcule, le mica- nisme proposC par Chapman et coll. (29) relatif aux tropolones, ferait intervenir 1'Ctat triplet. Ceci reste cependant a vCrifier dans le cas de la colchicine.

La transition la plus importante demeure le croisement inter-systkme S, -, TI, ce qui signifie

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que la plupart des moltcules se retrouvent en T I apr6s l'absorption d'un photon.

Tous ces processus sont schtmatists sur le diagramme de la fig. 3.

En conclusion de cette ttude photophysique de la colchicine, on peut affirmer que les rtsultats concernant le rendement quantique de photo- isomerisation viennent corroborer ceux obtenus prtctdemment sur le rendement de phospho- rescence. Ces deux processus primaires sont de loin les plus importants que subit la molCcule et on s'aper~oit que la sonme des deux rende- ments approche I'unitt.

Nous tenons a exprirner notre gratitude au Conseil national de recherches du Canada ainsi qu'au Conseil de Recherches pour la DCfense (# 9530-1 17) qui ont fourni l'apport financier a notre Ctude.

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